Name: Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj uproszczoną metodę proteomiki opartą na spektrometrii mas do analizy wybranych regionów tkanek FFPE. Technika ta poprawia dokładność i niezawodność badań nad zmianami białkowymi w chorobach trzustki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie figurki w tym artykule zostały stworzone za pomocą BioRender (http://www.biorender.com). Prace te były wspierane przez granty Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) (grant nr RS-2023-00253403 i RS-2024-00454407).

To badanie zostało zrecenzowane i zatwierdzone przez Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (IRB No. 1904-114-1028). Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Pobieranie antygenu tkankowego FFPE do przygotowania próbki proteomicznej
UWAGA: Upewnij się, że skalpele i wszystkie materiały, takie jak używana rurka, są sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Protokoły tego badania mogą być dostosowane do dowolnej tkanki FFPE z niewielkimi modyfikacjami w oparciu o konfigurację laboratoryjną.
<ol>
	<li>Wytnij 10-μm skrawki tkanki FFPE z całych bloków tkanek FFPE i umieść je na szkiełkach podstawowych. 
	UWAGA: W tym badaniu do przygotowania próbki proteomicznej wykorzystano ludzką tkankę FFPE torbieli trzustki (dwa różne typy tkanki torbielowatej - SCN i IPMN).</li>
	<li>Usunąć wosk parafinowy z tkanki FFPE (odparafinować) dwoma płukaniami w ksylenie z zachowaniem ostrożności: jedno przez 5 minut, a drugie przez 2 minuty.</li>
	<li>Ponownie nawodnić tkankę poprzez seryjne płukanie stopniowaną mieszaniną etanolu: po 3 minuty w 100%, 85%, 70% i 50% etanolu, a następnie spłukać w wodzie dejonizowanej. 
	UWAGA: Upewnij się, że ksylen i etanol są przenoszone w okapie oparów chemicznych.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja białek tkankowych FFPE
<ol>
	<li>Przygotuj szkiełko tkankowe barwione HE lub IHC, na którym patolodzy wskazują ROI.</li>
	<li>Umieść niebarwione szkiełko tkankowe i szkiełko z barwioną tkanką tylnymi stronami do siebie, wyrównując je ze sobą. Upewnij się, że zwrot z inwestycji jest obserwowany przez szklane szkiełko.</li>
	<li>Usuń nieinteresujące obszary tkanek za pomocą skalpela. 
	UWAGA: Jeśli sąsiednie normalne tkanki powinny być analizowane, zbierz je do innych probówek.</li>
	<li>Zeskrob ROI tkanek do środka szkiełka za pomocą skalpela i przenieś je do czystych probówek o niskiej zawartości białka o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 180 μl buforu do lizy dodecylosiarczanu sodu (SDS) (5 % SDS, 2 mM tris (2-karboksetylo)fosfiny) [TCEP], 300 mM pH 8,5 Tris-HCl w wodzie dejonizowanej) do każdej probówki. 
	UWAGA: Upewnij się, że objętość buforu do lizy jest wystarczająca do rozpuszczenia tkanki podczas sonikacji i zawieszenia wyekstrahowanych białek. Niewystarczający bufor może prowadzić do niepełnej lizy tkanek, podczas gdy nadmiar buforu może rozcieńczyć lizat białkowy.</li>
	<li>Wykonaj sonizację sondy przy amplitudzie 20%, stosując 10 cykli po 5 s włączania i 5 s wyłączania.</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze 100 °C przez 3,5 godziny z 1 000 x g. 
	UWAGA: Podczas inkubacji należy wykonywać sonikację próbek wodą przez 1 minutę co godzinę w celu efektywnej ekstrakcji białka.</li>
	<li>Po inkubacji schłodzić próbkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia resztek tkankowych od supernatantu.</li>
	<li>Zebrać supernatant do czystej, oznakowanej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja białka w lizacie tkankowym FFPE
UWAGA: Większość etapów oznaczania ilościowego białka kwasem bicynkowym opiera się na instrukcjach producenta z niewielkimi modyfikacjami. Zaleca się, aby odczynniki były przygotowywane zgodnie z wytycznymi producenta.
<ol>
	<li>Przygotować wzorce albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o różnym stężeniu, seryjnie rozcieńczając roztwór podstawowy (2 mg/ml BSA). W razie potrzeby rozcieńczyć próbki o współczynniku rozcieńczenia 20 lub 40.</li>
	<li>Przygotować wodę dejonizowaną jako ślepą próbę i bufor do lizy SDS jako kontrolę próbki.</li>
	<li>Odpipetować 9 μl wzorców, ślepą próbę, próbkę kontrolną i próbki do środka dołka mikropłytki.</li>
	<li>Dodać 4 μl roztworu odczynnika zgodności do próbki w każdym dołku.</li>
	<li>Przykryj talerz i mieszaj na wytrząsarce talerzowej na średnich obrotach przez 1 min. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 260 μl odczynnika roboczego BCA do każdego dołka, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Schłodzić talerz w temperaturze RT przez 3 minuty.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję studzienek przy 562 nm na czytniku płytkowym.</li>
	<li>Odjąć wartość absorbancji 562 nm ślepej próby od absorbancji wszystkich próbek i próbki kontrolnej.</li>
	<li>Następnie odjąć wartość absorbancji 562 nm dla próbki kontrolnej odjętej metodą ślepej próby od wartości wszystkich próbek.</li>
	<li>Wykreślić krzywą wzorcową i użyć jej do określenia stężenia białka w każdej próbce. 
