Name: Wykorzystanie pułapki optycznej do badania interakcji gospodarz-patogen do dynamicznego obrazowania żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj metodę pułapki optycznej do badania interakcji gospodarz-patogen z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia precyzyjną manipulację patogenami i dynamiczne obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez fundusze wewnętrzne Wydziału Medycyny Massachusetts General Hospital (J.M.T., M.K.M, M.L.C., J.M.V.), grant T32EB006348 Narodowego Instytutu Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii (C.E.C.), fundusz rozwoju Centrum Biologii Obliczeniowej i Integracyjnej Massachusetts General Hospital oraz grant AI062773 (R.J.H.), granty AI062773, DK83756 i DK 043351 (R.J.X.), NSF 0643745 (M.J.L.), NIH R21CA133576 (M.J.L.) oraz grant AI057999 Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) (J.M.V.). Dziękujemy Nicholasowi C. Yoderowi za pomocne dyskusje oraz Charlesowi Feltsowi (RPI, Inc.) za pomoc techniczną.

1. Warunki hodowli patogenów do pułapkowania optycznego
<ol>
	<li>Hodować A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) na półpłynnej pożywce agarowej zawierającej SBD (Sabouraud dextrose) w temperaturze 30°C przez 3 dni. </li>
	<li>Hodować C. albicans (SC5314) w płynnej kulturze YPD (Yeast-Peptone Dextrose) zawierającej 100 μg/mL ampicyliny przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30°C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie patogenów do znakowania fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Zebrać pożądaną ilość patogenów i przenieść do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Do probówki reakcyjnej dodać 300 μL fosforanu soli buforowanej (PBS).</li>
	<li>Mieszaninę poddać sonikacji przez 30 sekund.</li>
	<li>Wirować z prędkością 4000 rpm przez 1 minutę.</li>
	<li>Odssać nadsącz, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Powtórzyć kroki (2.4) i (2.5) jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Resuspendować w 500μL PBS.</li>
</ol>
3. Znakowanie patogenów barwnikiem fluorescencyjnym
<ol>
	<li>Rozpuścić 1 mg wybranego barwnika (np. Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) w 100 μL dimetyloformamidu (DMF) (stężenie 10 mg/mL).</li>
	<li>Dodać 3 μL mieszaniny barwnika do probówek reakcyjnych zawierających przemyte patogeny.</li>
	<li>Próbkę rotować lub wstrząsać w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przemyć próbkę PBS 3X, wirując z prędkością 4000 rpm przez 1 minutę.</li>
	<li>Resuspendować w 300 μL PBS.</li>
</ol>
4. Izolowanie limfocytów T z krwi pełnej
<ol>
	<li>Pobrać krew pełną (świeżą).</li>
	<li>Doprowadzić krew, PBS + 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz histopaque do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodać koktajl do wzbogacania limfocytów T CD4+ RosetteSep Human w ilości 50 μL/mL krwi pełnej.</li>
	<li>Obracać próbkę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę równą objętością PBS + 2% FBS i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Nanieść rozcieńczoną próbkę na wierzch histopaque, minimalizując mieszanie.</li>
	<li>Wirować przez 20 minut przy 1200 x g w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem.</li>
	<li>zebrać wzbogacone komórki.</li>
	<li>Przemyć wzbogacone komórki 2x roztworem PBS + 2% FBS.</li>
	<li>Lizować erytrocyty przez 2 minuty przy użyciu buforu do lizy erytrocytów.</li>
	<li>Dodać 10 mL PBS + 2% FBS i wirować zlizowane erytrocyty przy 1500 rpm przez 5 minut.</li>
	<li>Odssać nadosad, uważając, aby nie poruszyć osadu.</li>
	<li>Resuspendować w pożywce IMDM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej.</li>
</ol>
5. Przygotowanie makrofagów RAW 264.7 w szkiełkach komorowych
<ol>
