Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Ogólnym celem niniejszego testu Duplex Digital PCR jest jednoczesna kwantyfikacja ogólnego oraz pochodzącego od ludzi zanieczyszczenia fekalnego w wodach. Test ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w monitorowaniu jakości wód rekreacyjnych, takie jak: jaka ilość ogólnych wskaźników fekalnych, tj. Enterococcus, a co ważniejsze, markeru HF183 związanego z odchodami ludzkimi, znajduje się w wodach.

Główną zaletą tego testu jest to, że pozwala on na ilościowe oznaczenie dwóch celów w jednej reakcji, a w porównaniu z qPCR eliminuje konieczność wyznaczania krzywych wzorcowych, a tym samym powiązane z nimi błędy systematyczne i zmienność. Procedurę zaprezentuje Meredith Raith, nasz starszy technik badawczy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy najpierw przygotować roztwory stokowe wszystkich starterów o stężeniu 100 µmol/L w wodzie klasy molekularnej oraz sond w buforze TEPH 8, zgodnie z opisem w tekście protokołu.

Następnie przygotuj Master Mix, mieszając odpowiednie ilości mieszaniny do Digital PCR, starterów forward i reverse, sondy fluorescencyjnej oraz wody wolnej od nukleaz (Nuclease-Free Water). Pipetuj ciecz w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby wymieszać składniki, uważając jednocześnie, by nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu. Ponieważ dPCR Master Mix jest bardziej lepki niż konwencjonalny qPCR Master Mix, konieczne jest zastosowanie techniki mieszania przez pipetowanie w celu uzyskania homogenicznego roztworu.

Umożliwia to dokładną kwantyfikację dPCR w kolejnych etapach. Aby przygotować mieszaninę do testu do generowania kropelek dla próbek analizowanych w duplikacie, należy pipetować 36 µL Master Mixu do zwykłej płytki PCR. Do każdej z 36 µL porcji Master Mixu należy dodać 12 µL matrycy DNA, pozostawiając na płytce puste odpowiadające im dołki dla powtórzeń.

Należy dołączyć kontrole pozytywne, aby upewnić się, że test przebiega prawidłowo. Należy również uwzględnić kontrole bez matrycy (NTC), aby wykluczyć zanieczyszczenia na płytce i umożliwić późniejsze wyznaczenie linii bazowej fluorescencji do analizy danych. Przed przygotowaniem generatora kropli należy wymieszać mieszaniny testowe, pipetując je w górę i w dół około 15 razy za pomocą pipety wielokanałowej.

Należy upewnić się, że końcówka pipety pozostaje zanurzona w cieczy, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza w mieszaninie. Następnie należy włożyć kartridż pierwszy zawierający osiem dołków do białego uchwytu na kartridże i zatrzasnąć uchwyt. Kartridż pierwszy jest teraz stabilnie zamocowany i nie może zostać wysunięty z uchwytu podczas generowania kropel.

Używając pipety wielokanałowej, ostrożnie przenieś 20 µL Mieszaniny do Analizy do środkowej pozycji kartridża oznaczonej jako sample, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Pipetuj 70 µL oleju do generowania kropelek (Droplet Generation oil) na lewą stronę kartridża oznaczoną jako oil. Przykryj kartridż uszczelką, upewniając się, że uszczelka przylega płasko i jest równomiernie przytrzymywana przez cztery wypustki skierowane w stronę krawędzi kartridża.

Naciśnij podświetlony na zielono przycisk w generatorze kropel (Droplet Generator), aby otworzyć drzwiczki i umieścić kasetę. Naciśnij przycisk ponownie, aby zamknąć generator. Po zamknięciu drzwiczek zielony przycisk gaśnie, a drzwiczki nie mogą zostać ponownie otwarte.

Generowanie kropelek rozpocznie się natychmiast i potrwa około jednej minuty. Podczas gdy trwa generowanie kropelek, należy umieścić drugi kartridż w drugim białym uchwycie na kartridże i przygotować go w ten sam sposób, co w przypadku pierwszego kartridża. Po zakończeniu generowania kropelek słabo oświetlony przycisk zmieni kolor na zielony.