	UWAGA: Upewnij się, że szacunkowe 200-250 μg białek zostało wyekstrahowane z trzech szklanych szkiełek tkanek FFPE, każde o przybliżonej powierzchni 1 cm2.</li>
</ol>
4. Wytrącanie białka acetonem
UWAGA: Upewnij się, że do wytrącania acetonu i trawienia białek opartego na pułapkowaniu zawiesiny używane jest łącznie 100-300 μg.
<ol>
	<li>Umieścić próbkę białka (odpowiadającą 100-300 μg) w probówce kompatybilnej z acetonem.</li>
	<li>Dodać do probówki aceton o temperaturze -20 °C w objętości pięciokrotnie większej niż objętość próbki.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze -20 °C przez 18 godzin.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 16 000 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem, nie naruszając osadu białkowego.</li>
	<li>Dodać 500 μl acetonu o temperaturze -20 °C i powtórzyć czynności 4.4-4.5.</li>
	<li>Wysuszyć próbkę na powietrzu.</li>
</ol>
5. Trawienie białek oparte na pułapkach zawiesinowych
UWAGA: Procedura trawienia białek oparta na filtrze zatrzymującym zawiesinę została zaadaptowana z instrukcji producenta z niewielkimi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy wychwytujący zawiesinę (5 % SDS, 5 mM TCEP, 50 mM pH 8,5 TEAB w wodzie dejonizowanej).</li>
	<li>Dodać 40 μl buforu do probówki z próbką i dokładnie przemieszać, aby rozpuścić wysuszone na powietrzu osadki białkowe.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 100 °C, wytrząsając przy 1 000 x g przez 35 minut.</li>
	<li>Dodać 10 μl odczynnika alkilującego (100 mM chloroacetamidu [CAA] w 100 mM pH 8,5 bromku tetraetyloamoniowego [TEAB]) do próbki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 300 x g przez 1 godzinę.</li>
	<li>Ostrożnie przygotuj zakwaszacz (10% kwas trifluorooctowy [TFA] w wodzie dejonizowanej). Upewnij się, że TFA, mocny kwas, jest obchodzony w dygestoriach chemicznych.</li>
	<li>Dodać 5 μl zakwaszacza do próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 1% TFA (końcowa objętość próbki: 55 μl).</li>
	<li>Sprawdź pH próbki za pomocą bibuły pH. Upewnij się, że pH jest mniejsze niż 1.</li>
	<li>Dodać 350 μl buforu wiążącego/przemywającego-1 (0,1 M pH 8,5 TEAB w 90% MeOH) do próbki, aby wyłapać białka. 
	UWAGA: Unikaj wirowania i wirowania podczas wychwytywania białka (krok 5.9), aby zapobiec utracie próbki. Wystarczająca ilość białka zapewnia tworzenie się widocznych koloidalnych cząstek białkowych o półprzezroczystym wyglądzie.</li>
	<li>Umieścić kolumnę wychwytującą zawiesinę w probówce o pojemności 2 ml i przenieść całą próbkę, w tym wszelki nierozpuszczalny materiał, do kolumny wychwytującej zawiesinę.</li>
	<li>Odwirować kolumnę przy 4 000 x g przez 50 s w celu uwięzienia białek. 
	UWAGA: Upewnij się, że cała próbka przechodzi przez kolumnę; Jeśli nie, powtarzaj wirowanie, aż do całkowitej filtracji.</li>
	<li>Dodać 400 μl buforu do przemywania 2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) do kolumny, odwirować przy 4000 x g przez 50 s i odrzucić przepływ.</li>
	<li>Powtórz krok 5.12 trzy razy.</li>
	<li>Dodać 400 μl buforu-1, odwirować przy 4000 x g przez 50 s i odrzucić przepływ</li>.
	<li>Powtórz krok 5.14 trzy razy.</li>
	<li>Wirować przy 4000 x g przez 1,25 minuty, aby zapewnić cały przepływ buforu-1.</li>
	<li>Przenieść kolumnę wychwytującą zawiesinę do nowej probówki z próbką w celu roztwarzania enzymatycznego.</li>
	<li>Dodać 125 μl buforu wytrawiającego (0,16 μg/μL trypsyny/Lys-C w 50 mM pH 8,5 TEAB) do kolumny zatrzymującej zawiesinę i przykryć ją, aby zapobiec parowaniu. 
	UWAGA: Stosunek trypsyny/Lys-C powinien wynosić 1:10 (waga/waga). Zapewnij minimum 10 μg trypsyny/Lys-C dla skutecznego trawienia.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin bez wytrząsania.</li>
	<li>Przygotować następujące elucyjne: bufor-1 (50 mM pH 8,5 TEAB w wodzie dejonizowanej), bufor-2 (0,2 % FA w wodzie dejonizowanej) i bufor-3 (50 % acetonitrylu [ACN] w wodzie dejonizowanej).</li>
	<li>Dodać 80 μl buforu elucyjnego-1 do kolumny zatrzymującej zawiesinę i odwirować przy 4000 x g przez 1,25 min.</li>
	<li>Powtórzyć krok 5.20 z 80 μl buforu elucyjnego-2 i buforu-3.</li>
	<li>Zbierz eluowane peptydy i przenieś je do czystej, nowej probówki.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja peptydów
UWAGA: Większość etapów ilościowego testu peptydowego kolorymetrycznego jest zaadaptowana z instrukcji producenta z niewielkimi modyfikacjami. Zaleca się, aby odczynniki były przygotowywane zgodnie z wytycznymi producenta.
<ol>
	<li>Przygotować serię wzorców, seryjnie rozcieńczając roztwór podstawowy wzorca (1 mg/ml). W razie potrzeby rozcieńczyć próbki, stosując współczynnik rozcieńczenia 4 lub 5.</li>
	<li>Przygotować wodę dejonizowaną jako ślepą próbę i mieszaninę buforu elucyjnego-1, buforu-2 i buforu-3 w równych proporcjach jako próbkę kontrolną.</li>
	<li>Umieścić 20 μl wzorców, ślepą próbę, próbkę kontrolną i próbki w środku każdej studzienki mikropłytki.</li>
	<li>Dodać 180 μl odczynnika roboczego do każdej studzienki i dokładnie wymieszać płytkę na wytrząsarce przez 1 minutę.</li>
