Ocena wpływu szczelinowania hydraulicznego na strumienie przy użyciu mikrobiologicznych sygnatur molekularnych

Protokół ten może być wykorzystany do odpowiedzi na pytanie, czy i w jaki sposób szczelinowanie hydrauliczne wpływa na bakterie w pobliskich strumieniach, a co za tym idzie, na same strumienie. Główną zaletą tej techniki jest jej holistyczny charakter, ponieważ prowadzi badacza od pobrania próbki aż po analizę danych. Procedurę zademonstrują Jeremy Chansee, bioinformatyk w moim laboratorium, Sydney Regal, studentka studiów licencjackich w Juniata College i Gillian Leister, kierowniczka mojego laboratorium.

Aby pobrać próbki osadu do ekstrakcji kwasów nukleinowych, użyj rękawiczek, aby zanurzyć zakorkowaną, sterylną stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów w wodzie strumienia z brzegu. Gdy rurka jest zanurzona, zdejmij nakrętkę i użyj nakrętki, aby zgarnąć około trzech mililitrów osadu z głębokości od jednego do trzech centymetrów do probówki. Po pobraniu próbki wylej z probówki cały litr wody z wyjątkiem około jednego mililitra i użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby dodać trzy mililitry środka konserwującego DNA/RNA do próbki.

Obracać zakręconą stożkową probówkę przez pięć sekund, aby dokładnie wymieszać środek konserwujący i próbkę, a następnie przechowywać próbkę na lodzie. Po powrocie do laboratorium przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w przypadku analizy DNA 16S lub minus 70 stopni Celsjusza w przypadku metatranskryptomicznej analizy RNA. W celu zebrania filtra całkowicie napełnij i opróżnij całą sterylną jednolitrową butelkę trzykrotnie strumieniem wody, aby kondycjonować butelkę przed ostatnim napełnieniem butelki.

Na stabilnej powierzchni nabierz pełną objętość strumienia wody do sterylnej strzykawki typu luer lock i podłącz strzykawkę do sterylnego i wolnego od DNA/RNA filtra polieterosulfonowego o średnicy 1,7 centymetra z porami o wielkości 0,22 mikrona. Przepłukać całą objętość strumienia wody przez filtr. Gdy cała objętość próbki zostanie przefiltrowana w ten sam sposób, wciągnij około 20 mililitrów powietrza do strzykawki i przepchnij powietrze przez filtr, aby usunąć nadmiar wody z filtra.

Następnie za pomocą mikropipety P1000 dodaj dwa mililitry środka konserwującego DNA/RNA do większego otworu filtra, trzymając filtr poziomo końcówką pipety w cylindrze filtra, aby upewnić się, że środek konserwujący dostanie się do filtra. Następnie uszczelnij filtr szczelnie owiniętymi kwadratami folii parafinowej wokół każdego otworu i umieść filtr w sterylnej torbie na próbki na lodzie. Po powrocie z pobierania próbek należy przechowywać filtry dla 16S lub do analizy metatranskryptomicznej, jak pokazano.

Przed rozpoczęciem przenoszenia próbki należy oczyścić obszar roboczy 10% wybielaczem i 70% etanolem. Do ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbki osadu użyj metalowego narzędzia sterylizowanego płomieniem i etanolem, aby przenieść około 250 miligramów próbki do probówki mikrowirówkowej. Do ekstrakcji kwasu nukleinowego z próbki filtra użyj 70% etanolu i sterylizowanego płomieniem uchwytu imadła, aby otworzyć obudowę filtra na sterylnej powierzchni i usunąć rdzeń z obudowy.

Użyj sterylnego skalpela, aby pokroić na górze, na dole i wzdłuż szwu rdzenia, a następnie użyj sterylnej pęsety, aby złożyć bibułę filtracyjną przed pocięciem jej na małe kawałki skalpelem. Następnie ostrożnie umieść elementy filtra w probówce mikrowirówkowej, nie kontaktując się z żadnymi niewysterylizowanymi powierzchniami. W celu lizy komórek w dowolnym typie próbki, należy poddać probówkę działaniu zakłócacza komórek z dużą prędkością.

Po upływie co najmniej pięciu minut odwirować próbki i przenieść supernatant do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. Dodać bufor do lizy do supernatantu w stosunku jeden do jednego i przenieść roztwór do dostarczonego filtra. Umieść filtr w nowej probówce do mikrowirówki i dodaj do probówki 400 mikrolitrów buforu przygotowawczego.