Otwórz drzwiczki Generatora Kropli, wyjmij biały uchwyt kartridża zawierający kartridż pierwszy i odstaw go na bok. Umieść kartridż drugi w Generatorze Kropli. Zdejmij uszczelkę z kartridża pierwszego i wyrzuć ją.

Nie należy odklikiwać białego uchwytu kartridża, ponieważ czynność ta może doprowadzić do zniszczenia nowo wytworzonych kropel. Używając pipety wielokanałowej ustawionej na 40 µL, należy włożyć końcówki pod kątem 45 stopni do trzeciej kolumny kartridża oznaczonej jako droplets i powoli odessać wszystkie krople. Należy przenieść je do końcowej płytki PCR, przykładając końcówkę pipety do ścianki dołka mniej więcej w połowie jego wysokości i powoli wydmuchując krople.

W ten sam sposób, po zakończeniu generowania kropel dla wkładu drugiego, należy zdjąć uszczelkę z wkładu drugiego i przenieść wygenerowane krople na końcową płytkę PCR. Na wierzchu płytki należy umieścić przepieracalną folię ochronną, a następnie umieścić ją w zgrzewarce do płytek. Nastawić zgrzewarkę na 180 °C, uruchomić proces i zgrzewać przez 10 sekund.

Aby rozpocząć tę procedurę, umieść zamkniętą końcową płytkę PCR w termocyklerze. Użyj termocyklera kompatybilnego z końcową płytką PCR, o szybkości zmiany temperatury 2 °C/s. Przeprowadź następujący program termiczny: 10 minut w 95 °C, a następnie 40 cykli obejmujących 30 sekund w 94 °C i 60 sekund w 60 °C, kończąc proces 10-minutowym utrzymaniem temperatury 98 °C.

Po zakończeniu cykli przenieś płytkę do czytnika kropel (Droplet Reader) w celu automatycznego pomiaru fluorescencji w każdej kropelce w każdej studzience. Przed przystąpieniem do odczytu kropel upewnij się, że kropelki mają temperaturę pokojową. Rozpocznij od uruchomienia dołączonego oprogramowania, aby skonfigurować odczyt kropel.

W domyślnym menu konfiguracji zawierającym schemat pustej płytki 96-dołkowej, kliknij dwukrotnie w dołek A1, aby otworzyć menu składające się z trzech sekcji: Sample, Assay 1 oraz Assay 2. W sekcji Sample wpisz identyfikator próbki (Sample ID) w polu opisanym jako Name i zaznacz pole wyboru po prawej stronie oznaczone jako Apply. Następnie kliknij menu rozwijane opisane jako experiment, wybierz RED dla Rare Event Detection i zatwierdź przyciskiem Enter.

Przejdź do sekcji oznaczonej jako Assay 1. W sekcji Name wpisz nazwę testu i naciśnij Enter. W polu poniżej opisanym jako Type kliknij menu rozwijane, wybierz Channel 1 Unknown i naciśnij Enter.

Przejdź do sekcji oznaczonej jako Assay 2. W sekcji Name wpisz nazwę testu i zatwierdź klawiszem Enter. W poniższym polu opisanym jako Type otwórz menu rozwijane, wybierz opcję Channel 2 Unknown i zatwierdź klawiszem Enter.

Wszystkie informacje z poprzednich kroków znajdują się teraz w studzience A1. Nazwij wszystkie kolejne studzienki zawierające kropelki. Aby skrócić całkowity czas konfiguracji, przytrzymaj klawisz Shift lub Ctrl, aby wybrać wiele studzienek jednocześnie. Gdy cyfrowy obraz płytki będzie odpowiadał płytce fizycznej, kliknij OK w prawym dolnym rogu menu.

W nowym menu, które pojawi się u góry schematu płytki, w sekcji Szablon wybierz Zapisz jako, a następnie nazwij i zapisz płytkę. Po lewej stronie ekranu kliknij Uruchom i wybierz odpowiedni Zestaw Barwników w wyskakującym oknie Opcje Uruchamiania. Gromadzenie danych rozpocznie się i będzie wyświetlane w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu.

Po zakończeniu odczytu i pojawieniu się okna z komunikatem Run Complete, kliknij OK. Sprawdź separację między kropelkami pozytywnymi a negatywnymi. Upewnij się, że fluorescencja we wszystkich kropelkach w studzienkach NTC znajduje się blisko poziomu bazowego. Kliknij przycisk oznaczony jako Events.

Na dole kliknij pole o nazwie Single, a po prawej stronie wyświetlonego Histogramu kliknij pole o nazwie Total, aby wyświetlić całkowitą liczbę zaakceptowanych kropli na dołek. Wyklucz wszystkie dołki zawierające mniej niż 10 000 kropli, przytrzymując klawisz Ctrl i klikając na dołki do wykluczenia. Kliknij przycisk oznaczony jako 1D Amplitude, aby ustawić próg fluorescencji na poziomie około jednego odchylenia standardowego kropli negatywnych w dołkach NTC dla obu celów.

Po lewej stronie ekranu, w sekcji Auto Analyze wyświetlającej dwa przyciski progowe, wybierz ikonę po prawej stronie z poziomą, różową linią. Kliknij pole po lewej stronie opcji Set Threshold pod każdym z wykresów amplitudy (Amplitude Graphs) i wprowadź odpowiednie wartości progowe fluorescencji. Docelowe stężenia w kopiach na mikrolitr reakcji zostaną następnie obliczone automatycznie.

Wyeksportuj wyniki do pliku CSV, klikając przycisk Export w lewym górnym rogu ekranu 1D Amplitude. W pliku CSV pomnóż wyeksportowane stężenie celu przez cztery, aby przeliczyć je z kopii celu na µL reakcji na kopię celu na µL matrycy DNA. Rysunek ten porównuje formaty duplex i simplex testu Digital PCR.

Lewy i prawy panel przedstawiają odpowiednio ilościowe oznaczenie Enterococcus oraz HF183 wraz z odpowiadającymi im współczynnikami korelacji między wynikami duplex i simplex. Linie ciągłe oznaczają linie regresji, a szare obszary reprezentują odpowiadające im błędy standardowe. Różne rodzaje próbek zostały oznaczone symbolami.

Wyniki są wysoce spójne i często nieodróżnialne, niezależnie od tego, czy Enterococcus oraz HF183 są mierzone jednocześnie w jednej reakcji, czy osobno w dwóch reakcjach. Test Digital PCR może również tolerować inhibitory w stężeniach o jeden do dwóch rzędów wielkości wyższych niż te tolerowane przez jego odpowiedniki w qPCR. Rysunek ten przedstawia ilościowe oznaczanie markera HF183 metodą qPCR oraz Digital PCR w czystym DNA ze ścieków z dodatkiem rosnących stężeń kwasu huminowego, który hamuje reakcję PCR.

Oczekiwana ilość HF183 w nieobecności inhibitorów jest zdefiniowana jako 95% przedział ufności między dwiema poziomymi liniami przerywanymi. Cyfrowy PCR, oznaczony trójkątami, nadal zapewnia dokładną kwantyfikację do stężenia kwasu huminowego wynoszącego 15 ng/µL reakcji, podczas gdy qPCR, oznaczony krzyżykami, zaczyna zaniżać wyniki przy 1 ng/µL i zostaje całkowicie zahamowany przy 5 ng/µL. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania tego wewnętrznego testu HF183 Duplex Droplet Digital PCR lub innego podobnego testu z wykorzystaniem innych starterów i sond.

Od czasu opracowania tego testu Duplex, który został opublikowany w czasopiśmie Water Research w 2015 roku, opracowaliśmy i zwalidowaliśmy szereg innych testów Digital PCR skierowanych przeciwko ogólnym bakteriom wskaźnikowym zanieczyszczeń kałowych, mikrobiologicznym markerom śledzącym oraz patogenom przenoszonym przez wodę. Testy te zapewniają bezpośrednią i bezstronną kwantyfikację celu i stają się przydatną alternatywą dla testów qPCR w dziedzinie badania jakości wody.