	<li>Przykryć płytkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Pozostaw płytkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję studzienek przy 480 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
	<li>Odjąć wartość absorbancji 480 nm ślepej próby od wartości absorbancji wszystkich próbek i próbki kontrolnej.</li>
	<li>Następnie odjąć wartość absorbancji 480 nm dla próbki kontrolnej odjętej metodą ślepą od wartości wszystkich próbek.</li>
	<li>Wykreślić krzywą wzorcową i użyć jej do obliczenia stężenia peptydu dla każdej próbki.</li>
</ol>
7. Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas
<ol>
	<li>Po ilościowym określeniu peptydów liofilizować 20 μg peptydów.</li>
	<li>Ponownie rozpuścić peptydy w 40 μl wodnego buforu (3% ACN w 0,1% wodzie z kwasem mrówkowym [FA]) przez 10 minut w kąpieli dźwiękowej. Wynikowe stężenie peptydu wyniesie 0,5 μg/ μL.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 60 minut i przenieść próbki do fiolek w celu analizy MS.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl każdej próbki za pomocą automatycznego podajnika próbek systemu nano LC-MS/MS.</li>
	<li>Oddziel peptydy na kolumnie z odwróconymi fazami (kolumna 0,075 mm ID x 150 mm, wypełniona materiałem C18 o grubości 3 μm, używając 127-minutowego gradientu 5%-35% acetonitrylu przy 100 nL/min. Zjonizuj peptydy za pomocą źródła jonów w sprayu i przenieś je do spektrometru masowego opartego na orbitrapie.</li>
	<li>Analizuj peptydy przy użyciu metody pozyskiwania niezależnej od danych w wąskim zakresie21.</li>
	<li>Zastosuj następujące ustawienie parametrów MS: zakres MS m/z: 495-745, docelowa rozdzielczość: 15000, docelowa AGC: 3 x 10E6, maksymalny czas wtrysku: auto, okno MS/MS: zdefiniowane przez użytkownika (plik uzupełniający 1), docelowa rozdzielczość: 45000, docelowa AGC 3 x 10E6, maksymalny czas wtrysku: auto, energia kolizji HCD: 22%, 26%, 30%. 
	UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie wstępnej kontroli jakości przyrządu poprzez analizę próbek wzorcowych przed analizą. Użyj oprogramowania do akwizycji danych MS, aby skonfigurować parametry (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
8. Analiza danych do wyszukiwania proteomicznego
UWAGA: Do proteomicznego wyszukiwania surowych danych MS, użyto narzędzi open-source do konwersji formatu danych LC-MS i przeprowadzenia wyszukiwania proteomu (patrz Tabela materiałów). Parametry używane do analizy danych są szczegółowo opisane w pliku uzupełniającym 2. Podstawowe instrukcje użytkowania narzędzi typu open source można znaleźć pod linkiem zawartym w Tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Zakryj surowe pliki widma MS/MS (*.raw) uzyskane z LC-MS do formatu *.mzML za pomocą oprogramowania typu open source.</li>
	<li>Użyj przekonwertowanych na format plików RAW (*.mzML) jako danych wejściowych dla wyszukiwarki typu open source w celu przeprowadzenia wyszukiwania proteomu.</li>
	<li>Rozpocznij wyszukiwanie proteomiczne na podstawie parametrów określonych w pliku uzupełniającym 2.</li>
</ol>
9. Analiza statystyczna
UWAGA: Do analizy statystycznej w celu identyfikacji białek o zróżnicowanej ekspresji, użyto narzędzia open-source do przeprowadzenia analizy jednowymiarowej (np. test t-Studenta; patrz Tabela materiałów). Zaleca się zapoznanie się z podstawowymi instrukcjami użytkowania narzędzia typu open source za pośrednictwem linku podanego w tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Zaimportuj listę zidentyfikowanych białek (*.txt) do narzędzia typu open source.</li>
	<li>Kategoryzuj próbki w grupy. Do badań wyznaczono dwie grupy: SCN i IPMN.</li>
	<li>Wykonaj transformację Log2 wartości obfitości, aby dostosować rozkład danych do przybliżonego rozkładu normalnego.</li>
	<li>Zastosuj krok filtrowania, aby usunąć białka z brakującymi wartościami. W tym badaniu do włączenia wymagane były co najmniej dwie ważne wartości w każdej grupie.</li>
	<li>Imputuj brakujące wartości przy użyciu podejścia opartego na rozkładzie normalnym, aby wygenerować kompleksową listę białek oznaczonych ilościowo do późniejszej analizy jednowymiarowej.</li>
	<li>Wykonaj test t Studenta, aby zidentyfikować białka o zróżnicowanej ekspresji między dwiema grupami. W pracy zastosowano poprawkę Benjaminiego-Hochberga na wskaźnik fałszywych wykryć (FDR).</li>
	<li>Ekstrahować białka o zróżnicowanej ekspresji spełniające następujące kryteria: Benjamini-Hochberg FDR < 0,05 i |krotna zmiana| ≥ 2.</li>
</ol>
10. Analiza bioinformatyczna
UWAGA: Komercyjne narzędzie bioinformatyczne zostało użyte do analizy nadreprezentacji (np. analiza ścieżki Ingenuity, patrz Tabela materiałów). Przed użyciem tego narzędzia zaleca się zapoznanie się z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Zaimportuj listę funkcji DEP (*.txt) do narzędzia komercyjnego.</li>
	<li>Zainicjuj analizę rdzenia, aby przeprowadzić analizę nadreprezentacji.</li>
	<li>Eksport znaczących ścieżek kanonicznych wzbogaconych o DEP przy użyciu dokładnego testu Fishera (skorygowana wartość p < 0,05). Zidentyfikuj interesujące Cię ścieżki, które są istotne dla badania.</li>
</ol>

