Name: Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Poznaj dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i markera HF183 w wodzie rekreacyjnej. Ta metoda eliminuje krzywe wzorcowe, zapewniając dokładniejszą ocenę jakości wody i ochronę zdrowia publicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Przygotowanie mieszaniny testowej
<ol>
	<li>Przygotować 100 μmol/l stężenia podstawowe dla wszystkich starterów w wodzie molekularnej i sondach w buforze TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP13]. 
	Uwaga: Sondy dla dwóch celów są znakowane fluorescencyjnie różnymi fluoroforami7, jak wskazano w Wykazie materiałów/sprzętu.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę wzorcową, mieszając, zgodnie z planowaną reakcją, 12 μl cyfrowej mieszanki PCR (2x zapas, patrz Lista materiałów/sprzętu), 0,216 μl każdego startera do przodu i do tyłu, 0,06 μl każdej sondy fluorescencyjnej i 5,016 μl wody wolnej od nukleaz (końcowe stężenie: 900 nM każdy starter, 250 nM każda sonda). Pipetować w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby wymieszać, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu.</li>
	<li>Odpipetować 18 μl mieszanki wzorcowej (z kroku 1.2) do zwykłej probówki lub płytki PCR, mieszając z 6 μl matrycy DNA (ekstrahowanej w sposób opisany wcześniej13) w celu uzyskania mieszaniny do oznaczania do wytwarzania kropel. W przypadku pobierania próbek w dwóch egzemplarzach należy odpipetować 36 μl mieszanki wzorcowej i 12 μl matrycy DNA do każdego dołka. Pozostawić odpowiednie studzienki repliki puste na płytce. Uwzględnij kontrole dodatnie (patrz Wykaz materiałów/sprzętu) i nie zawieraj kontroli matrycowych (NTC) (tj. z wodą molekularną użytą jako szablon). 
	Uwaga: Kontrola pozytywna jest konieczna, aby upewnić się, że test przebiega prawidłowo, a NTC jest niezbędna, aby upewnić się, że na płytce nie ma zanieczyszczeń i ustalić fluorescencyjną linię bazową w dalszej części analizy danych. Użytkownikom po raz pierwszy zaleca się stosowanie zarówno nierozcieńczonych, jak i rozcieńczonych próbek DNA.</li>
</ol>
2. Generacja kropel i konfiguracja płytki PCR
<ol>
	<li>Wymieszać mieszaniny testowe, pipetując w górę w dół około 15 razy za pomocą pipety wielokanałowej. Upewnij się, że końcówka pipety pozostaje w cieczy, aby uniknąć tworzenia się nadmiaru pęcherzyków w mieszaninie.</li>
	<li>Włóż wkład 1 (zawierający 8 dołków) do białego uchwytu na wkład i zatrzasnij uchwyt wkładu. Kartridż 1 jest teraz mocno osadzony i nie można go wysunąć z uchwytu podczas generowania kropel. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie przenieść 20 μl mieszaniny testowej do środkowego położenia wkładu oznaczonego "Próbka", nie wprowadzając pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 70 μl oleju wytwarzającego kropelki na lewą stronę wkładu (oznaczonego "Olej").</li>
	<li>Przykryj wkład uszczelką, upewniając się, że uszczelka jest płaska i równomiernie trzymana przez 4 kleszcze w kierunku krawędzi wkładu. Naciśnij podświetlony na zielono przycisk na generatorze kropel, aby otworzyć i umieścić wkład. Naciśnij ponownie przycisk z zielonym światłem, aby zamknąć generator. 
	Uwaga: Po zamknięciu drzwi przycisk jest przyciemniony, drzwi nie można ponownie otworzyć, a wytwarzanie kropel rozpoczyna się natychmiast, trwając przez około 1 minutę.</li>
	<li>Jeśli wykonujesz więcej niż 8 reakcji, umieść wkład 2 w drugim białym uchwycie na wkład i przygotuj go w taki sam sposób, jak wkład 1, podczas gdy trwa wytwarzanie kropli, aby zaoszczędzić całkowity czas konfiguracji.</li>
	<li>Otwórz drzwiczki generatora kropel, gdy przyciemniony podświetlony przycisk zmieni kolor na zielony, wskazując zakończenie generowania kropel. Wyjmij biały uchwyt wkładu zawierającego wkład 1, odłóż na bok i umieść wkład 2 na generatorze kropel.</li>
	<li>Usuń uszczelkę z wkładu 1 i wyrzuć. Delikatnie przenieść całkowitą objętość (około 40 μl) wytworzonych kropel z trzeciej kolumny wkładu (oznaczonej "Kropelkami") na końcową płytkę PCR (utrzymywaną w temperaturze pokojowej) w celu przeprowadzenia cykli termicznych. 
	Uwaga: Nie odznaczaj białego uchwytu na wkład, ponieważ może to spowodować przerwanie nowo wygenerowanych kropel; Uchwyt wkładu należy otwierać dopiero po przeniesieniu kropelek na ostateczną płytkę.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.1-2.7 dla dodatkowych próbek.</li>
	<li>Gdy wszystkie kropelki znajdą się na końcowej płytce do PCR, umieść na niej foliową osłonę z możliwością przekłuwania i umieść ją na uszczelniarce do płytek. Ustaw zgrzewarkę na 180 °C, naciśnij przycisk "Play" na zgrzewarce i pozostaw na 10 sekund.</li>
</ol>
3. Cykl termiczny i odczyt kropelek
<ol>
	<li>Umieść zapieczętowaną płytkę na termocyklerze, kompatybilną z końcową płytką PCR użytą w kroku 2.7 i prędkość narastania temperatury 2.0 °C/s.</li>
