Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zidentyfikowanie i dokładne określenie ilościowe ponad 10 000 białek z lizatu komórkowego lub tkankowego w różnych terapiach lekowych, przebiegach czasowych lub warunkach biologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny medycyny lub biologii, takie jak to, jakie białka zmieniają się w odpowiedzi na lek lub inny bodziec biologiczny. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma ona zdolność do dokładnego ilościowego określenia ponad 70% wyrażonego proteomu w 10 różnych warunkach eksperymentalnych.

Implikacje tej technologii można rozszerzyć na diagnostykę chorób człowieka poprzez potencjalne odkrycie biomarkerów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ optymalna liza komórek i szacowanie płynów odgrywają kluczową rolę w dalszych procedurach trawienia, etykietowania i separacji. Aby rozpocząć ten protokół, uzyskaj hodowane komórki, które Cię interesują.

Umyj komórki dwukrotnie, używając 10 mililitrów PBS do każdego prania. Zeskrob i zbierz umyte komórki w 1,5 mililitrowej probówce zawierającej jeden mililitr PBS. Wirować w temperaturze 600 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Usuń supernatant i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do lizy komórek. Zbierz i zważ żądane tkanki szybko po sekcji. Następnie natychmiast przechowuj je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Przygotować bufor do lizy w dniu eksperymentu, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj bufor do lizy do zamrożonej próbki tak, aby stosunek buforu do próbki wynosił 10 do jednego, a końcowe stężenie białka wynosiło od pięciu do 10 miligramów na mililitr. Następnie dodaj szklane kulki i za pomocą blendera zmiksuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przyspiesz do ośmiu, miksując przez 30 sekund, a następnie odpoczywając przez pięć sekund, powtarzając to pięć razy lub do momentu, gdy próbki zostaną zhomogenizowane.

Zmierzyć stężenie białka za pomocą standardowego testu ilościowego białka lub barwionego Coomassie żelu poliakrylamidowego SDS z BSA jako wzorcem. Następnie dodaj 100% acetonitrylu tak, aby końcowe stężenie wynosiło 10%, a proteaza Lys-C miała stosunek enzymu do substratu od jednego do 100. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby umożliwić trawienie białka.

Następnie dodaj DTT tak, aby końcowe stężenie wynosiło jeden milimol. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie dodaj 50 milimolowych HEPES, aż stężenie mocznika w próbkach zostanie rozcieńczone do dwóch molowców.

Dodaj trypsynę do każdej próbki w stosunku trypsyny do białka od jednego do 50. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny. Następnie dodawaj DTT, aż jego stężenie ponownie wyniesie jeden milimol i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Dodaj jodoacetamid tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 10 milimolów. Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy schłodzić nieprzereagowany jodoacetamid, dodając DTT tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 30 milimolów.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Sprawdź skuteczność trawienia trypsyny zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj TFA do każdej próbki tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1%Za pomocą paska pH zmierz pH każdej próbki, aby sprawdzić, czy wynosi od dwóch do trzech.

W razie potrzeby dodaj więcej TFA kroplami, aby osiągnąć niedopuszczalne pH. Odwirować próbki w temperaturze 20 000 g i temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zebrać supernatant i załadować próbki do przygotowanych kolumn wirowych.

Wirować w temperaturze 100 razy g przez trzy minuty lub do momentu, gdy próbka całkowicie przejdzie przez kolumnę w celu związania próbek. Następnie dodaj 0,5 mililitra 0,1% TFA do każdej kolumny. Wirować 500 razy g przez 30 sekund.

Następnie dodać 125 mikrolitrów roztworu zawierającego 60% acetonitrylu i 0,1 TFA do każdej kolumny. Wirować przy 100 razy g przez trzy minuty, aby wymyć peptydy z kolumny. Rozpuść każdą odsoloną próbkę peptydu w 50 mikrolitrach 50-milimolowego HEPES.

Za pomocą paska pH sprawdź, czy pH każdej próbki wynosi od siedmiu do ośmiu. Następnie rozpuść odczynniki TMT w bezwodnym acetonitrylu, dodaj je do próbek, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie użyj 10 mikrolitrowych końcówek pipet osadzonych w pożywce chromatograficznej, aby odsolić jeden mikrogram każdej próbki i przeanalizować skuteczność etykietowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Zbadaj od sześciu do 10 oddzielnych peptydów, aby upewnić się, że nieznakowane peptydy nie zostaną wykryte w znakowanych próbkach. Następnie wymieszaj ze sobą około dwóch mikrolitrów każdej próbki. Użyj 10 mikrolitrowych końcówek do pipet osadzonych w pożywce chromatograficznej, aby odsolić tę mieszaninę.