<ol><li>Van Maldegem, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+processing+delay%2C+formalin+fixation%2C+and+immunohistochemistry+on+RNA+recovery+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections.</a> Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+of+formaldehyde+with+proteins%3B+cross-linking+between+amino+and+primary+amide+or+guanidyl+groups%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups.</a> J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).</li>
<li>Basyuni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+whole+genome+sequencing+data+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+cancer+specimens+demonstrates+preservation+of+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility.</a> Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).</li>
<li>Gracia Villacampa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+spatial+expression+profiling+in+formalin-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues.</a> Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+genomic+landscape+in+large-scale+Chinese+patients+with+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer.</a> EBioMedicine. 77, 103897(2022).</li>
<li>Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archival+FFPE+blocks%3A+the+gift+that+keeps+giving%5BTitle%5D)+AND+%22Innov%22%5BJournal%5D)">Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving.</a> Innov. 5 (1), 100532(2024).</li>
<li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li>
<li>Soni, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+deep+proteomic+profiling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens+using+a+spectral+library-free+approach%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).</li>
<li>Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+developments+in+the+analysis+of+formalin-fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Proteins+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue.</a> Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).</li>
<li>O'Rourke, M. B., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue+via+proteomic+techniques+and+misconceptions+of+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval.</a> Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomics+sample+preparation+and+fractionation%3A+method+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications.</a> TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).</li>
<li>Nwosu, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+mass+spectrometry-based+proteomics+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+with+a+spatial+resolution+of+50-200+%C2%B5m%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm.</a> J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).</li>
<li>Makhmut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+ultra-low-input+spatial+tissue+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics.</a> Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).</li>
<li>Shin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TUBB2A+by+quantitative+proteomic+analysis+as+a+novel+biomarker+for+the+prediction+of+distant+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer.</a> Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+oxidase+2+%28DUOX2%29+as+a+proteomic+biomarker+for+predicting+treatment+response+to+chemoradiation+therapy+for+locally+advanced+rectal+cancer%3A+using+high-throughput+proteomic+analysis+and+machine+learning+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm.</a> Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).</li>
<li>Tüshaus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+routine+proteome+profiling+of+FFPE+tissue%3A+insights+from+a+1%2C220-case+pan-cancer+study%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study.</a> EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).</li>
<li>Schweizer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+multiorgan+proteomics+of+fatal+COVID-19+uncovers+tissue-specific+effects+beyond+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation.</a> EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).</li>
<li>Kobayashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+FFPE+specimens%3A+discovery+of+HNRNPA2%2FB1+and+STT3B+as+biomarkers+for+determining+formalin+fixation+durations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations.</a> J Proteomics. 301, 105196(2024).</li>
<li>Kawashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-shot+10k+proteome+approach%3A+over+10%2C000+protein+identifications+by+data-independent+acquisition-based+single-shot+proteomics+with+ion+mobility+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry.</a> J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+prognostic+analysis+of+biomarkers+to+predict+the+progression+of+pancreatic+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients.</a> Mol Med. 28 (1), 43(2022).</li>
<li>Martinelli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+regulates+EMT+and+tumour+dissemination%2C+and+is+a+marker+of+response+to+adjuvant+chemotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).</li>
<li>Racu, M. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad4+positive+pancreatic+ductal+adenocarcinomas+are+associated+with+better+outcomes+in+patients+receiving+FOLFIRINOX-based+neoadjuvant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy.</a> Cancers. 15 (15), 3765(2023).</li>
<li>Roy, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC1+enhances+invasiveness+of+pancreatic+cancer+cells+by+inducing+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition.</a> Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).</li>
<li>Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CEACAM5+as+a+stemness-related+inhibitory+immune+checkpoint+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer.</a> BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).</li>
<li>Waters, A. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS%3A+the+critical+driver+and+therapeutic+target+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).</li>
<li>Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypican-3+and+KRT19+are+markers+associating+with+metastasis+and+poor+prognosis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).</li>
<li>Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FUT3+disrupts+the+proliferation%2C+migration%2C+tumorigenesis+and+TGF%CE%B2+induced+EMT+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells.</a> Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).</li>
<li>Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust%2C+precise%2C+and+deep+proteome+profiling+using+a+small+mass+range+and+narrow+window+data-independent-acquisition+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme.</a> J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).</li>
<li>Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+data+independent+acquisition+%28DIA%29+mass+spectrometry%3A+application+of+quantitative+analysis+of+the+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome.</a> Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).</li>
<li>Searle, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatogram+libraries+improve+peptide+detection+and+quantification+by+data+independent+acquisition+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry.</a> Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).</li>
<li>Prakash, J., Shaked, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+extracellular+matrix+remodeling+and+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics.</a> Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).</li>
<li>Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDAC+extracellular+matrix%3A+a+review+of+the+ECM+protein+composition%2C+tumor+cell+interaction%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies.</a> Front Oncol. 11, 751311(2021).</li>
<li>Ferrara, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+pancreatic+cancer%3A+description+of+a+complex+network+and+promising+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options.</a> Cancers. 13 (17), 4442(2021).</li>
<li>Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+and+pancreatic+cancer%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship.</a> Cancers. 10 (9), 316(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów

Protokół ten przedstawia szybką i wydajną metodę proteomiczną, która wykorzystuje ROI wyizolowane z skrawków tkanek FFPE zamontowanych na szklanych szkiełkach w celu diagnozy patologicznej. Gdy interwencja chirurgiczna jest korzystna, nowotwory lite, takie jak nowotwory i torbiele, są chirurgicznie wycinane i konserwowane do oceny patologicznej. W celu długotrwałego przechowywania tkanki są utrwalane w formalinie i zatopiane w parafinie (FFPE). Bloki tkankowe FFPE są następnie cięte na grubość 4-10 μm, montowane na szkie...

Przez dziesięciolecia, chirurgicznie wycinane tkanki ludzkie były archiwizowane jako bloki utrwalone formaliną, zatopione w parafinie (FFPE). Te bloki tkankowe początkowo zachowują trójwymiarową (3D) strukturę zatopioną w parafinie. Tkanki są następnie cięte za pomocą mikrotomów, montowane na szkiełkach i barwione - zwykle hematoksyliną i eozyną (HE) lub immunohistochemią (IHC) - w celu ułatwienia diagnozy histopatologicznej przez doświadczonych patologów1,2. Tkanki FFPE oferują wyraźne korzyści w zakresie długotrwałego przechowywania ze względu na sieciowanie białek indukowane przez formalinę, która zatrzymuje aktywność enzymatyczną i proteolityczną3. Ze względu na to, że ułatwiają one konstruowanie dużych, dobrze zarchiwizowanych zestawów próbek, tkanki FFPE są uważane za kamień węgielny dla odkrywania biomarkerów w różnych dziedzinach, w tym genomiki4,5,6,7.
Jednak ich zastosowanie w proteomice opartej na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS) historycznie stanowiło wyzwanie. Kluczowym ograniczeniem jest indukowane formaliną sieciowanie białek, które zakłóca trawienie tryptyczne -- krytyczny krok w globalnej analizie proteomu8. Co więcej, niewielka ilość białka możliwa do odzyskania ze szkiełek tkankowych często sprawia, że konwencjonalne metody przygotowania próbek są nieodpowiednie. Pomimo tych wyzwań postępy wykazały, że wiązania krzyżowe białek można odwrócić poprzez długotrwałą obróbkę w wysokiej temperaturze9,10,11. Jednocześnie metody przygotowania próbek zoptymalizowane pod kątem próbek białek o małej ilości rozszerzyły zastosowanie tkanek FFPE w badaniach proteomicznych12,13,14,15.
Jedną z istotnych zalet korzystania z preparatów tkankowych FFPE w proteomice jest ich zdolność do umożliwienia analizy specyficznej dla regionu. Szkiełka FFPE zazwyczaj zawierają zarówno zmiany chorobowe, jak i przylegającą normalną tkankę (ANT). Bezkrytyczna analiza całej tkanki grozi mylącymi wynikami z powodu mieszanych sygnatur molekularnych. W przeciwieństwie do tego, izolowanie i analizowanie regionów zainteresowania (ROI) - zmian chorobowych w porównaniu z ANT - umożliwia bardziej precyzyjną charakterystykę cech molekularnych specyficznych dla regionów patologicznych. W związku z tym podejścia oparte na FFPE stają się coraz bardziej popularne w badaniach proteomicznych16,17,18,19,20. Pomimo ich rosnącego zastosowania, usprawniony przepływ pracy, który krok po kroku opisuje cały eksperyment proteomiczny, nadal pozostaje rzadkością. W szczególności nie opublikowano protokołu opartego na wideo.
W tym badaniu stworzono solidny przepływ pracy proteomiki oparty na LC-MS, dostosowany do dokładnego profilowania zmian molekularnych w regionach specyficznych dla zmian. Korzystając z tkanek FFPE zdiagnozowanych przez dwóch patologów, makropreparowato, zebrano i przeanalizowano ROI z łagodnych surowiczych nowotworów torbielowatych (SCN) i przedrakowych wewnątrzprzewodowych brodawkowatych nowotworów śluzowych (IPMN). Protokół obejmuje makrodysekcję ROI, przygotowanie próbki oparte na pułapce zawiesinowej zoptymalizowane pod kątem minimalnych nakładów białka oraz wąską analizę akwizycji niezależnej od danych (DIA)-MS. Metoda ta umożliwiła identyfikację ponad 9 000 białek z obszarów tkanek o powierzchni około 1 cm², rozszyfrowując odrębne sygnatury proteomiczne związane z SCN i IPMN.

