Wykorzystanie pułapki optycznej do badania interakcji gospodarz-patogen do dynamicznego obrazowania żywych komórek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie pułapki optycznej w połączeniu z mikroskopią konfokalną z wirującym dyskiem do obserwacji interakcji patogenów gospodarza w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez dodanie najpierw interesujących patogenów do komorowego szkła nakrywkowego. Następnie cząstka jest wybierana i wychwytywana za pomocą pułapki optycznej.

Na koniec cząstka jest kierowana do komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Jak widać tutaj. Pułapkowanie optyczne może być skuteczną metodą kontrolowania dwóch cząstek w celu obserwacji dynamicznych interakcji wewnątrzkomórkowych.

Metoda ta może odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące interakcji patogenów gospodarza w dziedzinie chorób zakaźnych i immunologii, w tym jaki jest wpływ na fagocytozę, gdy uzyskuje się pełną kontrolę nad relacjami przestrzennymi między komórkami gospodarza a patogenami, a także czy kolejność patogenów pobieranych przez komórkę fagocytarną wpływa na dojrzewanie PHA somalne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ warunki odłowu muszą być zoptymalizowane dla różnych typów komórek i kulek. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie jako proces konfiguracji i integracji obracającego się dysku.

Konfokalne do pułapki optycznej jest trudne do konceptualizacji ze względu na precyzyjne wyrównanie, które jest niezbędne dla wszystkich elementów optycznych. Zbierz interesujący Cię patogen. Na przykład tutaj 300 mikrolitrów kanadyjskich albicanów wyhodowanych przez noc w bulionie jest usuwanych z kultury i przenoszonych patogenów do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej.

Następnie przemyć patogeny trzykrotnie w temperaturze około 1300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, zasysając supernatant i pozostawiając osad w spokoju za każdym razem, gdy jest ponownie zawieszony PBS i sonicate. Po trzecim praniu zawiesić granulat w 500 mikrolitrach PBS. Następnie rozpuść jeden miligram barwnika powierzonego w 100 mikrolitrach dimetyloformamidu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 miligramów na mililitr.

Następnie dodaj trzy mikrolitry mieszaniny barwników do probówki reakcyjnej zawierającej umyte patogeny. Umieść folię wokół probówek, ponieważ barwniki są wrażliwe na światło i potrząśnij próbką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie osadź i umyj próbkę w PB S3 razy, tak jak poprzednio. Ponownie zawiesić pellet w 300 mikrolitrach PBS po ostatnim praniu.

Ciepłe media i PVS do 37 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej Myć. 10-centymetrowa płytka do hodowli tkankowej pokryta surowymi 2, 6, 4, 0,7 makrofagami dwa razy PBS, zasysająca PBS między każdym myciem. Następnie przykryj powierzchnię płytki pięcioma mililitrami trypsyny i inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie delikatnie uderz w bok płytki, aby oderwać komórki od powierzchni płytki. Uważając, aby nie rozpryskiwać trypsyny na zewnątrz talerza. Teraz dodaj pięć mililitrów pożywki do płytki i przenieś mieszaninę do probówki reakcyjnej.

Po granulowaniu komórki zasysają pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki do każdej komory szkiełka komorowego, a następnie dodaj pięć mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej komory. Pozwól komórkom rosnąć przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.

Pobrać szkiełko komorowe z pipety inkubatora od pięciu do 10 mikrolitrów wcześniej przygotowanych, znakowanych fluorescencyjnie patogenów będących przedmiotem zainteresowania do każdej komory makrofagów. Dokładnie wymieszaj makrofagi i patogeny, pipetując w górę iw dół, uważając, aby nie dotknąć dna komory i nie naruszyć przylegających makrofagów. Włącz wszystkie elementy mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem.

Przygotuj mikroskop, dodając olej do soczewki obiektywu zanurzeniowego w olejku. Włóż szkiełko komory do specjalistycznego stolika, a następnie zdejmij górną część mikroskopu wyrównającego suwak komory do obrazowania DIC. Włącz migawkę pułapki optycznej i lasera IR

Następnie otwórz migawkę lasera do pułapki optycznej. Upewnij się, że migawka przed laserem IR jest zamknięta, sprawdzając za pomocą karty IR. Teraz skup się na makrofagach na przyklejonym szkiełku.

Następnie znajdź patogeny swobodnie unoszące się w roztworze w sąsiedztwie makrofagów. Najtrudniejszą częścią tej procedury jest znalezienie odpowiedniego obiektu do śledzenia w komorze na próbkę ze względu na siły przylegania między obiektem a szkłem nakrywkowym w komorze na próbkę. Aby przesunąć ten obiekt, musisz przesunąć scenę, gdy obiekt jest trzymany przez laser drogowy, a także ważne jest, aby pamiętać, że musisz przesuwać scenę na tyle wolno, aby siła oporu sceny nie przekraczała maksymalnej siły pułapki przez pułapkę.

Przesuń scenę tak, aby patogen znajdował się w pobliżu pułapki. Następnie otwórz migawkę i włącz pułapkę. Przesunąć próbkę, aby doprowadzić makrofagi do kontaktu ze stacjonarnym obrazem uwięzionego patogenu.

Patogeny z mikroskopem konfokalnym z wirującym dyskiem albo we fluorescencji DIC, albo w kombinacji obu oddzielnych populacji Canada albicans, które zwykle mają wielkość około pięciu mikronów, zostały oznaczone na zielono, niebiesko i czerwono. Aby zilustrować obrazowanie, pojedynczy C albicans został uwięziony i przemieszczony w kwadratowy wzór przez skupisko innych drożdży, jak wskazano szarymi strzałkami, demonstrując zdolność do uchwycenia i manipulowania specyficzną lokalizacją pojedynczego patogenu wybranego przez operatora nawet w zatłoczonym środowisku. Aby jeszcze bardziej zilustrować elastyczność tego systemu w celu uchwycenia różnych morfologii kształtów wykazywanych przez organizmy chorobotwórcze na tym rysunku, pęseta optyczna została użyta do przytrzymania i umiejscowienia cząstki C albicans za pomocą pseudo hyphy.

C albicans jest oznaczany czerwonym barwnikiem i przesuwany wzdłuż trajektorii wyznaczonej białą strzałką i umieszczany obok fluorescencyjnych surowych komórek GFPL C3. Na zielono. Drożdżowa część albicansów została uwięziona, gdy pseudo hyphy ciągnęła się za sobą.

Bogini Aspergillus fum również została umieszczona obok surowej komórki makrofagów myszy w celu przeanalizowania bezwzględnych ram czasowych fagocytozy z tą konkretną linią komórkową i patogenem. Na tym rysunku obrazy w jasnym polu pokazują, w jaki sposób uwięziony aspergillus, jak wskazuje biała strzałka, został przesunięty i umieszczony wzdłuż ścieżki, jak wskazuje czerwona strzałka. Uwięziony patogen jest nieco nieostry, ponieważ pułapka wypycha organizm nieco powyżej płaszczyzny ogniskowej.

Aspergillus był przenoszony, dopóki nie został umieszczony w sąsiedztwie pożądanej surowej komórki. Gdy patogen wejdzie w kontakt z komórką, pułapka zostanie wyłączona. Aktywowano proces fagocytozy i zastosowano obrazowanie poklatkowe do obserwacji kolejnych zdarzeń komórkowych.

Po 30 sekundach błona surowej komórki zaczęła się zmieniać i tworzyć miseczkę wokół cząsteczki. Po 60 sekundach kubek był w pełni uformowany. Od 90 sekund do 150 sekund Afu Gotti stawało się i pochłaniało, a po 180 sekundach cząstka była w pełni zinternalizowana.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć aparat pułapki optycznej z wirującym dyskiem i jak taki instrument może umożliwić nieinwazyjne kontrolowanie patogenów do obrazowania żywych komórek po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się interakcjami patogenów gospodarza do zbadania roli relacji przestrzennych między komórkami gospodarza a patogenami oraz ich roli w wynikającej z nich odpowiedzi immunologicznej.