Analizować próbki za pomocą LC-MS/MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na początek rozpuść odsoloną zbiorczą próbkę peptydu znakowaną TMT w 65 mikrolitrach buforu A. Użyj paska pH, aby sprawdzić, czy pH wynosi około 8,0. Jeśli próbka jest nadal kwaśna, użyj wodorotlenku amonu, aby w razie potrzeby dostosować pH.

Następnie należy frakcjonować próbkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ustaw kolektor frakcji tak, aby zbierał ułamki co dwie minuty, łącznie z czasem ładowania. Ustaw natężenie przepływu na 0,4 mililitra na minutę.

Zbierz w sumie 80 frakcji. Następnie użyj koncentratora próżniowego, aby całkowicie wysuszyć co drugą próbkę. Za pomocą LC-MS/MS przeanalizuj wszystkie 80 frakcji, aby uzyskać ultra głębokie pokrycie proteomu.

Najpierw zapakuj żywicę C18 o wielkości 1,9 mikrometra do pustych kolumn o średnicy wewnętrznej 75 mikrometrów, osiągając objętość złoża około 1,3 mikrolitra. Zwiń kolumnę dwa do trzech razy wewnątrz grzejnika motylkowego, aby upewnić się, że cała długość jest podgrzana. Przyklej kolumnę do wnętrza grzejnika, uważając, aby nie zakleić czujnika temperatury grzejnika.

Następnie podgrzej kolumnę do 65 stopni Celsjusza. Przepuść 100 nanogramów peptydów mózgu szczura przez system LC-MS/MS, aby ocenić jakość systemu. Powtórz tę ocenę jeszcze raz.

Następnie załaduj około 0,2 mikrograma odtworzonych peptydów na kolumnę, przepływając 5% bufor A.Usuń peptydy z kolumny i przeanalizuj za pomocą spektrometru mas, jak opisano w protokole tekstowym. W niniejszej pracy opisano wysokoprzepustową metodę oznaczania ilościowego białek ze strategią znakowania izobarycznego 10-plex. Skuteczność etykietowania TMT jest badana za pomocą LC-MS/MS do analizy próbek znakowanych TMT i odpowiadających im próbek nieoznakowanych.

Jak widać, nieznakowany pik peptydu znajduje się tylko w nieznakowanej próbce, podczas gdy pik peptydu znakowany TMT znajduje się tylko w znakowanej próbce. Następnie oceniany jest wpływ okna izolacji MS2 na zakłócenia. Wszystkie skanowania MS2 są oznaczone jako czyste lub zaszumione.

Podczas gdy czyste skany wykazują jony y1 tylko lizyny, hałaśliwe skany wykazują je zarówno w lizynie, jak i argininie. Reprezentatywne usuwanie zakłóceń za pomocą peptydów E.coli indywidualnie znakowanych trzema różnymi odczynnikami TMT pokazano tutaj. Zsumowane względne intensywności pokazują, że poprawka oparta na jonach y1 jest dokładniejsza w przypadku kwantyfikacji opartej na TMT.

Po opanowaniu protokół ten można ukończyć w ciągu czterech do pięciu tygodni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie etapy kontroli jakości zostały wykonane w całości, aby zapewnić, że końcowy zestaw danych jest tak dokładny, jak to tylko możliwe. Dostosowanie tej procedury w celu skupienia się na modyfikacjach potranslacyjnych może odpowiedzieć na inne pytania, takie jak to, jak zmienia się ubikwitynacja, fosforylacja lub acetylacja w odpowiedzi na postęp choroby lub leczenie farmakologiczne.

Po jej opracowaniu technologia utorowała drogę naukowcom zajmującym się produktami do badania zmian białkowych w komórkach i tkankach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś bardzo dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować i dokładnie określić ilościowo ponad 10 000 białek z komórki lub tkanki ssaka. Nie zapominaj, że praca z wysokociśnieniowym UPLC i kilkoma kolumnami krzemionkowymi może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaczęliśmy zajmować się znanym problemem kompresji proporcji, który występuje w znakowaniu izobarycznym. Zdaliśmy sobie sprawę, że ekstensywna frakcjonowanie jest świetnym sposobem nie tylko na złagodzenie tego problemu, ale także na zwiększenie identyfikacji białek i peptydów, które mogą jeszcze bardziej zwiększyć i dostosować się do analizy proteomu.