Name: Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Poznaj analizę transkryptomu RNA-seq do badania interakcji gospodarz-patogen z użyciem Dockera i narzędzi internetowych. Pipeline obejmuje kontrolę jakości, mapowanie, analizę różnicową i wzbogacenie funkcjonalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HN jest finansowany przez FAPESP (numery grantów: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 i 2013/08216-2) oraz CNPq (313662/2017-7).
Jesteśmy szczególnie wdzięczni następującym grantom dla stypendystów: ANAG (Proces FAPESP 2019/13880-5), VEM (Proces FAPESP 2019/16418-0), IMSC (Proces FAPESP 2020/05284-0), APV (Proces FAPESP 2019/27146-1) oraz, RLTO (Proces CNPq 134204/2019-0).

<ol><li>Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika%2C+Chikungunya%2C+and+Other+Emerging+Vector-Borne+Viral+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases.</a> Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).</li>
<li>Burt, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus%3A+an+update+on+the+biology+and+pathogenesis+of+this+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).</li>
<li>Hua, C., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus-associated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reports%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus-associated disease.</a> Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69(2017).</li>
<li>Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -C., Gasque, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthritogenic+alphaviruses-an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Arthritogenic alphaviruses-an overview.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).</li>
<li>Nakaya, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+of+chikungunya+virus+arthritis+in+a+mouse+model+reveals+significant+overlap+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).</li>
<li>Michlmayr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+innate+immune+profiling+of+chikungunya+virus+infection+in+pediatric+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases.</a> Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862(2018).</li>
<li>Soares-Schanoski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+analysis+of+subjects+acutely+infected+with+the+Chikungunya+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880(2019).</li>
<li>Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+genomic+and+subgenomic+RNAs+in+diagnostic+samples+are+not+an+indicator+of+active+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication.</a> Nature Communications. 11 (1), 6059(2020).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SARS-CoV-2+subgenome+landscape+and+its+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features.</a> Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).</li>
<li>Wilson, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+of+chikungunya+virus+infection+and+identification+of+granzyme+A+as+a+major+promoter+of+arthritic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation.</a> PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155(2017).</li>
<li>Gonçalves, A. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+impact+of+sample+heterogeneity+on+transcriptome+analysis+of+human+diseases+using+MDP+webtool%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool.</a> Frontiers in Genetics. 10, 971(2019).</li>
<li>Russo, P. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEMiTool%3A+a+Bioconductor+package+for+performing+comprehensive+modular+co-expression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 56(2018).</li>
<li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+differential+expression+analysis%3A+An+extended+review+and+a+software+tool%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12 (12), 0190152(2017).</li>
<li>Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+software+packages+for+detecting+differential+expression+in+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).</li>
<li>Zhang, B., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+framework+for+weighted+gene+co-expression+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Applications+in+Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A general framework for weighted gene co-expression network analysis.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, Article17 (2005).</li>
<li>Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+CEMiTool+for+gene+co-expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data.</a> Computers in Biology and Medicine. 125, 103975(2020).</li>
<li>Cardozo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((webCEMiTool%3A+Co-expression+modular+analysis+made+easy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy.</a> Frontiers in Genetics. 10, 146(2019).</li>
<li>de Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+are+involved+in+multiple+immunological+pathways+in+response+to+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).</li>
<li>Prada-Medina, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+immunology+of+diabetes-tuberculosis+comorbidity+reveals+signatures+of+disease+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1999(2017).</li>
<li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+interactive+and+collaborative+HTML5+gene+list+enrichment+analysis+tool%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.</a> BMC Bioinformatics. 14, 128(2013).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).</li>
<li>Raudvere, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((g%3AProfiler%3A+a+web+server+for+functional+enrichment+analysis+and+conversions+of+gene+lists+%282019+update%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update).</a> Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).</li>
<li>Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology+analysis+for+RNA-seq%3A+accounting+for+selection+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias.</a> Genome Biology. 11 (2), 14(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie bibliotek sekwencjonowania jest kluczowym krokiem w kierunku jak najlepszego odpowiedzi na pytania biologiczne. Rodzaj transkrypcji będących przedmiotem zainteresowania badania wskaże, jaki rodzaj biblioteki sekwencjonowania zostanie wybrany, i będzie napędzał analizy bioinformatyczne. Na przykład na podstawie sekwencjonowania interakcji patogenu i gospodarza, w zależności od rodzaju sekwencjonowania, możliwe jest zidentyfikowanie sekwencji z obu lub tylko z transkryptów gospodarza.
<p class="jove_conte...

Arbowirusy, takie jak denga, żółta febra, chikungunya i zika, były szeroko kojarzone z kilkoma endemicznymi epidemiami i stały się jednym z głównych patogenów odpowiedzialnych za infekowanie ludzi w ostatnich dziesięcioleciach1,2. Osoby zakażone wirusem chikungunya (CHIKV) często mają gorączkę, ból głowy, wysypkę, wielostawowość i zapalenie stawów3,4,5. Wirusy mogą zaburzać ekspresję genów w komórce i wpływać na różne szlaki sygnałowe gospodarza. Ostatnio w badaniach transkryptomu krwi wykorzystano sekwencję RNA do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) związanych z ostrym zakażeniem CHIKV w porównaniu z rekonwalescencją6 lub zdrowymi grupą kontrolną7. Dzieci zakażone CHIKV miały podwyższoną regulację genów, które są zaangażowane w wrodzoną odporność, takich jak te związane z czujnikami komórkowymi wirusowego RNA, sygnalizacją JAK/STAT i szlakami sygnałowymi receptorów toll-podobnych6. Dorośli z ostrym zakażeniem CHIKV wykazywali również indukcję genów związanych z odpornością wrodzoną, takich jak te związane z monocytami i aktywacją komórek dendrytycznych oraz z odpowiedziami przeciwwirusowymi7. Szlaki sygnałowe wzbogacone o geny regulowane w dół obejmowały te związane z odpornością adaptacyjną, takie jak aktywacja i różnicowanie limfocytów T oraz wzbogacanie w komórkach T i B7.
Do analizy danych transkryptomu genów gospodarza i patogenu można użyć kilku metod. Często przygotowanie biblioteki sekwencyjnej RNA rozpoczyna się od wzbogacenia dojrzałych transkryptów poli-A. Ten etap usuwa większość rybosomalnego RNA (rRNA), a w niektórych przypadkach wirusowe/bakteryjne RNA. Jednakże, gdy kwestia biologiczna obejmuje wykrywanie transkryptów patogenu, a RNA jest sekwencjonowane niezależnie od poprzedniej selekcji, wiele innych różnych transkryptów można wykryć przez sekwencjonowanie. Na przykład wykazano, że subgenomowe mRNA są ważnym czynnikiem weryfikującym nasilenie chorób8. Ponadto w przypadku niektórych wirusów, takich jak CHIKV i SARS-CoV-2, nawet biblioteki wzbogacone o poli-A generują odczyty wirusów, które można wykorzystać w dalszych analizach9,10. Koncentrując się na analizie transkryptomu gospodarza, naukowcy mogą badać zakłócenia biologiczne w próbkach, identyfikować geny o zróżnicowanej ekspresji i wzbogacone szlaki oraz generować moduły koekspresji7,11,12. Protokół ten podkreśla analizy transkryptomu pacjentów zakażonych CHIKV i osób zdrowych przy użyciu różnych podejść bioinformatycznych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Do uzyskania reprezentatywnych wyników wykorzystano dane z wcześniej opublikowanego badania7 składającego się z 20 zdrowych i 39 osób z ostrym zakażeniem CHIKV.

<table><tbody><tr><td>CEMiTool</td><td>Computational Systems Biology Laboratory</td><td>1.12.2</td><td>Odkrywanie i analiza modułów genów koekspresji w sposób w pełni automatyczny, przy jednoczesnym dostarczaniu przyjaznego dla użytkownika raportu HTML z wysokiej jakości wykresami.</td></tr><tr><td></td><td>EdgeR Bioconductor (Opiekun: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])</td><td>3.30.3</td><td>Różnicowa analiza ekspresji profili ekspresji RNA-seq z replikacją biologiczną</td></tr><tr><td>EnhancedVolcano</td><td>Bioconductor (Opiekun: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])</td><td>1.6.0</td><td>Gotowe do publikacji wykresy wulkaniczne z ulepszonym kolorowaniem i etykietowaniem</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>Babraham Bioinformatics</td><td>0.11.9</td><td>Ma na celu zapewnienie prostego sposobu przeprowadzania kontroli jakości surowych danych sekwencyjnych pochodzących z sekwencjonowania o wysokiej przepustowości</td></tr><tr><td>FeatureCounts</td><td>Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research</td><td>2.0.0</td><td>Przypisywanie zmapowanych odczytów sekwencjonowania do określonych cech genomowych</td></tr><tr><td>MDP</td><td>Computational Systems Biology Laboratory</td><td>1.8.0</td><td>Molekularny stopień perturbacji oblicza wyniki dla próbek danych transkryptomu na podstawie ich perturbacji z kontroli</td></tr><tr><td>R</td><td>R Core Group</td><td>4.0.3</td><td>Język programowania i środowisko wolnego oprogramowania do obliczeń statystycznych i grafiki</td></tr><tr><td>Zakład Bioinformatyki STAR</td><td>, Instytut Badań Medycznych Waltera i Elizy Hall</td><td>2.7.6a</td><td>Aligner zaprojektowany, aby sprostać wielu wyzwaniom związanym z mapowaniem danych sekwencyjnych RNA przy użyciu strategii uwzględniania dopasowań splicingów</td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>Uniwersytet Johnsa Hopkinsa</td><td>2.4.2</td><td>Ultraszybkie i wydajne pod względem pamięci narzędzie do wyrównywania odczytów sekwencjonowania do długich sekwencji referencyjnych</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td>THE USADEL LAB</td><td>0.39</td><td>Przycinanie zadań sekwencji adaptera dla sparowanych i pojedynczych danych Illumina</td></tr><tr><td>Pobierz Docker</td><td>Docker</td><td>20.10.2</td><td>Tworzenie środowiska bioinformatycznego powtarzalnego i przewidywalnego (https://docs.docker.com/get-docker/)</td></tr><tr><td>WSL2-Kernel</td><td>Windows</td><td>NA</td><td>https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel</td></tr><tr><td>Pobierz Docker Linux</td><td>Docker</td><td>NA</td><td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/</td></tr> <tr><td>Repozytorium Docker Linux</td><td>Docker</td><td>NA</td><td>https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository</td></tr><tr><td>Strona internetowa MDP</td><td>Laboratorium Biologii Systemów Obliczeniowych</td><td>NA</td><td>https://mdp.sysbio.tools</td></tr><tr><td>Enrichr Strona internetowa</td><td>MaayanLab</td><td>NA</td><td>https://maayanlab.cloud/Enrichr/</td></tr> <tr><td>webCEMiTool</td><td>Laboratorium Biologii Systemów Obliczeniowych</td><td>NA</td><td>https://cemitool.sysbio.tools/</td></tr> <tr><td>gProfiler</td><td>Grupa Bioinformatyki, Algorytmiki i Eksploracji Danych</td><td>NA</td><td>https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost</td></tr><tr><td>goseq</td><td>Bioconductor (Opiekun: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])</td><td>NA</td><td>http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html</td></tr><tr><td>Badanie NCBI</td><td>NCBI NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Patogeny mogą powodować wiele różnych chorób zakaźnych. Procesy biologiczne wywołane przez gospodarza w odpowiedzi na zakażenie określają nasilenie choroby. Aby zbadać takie procesy, naukowcy mogą wykorzystać techniki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (sekwencje RNA), które mierzą dynamiczne zmiany transkryptomu gospodarza na różnych etapach infekcji, wyniki kliniczne lub ciężkość choroby. Badanie to może prowadzić do lepszego zrozumienia chorób, a także do odkrycia potencjalnych celów leków i metod leczenia. Przedstawiony tutaj protokół opisuje kompletny potok do analizy danych sekwencjonowania RNA od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej. Pipeline jest podzielony na pięć etapów: (1) kontrola jakości danych; (2) mapowanie i adnotacja genów; (3) analiza statystyczna w celu identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji i genów o współekspresji; (4) określenie stopnia molekularnego zaburzeń próbek; oraz (5) analiza funkcjonalna. Krok 1 usuwa artefakty techniczne, które mogą mieć wpływ na jakość dalszych analiz. W kroku 2 geny są mapowane i opisywane zgodnie ze standardowymi protokołami bibliotecznymi. Analiza statystyczna w kroku 3 identyfikuje geny, które są różnie wyrażane lub współeksprymowane w zakażonych próbkach w porównaniu z genami niezakażonymi. Zmienność próbki i obecność potencjalnych biologicznych wartości odstających są weryfikowane przy użyciu podejścia molekularnego stopnia perturbacji w kroku 4. Wreszcie, analiza funkcjonalna w kroku 5 ujawnia szlaki związane z fenotypem choroby. Przedstawiona linia produkcyjna ma na celu wsparcie naukowców w analizie danych sekwencyjnych RNA z badań interakcji gospodarz-patogen oraz napędzanie przyszłych eksperymentów in vitro lub in vivo, które są niezbędne do zrozumienia molekularnego mechanizmu infekcji.

