Name: Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metodę głębokiego profilowania proteomu z wykorzystaniem znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. Technika umożliwia ilościowe określenie ponad 10 000 białek z różnych próbek biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim pozostałym członkom laboratorium i placówki za pomocną dyskusję. Praca ta była częściowo wspierana przez granty NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 i ALSAC. Analiza stwardnienia rozsianego została przeprowadzona w St. Jude Children's Research Hospital Proteomics Facility, częściowo wspieranym przez NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Autorzy dziękują Nishy Badders za pomoc w redakcji rękopisu.

<ol><li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li>
<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+proteomics%3A+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Profiling+of+Proteome+and+Phosphoproteome+by+Isobaric+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Extensive+Liquid+Chromatography%2C+and+Mass+Spectrometry.+Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling.</a> Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+throughput+in+targeted+proteomics+assays%3A+54-plex+quantitation+in+a+single+mass+spectrometry+run%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run.</a> Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approaches+for+analyzing+U1-70K+cleavage+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li>
<li>Churchman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Retinoids+in+IKZF1-Mutated+BCR-ABL1+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464(2016).</li>
<li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+hour+yeast+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMP%3A+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Niu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Peptide+Fractionation+and+y1+Ion-Based+Interference+Detection+Method+for+Enabling+Accurate+Quantification+by+Isobaric+Labeling+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+purification+enables+accurate%2C+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+enables+accurate%2C+sensitive%2C+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171(2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Ahrne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Improvement+of+Quantification+Accuracy+in+Isobaric+Mass+Tag-Based+Protein+Quantification+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments.</a> J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li>
<li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMPg%3A+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy wysokoprzepustowy protokół oznaczania ilościowego białek ze strategią znakowania izobarycznego 10-plex, który został z powodzeniem wdrożony w kilku publikacjach 12,13,14,32. W tym protokole możemy przeanalizować do 10 różnych próbek białek biologicznych w 1 eksperymencie. Z dużą pewnością jesteśmy w stanie rutynowo zidentyfikować i określić ilościowo ponad 10 000 białek. Chociaż znako...

Postępy w technologii sekwencjonowania nowej generacji doprowadziły do powstania nowego krajobrazu do badania systemów biologicznych i chorób ludzkich. Pozwoliło to na uzyskanie dużej liczby pomiarów genomu, transkryptomu, proteomu, metabolomu i innych układów molekularnych. Spektrometria mas (MS) jest jedną z najbardziej czułych metod w chemii analitycznej, a jej zastosowanie w proteomice gwałtownie rozszerzyło się po sekwencjonowaniu ludzkiego genomu. W dziedzinie proteomiki ostatnie kilka lat przyniosło znaczny postęp techniczny w analizach ilościowych opartych na MS, w tym możliwość znakowania izobarycznego i multipleksowania w połączeniu z rozległą chromatografią cieczową, a także postęp w oprzyrządowaniu, co pozwala na szybsze i dokładniejsze pomiary przy mniejszym zapotrzebowaniu na materiał próbki. Proteomika ilościowa stała się głównym nurtem podejścia do profilowania dziesiątek tysięcy białek i modyfikacji potranslacyjnych w wysoce złożonych próbkach biologicznych1,2,3,4,5,6.
Multipleksowane metody znakowania izobarycznego, takie jak znacznik izobaryczny do względnej i bezwzględnej oceny ilościowej (np. iTRAQ) oraz tandemowy znacznik masy (TMT) MS znacznie poprawiły przepustowość próbek i zwiększyły liczbę próbek, które mogą być analizowane w jednym eksperymencie1,6,7,8. Wraz z innymi metodami ilościowymi opartymi na MS, takimi jak kwantyfikacja bez znaczników i znakowanie stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej (tj. SILAC), potencjał tych technik w dziedzinie proteomiki jest znaczny9,10,11. Na przykład metoda TMT pozwala na analizę 10 próbek białek razem w 1 eksperymencie przy użyciu odczynników 10-plex. Te strukturalnie identyczne znaczniki TMT mają tę samą masę całkowitą, ale ciężkie izotopy są różnie rozmieszczone na atomach węgla lub azotu, co skutkuje unikalnym jonem reporterowym podczas fragmentacji MS/MS każdego znacznika, umożliwiając w ten sposób względną ocenę ilościową między 10 próbkami. Strategia TMT jest rutynowo stosowana do badania szlaków biologicznych, progresji choroby i procesów komórkowych12,13,14.
Znaczne ulepszenia techniczne ulepszyły systemy chromatografii cieczowej (LC) –MS/MS, zarówno pod względem separacji LC, jak i parametrów MS, aby zmaksymalizować identyfikację białek bez poświęcania dokładności ilościowej. Rozdzielanie peptydów w pierwszym wymiarze za pomocą techniki rozdzielania o wysokiej ortogonalności w stosunku do drugiego wymiaru ma kluczowe znaczenie w tego typu metodzie proteomiki typu shotgun w celu osiągnięcia maksymalnych wyników20. Chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami o wysokim pH (RPLC) zapewnia lepszą wydajność niż konwencjonalna chromatografia silnej kationowymienności20. Gdy RPLC o wysokim pH jest połączony z drugim wymiarem RPLC o niskim pH, poprawia się zarówno analityczny zakres dynamiczny, jak i pokrycie białek, co skutkuje możliwością identyfikacji większości wyrażonych białek podczas wykonywania analiz całego proteomu15,16,17,18. Inne osiągnięcia techniczne obejmują małe cząstki C18 (1,9 μm) i wydłużoną długą kolumnę (~1 m)19. Ponadto inne godne uwagi ulepszenia obejmują nowe wersje spektrometrów masowych z dużą szybkością skanowania, ulepszoną czułością i rozdzielczością20 oraz zaawansowane potoki bioinformatyczne do eksploracji danych MS21.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół, który zawiera najnowsze metodologie z modyfikacjami w celu poprawy zarówno czułości, jak i przepustowości, jednocześnie skupiając się na mechanizmach kontroli jakości podczas całego eksperymentu. Protokół obejmuje ekstrakcję i trawienie białek, znakowanie TMT 10-plex, frakcjonowanie RPLC zasadowego pH i kwaśnego pH, wykrywanie MS w wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie danych MS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Ponadto wdrażamy kilka etapów kontroli jakości w celu rozwiązywania problemów i oceny zmienności eksperymentalnej. Ten szczegółowy protokół ma na celu pomóc naukowcom początkującym w tej dziedzinie rutynowo identyfikować i dokładnie określać ilościowo tysiące białek z lizatu lub tkanki.