	<li>Przygotować DMEM (pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco) zawierającą 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 1% L-glutaminy.</li>
	<li>Podgrzać pożywkę, trypsynę i PBS w kąpieli wodnej do 37°C.</li>
	<li>Przemyć płytkę 2x roztworem PBS.</li>
	<li>Odsysać PBS po każdym przemyciu.</li>
	<li>Dodać 5 mL trypsyny na płytkę, aby pokryć powierzchnię (dla płytki hodowlanej o średnicy 10 cm).</li>
	<li>Inkubować przez 5 min w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Delikatnie opukać bok płytki, aby odłączyć komórki od jej powierzchni. Należy uważać, aby nie rozbryzgać trypsyny poza płytkę.</li>
	<li>Dodać 5 mL lub równoważną ilość pożywki do trypsyny.</li>
	<li>Odsysać mieszaninę do probówki reakcyjnej.</li>
	<li>Wirować przy 1000 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Odsysać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Resuspendować w 10 mL pożywki.</li>
	<li>Dodać 400 μL pożywki do każdej komory szkiełka wielokomorowego.</li>
	<li>Dodać 5 μL zawiesiny komórkowej do każdej komory.</li>
	<li>Hodować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C przy 5% CO2.</li>	
</ol>
6. Dodanie patogenów do próbki
<ol>
	<li>Pipetować 5-10 μL oznakowanych patogenów (z kroków 1-3) do komory.</li>
	<li>Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie dotknąć dna komory i nie zakłócić przywierdziałych makrofagów.</li>
</ol>
7. Nakładanie próbki na konfokalny mikroskop dyskowy (w filmie: przegląd komponentów)
<ol>
	<li>Włącz wszystkie komponenty konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym.</li>
	<li>Ustaw mikroskop do obrazowania DIC.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko z komorą z inkubatora.</li>
	<li>Włóż szkiełko z komorą do specjalistycznego stolika.</li>
	<li>Zdejmij górną część szkiełka z komorą (niezbędne do obrazowania DIC).</li>
</ol>
8. Przygotowanie do pułapkowania optycznego (w filmie przejrzyj komponenty oraz sposób ich integracji z mikroskopem)
<ol>
	<li>Włącz migawkę pułapki optycznej.</li>
	<li>Włącz laser podczerwony (IR).</li>
	<li>Otwórz migawkę (na laserze) prowadzącą do pułapki optycznej.</li>
	<li>Potwierdź, że migawka przed laserem IR jest zamknięta, sprawdzając to za pomocą karty IR.</li>
</ol>
9. Selekcja i manipulacja patogenem za pomocą pułapki optycznej
<ol>
	<li>Ustaw ostrość na makrofagi na przytwierdzonym szkiełku.</li>
	<li>Znajdź patogeny swobodnie unoszące się w roztworze w sąsiedztwie makrofagów.</li>
	<li>Przesuń stolik tak, aby patogen znalazł się w pobliżu pułapki.</li>
	<li>Otwórz migawkę i aktywuj pułapkę.</li>
	<li>Przesuń próbkę, aby doprowadzić do kontaktu makrofagów ze stacjonarnym, schwytanym patogenem.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym, w trybie DIC, fluorescencji lub w obu tych trybach jednocześnie. Zazwyczaj chwytanie odbywa się w trybie DIC, a obrazowanie w czasie rzeczywistym w trybie fluorescencji.</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki: 
Aby uzyskać pełną kontrolę przestrzenną i czasową nad patogenami i koralikami w środowisku in vivo oraz in vitro, zaprojektowaliśmy specjalistyczne urządzenie do pułapkowania zintegrowane z konfokalnym mikroskopem dyskowym (schemat przedstawiono na Rys. 1). Przy pełnej mocy laser dostarczał 350 mW, a po sprzężeniu światła z różnymi komponentami optycznymi w urządzeniu pułapki optycznej, do utworzenia pułapki w komorze wykorzystano moc ˜80 mW na obiektywie TIRF, zmierzoną za pomocą miernika mocy.
Aby ustawić obiekt w komorze względem obiektu uwięzionego, przesuwano stolik, utrzymując obiekt uwięziony w miejscu za pomocą lasera pułapkującego. Stolik przesuwano z prędkościami na tyle niskimi, aby siła oporu działająca na uwięzioną cząstkę nie przekroczyła maksymalnej siły pułapkowania.