Środowisko obliczeniowe do analiz transkryptomu zostało utworzone i skonfigurowane na platformie Docker. Takie podejście pozwala początkującym użytkownikom systemu Linux korzystać z terminala bez uprzedniej wiedzy z zakresu zarządzania systemem. Platforma Docker wykorzystuje zasoby systemu operacyjnego gospodarza do utworzenia kontenera usług, który zawiera specyficzne narzędzia użytkownika (Rysunek 1B). Utworzono kontener oparty na dystrybucji systemu Linux Ubuntu 20.04, który został w pełn...

Protokół przedstawiony tutaj opisuje kompletny potok do analizy danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej, w tym etapy kontroli jakości i wstępnego przetwarzania do zaawansowanych metod analizy statystycznej.

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Witamy w protokole wysokoprzepustowej analizy transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen. Ten protokół jest podzielony na następujące kroki. Kontrola jakości w celu filtrowania odczytów o niskiej jakości, a także usuwania sekwencji adapterów Sekwencjonowanie i adnotacje, gdzie musisz zmapować odczyty do genomów referencyjnych i dodać adnotacje do odczytów w genach.Analiza statystyczna i koekspresji, która definiuje geny o zróżnicowanej ekspresji, a także znajduje moduły koekspresji. Molekularna analiza stopnia perturbacji w celu znalezienia potencjalnych próbek odstających. I wreszcie analiza funkcjonalna w celu określenia funkcji biologicznych genów o zróżnicowanej ekspresji.Wszystkie narzędzia wykorzystujące te potoki zostały wstępnie zainstalowane w systemie Linux i zamknięte w kontenerze Docker. Próbki wykorzystujące te protokoły pochodzą z artykułu opublikowanego przez naszą grupę w PLOS Pathogen. Próbki pochodzą od 20 zdrowych osób i 39 pacjentów zakażonych wirusem Chikungunya.Pobrano próbki krwi i przeprowadzono sekwencjonowanie RNA. Aby zainstalować Dockera w systemie Windows, musisz wykonać następujące kroki. Przejdź do oficjalnej strony internetowej Dockera i kliknij Rozpocznij.Znajdź instalatora programu Docker Desktop dla systemu Windows. Pobierz plik. Zainstaluj lokalnie na swoim komputerze.Upewnij się, że te dwie opcje są zaznaczone. Po zainstalowaniu programu pobiera obraz Dockera dla tego protokołu. Przejdź do terminala Windows.Wykonaj polecenia, aby pobrać obraz. Po pobraniu obrazu możemy zobaczyć plik w pulpicie Dockera i z tego obrazu możemy zainicjować kontener. Po kliknięciu okrągłego przycisku należy rozwinąć oryginalne parametry i opcje, aby zdefiniować nazwę kontenera i skojarzyć folder na komputerze lokalnym z folderem wewnątrz Dockera.Następnie kliknij przycisk Uruchom, aby zainicjować kontener. Następnie możesz uzyskać dostęp do terminala, który znajduje się w systemie Linux wewnątrz Dockera. Wpisz polecenia bash, a następnie możesz wykonać wszystkie polecenia tego protokołu.Najpierw musimy uruchomić źródło, aby udostępnić wszystkie narzędzia tego protokołu. Powinieneś uzyskać dostęp do skryptów katalogu. Aby przeprowadzić analizę transkryptomiczną, należy najpierw pobrać genom referencyjny.W tym celu musisz wykonać następujące polecenia. Po pobraniu genomu należy pobrać adnotację genów. Aby to zrobić, musisz wpisać następujące polecenia.Następnie musisz skonfigurować fastq-dump. Umożliwia to pobranie plików sekwencjonowania przykładów. Po wpisaniu poniższych poleceń musisz użyć przycisku Tab, aby przejść do opcji Narzędzia i zaznaczyć katalog opcji currents.Użyj przycisków Tab, aby zapisać, a następnie kliknij przycisk OK. A następnie wyjdź z narzędzia fastq-dump. Teraz możemy zainicjować pobieranie odczytów, wpisując następujące polecenia.Kontrola jakości polega na graficznej ocenie prawdopodobieństwa wystąpienia błędów w odczytach sekwencyjnych. Na tym etapie musisz również usunąć sekwencje techniczne, takie jak adaptery. Aby wygenerować wykresy kontroli jakości, musisz uruchomić program FastQC.Aby usunąć sekwencje adapterów i sekwencje o niskiej jakości, musisz wpisać następujące polecenia. Dzięki dobrej jakości odczytom musimy teraz zmapować odczyty do genomu referencyjnego. Po mapowaniu będziemy musieli oznaczyć geny zgodnie z ludzkimi genami, a następnie policzyć liczbę odczytów, które pasują do każdego ludzkiego genu.Pierwszym krokiem jest zindeksowanie genomu referencyjnego poprzez wpisanie następującego polecenia. A następnie wpisujemy te polecenia, aby zmapować odczyty do ludzkiego genomu. Następnie należy uruchomić skrypty, które dodają adnotacje do odczytów.Po mapowaniu i adnotacji można przeprowadzić analizę ekspresji różnicowej, która polega na znalezieniu genów, których ekspresja jest wyższa lub niższa w jednej grupie w porównaniu z inną. Aby zidentyfikować geny o zróżnicowanej ekspresji lub DEG, musisz uruchomić następujące polecenia. Następnie możesz przenieść wyniki danych z platformy Docker na komputer lokalny.W tym celu przejdź do terminala i wpisz następujące polecenia, aby zapisać wszystkie wyniki w folderze lokalnym. Aby przeprowadzić pozostałą analizę, należy również skopiować wszystkie pliki danych katalogu do katalogu na komputerze lokalnym. Na komputerze lokalnym będzie można zobaczyć katalogi, w których zapisano dane z platformy Docker.Jak widać, możesz uzyskać dostęp do wszystkich bibliotek. Można również otworzyć plik HTML zawierający raporty z kontroli jakości. Możesz również uzyskać dostęp do katalogu zawierającego geny o zróżnicowanej ekspresji.A w tym katalogu znajdziesz wykresy wulkanów, na których możesz zobaczyć geny, które są regulowane w górę lub w dół w jednej grupie w porównaniu z drugą, w tym przypadku pacjenci zakażeni wirusem Chikungunya w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Wszystkie pozostałe kroki tego protokołu zostaną wykonane w narzędziach internetowych za pomocą przeglądarki. Zacznijmy najpierw od CEMiTool.Przejdź do przeglądarki i wpisz następujący adres. CEMiTool identyfikuje moduły koekspresji ze zbiorów danych wyrażeń dostarczonych przez użytkowników. Na stronie głównej możesz przejść do menu i kliknąć w przycisk Uruchom.Spowoduje to otwarcie nowej strony, na której możesz przesłać plik wyrażenia. Ten plik znajduje się w katalogu danych komputera lokalnego. Zobaczysz, że istnieją trzy pliki wyrażeń, a ten, którego zamierzamy użyć dla CEMiTool, to wywołanie normalizacji tmm.Następnie musisz wybrać plik z fenodanymi, to samo dotyczy pliku zawierającego interakcje białko-białko, a na końcu przesłać plik zawierający zestawy genów lub szlaki. Plik zestawów genów umożliwia CEMiTool przeprowadzenie analizy wzbogacenia dla każdego z modułów koekspresji. Następnie należy rozwinąć sekcję parametrów i kliknąć Zastosuj VST.Następnie możesz po prostu kliknąć Uruchom CEMiTool. Po uruchomieniu CEMiTool zobaczysz, że zidentyfikowano 12 modułów koekspresji. Klikając tutaj, możesz pobrać wszystkie wyniki tych analiz.Innym narzędziem, które zamierzamy wykorzystać w tym protokole, jest MDP, czyli molekularny stopień perturbacji. Wystarczy, że wpiszesz w przeglądarce mdp.sysbio.tools. MDP oblicza odległość molekularną każdej próbki w porównaniu z grupą referencyjną próbek, w tym przypadku zdrowymi osobami z grupy kontrolnej, w celu znalezienia nie tylko potencjalnych wartości odstających, ale także tego, jak zaburzone są każda próbka w porównaniu z tą grupą.Na stronie Uruchom możesz po prostu przekazać plik wyrażenia, klikając przycisk i wybierając plik. Następnie musisz przesłać plik phenodata. Następnie należy określić, która kolumna zawiera informacje o grupie lub klasie, a następnie, która klasa lub grupa odpowiada grupie kontrolnej.Następnie możesz po prostu uruchomić MDP. Wykres słupkowy pokazuje dla każdej z próbek jako słupek wynik molekularnego stopnia perturbacji, a kolory reprezentują różne grupy. Wykres pudełkowy to kolejny sposób wizualizacji tych samych wyników, w którym na każdej kropce widać różne próbki oddzielone dwiema grupami.Do przeprowadzenia