Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Ogólnym celem tego testu Duplex Digital PCR jest jednoczesne ilościowe określenie ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodzie. Test ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące monitorowania jakości wody rekreacyjnej, takie jak, ile w wodach znajduje się ogólny wskaźnik kału, tj. Enterococcus i, co ważniejsze, marker HF183 związany z kałem.

Główną zaletą tego testu jest to, że określa ilościowo dwa cele w jednej reakcji i w porównaniu z qPCR eliminuje potrzebę prowadzenia krzywych standardowych, a tym samym związane z tym odchylenie i zmienność. Procedurę zademonstruje Meredith Raith, nasz starszy technik ds. badań. Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw przygotuj 100 mikromoli na litr stężeń podstawowych dla wszystkich starterów w wodzie molekularnej i sond w buforze TEPH 8, jak opisano w tekście protokołu.

Następnie przygotuj Master Mix, mieszając odpowiednie ilości mieszanki Digital PCR, starterów do przodu i do tyłu, sondy fluorescencyjnej i wody wolnej od nukleaz. Pipetować w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby wymieszać, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu. Ponieważ dPCR Master Mix jest bardziej lepki niż konwencjonalny qPCR Master Mix, konieczne jest stosowanie mieszania techniką pipetowania w celu uzyskania jednorodnego roztworu.

Pozwala to na dokładną kwantyfikację dPCR na dalszych etapach. Aby przygotować mieszaninę testową do generowania kropelek do pobierania próbek w dwóch egzemplarzach, należy odpipetować 36 mikrolitrów mieszanki głównej na zwykłą płytkę do PCR. Do każdej z 36 mikrolitrowych mieszanek głównych wymieszaj 12 mikrolitrów matrycy DNA, pozostawiając odpowiednie dołki replikacji puste na płytce.

Uwzględnij kontrole pozytywne, aby upewnić się, że test działa prawidłowo. Nie dołączaj żadnych kontrolek szablonowych ani NTC, aby upewnić się, że na płytce nie ma zanieczyszczeń i ustawić później fluorescencyjną linię bazową do analizy danych. Przed skonfigurowaniem generatora kropel wymieszaj mieszaniny testowe za pomocą pipety wielokanałowej, aby pipetować mieszaniny w górę iw dół około 15 razy.

Upewnij się, że końcówka pipety pozostaje w cieczy, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w mieszaninie. Następnie włóż pierwszy wkład zawierający osiem dołków do białego uchwytu na wkład i zatrzaśnij uchwyt wkładu. Pierwszy wkład jest teraz mocno osadzony i nie można go wysunąć z uchwytu podczas generowania kropel.

Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie przenieś 20 mikrolitrów mieszaniny testowej do środkowej pozycji próbki oznaczonej wkładem, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza. Odpipetować 70 mikrolitrów oleju Droplet Generation do lewej strony wkładu oznaczonego olejem. Przykryj wkład uszczelką, upewniając się, że uszczelka jest płaska i równomiernie trzymana przez cztery znaczniki w kierunku krawędzi wkładu.

Naciśnij podświetlony na zielono przycisk na generatorze kropel, aby otworzyć drzwiczki i umieścić wkład. Naciśnij przycisk ponownie, aby zamknąć generator. Po zamknięciu drzwi zielony przycisk jest przyciemniony i nie można ich ponownie otworzyć.

Generowanie kropel rozpocznie się natychmiast i będzie trwało około jednej minuty. W trakcie generowania kropli należy umieścić dwa naboje w drugim białym uchwycie na naboje i przygotować je w taki sam sposób, jak w przypadku wkładu pierwszego. Po zakończeniu generowania kropel słabo podświetlony przycisk zmieni kolor na zielony.

Otwórz drzwiczki generatora kropel, wyjmij biały uchwyt na nabój zawierający nabój pierwszy i odłóż go na bok. Umieść drugi wkład w generatorze kropel. Usuń uszczelkę z pierwszego wkładu i wyrzuć.