Osobne populacje C. albicans (typowy rozmiar – ˜5 μm) zostały oznakowane każdym z trzech kolorów (AF488, AF568 oraz AF647, odpowiadającymi odpowiednio kolorom zielonemu, niebieskiemu i czerwonemu na rysunku), aby zilustrować obrazowanie z wykorzystaniem wielu kanałów fluorescencji przy jednoczesnym optycznym chwytaniu patogenu. Pojedyncza komórka C. albicans została schwytana i przemieszczana po kwadratowym torze przez skupisko innych drożdży, co wskazują szare strzałki, wykazując zdolność do przechwytywania i manipulowania konkretną lokalizacją pojedynczego patogenu wybranego przez operatora, nawet w zatłoczonym środowisku (Rys. 2A).
Aby dalej zilustrować elastyczność tego systemu w chwytaniu różnych morfologii kształtów wykazywanych przez organizmy patogenne, pęseta optyczna była również w stanie utrzymać i ustawić cząsteczkę C. albicans z pseudohifą. C. albicans znakowany AF647 (czerwony) był przemieszczany wzdłuż trajektorii zaznaczonej białą strzałką i umieszczony obok fluorescencyjnych komórek GFP-LC3-RAW (Rys. 2B). Część drożdżowa C. albicans została uwięziona, podczas gdy pseudohifa ciągnęła się za nią.
Umieściliśmy również Aspergillus fumigatus obok mysiej makrofagi RAW, aby przeanalizować bezwzględny ramy czasowe fagocytozy w przypadku tej konkretnej linii komórkowej i patogenu (Rys. 3A). W momencie, gdy patogen nawiąże kontakt z komórką, pułapka optyczna jest wyłączana, a następnie stosuje się obrazowanie poklatkowe w celu obserwacji następujących zdarzeń komórkowych (Rys. 3B). Pułapkę optyczną wykorzystano również do przechwycenia pierwotnych limfocytów T wyizolowanych z krwi i skierowania ich w sąsiedztwo kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD3, aby limfocyt T mógł utworzyć synapsę immunologiczną z kulką (Rys. 4), co demonstruje dodatkową wszechstronność w bezpośrednim chwytaniu i manipulowaniu komórkami odpornościowymi.
<img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="Schemat pułapki optycznej; wzbudzenie laserowe, układ konfokalny, analiza emisji, proces mikroskopii." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Przegląd i schemat połączonego układu pułapki optycznej i konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym. Układ instrumentu przedstawiający wiązkę pułapkującą (fioletowa), tor oświetlenia do obrazowania w jasnym polu (pomarańczowy), wiązkę wzbudzenia fluorescencji (czerwona), emisję fluorescencji (zielona), kamerę o ładunku sprzężonym (CCD), kamerę z mnożeniem ładunku (EM-CCD), lustra dichroiczne (D1 i D2), lustra (M1 i M2) oraz soczewki (L1, L2, L3, L4). Wszystkie pozostałe elementy systemu mikroskopu pułapka-konfokal są opisane na rycinie.
<img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopowy przedstawiający procesy komórkowe; skala 5μm, markery fluorescencyjne podkreślają dynamikę." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. (A) Obrazy fluorescencyjne uwięzionych i manipulowanych C. albicans. Uwięziony organizm znakowany fluorescencyjnie (Alexa Fluor 488 (AF488), niebieski) w polu innych znakowanych fluorescencyjnie C. albicans (AF568, zielony i AF647, czerwony). Stolik mikroskopu jest przesuwany wokół uwięzionej, niebieskiej cząsteczki CA, zgodnie ze wskazaniem szarych strzałek. (B) Uwięziona forma pseudohifowa C. albicans obok komórki RAW z GFP-LC3. Znakowana fluorescencyjnie forma pseudohifowa CA (czerwona, AF647) uwięziona optycznie i przesunięta w sąsiedztwo makrofagów RAW wykazujących ekspresję GFP-LC3. Organizm CA jest przemieszczany wzdłuż trajektorii wskazanej przez białą strzałkę.