analizy funkcjonalnej wykorzystamy narzędzie Enrichr. W tym celu musisz wybrać listę genów, które uległy zróżnicowanej ekspresji, regulowanej w górę lub w dół, i użyć jej jako listy genów wejściowych w narzędziu Enrichr. Zobaczysz, że są różne zakładki.Wszystkie wyniki można również pobrać na komputer lokalny. Środowisko komputerowe do analizy transkryptomu zostało umieszczone na platformie Docker. Takie podejście pozwala użytkownikom bez wcześniejszego doświadczenia z systemem Linux na korzystanie z terminala.W tym kontenerze znajduje się predefiniowana struktura folderów dla zestawu danych i skryptów, które są niezbędne do całej analizy. W ramach przygotowań użytkownicy będą wykorzystywać dane transkryptomu krwi od 20 zdrowych osób i 39 pacjentów ostro zakażonych wirusem Chikungunya. Platforma sekwencjonowania zwraca zestaw plików FASTQ zawierających sekwencję DNA, tj. odczyty i powiązaną jakość dla każdej zasady nukleotydowej. Skala jakości Phred wskazuje prawdopodobieństwo nieprawidłowego odczytu dla każdej zasady. Narzędzia identyfikują i usuwają odczyty o niskiej jakości z próbek oraz zwiększają prawdopodobieństwo mapowania odczytów.Na tym etapie moduł mapowania, odzyskane odczyty wysokiej jakości są wykorzystywane jako dane wejściowe w celu dopasowania ich do ludzkiego genomu referencyjnego. CEMiTool identyfikuje i analizuje moduły koekspresji. Geny w tym samym module ulegają koekspresji, co oznacza, że wykazują podobne wzorce ekspresji w próbkach zestawów danych.Analiza sieci dostarcza informacji o najbardziej połączonych genach, czyli hubach. Nazwy tych genów są pokazane w sieci.Rozmiar węzłów jest proporcjonalny do stopnia ich łączności. Wyniki uzyskane z analizy DEG podsumowano na wykresach wulkanicznych. Analiza molekularnego stopnia perturbacji pozwala na identyfikację zaburzonych próbek od osób zdrowych i zakażonych.MDP sugeruje, które próbki są potencjalnymi biologicznymi wartościami odstającymi. Usunięcie tych próbek będzie miało wpływ na dalsze wyniki. Funkcjonalną analizę wzbogacenia za pomocą AURA można przeprowadzić za pomocą narzędzia Enrichr.Kroki te pomagają zinterpretować wyniki, ujawniając wspólne role funkcjonalne kilku genów, które uległy zróżnicowanej ekspresji. Proces biologiczny pokazany na wykresach słupkowych to 10 najbardziej wzbogaconych zestawów genów na podstawie ich rankingu wartości p. Podsumowując, protokoły te obejmują wszystkie etapy analizy sekwencyjnej RNA.Rurociąg został opracowany i zamknięty w niekomercyjnym systemie o nazwie Docker. Na obrazie i udostępnione środowisku naukowemu. Ze względu na system kontenerów, wszystkie skrypty i narzędzia są objęte tą samą konkretną wersją, aby zagwarantować odtwarzalność.Co więcej, część analizy bioinformatycznej została przeprowadzona za pomocą bezpłatnych, przyjaznych dla użytkownika narzędzi internetowych.

high-throughput-transcriptome-analysis-for-investigating-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Wykrywanie interakcji patogenów gospodarz-bakteria na podstawie przestrzegania fenotypu za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego wraz z automatycznymi metodami analizy statystycznej umożliwia szybką ocenę potencjalnych interakcji bakteryjnych z komórkami gospodarza.

Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza

Przesłany tutaj protokół wyjaśnia kompletny proces in silico potrzebny do przewidywania i funkcjonalnego charakteryzowania circRNA na podstawie danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, badających interakcje gospodarz-patogen.

In Silico Identyfikacja i charakterystyka circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Poznaj analizę transkryptomu RNA-seq do badania interakcji gospodarz-patogen z użyciem Dockera i narzędzi internetowych. Pipeline obejmuje kontrolę jakości, mapowanie, analizę różnicową i wzbogacenie funkcjonalne.

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

Przeglądaj więcej filmów