Nie odklikuj białego uchwytu wkładu, ponieważ może to spowodować przerwanie nowo wygenerowanych kropel. Używając pipety wielokanałowej ustawionej na 40 mikrolitrów, włóż końcówki do trzeciej kolumny kropli oznaczonych wkładem pod kątem 45 stopni i powoli pipetuj wszystkie kropelki. Przenieś je na końcową płytkę do PCR, przykładając końcówkę pipety do ścianki studzienki mniej więcej do połowy i powoli usuwając kropelki.

W ten sam sposób, po zakończeniu generowania kropel dla drugiego wkładu, usuń uszczelkę z drugiego wkładu i przenieś wytworzone kropelki na końcową płytkę PCR. Umieść przebijaną osłonę foliową na wierzchu płytki i umieść ją na zgrzewarce do płyt. Ustaw zgrzewarkę na 180 stopni Celsjusza, naciśnij przycisk luzu na zgrzewarce i uszczelniaj przez 10 sekund.

Aby rozpocząć tę procedurę, umieść szczelnie zapieczętowaną końcową płytkę PCR w termocyklerze. Użyj termocyklera, który jest kompatybilny z końcową płytką PCR i ma prędkość narastania temperatury wynoszącą dwa stopnie Celsjusza na sekundę. Uruchom następujący program termiczny przez dziesięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie 40 cykli po 30 sekund w temperaturze 94 stopni Celsjusza i 60 sekund w temperaturze 60 stopni Celsjusza, a następnie dziesięciominutowe zatrzymanie w temperaturze 98 stopni Celsjusza.

Po zakończeniu cyklu przenieś płytkę do czytnika kropel w celu automatycznego pomiaru fluorescencji w każdej kropli w każdym dołku. Upewnij się, że kropelki mają temperaturę pokojową przed przystąpieniem do odczytu kropel. Zacznij od otwarcia dołączonego oprogramowania, aby skonfigurować odczyt kropelkowy.

W domyślnym menu ustawień zawierającym schemat pustej płytki 96-dołkowej, kliknij dwukrotnie basenik A1, aby otworzyć menu zawierające trzy sekcje: Próbka, Test 1 i Test 2. W sekcji Przykład wpisz identyfikator próbki w polu oznaczonym Nazwa i zaznacz pole po prawej stronie oznaczone jako Zastosuj. Następnie kliknij menu rozwijane z etykietą eksperyment, wybierz CZERWONY dla wykrywania rzadkich zdarzeń i kliknij Enter.

Przejdź do sekcji oznaczonej Test 1. W sekcji Nazwa wypełnij pole Test i kliknij Enter. W polu poniżej oznaczonym Typ kliknij menu rozwijane, wybierz Kanał 1 Nieznany i kliknij Enter.

Przejdź do sekcji oznaczonej Test 2. W sekcji Nazwa wypełnij pole Test i kliknij Enter. W polu poniżej oznaczonym Typ kliknij menu rozwijane, wybierz Kanał 2 Nieznany i kliknij Enter.

Wszystkie informacje z poprzednich etapów są teraz obecne w studzience A1.Name wszystkich kolejnych studzienkach zawierających kropelki. Aby zaoszczędzić całkowity czas konfiguracji, kliknij Shift lub Control, aby wybrać wiele dołków jednocześnie. Gdy cyfrowy obraz tablicy odzwierciedla fizyczną tablicę, naciśnij przycisk OK w prawym dolnym rogu menu.

W nowym menu, które pojawi się w górnej części schematu płyty, w obszarze Szablon wybierz Zapisz jako, nazwij i zapisz blachę. Po lewej stronie ekranu kliknij Uruchom i wybierz odpowiedni zestaw barwników w wyskakującym oknie Opcje uruchamiania. Zbieranie danych rozpocznie się i jest wyświetlane w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu.

