Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Opracowaliśmy uproszczoną metodę badania proteomu w określonych regionach wyższych próbek tkanek za pomocą spektrometrii mas. Naszym celem jest ulepszenie techniki proteomicznej, w tym przygotowania próbek i analizy spektrometrii mas, w celu osiągnięcia wysokiej dokładności i niezawodności. Jednym z wyzwań w proteomice przestrzennej opartej na FFPE jest niepełne trawienie białek, co zmniejsza ogólne pokrycie białkami.

Pokonanie tych problemów wymaga zoptymalizowanych protokołów trawienia i ulepszonych strategii spektrometrii mas w celu poprawy głębokości i dokładności proteomu. Zidentyfikowaliśmy wyraźne zmiany białek w różnych typach chorób trzustki, zapewniając wgląd w różnice między stanami łagodnymi i przedrakowymi. Odkrycia te mogą pomóc we wczesnej diagnozie raka trzustki.

Naszym celem jest udoskonalenie metody proteinazy u pacjentów, aby uzyskać mapowanie białek w wysokiej rozdzielczości w regionach tkanki. Wykorzystując proteomikę opartą na spektrometrii mas, staramy się zidentyfikować specyficzne dla regionu sygnatury molekularne, które przyczyniają się do odkrycia biomarkerów. Nasze podejście integruje te pułapki pacjentów i wstępne przygotowanie z niezależną od danych spektrometrią mas w celu szybkiego generowania wysokiej jakości danych proteomu z wybranych regionów tkanek FFPE.

Metoda ta umożliwia doskonałe ilościowe określenie proteomu przestrzennego. Na początek przygotuj szkiełko tkankowe barwione hematoksyliną i eozyną lub barwione immunohistochemicznie z obszarem zainteresowania wskazanym przez patologa. Umieść niezabarwione szkiełko tkankowe, a barwioną tkankę przesuń się z powrotem do tyłu, zapewniając prawidłowe wyrównanie.

Za pomocą skalpela usuń obszary tkanki, które nie są interesujące i zeskrob interesujące obszary tkanki w kierunku środka szkiełka. Przenieś pobraną tkankę do czystej 1,5 mililitrowej probówki o niskiej zawartości białek i dodaj 180 mikrolitrów buforu do lizy SDS do każdej probówki. Wykonaj sonizację sondy przy amplitudzie 20% przez 10 cykli po pięć sekund włączenia i pięciu sekund wyłączenia.

Teraz inkubuj próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 3,5 godziny, utrzymując prędkość 1 000 G. Po inkubacji pozwól próbce ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odwirować przy 16 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia resztek tkanek od supernatantu. Zebrać supernatant do czystej, oznakowanej probówki i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.

W przypadku wytrącania acetonu należy umieścić próbkę białka odpowiadającą 100 do 300 mikrogramom w probówce kompatybilnej z acetonem. Następnie dodaj lodowaty aceton, wstępnie schłodzony do minus 20 stopni Celsjusza, w objętości pięciokrotnie większej niż objętość próbki. Inkubować mieszaninę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 18 godzin.

Po inkubacji odwirować probówkę o stężeniu 16 000 G przez 15 minut. Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem, nie naruszając osadu białkowego. Dodaj 500 mikrolitrów acetonu zahartowanego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i odwiruj.

Po zdekantacji supernatantu wysuszyć próbkę na powietrzu. Przygotować bufor do lizy zatrzymujący zawiesinę w wodzie dejonizowanej. Następnie dodaj 40 mikrolitrów przygotowanego buforu do probówki z próbką i dokładnie zwiruj, aby rozpuścić wysuszone na powietrzu osadki białkowe.

Umieścić próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 100 stopni Celsjusza i 1 000 G na 35 minut. Następnie dodać 10 mikrolitrów odczynnika alkilującego do próbki i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przy 300 G przez jedną godzinę. Wewnątrz dygestorium chemicznego dodaj pięć mikrolitrów 10% kwasu trichlorooctowego do próbki, co daje całkowitą objętość 55 mikrolitrów.

Sprawdź pH próbki za pomocą bibuły pH, aby upewnić się, że jest mniejsze niż jeden. Następnie dodaj 350 mikrolitrów buforu wiążącego jeden do próbki, aby wychwycić białka. Umieścić kolumnę zatrzymującą zawiesinę w dwumililitrowej probówce i przenieść całą próbkę, w tym wszelki nierozpuszczalny materiał, do kolumny.

Odwirować kolumnę przy 4 000 G przez 50 sekund w celu wychwycenia białek. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu do płukania dwa. Po odwirowaniu wyrzuć przepływ.

Po ostatnim płukaniu odwirować kolumnę o stężeniu 4 000 G przez 1,25 minuty, aby zapewnić całkowite przejście buforu pierwszego. Dodać 125 mikrolitrów buforu wytrawiającego do kolumny zatrzymującej zawiesinę i przykryć ją, aby zapobiec parowaniu. Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin bez wstrząsania.

Teraz dodaj 80 mikrolitrów buforu elucyjnego jeden do kolumny zatrzymującej zawiesinę i odwiruj przy 4 000 G przez 1,25 minuty. Wyciągnij wymyte peptydy i przenieś je do czystej, nowej probówki. Po ilościowym określeniu peptydów liofilizuj 20 mikrogramów peptydów.

Ponownie rozpuścić liofilizowane peptydy w 40 mikrolitrach wodnego buforu zawierającego 3% acetonitrylu w 0,1% wodzie z kwasem mrówkowym i sonikować przez 10 minut w kąpieli sonikacyjnej. Odwirować próbkę o sile 16 000 G przez 60 minut i przenieść supernatant do fiolek do analizy metodą spektrometrii mas. Wstrzyknąć dwa mikrolitry każdej próbki za pomocą automatycznego podajnika próbek systemu spektrometrii mas do chromatografii nanocieczowej.

Oddziel peptydy na kolumnie z odwróconą fazą wypełnioną materiałem C18 o trzech mikrometrach, używając 127-minutowego gradientu od pięciu do 35% acetonitrylu przy 100 nanolitrach na minutę. Zjonizuj peptydy za pomocą źródła jonów w sprayu i przenieś je do spektrometru masowego opartego na Orbitrap. Analizuj peptydy przy użyciu metody pozyskiwania niezależnej od danych w wąskim zakresie.

Precyzyjną izolację obszaru zainteresowania podczas przetwarzania tkanki FFPE uzyskano w różnych tkankach zatopionych w parafinie utrwalonych w torbielowatych forminach trzustki. Uzyskano powtarzalne chromatogramy jonów całkowitych między trireplikatami biologicznymi dla każdego typu torbielowatego nowotworu trzustki. Analiza spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej zidentyfikowała 9 703 białka.

Obfitość wszystkich zidentyfikowanych białek obejmowała 6,25 rzędów wielkości, co świadczy o kompleksowym pokryciu proteomu, a znane markery białkowe raka trzustki zostały określone ilościowo. Zidentyfikowano łącznie 933 białka o zróżnicowanej ekspresji, z czego 457 było regulowanych w górę, a 476 w dół w wewnątrzprzewodowych brodawkowatych nowotworach śluzowych. Analiza bioinformatyczna wykazała, że białka o zróżnicowanej ekspresji były związane z kilkoma szlakami związanymi z rakiem trzustki.