<table><tbody><tr><td>System 1220 LC</td><td>Agilent</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50% Hydroksyloamina</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>Grzejnik portfelowy motylkowy</td><td>Phoenix S& T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 Końcówki</td><td>Aparat Harvarda</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor frakcji</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Next Advance</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Burdick & Zestaw</td> do oznaczania białek Jackson <td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA</td><td>Spektrometr masowy Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>nanoflow UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>Żywica ReproSil-Pur C18, 1,9um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny samodzielne Pck</td><td>Nowy cel</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex Odczynnik do etykiet izobarycznych</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Applied Biosystems</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge Kolumna C18</td><td>kolumna Wody</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Wody</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Wiele wyjątkowych postępów zostało dokonanych w proteomice opartej na spektrometrii mas (MS), ze szczególnym postępem technicznym w chromatografii cieczowej (LC) połączonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) i zdolnością multipleksowania znakowania izobarycznego. W tym miejscu wprowadzamy protokół profilowania głębokiej proteomiki, który łączy znakowanie 10-pleksowym tandemowym znacznikiem masy (TMT) z rozbudowaną platformą LC/LC-MS/MS oraz korekcją interferencji obliczeniowej po MS w celu dokładnego ilościowego określenia całych proteomów. Protokół ten obejmuje następujące główne etapy: ekstrakcję i trawienie białek, znakowanie TMT, dwuwymiarowy (2D) LC, spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości i przetwarzanie danych obliczeniowych. Uwzględniono etapy kontroli jakości w celu rozwiązywania problemów i oceny zmienności eksperymentalnej. Za pomocą tego protokołu można z pewnością określić ilościowo ponad 10 000 białek w próbkach ssaków. Protokół ten można również zastosować do ilościowego oznaczania modyfikacji potranslacyjnych z niewielkimi zmianami. Ta multipleksowana, solidna metoda stanowi potężne narzędzie do analizy proteomicznej w różnych złożonych próbkach, w tym w hodowlach komórkowych, tkankach zwierzęcych i ludzkich próbkach klinicznych.

Użyliśmy wcześniej opisanej międzygatunkowej mieszaniny peptydów, aby systematycznie przeanalizować efekt kompresji stosunków w 3 głównych etapach protokołu, obejmujących frakcjonowanie przed-MS, ustawienia MS oraz korekcję po-MS23. Frakcjonowanie przed-MS zostało ocenione i zoptymalizowane przy użyciu kombinacji RPLC przy zasadowym pH oraz RPLC przy kwasowym pH. W analizie po-MS uwzględniono wyłącznie peptydy specyficzne dla gatunku. Wykorzystaliśmy ten model inte...