Gdy czytnik zakończy pracę i pojawi się okno z informacją Uruchom zakończono, kliknij przycisk OK. Sprawdź separację między kroplami dodatnimi i ujemnymi. Upewnij się, że fluorescencyjne we wszystkich kropelkach w studzienkach NTC są bliskie linii podstawowej. Kliknij przycisk oznaczony Wydarzenia.

U dołu kliknij pole o nazwie Pojedyncze, a po prawej stronie prezentowanego Histogramu kliknij pole o nazwie Suma, aby wyświetlić całkowitą liczbę zaakceptowanych kropel na studzienkę. Wyklucz wszystkie studzienki zawierające mniej niż 10 000 kropel, przytrzymując Control i klikając studzienki, które mają zostać wykluczone. Kliknij przycisk oznaczony amplitudą 1D, aby ustawić próg fluorescencyjny na około jedno odchylenie standardowe ujemnych kropel w studzienkach NTC dla obu celów.

Po lewej stronie ekranu pod Automatyczna analiza pokazująca dwa przyciski progowe wybierz ikonę po prawej stronie, przez którą przebiega ciągła różowa pozioma linia. Kliknij pole po lewej stronie opcji Ustaw próg pod każdym z wykresów amplitudy i wprowadź odpowiednie wartości progu fluorescencji. Docelowe stężenia w kopii na mikrolitr reakcji są następnie obliczane automatycznie.

Wyeksportuj wyniki do pliku CSV, klikając przycisk Eksportuj w lewym górnym rogu ekranu Amplituda 1D. W pliku CSV pomnóż wyeksportowane stężenie docelowe przez cztery, aby przekonwertować je z kopii celu na mikrolitr reakcji na kopię celu na mikrolitr matrycy DNA. Na tym rysunku porównano formaty dupleksu i sympleksu w teście Digital PCR.

Lewy i prawy panel wyświetlają odpowiednio kwantyfikację Enterococcus i HF183 z odpowiednimi współczynnikami korelacji między wynikami dupleksu i sympleksu. Linie ciągłe wskazują linie regresji, a szare cieniowanie oznacza odpowiednie błędy standardowe. Symbole oznaczają różne rodzaje próbek.

Wyniki są bardzo spójne i często nie można ich odróżnić, niezależnie od tego, czy Enterococcus i HF183 są mierzone jednocześnie w jednej reakcji, czy osobno w dwóch reakcjach. Test Digital PCR może również tolerować inhibitor w stężeniach o jeden do dwóch rzędów wielkości wyższych niż tolerowane przez jego odpowiedniki qPCR. Rysunek ten przedstawia kwantyfikację qPCR i Digital PCR markera HF183 w DNA czystych ścieków ze wzrostem stężenia kwasu humusowego, który hamuje PCR.

Oczekiwana kwantyfikacja HF183 przy braku inhibitorów jest definiowana jako 95% pewność między dwiema poziomymi liniami przerywanymi. Cyfrowy PCR oznaczony trójkątami nadal zapewnia dokładną kwantyfikację do stężenia kwasu humusowego wynoszącego 15 nanogramów na mikrolitr reakcji, podczas gdy qPCR oznaczony krzyżówkami zaczyna być niedoceniany przy jednym nanogramie na mikrolitr i zostaje całkowicie zahamowany przy pięciu nanogramach na mikrolitr. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać ten dojelitowy test HF183 Duplex Droplet Digital PCR lub inny podobny test przy użyciu różnych starterów i sond.

Od czasu opracowania tego testu Duplex, który został opublikowany w Water Research w 2015 roku, opracowaliśmy i walidujemy mnóstwo innych cyfrowych testów PCR, które są ukierunkowane na ogólne bakterie wskaźnikowe kału, markery śledzenia drobnoustrojów i patogeny przenoszone przez wodę. Testy te zapewniają bezpośrednią i bezstronną kwantyfikację ich celu i stają się użyteczną alternatywą dla testów qPCR w dziedzinie badań jakości wody.