<table><tbody><tr><td>0,1% FA w ACN (klasa LC-MS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>LS120-212</td><td></td></tr><tr><td>0,1% FA w wodzie (klasa LC-MS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>LS118-4</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>2679093</td><td></td></tr><tr><td>1M TEAB (pH 8,5)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102545001</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-cl (pH 8,5)</td><td>Wirówka BIOSOLUTION</td><td>BTO21</td><td></td></tr><tr><td>A-14C</td><td>Satorious</td><td>167709</td><td></td></tr><tr><td>Aceton (klasa HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>ACN (klasa HPLC)</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-88</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3 (klasa HPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>022920.k2</td><td></td></tr><tr><td>Papier CR</td><td>ADVANTEC</td><td>70406001</td><td></td></tr><tr><td>DIA-NN wersja 1.9&nbsp;</td><td>Otwarte oprogramowanie&nbsp;</td><td>https://github.com/vdemichev/DiaNN</td><td>Wyszukiwarka Proteomika&nbsp;</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek EPOCH2</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td>2106208</tr><tr><td>Etanol</td><td>MERCK</td><td>K50505283 836</td><td></td></tr><tr><td>FA (klasa LC-MS)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Analiza ścieżki pomysłowości (IPA)</td> <td>Narzędzie bioinformatyczne</td> <td>QIAGEN</td><td>830018</td></tr><tr><td>Liofilizator (SRF110R+pułapka na pary)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SRF-110-115</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (klasa HPLC)</td><td>MERCK</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA mikropłytek-Kompatybilny ze środkiem redukującym</td><td>Thermo Scientific</td><td>23252</td><td></td></tr><tr><td>MSConvert&nbsp;</td><td>Otwarte oprogramowanie&nbsp;</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml</td><td>Oprogramowanie do transformacji danych MS</td></tr><tr><td>Orbitrap Exploris 480</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA10813C</td><td>Kolumna</td></tr><tr><td>separacyjna MS PepMAP RSLC C18&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES903</td><td></td></tr><tr><td>Perseus</td> Narzędzie statystyczne Open <td>Source</td><td>https://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.html</td><td>Narzędzie statystyczne</td></tr><tr><td>PIERCE chloroacetamid No-Weigh Format</td><td>Thermo</td><td>Scientific A39270</td><td></td></tr><tr><td>PIERCE Ilościowy test peptydów kolorymetrycznych</td><td>Thermo Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do płytek&nbsp;</td><td>Zielona sonda SSeriker</td><td>VS-202D</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>VibraCellTM</td><td>VCX750</td><td></td></tr><tr><td>Białkowa rurka LoBind 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>QSP 10 &micro; L Końcówka do pipet</td><td>Thermo Scientific</td><td>TLR102RS-Q</td><td></td></tr><tr><td>QSP 300 &micro; L Końcówka do pipety</td><td>Thermo Scientific</td><td>TLR106RS-Q</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Bard-Parker</td><td>372615</td><td></td></tr><tr><td>S-Trap: Szybki uniwersalny MS do przygotowania próbki</td><td>PROTIFI</td><td>CO2-mini-40</td><td></td></tr><tr><td>SureSTART Fiolka 0,2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>6pk1655</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102614284</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/Lys-C (klasa LC-MS)</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Vanquish NEO</td><td>Thermo Scientific</td><td>8348249</td><td>LC</td></tr><tr><td>Water (klasa HPLC)</td><td>Honeywell</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur ver 4.7</td><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>Thermo Scientific</td><td>30966</td> MS</tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102033629</td><td></td></tr></tbody></table>

uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

A Streamlined Approach for Mass Spectrometry-Based Proteomics Using Selected Tissue Regions

Proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) umożliwia kompleksową analizę proteomu w szerokim zakresie próbek biologicznych, w tym komórek, tkanek i płynów ustrojowych. Utrwalone formaliną i zatopione w parafinie (FFPE) skrawki tkanek, powszechnie używane do długoterminowej archiwizacji, stały się cennymi zasobami do badań proteomicznych. Oprócz korzyści związanych z przechowywaniem, naukowcy mogą izolować obszary zainteresowania (ROI) od normalnych regionów tkanek dzięki współpracy z patologami. Pomimo tego potencjału, nadal brakuje uproszczonego podejścia do eksperymentów proteomicznych obejmującego izolację ROI, przygotowanie próbek proteomicznych i analizę stwardnienia rozsianego. W tym protokole przedstawiono zintegrowany przepływ pracy, który łączy makrodysekcję ROI, przygotowanie próbki oparte na pułapkowaniu zawiesiny i wysokoprzepustową analizę MS. Dzięki takiemu podejściu ROI tkanek FFPE pacjentów, składających się z łagodnych surowiczych nowotworów torbielowatych (SCN) i przedrakowych wewnątrzprzewodowych brodawkowatych nowotworów śluzowych (IPMN) zdiagnozowanych przez patologów, zostały makrorozcięte, zebrane i przeanalizowane, co dało wysokie pokrycie proteomem. Co więcej, udało się zidentyfikować różnice molekularne między dwoma odrębnymi nowotworami torbielowatymi trzustki, wykazując w ten sposób możliwość zastosowania tego podejścia do postępów w badaniach proteomicznych z tkankami FFPE.