	<li>Uruchomić program termiczny w następujący sposób: 10 minut w temperaturze 95 °C, następnie 40 cykli po 30 sekund w temperaturze 94 °C i 60 sekund w temperaturze 60 °C, a następnie 10-minutowe zatrzymanie w temperaturze 98 °C (opcjonalnie: końcowe zatrzymanie w temperaturze 4 lub 15 °C).</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu przenieś płytkę do czytnika kropel w celu automatycznego pomiaru fluorescencji w każdej kropli w każdym dołku. Alternatywnie, należy przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C do 3 dni przed odczytem kropli. Upewnij się, że kropelki mają temperaturę pokojową przed przystąpieniem do czytania.
	<ol>
		<li>Otwórz dołączone oprogramowanie, aby skonfigurować odczyt kropli. W domyślnym menu "Ustawienia" zawierającym schemat pustej płytki 96-dołkowej, kliknij dwukrotnie na basenik A1, aby otworzyć menu zawierające trzy sekcje: "Próbka", "Test 1" i "Test 2".</li>
		<li>W sekcji "Próbka" wpisz identyfikator próbki w polu oznaczonym "Nazwa" i naciśnij enter lub zaznacz pole po prawej stronie oznaczone jako "Zastosuj". Następnie kliknij menu rozwijane oznaczone "Eksperyment" i wybierz "CZERWONY" (wykrywanie rzadkich zdarzeń) i kliknij enter.</li>
		<li>Przejdź do sekcji oznaczonej jako "Test 1". W sekcji "Nazwa" wpisz test (np. Enterococcus) i kliknij Enter. W polu poniżej oznaczonym "Typ" kliknij menu rozwijane, wybierz "Kanał 1 nieznany" i kliknij Enter.</li>
		<li>Przejdź do sekcji oznaczonej jako "Test 2". W sekcji "Nazwa" wypełnij test (np. HF183) i kliknij Enter. W polu poniżej oznaczonym "Typ" kliknij menu rozwijane, wybierz "Kanał 2 nieznany" i kliknij Enter. Wszystkie informacje z kroków 3.3.2 do 3.3.4 są teraz obecne w studzience A1.</li>
		<li>Nazwij wszystkie kolejne studzienki zawierające kropelki. Aby zaoszczędzić całkowity czas instalacji, kliknij "Shift" lub "Ctrl", aby wybrać wiele dołków jednocześnie.</li>
		<li>Gdy cyfrowy obraz tablicy odzwierciedla fizyczną tablicę, naciśnij przycisk "OK" w prawym dolnym rogu menu. W nowym menu, które pojawi się w górnej części schematu płyty, w sekcji "Szablon" wybierz "Zapisz jako" oraz nazwij i zapisz płytę.</li>
		<li>Po lewej stronie ekranu kliknij "Uruchom" i wybierz odpowiedni zestaw barwników w wyskakującym oknie "Opcje uruchamiania". Rozpoczyna się zbieranie danych, które są wyświetlane w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych i raportowanie
<ol>
	<li>Gdy czytnik zakończy pracę i pojawi się pole z napisem "Uruchom zakończono", kliknij "OK". 
	Uwaga: Oprogramowanie wyświetla ostateczny plik danych w sekcji "Analizuj" oprogramowania. W tym widoku oprogramowanie wybiera wszystkie studzienki w płycie i domyślnie ustawia wykres danych "Amplituda 2D".</li>
	<li>Sprawdź separację między kroplami dodatnimi i ujemnymi. Upewnij się, że fluorescencja we wszystkich kropelkach w studzienkach NTC jest bliska linii podstawowej.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Zdarzenia". Po prawej stronie prezentowanego histogramu kliknij pole o nazwie "Łącznie" i pole o nazwie "pojedyncze" na dole, aby wyświetlić całkowitą liczbę zaakceptowanych kropel na studzienkę. Wyklucz wszystkie studzienki zawierające <10 000 kropel7, przytrzymując Ctrl i klikając studzienkę, która ma zostać wykluczona.</li>
	<li>Kliknij przycisk oznaczony jako "Amplituda 1D", aby ustawić próg fluorescencyjny na około jedno odchylenie standardowe (500-700 jednostek fluorescencji) powyżej ujemnych kropelek w studzienkach NTC dla obu celów. Po lewej stronie ekranu pod "Automatyczną analizą" pokazującą dwa przyciski progowe wybierz ikonę po prawej stronie, przez którą przebiega ciągła różowa pozioma linia.</li>
	<li>Kliknij pole po lewej stronie opcji "Ustaw próg" pod każdym z wykresów amplitudy i wprowadź odpowiednie wartości progu fluorescencji. Następnie automatycznie obliczane są stężenia docelowe w kopii na μl reakcji. 
	Uwaga: progi nie muszą być identyczne dla różnych wartości docelowych.</li>
	<li>Wyeksportuj wyniki do pliku .csv, klikając przycisk "Eksportuj" w lewym górnym rogu ekranu Amplituda 1D. W pliku .csv pomnóż wyeksportowane stężenie docelowe przez 4, aby przeliczyć je z kopii celu (gen 23S Enterococcus spp. lub marker HF183) na reakcję μl na kopię matrycy DNA na cel na μl.</li>
</ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W protokole jest kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, mieszanie mieszanin testowych może być trudne, ponieważ mieszanka wzorcowa jest bardziej lepka niż konwencjonalne mieszanki wzorcowe qPCR. Proste wirowanie może prowadzić do niewystarczającego wymieszania, co z kolei prowadzi do nierównomiernego rozmieszczenia matryc DNA w mieszaninach testowych, a następnie w kropelkach. Aby zapewnić dokładne oznaczanie ilościowe dPCR, należy postępować zgodnie z techniką mieszania przez pipetowanie opisaną w protokole. Po drugie, ...