<img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="Analiza mikroskopowa wychwytywania Aspergillus przez komórki RAW; seria time-lapse; interakcja z komórkami grzyba." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Wychwytywanie i pozycjonowanie A. fumigatus obok fagocytującej komórki RAW. (A) Obrazy w polu jasnym wychwyconego A. fumigatus, wskazanego białą strzałką, przemieszczanego i pozycjonowanego wzdłuż ścieżki wskazanej czerwoną strzałką. Wychwycony patogen znajduje się lekko poza ostrością, ponieważ pułapka wypycha organizm nieco powyżej płaszczyzny ogniskowej. A. fumigatus jest przemieszczany aż do momentu umieszczenia go obok wybranej komórki RAW. (B) Obrazowanie fluorescencyjne fagocytozy A. fumigatus przez komórkę RAW. Po umieszczeniu wychwyconego patogenu obok komórki RAW aktywowany jest proces fagocytozy. W 30 s błona komórki RAW zaczyna ulegać zmianie i formować puchar wokół cząsteczki. W 60 s puchar jest w pełni uformowany. Od 90 s do 150 s A. fumigatus jest pochłaniany, a do 180 s cząsteczka zostaje całkowicie zinternalizowana
<img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="Schemat dynamiki komórkowej z mikroiniekcją, analizą mikroskopową i sekwencyjnym obrazowaniem time-lapse." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Pułapkowanie pierwotnej komórki T w celu utworzenia synapsy z kuleczkami powlekanymi przeciwciałem anty-CD3. Obrazy DIC pierwotnej komórki T przemieszczonej za pomocą pułapki optycznej na pozycję obok kuleczki powlekanej przeciwciałem anty-CD3. Następnie komórka tworzy synapsę immunologiczną, której nie można łatwo rozpoznać na obrazach.

<ol><li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li>
<li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity%3A+Learning+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+and+manipulation+of+neutral+particles+using+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).</li>
<li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+and+trapping+of+particles+by+radiation+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Acceleration and trapping of particles by radiation pressure.</a> Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science.</a> Nature. 235, 1517-1520 (1987).</li>
<li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+M13+bacteriophage+tethering+and+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single M13 bacteriophage tethering and stretching.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).</li>
<li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin%27s+cover-neck+bundle+folds+forward+to+generate+force%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA.%22%5BJournal%5D)">Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force.</a> Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+tether+formation+from+outer+hair+cells+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers.</a> Biophys J. , 1386-1395 (2002).</li>
<li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B1%CE%B2+T+cell+receptor+is+an+anisotropic+mechanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.</a> J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).</li>
<li>Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+interaction+of+RBC+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers.</a> Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).</li>
<li>Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+manipulation+of+pathogens+with+an+optical+trap+for+live+cell+imaging+of+intercellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.</a> PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).</li>
<li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillosis+case-fatality+rate%3A+Systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis.%22%5BJournal%5D)">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li>
<li>Wey, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hospital-acquired+candidemia+-+the+attributable+mortality+and+excess+length+of+stay%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay.</a> Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy wykorzystujemy pułapkę optyczną do wychwytywania patogenów o rozmiarach od 3 μm do 5 μm. Choć patogeny będące przedmiotem zainteresowania naszego laboratorium zazwyczaj mają takie wymiary, opisany tutaj system pęsety optycznej jest na tyle elastyczny, że pozwala na pułapkowanie cząstek o szerokim zakresie wielkości. Rzeczywiście, pułapki optyczne są stosowane do wychwytywania obiektów o rozmiarach od pojedynczych atomów po komórki o średnicy około 10 μm. Ponadto ten system pułapkowania optycznego umożl...