Po odwirowaniu dodać 700 mikrolitrów buforu płuczącego do probówki i ponownie odwirować filtr. Po odrzuceniu przepływu, dodać 400 mikrolitrów buforu płuczącego do probówki w celu dodatkowego odwirowania i przenieść filtr do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki. Aby wymyć DNA, należy potraktować filtr 50 mikrolitrami wody wolnej od DNaz/RNaz przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

W międzyczasie umieść filtr trzech HRC w probówce zbiorczej i dodaj 600 mikrolitrów roztworu przygotowawczego HRC. Po odwirowaniu przenieś filtr do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki i przenieś wymyte DNA do filtra w celu odwirowania. Przepływowy zawiera wyekstrahowane DNA.

Aby stworzyć bibliotekę DNA 16S RNA, najpierw użyj świeżo wyekstrahowanego produktu DNA do amplifikacji rybosomalnego RNA 16S za pomocą standardowego protokołu PCR. Wymieszaj siedem mikrolitrów powstałego produktu PCR i 13 mikrolitrów wody wolnej od DNaz i załaduj roztwór PCR na 2% żel agarozowy. Następnie uruchom żel pod napięciem 90 V przez 60 do 90 minut, aby sprawdzić, czy rozmiar pasma wynosi 386 par zasad jako dowód udanego wzmocnienia.

Aby oczyścić bibliotekę rybosomalnego RNA DNA 16S, należy zebrać 10 mikrolitrów produktów PCR, które dały jasne prążki i 13 mikrolitrów próbek, które dały słabe prążki w sterylnej probówce mikrowirówkowej i załadować około 150 do 200 nanogramów każdej próbki zbiorczej do indywidualnych dołków nowego 2% żelu. Po uruchomieniu żelu, jak pokazano, wytnij 386 prążków par zasad z żelu i użyj komercyjnego zestawu do oczyszczenia DNA. Następnie wymyj oczyszczone DNA za pomocą 30 mikrolitrów 10-milimolowego chlorowodorku Tris i zapakuj oczyszczone biblioteki w suchy lód przed wysyłką do sekwencjonowania nowej generacji.

W tej reprezentatywnej analizie wszystkie ekstrakcje z wyjątkiem jednej zostałyby uznane za udane. Jasne prążki obserwowane po amplifikacji PCR wskazują na sukces protokołu 16S. Próbki 16S powinny mieć co najmniej 1 000 sekwencji, przy czym co najmniej 5 000 jest idealne, podczas gdy próbki metatranskryptomiczne powinny mieć co najmniej 500 000 sekwencji, przy czym co najmniej 2 miliony są idealne.

Pokazano próbki osadów z 21 różnych miejsc w 13 różnych strumieniach dla 16S i analizy metatranskryptomicznej. Z tych 21 miejsc, 12 znajdowało się poniżej szczelinowania hydraulicznego i zostało sklasyfikowanych jako dodatnie przy szczelinowaniu hydraulicznym, a dziewięć znajdowało się albo przed szczelinowaniem, albo w dziale wodnym, w którym szczelinowanie nie było i zostało sklasyfikowane jako szczelinowanie hydrauliczne ujemne. Jak oceniono za pomocą analizy PERMANOVEJ, zaobserwowana separacja między pozytywnymi i negatywnymi danymi z szczelinowania hydraulicznego sugeruje, że szczelinowanie miało wpływ

Najważniejsze losowe predyktory lasu ujawniłyby, które cechy są najbardziej istotne dla prawidłowego różnicowania próbek. Jeśli takson zostanie zidentyfikowany jako ważny przez losowy model leśny, jego profil odporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w próbkach dodatnich do szczelinowania hydraulicznego można porównać z jego profilem w próbkach ujemnych przy szczelinowaniu hydraulicznym. Jeśli znacznie się różnią, może to sugerować, że płyn szczelinujący zawierający biocydy dostał się do strumienia.

Drobnoustroje są wszędzie, więc zanieczyszczenie jest poważnym potencjalnym problemem przy tego typu pracach. Początkowe etapy przenoszenia próbki są na to szczególnie podatne. Jeśli ktoś jest zainteresowany biodegradacją drobnoustrojów lub innymi metabolizmami, sekwencjonowanie RNA typu shotgun może być wykorzystane do zbadania aktywnej ekspresji genów drobnoustrojów.

Technika ta pozwala na standaryzację technik molekularnych do badania społeczności bakteryjnych in-situ, a także analizy bioinformatyczne danych dotyczących sekwencji bakterii.