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zidentyfikowanie i dokładne określenie ilościowe ponad 10 000 białek z lizatu komórkowego lub tkankowego w różnych terapiach lekowych, przebiegach czasowych lub warunkach biologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny medycyny lub biologii, takie jak to, jakie białka zmieniają się w odpowiedzi na lek lub inny bodziec biologiczny. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma ona zdolność do dokładnego ilościowego określenia ponad 70% wyrażonego proteomu w 10 różnych warunkach eksperymentalnych.Implikacje tej technologii można rozszerzyć na diagnostykę chorób człowieka poprzez potencjalne odkrycie biomarkerów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ optymalna liza komórek i szacowanie płynów odgrywają kluczową rolę w dalszych procedurach trawienia, etykietowania i separacji. Aby rozpocząć ten protokół, uzyskaj hodowane komórki, które Cię interesują.Umyj komórki dwukrotnie, używając 10 mililitrów PBS do każdego prania. Zeskrob i zbierz umyte komórki w 1,5 mililitrowej probówce zawierającej jeden mililitr PBS. Wirować w temperaturze 600 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Usuń supernatant i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do lizy komórek. Zbierz i zważ żądane tkanki szybko po sekcji. Następnie natychmiast przechowuj je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Przygotować bufor do lizy w dniu eksperymentu, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj bufor do lizy do zamrożonej próbki tak, aby stosunek buforu do próbki wynosił 10 do jednego, a końcowe stężenie białka wynosiło od pięciu do 10 miligramów na mililitr. Następnie dodaj szklane kulki i za pomocą blendera zmiksuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przyspiesz do ośmiu, miksując przez 30 sekund, a następnie odpoczywając przez pięć sekund, powtarzając to pięć razy lub do momentu, gdy próbki zostaną zhomogenizowane.Zmierzyć stężenie białka za pomocą standardowego testu ilościowego białka lub barwionego Coomassie żelu poliakrylamidowego SDS z BSA jako wzorcem. Następnie dodaj 100% acetonitrylu tak, aby końcowe stężenie wynosiło 10%, a proteaza Lys-C miała stosunek enzymu do substratu od jednego do 100. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby umożliwić trawienie białka.Następnie dodaj DTT tak, aby końcowe stężenie wynosiło jeden milimol. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie dodaj 50 milimolowych HEPES, aż stężenie mocznika w próbkach zostanie rozcieńczone do dwóch molowców.Dodaj trypsynę do każdej próbki w stosunku trypsyny do białka od jednego do 50. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny. Następnie dodawaj DTT, aż jego stężenie ponownie wyniesie jeden milimol i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Dodaj jodoacetamid tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 10 milimolów. Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy schłodzić nieprzereagowany jodoacetamid, dodając DTT tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 30 milimolów.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Sprawdź skuteczność trawienia trypsyny zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj TFA do każdej próbki tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1%Za pomocą paska pH zmierz pH każdej próbki, aby sprawdzić, czy wynosi od dwóch do trzech.W razie potrzeby dodaj więcej TFA kroplami, aby osiągnąć niedopuszczalne pH. Odwirować próbki w temperaturze 20 000 g i temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zebrać supernatant i załadować próbki do przygotowanych kolumn wirowych.Wirować w temperaturze 100 razy g przez trzy minuty lub do momentu, gdy próbka całkowicie przejdzie przez kolumnę w celu związania próbek. Następnie dodaj 0,5 mililitra 0,1% TFA do każdej kolumny. Wirować 500 razy g przez 30 sekund.Następnie dodać 125 mikrolitrów roztworu zawierającego 60% acetonitrylu i 0,1 TFA do każdej kolumny. Wirować przy 100 razy g przez trzy minuty, aby wymyć peptydy z kolumny. Rozpuść każdą odsoloną próbkę peptydu w 50 mikrolitrach 50-milimolowego HEPES.Za pomocą paska pH sprawdź, czy pH każdej próbki wynosi od siedmiu do ośmiu. Następnie rozpuść odczynniki TMT w bezwodnym acetonitrylu, dodaj je do próbek, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie użyj 10 mikrolitrowych końcówek pipet osadzonych w pożywce chromatograficznej, aby odsolić jeden mikrogram każdej próbki i przeanalizować skuteczność etykietowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Zbadaj od sześciu do 10 oddzielnych peptydów, aby upewnić się, że nieznakowane peptydy nie zostaną wykryte w znakowanych próbkach. Następnie wymieszaj ze sobą około dwóch mikrolitrów każdej