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;*A. fumigatus*&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>szczep albinos, B-5233/RGD12-8, dar od K.J. Kwon-Chung, NIH</td></tr><tr><td>C. albicans</td><td></td><td></td><td>mutant SSY50-B, dar od Eleftheriosa Mylonakisa, MGH; szczep SC5314, dar od Geralda Finka, Whitehead Institute</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>dimetylformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Świeża krew</td><td></td><td></td><td>Dar od R.J.W. Heath, MGH, HMS</td></tr><tr><td>odwrócony mikroskop Nikon</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Model Ti-E </td></tr><tr><td>Laser do pułapkowania, ChromaLase</td><td>Badania podstawowe</td><td>CLAS-106-STF02-02</td><td></td></tr><tr><td>Laser do wzbudzania fluorescencji</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td>Model Innova 70C </td></tr><tr><td>Płytki stykowe do unieruchamiania komponentów</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>MB1224, MB1218</td><td></td></tr><tr><td>Optyczny stół pneumatyczny</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczna migawka z sterowaniem pedałem</td><td>Uniblitz</td><td></td><td>Zakupione w firmie Vincent Associates, Rochester, NY</td></tr><tr><td>Jednomodowe światłowody optyczne</td><td>Oz Optics</td><td>PMJ-3S3S-1064-6</td><td></td></tr><tr><td>Pozycjoner światłowodowy</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PAF-X-5-C</td><td></td></tr><tr><td>Kolimator światłowodowy</td><td>Oz Optics</td><td>HPUCO-23-1064-P-25AC</td><td></td></tr><tr><td>Soczewki do teleskopu</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC254-150-B</td><td>Ogniskowa 150 mm</td></tr><tr><td>Etapy translacji (x, y, z)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-461-XYZ</td><td></td></tr><tr><td>lustro dichroiczne IR</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET750-sp-2p8</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw (100X)</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>NA = 1,49, imersja olejowa, obiektyw TIRF</td></tr><tr><td>Głowica konfokalna</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-XI</td><td></td></tr><tr><td>Polaryzator</td><td>Instrumenty Nikon</td><td>MEN51941</td><td></td></tr><tr><td>pryzmat Wollastona</td><td>Nikon Instruments</td><td>MBH76190</td><td></td></tr><tr><td>kamera EM-CCD</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>kamera CCD (ORCA ER)</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>C4742-80-12AG</td><td></td></tr><tr><td>Koło filtrów</td><td>Ludl</td><td>99A353</td><td></td></tr><tr><td>Koło filtrów</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>LB10-NWE</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe z komorką</td><td>Lab-Tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>111-51D</td><td>Pokryte przeciwciałami anty-CD3</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;zmodyfikowane medium Eagle&amp;rsquo;pożywka (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>10313</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (HyClone)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamiczne obrazowanie żywych komórek umożliwia bezpośrednią wizualizację interakcji w czasie rzeczywistym między komórkami układu odpornościowego1, 2; jednak brak kontroli przestrzennej i czasowej między komórką fagocytarną a drobnoustrojem utrudnia prowadzenie ukierunkowanych obserwacji początkowych interakcji odpowiedzi gospodarza na patogeny. Historycznie zdarzenia kontaktu międzykomórkowego, takie jak fagocytoza3, były obrazowane poprzez mieszanie dwóch typów komórek, a następnie ciągłe skanowanie pola widzenia w celu przypadkowego znalezienia kontaktów międzykomórkowych na odpowiednim etapie interakcji. Stochastyczny charakter tych zdarzeń sprawia, że proces ten jest żmudny, a obserwacja wczesnych lub przelotnych zdarzeń w kontakcie komórka-komórka za pomocą tej metody jest trudna. Metoda ta wymaga odnalezienia par komórek znajdujących się na granicy kontaktu i obserwowania ich do momentu, gdy kontakt zostanie sfinalizowany lub nie dojdzie do niego. Aby wyeliminować te ograniczenia, wykorzystujemy pułapkowanie optyczne jako nieinwazyjną, niedestrukcyjną, a jednocześnie szybką i skuteczną metodę pozycjonowania komórek w kulturze.
Pułapki optyczne, czyli pęsety optyczne, są coraz częściej wykorzystywane w badaniach biologicznych do wychwytywania i fizycznej manipulacji komórkami oraz innymi cząstkami o rozmiarach mikronowych w trzech wymiarach4. Ciśnienie promieniowania zostało po raz pierwszy zaobserwowane i zastosowane w systemach pęset optycznych w 1970 roku5, 6, a po raz pierwszy użyto go do kontrolowania próbek biologicznych w 1987 roku7. Od tego czasu pęsety optyczne rozwinęły się w technologię pozwalającą na badanie różnorodnych zjawisk biologicznych8-13.