Metody ilościowego PCR (qPCR) są szeroko stosowane do monitorowania jakości wody rekreacyjnej i śledzenia źródeł mikrobiologicznych, ponieważ są szybsze, bardziej elastyczne i specyficzne w porównaniu do tradycyjnych metod opartych na kulturach. W związku z tym qPCR jest zalecany do uzyskania szybkich wyników monitorowania wody pod kątem ogólnych wskaźników kałowych, takich jak Enterococcus spp., w zmienionych kryteriach jakości wody rekreacyjnej USEPA1. Opracowano również i zwalidowano wiele testów qPCR w celu identyfikacji źródeł zanieczyszczenia kałem w wodach środowiskowych2. Wśród nich testy markerów HF183 są jednymi z najczęściej stosowanych do identyfikacji zanieczyszczenia kałem związanego z człowiekiem3.
Jednak wyniki qPCR często mogą być stronnicze, ponieważ opierają się na standardowych krzywych do kwantyfikacji. qPCR określa ilościowo nieznane stężenia celu w próbkach poprzez interpolację ich cyklu kwantyfikacji (Cq) od krzywej standardowej, która opisuje liniową zależność między Cq a wielkością logarytmiczną zestawu seryjnie rozcieńczonych wzorców. Brak wiarygodnego i spójnego wzorcowego materiału referencyjnego może zatem znacznie zniekształcić wyniki qPCR. Badania wykazały, że wyniki qPCR różniły się o około pół logarytmu przy użyciu wzorców od różnych dostawców4 i 2-krotnie przy użyciu różnych partii wzorców od tego samego dostawcy5.
Technologia Digital PCR (dPCR) kwantyfikuje nieznaną próbkę, zliczając częstość dodatnich wyników w dużej liczbie miniaturowych reakcji PCR, które są generowane przez podzielenie masowego qPCR na tysiące lub miliony jednolitych reakcji nanolitrowych lub pikolitrowych6. Jest on określany odpowiednio jako kropelkowy cyfrowy PCR (tj. ten artykuł) lub cyfrowy PCR komorowy, jeśli przegrodami są kropelki wody w oleju (tj. ten artykuł) lub małe komory na chipie. Wyższe stężenie próbki spowoduje obecność docelowego DNA (stąd dodatni PCR) w większym odsetku partycji, zależność przybliżoną przez rozkład Poissona. W związku z tym rejestrowane są wyniki binarne (dodatni lub ujemny PCR), a częstotliwość dodatnich kropel jest wykorzystywana do obliczania nieznanych stężeń próbek bezpośrednio za pomocą przybliżenia Poissona, eliminując potrzebę stosowania krzywej wzorcowej, jak w qPCR.
Ta binarna natura cyfrowej kwantyfikacji PCR zapewnia dodatkowe zalety w porównaniu z qPCR7. Ponieważ opóźniona amplifikacja może nadal dawać dodatni wynik PCR, kwantyfikacja dPCR jest bardziej odporna na inhibicję, która zmniejsza wydajność amplifikacji. Podobnie, na kwantyfikację dPCR nie ma wpływu zmienność wartości Cq, tak jak w przypadku qPCR, co prowadzi do większej precyzji dPCR w porównaniu z qPCR8-10.
Ponadto, proces partycjonowania zapewnia bardzo małą ilość docelowego DNA obecnego w każdej kropli, skutecznie minimalizując konkurencję substratów (podczas amplifikacji różnych celów DNA), które są częstymi przeszkodami w osiągnięciu dupleksowania (tj. test jednocześnie mierzy dwa cele DNA) w qPCR. W związku z tym, niezależnie od tego, czy jest prowadzony w trybie dupleksowym, czy jednostronnym (tj. jeden cel jest mierzony w jednym teście), dPCR daje prawie nierozróżnialną kwantyfikację obu celów7,11.
Celem cyfrowego testu PCR (EntHF183 dPCR) opisanego w tym artykule jest uzyskanie jednoczesnej bezpośredniej kwantyfikacji ogólnego wskaźnika kału Enterococcus spp. i ludzko-kałowego markera HF183 z większą precyzją, powtarzalnością i odpornością na inhibicję w porównaniu do jego odpowiedników qPCR. Test ten został z powodzeniem wykorzystany do ilościowego określenia zanieczyszczenia kałem w środowisku słodkiej wody, wodzie morskiej i różnych materiałach kałowych7, ale może być również stosowany do wszelkich innych rodzajów wód i ścieków. Test ten jest bardzo obiecujący do analizy osadów lub gleb ze względu na wysoką tolerancję na inhibicję, ale wymagane są dalsze badania ze względu na złożoność mieszanin inhibitorów w tego typu próbkach.

<table><tbody><tr><td>Mikroprobówki o niskim poziomie wiązania</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>Do przechowywania odczynników, próbek/produkcji mieszanek głównych</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE bufor pH 8</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>Hardshell 96 Płytka dołkowa</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>Do wstępnej mieszanki głównej i inokulacji próbki</td></tr><tr><td>Aluminiowa folia</td> <td>uszczelniającaBioRad</td><td>359-0133</td><td>Do uszczelnienia płytki próbki</td></tr><tr><td>Generator kropel</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>Olej do wytwarzania kropel</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td> Wkład BioRad 186-4008 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DG8 Uchwyt wkładu</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; l końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>Do tansferring sample/master mix do cartidge</td></tr><tr><td>200 &#956; l Końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>Do przenoszenia kropel do końcowej płytki Twin.Tec</td></tr><tr><td>Płytka studzienkowa Twin.Tec 96</td><td>Eppendorf</td><td>951020320</td><td>Do końcowych kropel Cykl termiczny i odczyt</td></tr><tr><td>Folia termozgrzewalna do przekłuwania</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>Do uszczelniania płytki Twin.Tec przed cyklem termicznym</td></tr><tr><td>Uszczelniarka do płytek PCR PX1</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Thermalcycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96 i C1000</td><td>Potrzebny jest tylko termocykler, brak optyki</td></tr><tr><td>QX100 Czytnik kropel</td><td>BioRad</td><td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik kropel Olej</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Kroplowy PCR Supermix&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>i.e. cyfrowa mieszanka PCR w rękopisie</td></tr><tr><td>oprogramowania QuantaSoft (v1.3.2)</td><td>Quantasoft&nbsp;</td><td>QX100&nbsp;</td><td>Do przeglądania, analizowania i eksportowania danych ddPCR</td></tr><tr><td>Entero Forward Primer (Ent F1A)</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>Można użyć alternatywnego dostawcy</td></tr><tr><td>Entero Reverse Primer (Ent R1)</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATCATT</td><td>Można użyć alternatywnego dostawcy</td></tr><tr><td>Entero Probe (GPL813TQ)</td><td>Operon</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td><td>Można użyć alternatywnego dostawcy, ale floroforem musi być FAM</td></tr><tr><td>HF183 Forward Primer ( HF183-1)</td><td>Operon</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>Można użyć alternatywnego</td></tr><tr><td>dostawcy HF183 Reverse Primer (BthetR1)</td><td>Operon</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGTGT</td><td>Alternatywnego dostawcy można użyć</td></tr><tr><td>sondy HF183 (BthetP1)</td><td>Operon</td><td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>Można użyć alternatywnego dostawcy, ale florofor musi być HEX (jeśli używasz VIC, należy wybrać odpowiednią kompensację matrycową. &nbsp;</td></tr><tr><td>Kontrola</td><td></td><td></td> pozytywna <td>Mieszanina genomowego DNA E. faecalis i standardowego plazmidu HF183 (zamówionego w IDT). Szczegółowe metody hodowli E. faecalis oraz sekwencje uporządkowanego plazmidu HF183 można znaleźć w Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Dostępne na rynku wzorce DNA Enterococcus (ATCC 29212Q-FZ) mogą być również stosowane w kontroli pozytywnej zamiast genomowego DNA E. faecalis</td></tr></tbody></table>.