Ustanowiona metoda przygotowania próbek do proteomiki oparta na filtrach do wychwytywania zawiesin w połączeniu z ilościowym oznaczaniem bez użycia znaczników przy zastosowaniu jednorazowego nabytego trybu niezależnego od danych (DIA) została zastosowana do tkanek cystycznych trzustki utrwalonych w FFPE (Rysunek 1). Precyzyjna izolacja obszaru zainteresowania (ROI) podczas przetwarzania tkanek FFPE została osiągnięta w różnych tkankach cystycznych trzustki FFPE (Rysunek ...

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Mass spectrometry (MS)-based proteomics enables comprehensive proteome analysis across a wide range of biological samples, including cells, tissues, and ...

Opracowaliśmy uproszczoną metodę badania proteomu w określonych regionach wyższych próbek tkanek za pomocą spektrometrii mas. Naszym celem jest ulepszenie techniki proteomicznej, w tym przygotowania próbek i analizy spektrometrii mas, w celu osiągnięcia wysokiej dokładności i niezawodności. Jednym z wyzwań w proteomice przestrzennej opartej na FFPE jest niepełne trawienie białek, co zmniejsza ogólne pokrycie białkami.Pokonanie tych problemów wymaga zoptymalizowanych protokołów trawienia i ulepszonych strategii spektrometrii mas w celu poprawy głębokości i dokładności proteomu. Zidentyfikowaliśmy wyraźne zmiany białek w różnych typach chorób trzustki, zapewniając wgląd w różnice między stanami łagodnymi i przedrakowymi. Odkrycia te mogą pomóc we wczesnej diagnozie raka trzustki.Naszym celem jest udoskonalenie metody proteinazy u pacjentów, aby uzyskać mapowanie białek w wysokiej rozdzielczości w regionach tkanki. Wykorzystując proteomikę opartą na spektrometrii mas, staramy się zidentyfikować specyficzne dla regionu sygnatury molekularne, które przyczyniają się do odkrycia biomarkerów. Nasze podejście integruje te pułapki pacjentów i wstępne przygotowanie z niezależną od danych spektrometrią mas w celu szybkiego generowania wysokiej jakości danych proteomu z wybranych regionów tkanek FFPE.Metoda ta umożliwia doskonałe ilościowe określenie proteomu przestrzennego. Na początek przygotuj szkiełko tkankowe barwione hematoksyliną i eozyną lub barwione immunohistochemicznie z obszarem zainteresowania wskazanym przez patologa. Umieść niezabarwione szkiełko tkankowe, a barwioną tkankę przesuń się z powrotem do tyłu, zapewniając prawidłowe wyrównanie.Za pomocą skalpela usuń obszary tkanki, które nie są interesujące i zeskrob interesujące obszary tkanki w kierunku środka szkiełka. Przenieś pobraną tkankę do czystej 1,5 mililitrowej probówki o niskiej zawartości białek i dodaj 180 mikrolitrów buforu do lizy SDS do każdej probówki. Wykonaj sonizację sondy przy amplitudzie 20% przez 10 cykli po pięć sekund włączenia i pięciu sekund wyłączenia.Teraz inkubuj próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 3,5 godziny, utrzymując prędkość 1 000 G. Po inkubacji pozwól próbce ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odwirować przy 16 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia resztek tkanek od supernatantu. Zebrać supernatant do czystej, oznakowanej probówki i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.W przypadku wytrącania acetonu należy umieścić próbkę białka odpowiadającą 100 do 300 mikrogramom w probówce kompatybilnej z acetonem. Następnie dodaj lodowaty aceton, wstępnie schłodzony do minus 20 stopni Celsjusza, w objętości pięciokrotnie większej niż objętość próbki. Inkubować mieszaninę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 18 godzin.Po inkubacji odwirować probówkę o stężeniu 16 000 G przez 15 minut. Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem, nie naruszając osadu białkowego. Dodaj 500 mikrolitrów acetonu zahartowanego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i odwiruj.Po zdekantacji supernatantu wysuszyć próbkę na powietrzu. Przygotować bufor do lizy zatrzymujący zawiesinę w wodzie dejonizowanej. Następnie dodaj 40 mikrolitrów przygotowanego buforu do probówki z próbką i dokładnie zwiruj, aby rozpuścić wysuszone na powietrzu osadki białkowe.Umieścić próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 100 stopni Celsjusza i 1 000 G na 35 minut. Następnie dodać 10 mikrolitrów odczynnika alkilującego do próbki i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przy 300 G przez jedną godzinę. Wewnątrz dygestorium chemicznego dodaj pięć mikrolitrów 10% kwasu trichlorooctowego do próbki, co daje całkowitą objętość 55 mikrolitrów.Sprawdź pH próbki za pomocą bibuły pH, aby upewnić się, że jest mniejsze niż jeden. Następnie dodaj 350 mikrolitrów buforu wiążącego jeden do próbki, aby wychwycić białka. Umieścić kolumnę zatrzymującą zawiesinę w dwumililitrowej probówce i przenieść całą próbkę, w tym wszelki nierozpuszczalny materiał, do kolumny.Odwirować kolumnę przy 4 000 G przez 50 sekund w celu wychwycenia białek. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu do płukania dwa. Po odwirowaniu wyrzuć przepływ.Po ostatnim płukaniu odwirować kolumnę o stężeniu 4 000 G przez 1,25 minuty, aby zapewnić całkowite przejście buforu pierwszego. Dodać 125 mikrolitrów buforu wytrawiającego do kolumny zatrzymującej zawiesinę i przykryć ją, aby zapobiec parowaniu. Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin bez wstrząsania.Teraz dodaj 80 mikrolitrów buforu elucyjnego jeden do kolumny zatrzymującej zawiesinę i odwiruj przy 4 000 G przez 1,25 minuty. Wyciągnij wymyte peptydy i przenieś je do czystej, nowej probówki. Po ilościowym określeniu peptydów liofilizuj 20 mikrogramów peptydów.Ponownie rozpuścić liofilizowane peptydy w 40 mikrolitrach wodnego buforu zawierającego 3% acetonitrylu w 0,1% wodzie z kwasem mrówkowym i sonikować przez 10 minut w kąpieli sonikacyjnej. Odwirować próbkę o sile 16 000 G przez 60 minut i przenieść supernatant do fiolek do analizy metodą spektrometrii mas. Wstrzyknąć dwa mikrolitry każdej próbki za pomocą automatycznego podajnika próbek systemu spektrometrii mas do chromatografii nanocieczowej.Oddziel peptydy na kolumnie z odwróconą fazą wypełnioną materiałem C18 o trzech mikrometrach, używając 127-minutowego gradientu od pięciu do 35% acetonitrylu przy 100 nanolitrach na minutę. Zjonizuj peptydy za pomocą źródła jonów w sprayu i przenieś je do spektrometru masowego opartego na Orbitrap. Analizuj peptydy przy użyciu metody pozyskiwania niezależnej od danych w wąskim zakresie.Precyzyjną izolację obszaru zainteresowania podczas przetwarzania tkanki FFPE uzyskano w różnych tkankach zatopionych w parafinie utrwalonych w torbielowatych forminach trzustki. Uzyskano powtarzalne chromatogramy jonów całkowitych między trireplikatami biologicznymi dla każdego typu torbielowatego nowotworu trzustki. Analiza spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej zidentyfikowała 9 703 białka.Obfitość wszystkich zidentyfikowanych białek obejmowała 6,25 rzędów wielkości, co świadczy o kompleksowym pokryciu proteomu, a znane markery białkowe raka trzustki zostały określone ilościowo. Zidentyfikowano łącznie 933 białka o zróżnicowanej ekspresji, z czego 457 było regulowanych w górę, a 476 w dół w wewnątrzprzewodowych brodawkowatych nowotworach śluzowych. Analiza bioinformatyczna wykazała, że białka o zróżnicowanej ekspresji były związane z kilkoma szlakami związanymi z rakiem trzustki.

a-streamlined-approach-for-mass-spectrometry-based-proteomics-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Tutaj prezentujemy dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) w celu oddzielenia i identyfikacji proteomu tkankowego ludzkiego gruczolaka przysadki, który przedstawia dobry i powtarzalny wzór 2DE. Wiele białek obserwuje się w każdym miejscu 2DE podczas analizy złożonego proteomu nowotworu przy użyciu MS o wysokiej czułości.

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Prezentujemy zoptymalizowany protokół etykietowania tandemowego znacznika masy (TMT), który zawiera szczegółowe informacje dla każdego z następujących etapów: ekstrakcja białka, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie, etykietowanie, przesyłanie do ośrodka proteomicznego i analiza danych.

Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Protokół ma na celu wprowadzenie użycia potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego do monitorowania wielu reakcji (MRM) białek z próbek klinicznych. Zapewniliśmy systematyczny przepływ pracy, począwszy od przygotowania próbki po analizę danych dla próbek klinicznych, z zachowaniem wszystkich niezbędnych środków ostrożności, które należy podjąć.

Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity o ugruntowanej roli w chorobach człowieka. Scharakteryzowanie zmian w tkankach za pomocą spektrometrii mas może ujawnić role w etiologii choroby lub zidentyfikować cele terapeutyczne. Jednak związek KTT stosowany do kriokonserwacji w biorepozytoriach zakłóca spektrometrię mas. Przedstawiono metody analizy sfingolipidów w tkankach ludzkich osadzonych w OCT za pomocą LC-ESI-MS/MS.

Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

Dane proteomiczne oparte na spektrometrii mas są dostępne w otwartych bazach danych i dostępne za pomocą bezpłatnych narzędzi. Biorąc pod uwagę złożoność przeszukiwania i opisywania baz danych, wielu biologom brakuje wiedzy, aby wykorzystać te zestawy danych. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik dotyczący korzystania z bezpłatnych narzędzi do podstawowego wyszukiwania danych proteomicznych.

Poruszanie się po danych proteomicznych opartych na spektrometrii mas przy użyciu bezpłatnych narzędzi obliczeniowych

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Poznaj uproszczoną metodę proteomiki opartą na spektrometrii mas do analizy wybranych regionów tkanek FFPE. Technika ta poprawia dokładność i niezawodność badań nad zmianami białkowymi w chorobach trzustki.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Przeglądaj więcej filmów