Opisujemy metodę14, która usprawnia obrazowanie żywych komórek poprzez zintegrowanie pułapki optycznej z konfokalną mikroskopią dysku wirującego oraz kontrolą temperatury i wilgotności, co zapewnia wyjątkową kontrolę przestrzenną i czasową nad organizmami patogennymi w środowisku fizjologicznym, ułatwiając interakcje z komórkami gospodarza zgodnie z decyzją operatora. Żywe organizmy patogenne, takie jak Candida albicans i Aspergillus fumigatus, które mogą powodować potencjalnie śmiertelne, inwazyjne infekcje u osób z niedoborem odporności15, 16 (np. pacjentów z AIDS, poddawanych chemioterapii lub przeszczepom organów), były chwytane optycznie przy użyciu niedestrukcyjnych intensywności laserowych i przemieszczane w sąsiedztwo makrofagów, które mogą fagocytować patogen. Filmy o wysokiej rozdzielczości, wykonane w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym, potwierdziły możliwość obserwacji wczesnych zdarzeń fagocytozy w żywych komórkach. Aby zademonstrować szerokie zastosowanie w immunologii, chwytać i manipulować próbowano również pierwotnymi limfocytami T w celu tworzenia synaps z mikrosferami powleczonymi anty-CD3 in vivo, uzyskując obrazowanie poklatkowe procesu formowania synaps. Dzięki udostępnieniu metody precyzyjnej kontroli przestrzennej żywych patogenów względem komórek odpornościowych, interakcje komórkowe mogą być rejestrowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy minimalnych zaburzeniach komórek, co pozwala uzyskać cenne informacje na temat wczesnych odpowiedzi odporności wrodzonej i nabytej.

Opisano metodę indywidualnego wyboru, manipulowania i obrazowania żywych patogenów przy użyciu pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem dyskowym (spinning disk). Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad organizmami i pozwala na umieszczenie ich w bezpośrednim sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na rejestrację dynamicznych interakcji międzykomórkowych przy minimalnym zaburzeniu stanu komórek.

Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Dynamiczne obrazowanie żywych komórek umożliwia bezpośrednią wizualizację interakcji w czasie rzeczywistym między komórkami układu odpornościowego1, 2; jednak brak rozdzielczości przestrzennej i...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykorzystanie pułapki optycznej w połączeniu z konfokalną mikroskopią z dyskiem wirującym do obserwacji interakcji między gospodarzem a patogenem w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez uprzednie naniesienie wybranych patogenów na szkiełko nakrywkowe z komorką. Następnie wybierana jest cząstka, która zostaje przechwycona za pomocą pułapki optycznej.Na koniec cząsteczka jest kierowana do wybranej komórki, co przedstawiono tutaj. Pułapkowanie optyczne może być skuteczną metodą kontrolowania dwóch cząsteczek w celu obserwacji dynamicznych oddziaływań wewnątrzkomórkowych.Metoda ta pozwala odpowiedzieć na istotne pytania dotyczące interakcji między gospodarzem a patogenem w dziedzinach chorób zakaźnych i immunologii, w tym na pytanie, jaki jest wpływ na fagocytozę w sytuacji uzyskania pełnej kontroli nad relacjami przestrzennymi między komórkami gospodarza a patogenami, a także czy kolejność pochłaniania patogenów przez komórkę fagocytarną wpływa na dojrzewanie fagosomu. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ warunki pułapkowania muszą zostać zoptymalizowane dla różnych typów komórek i kulek. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, gdyż proces konfiguracji i integracji tarczy wirującej jest złożony.Koncepcja układu konfokalnego w odniesieniu do pułapki optycznej jest trudna do przedstawienia ze względu na konieczność precyzyjnego ustawienia wszystkich komponentów optycznych. Pozyskaj interesujący badacza patogen. Na przykład w tym przypadku 300 mikrolitrów *Candida albicans* hodowanej przez noc w pożywce płynnej zostaje pobranych z kultury, a następnie patogeny są przeniesione do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mililitra.Następnie przemyj patogeny trzykrotnie przy około 1300 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odsysając nadsącz i pozostawiając osad nienaruszony, za każdym razem resuspendując w PBS i poddając sonikacji. Po trzecim przemyciu resuspenduj osad w 500 µL PBS. Następnie rozpuść 1 mg barwnika DiO w 100 µL dimetyloformamidu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/mL.Następnie do probówki z reakcją zawierającej przemyte patogeny dodaje się 3 µL mieszaniny barwników. Probówki należy owinąć folią, ponieważ barwniki są światłoczułe, a następnie wstrząsać próbką w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po tym czasie próbkę należy odwirować i przemyć w PBS 3 razy, analogicznie jak poprzednio. Po ostatnim przemyciu osad resuspenduje się w 300 µL PBS.Podgrzać medium z trypsyną oraz PVS do 37°C w łaźni wodnej. Przemyć 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej z makrofagami RAW 264.7 dwukrotnie za pomocą PBS, odsysając PBS po każdym płukaniu. Następnie pokryć powierzchnię płytki 5 ml trypsyny i inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 37°C.Następnie delikatnie opukaj bok płytki, aby odczepić komórki od jej powierzchni, uważając, by nie rozpryskać trypsyny poza płytkę. Teraz dodaj do płytki pięć mililitrów pożywki i przenieś mieszaninę do probówki reakcyjnej.Po odwirowaniu i otrzymaniu osadu, odessać medium, uważając, aby nie zaburzyć osadu komórkowego, a następnie zawiesić osad w 10 ml medium. Do każdej komory szkiełka z komorami dodać 400 µL medium, a następnie do każdej komory dodać pięć µL zawiesiny komórkowej. Pozostawić komórki do wzrostu na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.Wyjmij szkiełko z komorami z inkubatora i pipetą nanieś od 5 do 10 µL wcześniej przygotowanych, znakowanych fluorescencyjnie patogenów do każdej komory z makrofagami. Dokładnie wymieszaj makrofagi z patogenami, pipetując próbkę w górę i w dół, uważając, aby nie dotknąć dna komory i nie naruszyć przywierających makrofagów. Włącz wszystkie komponenty konfokalnego mikroskopu z dyskiem rotującym.Przygotuj mikroskop, nakładając olej na obiektyw imersyjny. Wsuń szkiełko z komorą do specjalistycznego stolika, a następnie zdejmij górną część komory i ustaw mikroskop do obrazowania DIC. Włącz migawkę pułapki optycznej oraz laser podczerwony (IR).Następnie otwórz migawkę lasera prowadzącego do pułapki optycznej. Upewnij się, że migawka przed laserem IR jest zamknięta, sprawdzając to za pomocą karty IR. Teraz ustaw ostrość na makrofagach na przytwierdzeniu do szkiełka.Następnie należy zlokalizować patogeny swobodnie pływające w roztworze w sąsiedztwie makrofagów. Najtrudniejszą częścią tej procedury jest znalezienie odpowiedniego obiektu do śledzenia w komorze próbki, co wynika z sił adhezji między obiektem a szkiełkiem nakrywkowym w komorze. Aby przesunąć dany obiekt, należy przesuwać stołem, podczas gdy obiekt jest utrzymywany przez laser pułapkujący; należy również pamiętać, że stół musi być przemieszczany z dostatecznie małą prędkością, aby siła oporu nie przekroczyła maksymalnej siły pułapkowania pułapki.Przesuń stolik tak, aby patogen znajdował się w pobliżu pułapki. Następnie otwórz migawkę i aktywuj pułapkę. Przesuń próbkę, aby doprowadzić do kontaktu makrofagów z unieruchomionym w pułapce obrazem patogenu.Patogeny za pomocą konfokalnego mikroskopu z wirującym dyskiem, w trybie DIC, fluorescencji lub kombinacji obu, oddzielne populacje Canada albicans, które mają zazwyczaj około pięciu mikronów wielkości, zostały oznakowane kolorami zielonym, niebieskim i czerwonym. Aby zilustrować obrazowanie, pojedyncza komórka C albicans została pochwycona i przesunięta po kwadracie przez skupisko innych drożdży, co wskazują szare strzałki, wykazując zdolność do przechwytywania