dupleksowy cyfrowy test pcr do jednoczesnej kwantyfikacji enterococcus spp. i ludzkiego markera hf183 związanego z kałem w wodzie

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR (EntHF183 dPCR) do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzki marker HF183 związany z kałem. Test dPCR duplex EntHF183 (określany dalej jako EntHF183 dPCR) wykorzystuje te same sekwencje startera i sondy, co jego opublikowane indywidualne ilościowe odpowiedniki PCR (qPCR). Podobnie, przed uruchomieniem dPCR stosuje się te same procedury filtracji wody i ekstrakcji DNA, które zostały wykonane przed qPCR. Jednak test dPCR duplex ma kilka zalet w porównaniu z testami qPCR. Co najważniejsze, test dPCR eliminuje potrzebę prowadzenia krzywej standardowej, a co za tym idzie, związanego z nią odchylenia i zmienności, poprzez bezpośrednią kwantyfikację jego celów. Ponadto, podczas gdy dupleksowanie (tj. jednoczesna kwantyfikacja) Enterococcus i HF183 w qPCR często prowadzi do poważnego niedoszacowania mniej licznego celu w próbce, dPCR zapewnia spójną kwantyfikację obu celów, niezależnie od tego, czy są one określane ilościowo indywidualnie, czy jednocześnie w tej samej reakcji. Test dPCR jest również w stanie tolerować stężenia inhibitorów PCR, które są o jeden do dwóch rzędów wielkości wyższe niż te tolerowane przez qPCR. Te zalety sprawiają, że test dPCR EntHF183 jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ jednocześnie dostarcza dokładnych i powtarzalnych informacji na temat zarówno ogólnego, jak i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach środowiskowych bez konieczności przeprowadzania dwóch oddzielnych testów qPCR. Pomimo zalet w porównaniu z qPCR, górna granica oznaczalności testu dPCR przy użyciu obecnie dostępnego oprzyrządowania jest o około cztery rzędy wielkości niższa niż możliwa do osiągnięcia za pomocą qPCR. W związku z tym rozcieńczenie jest potrzebne do pomiaru wysokich stężeń organizmów docelowych, takich jak te zwykle obserwowane po wyciekach ścieków.

Prawidłowy przebieg dPCR dla dupleksu EntHF183 powinien skutkować stosunkowo wysoką liczbą zaakceptowanych kropelek (ok. 10 000-17 000) oraz stosunkowo dużą różnicą (ok. 5 000) między wartościami fluorescencji dla kropelek negatywnych i pozytywnych7. Nienaturalnie niska liczba kropelek prawdopodobnie wskazuje na problemy w procesie generowania kropelek, a na podstawie danych empirycznych z systemu dPCR użytego w tym artykule sugeruje się wartość odcięcia na po...

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Ogólnym celem niniejszego testu Duplex Digital PCR jest jednoczesna kwantyfikacja ogólnego oraz pochodzącego od ludzi zanieczyszczenia fekalnego w wodach. Test ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w monitorowaniu jakości wód rekreacyjnych, takie jak: jaka ilość ogólnych wskaźników fekalnych, tj. Enterococcus, a co ważniejsze, markeru HF183 związanego z odchodami ludzkimi, znajduje się w wodach.Główną zaletą tego testu jest to, że pozwala on na ilościowe oznaczenie dwóch celów w jednej reakcji, a w porównaniu z qPCR eliminuje konieczność wyznaczania krzywych wzorcowych, a tym samym powiązane z nimi błędy systematyczne i zmienność. Procedurę zaprezentuje Meredith Raith, nasz starszy technik badawczy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy najpierw przygotować roztwory stokowe wszystkich starterów o stężeniu 100 µmol/L w wodzie klasy molekularnej oraz sond w buforze TEPH 8, zgodnie z opisem w tekście protokołu.Następnie przygotuj Master Mix, mieszając odpowiednie ilości mieszaniny do Digital PCR, starterów forward i reverse, sondy fluorescencyjnej oraz wody wolnej od nukleaz (Nuclease-Free Water). Pipetuj ciecz w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby wymieszać składn

a-duplex-digital-pcr-assay-for-simultaneous-quantification

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie systemu zagęszczania próbek z wykorzystaniem ultrafiltracji stycznoprzepływowej z pustymi włóknami oraz dysocjacji termicznej jako alternatywnych kroków w wykrywaniu gatunków Cryptosporidium i Giardia przenoszonych przez wodę zgodnie z metodą EPA 1623.

Zmodyfikowana metoda EPA 1623 wykorzystująca ultrafiltrację przezroświećną z przepływem stycznym oraz etapy dysocjacji termicznej do wykrywania wodnych Cryptosporidium i Giardia spp.

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Test qPCR został opracowany do wykrywania Escherichia coli O157:H7 z unikalnym markerem genetycznym, Z3276. qPCR połączono z leczeniem monoazydkiem propidyny (PMA) w celu wykrywania żywych komórek. Protokół ten został zmodyfikowany i dostosowany do formatu płytki 96-dołkowej w celu łatwej i spójnej obsługi wielu...

Wykrywanie żywych komórek Escherichia coli O157:H7 metodą PMA-qPCR

Protokół obejmujący zintegrowane zagęszczenie, wzbogacenie i kolorymetryczne wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność w dużych ilościach wody rolniczej jest tutaj przedstawiony.  Woda jest filtrowana przez zmodyfikowane waciki Moore'a (MMS), wzbogacone o selektywne lub nieselektywne media, a detekcja odbywa się za pomocą papierowych urządzeń analitycznych (μPAD) osadzonych w bakteryjno-orientacyjnych podłożach kolorymetrycznych.

Kolorymetryczne wykrywanie Escherichia coli, Salmonella spp. i Listeria monocytogenes na papierze w dużych ilościach wody rolniczej

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Środowiskowe testy DNA wymagają rygorystycznego projektowania, testowania, optymalizacji i walidacji przed rozpoczęciem zbierania danych terenowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który przeprowadza użytkowników przez każdy etap projektowania specyficznego dla gatunku, opartego na sondzie testu qPCR do wykrywania i kwantyfikacji DNA gatunku docelowego z próbek środowiskowych.

Opracowywanie i testowanie specyficznych dla gatunku ilościowych testów PCR do zastosowań środowiskowych DNA

Ten protokół opisuje, jak zbudować system łańcucha polimerazy o ciągłym przepływie oparty na mikroprzepływowym chipie i jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawiono w nim prostą metodę analizy kwasów nukleinowych w laboratorium.

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Poznaj dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i markera HF183 w wodzie rekreacyjnej. Ta metoda eliminuje krzywe wzorcowe, zapewniając dokładniejszą ocenę jakości wody i ochronę zdrowia publicznego.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie (Wideo) | JoVE Journal

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Przeglądaj więcej filmów