próbki. Użyj 10 mikrolitrowych końcówek do pipet osadzonych w pożywce chromatograficznej, aby odsolić tę mieszaninę.Analizować próbki za pomocą LC-MS/MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na początek rozpuść odsoloną zbiorczą próbkę peptydu znakowaną TMT w 65 mikrolitrach buforu A. Użyj paska pH, aby sprawdzić, czy pH wynosi około 8,0. Jeśli próbka jest nadal kwaśna, użyj wodorotlenku amonu, aby w razie potrzeby dostosować pH.Następnie należy frakcjonować próbkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ustaw kolektor frakcji tak, aby zbierał ułamki co dwie minuty, łącznie z czasem ładowania. Ustaw natężenie przepływu na 0,4 mililitra na minutę.Zbierz w sumie 80 frakcji. Następnie użyj koncentratora próżniowego, aby całkowicie wysuszyć co drugą próbkę. Za pomocą LC-MS/MS przeanalizuj wszystkie 80 frakcji, aby uzyskać ultra głębokie pokrycie proteomu.Najpierw zapakuj żywicę C18 o wielkości 1,9 mikrometra do pustych kolumn o średnicy wewnętrznej 75 mikrometrów, osiągając objętość złoża około 1,3 mikrolitra. Zwiń kolumnę dwa do trzech razy wewnątrz grzejnika motylkowego, aby upewnić się, że cała długość jest podgrzana. Przyklej kolumnę do wnętrza grzejnika, uważając, aby nie zakleić czujnika temperatury grzejnika.Następnie podgrzej kolumnę do 65 stopni Celsjusza. Przepuść 100 nanogramów peptydów mózgu szczura przez system LC-MS/MS, aby ocenić jakość systemu. Powtórz tę ocenę jeszcze raz.Następnie załaduj około 0,2 mikrograma odtworzonych peptydów na kolumnę, przepływając 5% bufor A.Usuń peptydy z kolumny i przeanalizuj za pomocą spektrometru mas, jak opisano w protokole tekstowym. W niniejszej pracy opisano wysokoprzepustową metodę oznaczania ilościowego białek ze strategią znakowania izobarycznego 10-plex. Skuteczność etykietowania TMT jest badana za pomocą LC-MS/MS do analizy próbek znakowanych TMT i odpowiadających im próbek nieoznakowanych.Jak widać, nieznakowany pik peptydu znajduje się tylko w nieznakowanej próbce, podczas gdy pik peptydu znakowany TMT znajduje się tylko w znakowanej próbce. Następnie oceniany jest wpływ okna izolacji MS2 na zakłócenia. Wszystkie skanowania MS2 są oznaczone jako czyste lub zaszumione.Podczas gdy czyste skany wykazują jony y1 tylko lizyny, hałaśliwe skany wykazują je zarówno w lizynie, jak i argininie. Reprezentatywne usuwanie zakłóceń za pomocą peptydów E.coli indywidualnie znakowanych trzema różnymi odczynnikami TMT pokazano tutaj. Zsumowane względne intensywności pokazują, że poprawka oparta na jonach y1 jest dokładniejsza w przypadku kwantyfikacji opartej na TMT.Po opanowaniu protokół ten można ukończyć w ciągu czterech do pięciu tygodni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie etapy kontroli jakości zostały wykonane w całości, aby zapewnić, że końcowy zestaw danych jest tak dokładny, jak to tylko możliwe. Dostosowanie tej procedury w celu skupienia się na modyfikacjach potranslacyjnych może odpowiedzieć na inne pytania, takie jak to, jak zmienia się ubikwitynacja, fosforylacja lub acetylacja w odpowiedzi na postęp choroby lub leczenie farmakologiczne.Po jej opracowaniu technologia utorowała drogę naukowcom zajmującym się produktami do badania zmian białkowych w komórkach i tkankach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś bardzo dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować i dokładnie określić ilościowo ponad 10 000 białek z komórki lub tkanki ssaka. Nie zapominaj, że praca z wysokociśnieniowym UPLC i kilkoma kolumnami krzemionkowymi może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaczęliśmy zajmować się znanym problemem kompresji proporcji, który występuje w znakowaniu izobarycznym. Zdaliśmy sobie sprawę, że ekstensywna frakcjonowanie jest świetnym sposobem nie tylko na złagodzenie tego problemu, ale także na zwiększenie identyfikacji białek i peptydów, które mogą jeszcze bardziej zwiększyć i dostosować się do analizy proteomu.

deep-proteome-profiling-isobaric-labeling-extensive-liquid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Prezentujemy zoptymalizowany protokół etykietowania tandemowego znacznika masy (TMT), który zawiera szczegółowe informacje dla każdego z następujących etapów: ekstrakcja białka, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie, etykietowanie, przesyłanie do ośrodka proteomicznego i analiza danych.

Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

Poznaj metodę głębokiego profilowania proteomu z wykorzystaniem znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. Technika umożliwia ilościowe określenie ponad 10 000 białek z różnych próbek biologicznych.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo (Wideo) | JoVE Journal

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Przeglądaj więcej filmów