i manipulowania konkretną lokalizacją pojedynczego patogenu wybranego przez operatora nawet w zatłoczonym środowisku. Aby dodatkowo zilustrować elastyczność tego systemu w pochwytywaniu różnych morfologii kształtów wykazywanych przez organizmy patogenne na tej rycinie, pęseta optyczna została użyta do utrzymania i usytuowania cząsteczki C albicans z pseudohifą.Komórki C. albicans zostały oznakowane czerwonym barwnikiem i przemieszczone wzdłuż trajektorii zaznaczonej białą strzałką, a następnie umieszczone obok fluorescencyjnych surowych komórek GFPL C3 w kolorze zielonym. Część drożdżowa albicans została uwięziona, podczas gdy pseudohify ciągnęły się za nią.Zarodnik Aspergillus fumigatus został również umieszczony obok surowej makrofagi mysiej, aby przeanalizować dokładny czas fagocytozy w przypadku tej konkretnej linii komórkowej i patogenu. Na tej rycinie obrazy w jasnym polu pokazują, w jaki sposób uwięziony Aspergillus, wskazany białą strzałką, został przemieszczony i ustawiony wzdłuż ścieżki wskazanej czerwoną strzałką. Uwięziony patogen znajduje się nieco poza zakresem ostrości, ponieważ pułapka wypchnęła organizm nieco powyżej płaszczyzny ogniskowej.Grzyb Aspergillus był przemieszczany, aż znalazł się obok wybranej surowej komórki. W momencie nawiązania kontaktu patogenu z komórką pułapkę wyłączono. Następnie aktywowano proces fagocytozy i zastosowano obrazowanie poklatkowe w celu obserwacji kolejnych zdarzeń komórkowych.W 30. sekundzie błona surowej komórki zaczęła ulegać zmianie i tworzyć wgłębienie wokół cząsteczki. W 60. sekundzie wgłębienie było w pełni uformowane. Od 90. do 150. sekundy Afu Gotti ulegał otaczaniu i pochłanianiu, a do 180. sekundy cząsteczka została całkowicie zinternalizowana.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak zbudować aparat do optycznej pułapki z wirującym dyskiem oraz w jaki sposób instrument ten pozwala na nieinwazyjne kontrolowanie patogenów w celu obrazowania żywych komórek po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie oddziaływań między gospodarzem a patogenem do zbadania roli relacji przestrzennych między komórkami gospodarza a patogenami oraz ich wpływu na następującą po nich odpowiedź immunologiczną.

use-an-optical-trap-for-study-host-pathogen-interactions-for-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie pułapki optycznej do badań interakcji gospodarz-patogen w obrazowaniu dynamicznych żywych komórek

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

System opisany tutaj wykorzystuje tradycyjną pułapkę optyczną, jak również niezależną holograficzną linię pułapek optycznych, zdolną do tworzenia i manipulowania wieloma pułapkami. Pozwala to na tworzenie złożonych układów geometrycznych cząstek załamanych światła, a jednocześnie umożliwia jednoczesne szybkie pomiary aktywności enzymów biologicznych w wysokiej rozdzielczości.

Budowa mikroskopu o wysokiej rozdzielczości z konwencjonalnymi i holograficznymi możliwościami optycznego pułapkowania

Obrazowanie żywych komórek zakażeń wirusem opryszczki umożliwia analizę dynamicznych zdarzeń transportu kierowanego i rozprzestrzeniania się międzykomórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodologie, które wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa eksprymujące fluorescencyjne białka fuzyjne, aby ułatwić wizualizację zespołów wirusowych podczas infekcji neuronów pierwotnych.

Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Prezentujemy zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym oraz jej implementację do badania mechaniki komórkowej bez koralików w zarodku Drosophila.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Poznaj metodę pułapki optycznej do badania interakcji gospodarz-patogen z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia precyzyjną manipulację patogenami i dynamiczne obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów