Name: Izolacja kałowego (mikro) RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Naucz się izolować wysokiej jakości RNA z próbek kałowych przy minimalnym zanieczyszczeniu mikroorganizmami. Ta metoda zapewnia optymalną wydajność i czystość izolatu do zastosowań w sekwencjonowaniu i RT-PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Otrzymaliśmy pomoc techniczną od Zakładu Biopolimerów w Harvard Medical School w zakresie bioanalizatora. Praca ta była wspierana przez grant badawczy National Multiple Sclerosis Society RG-1707-28516 (H.L.W. i S.L.).

Wszystkie opisane tutaj metody z udziałem zwierząt badawczych zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) z Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.
Wszystkie opisane tutaj metody z udziałem ludzi są zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Komitet ds. Badań Naukowych na Ludziach Partnerów.
1. Pobieranie próbek kału
<ol>
	<li>Autoklaw lub przygotuj sterylną i wolną od nukleaz probówkę do mikrowirówek o pojemności 2 ml z zakrętką dla każdego zwierzęcia biorącego udział w eksperymencie.
	<ol>
		<li>W przypadku ludzi należy zapewnić odpowiednie, wolne od nukleaz i sterylne urządzenie do pobierania próbek kału dla każdego pacjenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz 25-100 mg (około 1-4 granulki kału dla próbek kału myszy) próbek kału od każdego zwierzęcia w sterylnym środowisku. 
	UWAGA: Dwie lub więcej granulek kału (~50 mg lub cięższych) są preferowane do uzyskania RNA o najwyższej czystości.
	<ol>
		<li>Wykorzystaj wszystkie niezbędne środki ochrony osobistej (PPE) i materiały, na przykład: parę rękawic laboratoryjnych, spray dezynfekujący i sterylny ręcznik papierowy, aby wysterylizować obszar roboczy, na którym umieszcza się obiekt badań na zwierzętach, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki kału.
		<ol>
			<li>W przypadku ludzi poinstruuj każdego uczestnika badań/kolekcjonera, aby zebrał 100-200 mg próbek kału w środowisku tak sterylnym, jak to tylko możliwe. Stosuj standardową sterylną operację i unikaj zanieczyszczenia próbki kału.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki kału od każdego zwierzęcia należy pobrać bezpośrednio do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z zakrętką, nie dotykając żadnych innych powierzchni, aby uniknąć zanieczyszczenia.
	<ol>
		<li>W przypadku ludzi należy poinstruować każdego uczestnika, aby wypróżniał się bezpośrednio do odpowiedniego dostarczonego urządzenia do pobierania kału (np. sterylnego zestawu do pobierania próbek kału), aby uniknąć zanieczyszczenia. 
		UWAGA: Poinstruuj testera, aby unikał zanieczyszczenia powierzchniami toalet, wodą, moczem lub innymi niesterylnymi powierzchniami/przedmiotami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki kału zebrane w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 2 ml należy natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C lub umieścić w wiadrze z suchym lodem w celu uzyskania lepszej ilości i jakości RNA przed ponownym zawieszeniem kału, jak opisano w poniższych krokach.
	<ol>
		<li>W przypadku próbek kału ludzkiego, każdą świeżą próbkę o objętości 200 mg należy rozmieścić w probówkach mikrowirówek o pojemności 2 ml z nakrętkami i zamrozić w temperaturze -80 °C przed ponownym zawieszeniem kału, jak opisano poniżej.
		<ol>
			<li>W celu przechowywania próbek kału znajdujących się nie w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml z nakrętkami, należy zważyć i przenieść 100-200 mg każdej z zamrożonych próbek do oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml z zakrętkami przed ponownym zawieszeniem kału, jak opisano poniżej. 
			UWAGA: W przypadku próbek kału ludzkiego należy unikać pobierania więcej niż 200 mg próbek kału do izolacji RNA, ponieważ może to spowodować trudności w kolejnych krokach. W przypadku przeciążonej próbki w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml faza wodna, faza organiczna i faza pośrednia mogą nie być wyraźnie uformowane i oddzielone. W tym miejscu procedurę można wstrzymać.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów myjących
<ol>
	<li>Dodaj 21 ml 100% etanolu klasy American Chemical Society (ACS) do roztworu myjącego 1 dostarczonego w zestawie do izolacji miRNA (patrz tabela materiałów), aby osiągnąć końcową objętość 30 ml, jak pokazano na butelce. Wiruj, aż wszystko rozpuści się w butelce.</li>
	<li>Dodaj 40 ml 100% etanolu klasy ACS do dostarczonego roztworu myjącego 2/3, aby osiągnąć końcową objętość 50 ml, jak pokazano na butelce. Wiruj przez 5 s lub do momentu, gdy ostateczna mieszanina dobrze się połączy.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sprzętu i materiałów
<ol>
	<li>Spryskać obszar roboczy i sprzęt, na przykładample: stół laboratoryjny, obszar roboczy w dygestoriach chemicznych i stojaki na probówki do mikrowirówek, roztworem do odkażania rybonukleazą (RNazą) (np. dostępnym w handlu roztworem do odkażania RNazy). Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy nakładać roztwór odkażający RNase na powierzchnie, gdziekolwiek i kiedykolwiek uznasz to za konieczne.</li>
	<li>Załóż czysty fartuch laboratoryjny, załóż maskę na twarz i załóż odpowiednie rękawice laboratoryjne, aby chronić RNA w próbkach kału przed nukleazami obecnymi na ludzkiej skórze. Spryskaj rękawice roztworem do odkażania RNazy i często zmieniaj rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Przygotować wiadro z suchym lodem na próbki kału przechowywane w temperaturze -80 °C, aby zapobiec rozmrożeniu przed ponownym zawieszeniem kału, oraz wiadro z lodem w przypadku materiałów, na przykład: Kwas-fenol: Chloroform, w celu przedłużenia okresu przydatności do spożycia. 
	UWAGA: Upewnij się, że materiały, w tym pożywki użyte w protokole, są sterylne bez zanieczyszczenia nukleazami.</li>
</ol>
4. Zawieszenie kału
<ol>
	<li>Zawiesić 25-100 mg próbek kału w 600 μl sterylnego 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS). 
	UWAGA: Próbki kału należy przetwarzać natychmiast po rozmrożeniu od -80 °C bez nawet częściowego rozmrażania, aby zminimalizować uwalnianie RNaz i komórkowego RNA, ponieważ kryształki lodu pękają zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne przedziały komórkowe, gdy komórki w próbce rozmrażają się.
	<ol>
		<li>Dodać 600 μl 1x DPBS do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z zakrętką zawierającej próbki kału w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Inkubować mieszaninę próbek kału zanurzonych w 600 μl 1x DPBS w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml zakrytej korkiem na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić mieszaninę, rozcierając końcówką pipety o pojemności 1 ml i dobrze przemieszać z zakręconą probówką do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Aby zoptymalizować i zwiększyć ilość i jakość RNA, należy ponownie zawiesić mieszaninę za pomocą homogenizatora z ustawieniem na jeden cykl przy S4000 (lub 4000 obr./min) i 45 s.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ekstrakcja organiczna
UWAGA: Użyj dygestorii z niebezpiecznymi chemikaliami do następujących kroków, aż do Kroku 6 z użyciem kwasowo-fenolowego: chloroform i 100% etanol klasy ACS ze względu na ich toksyczność i łatwopalność. W razie potrzeby należy zmieniać środki ochrony osobistej i przestrzegać odpowiednich standardowych środków ostrożności podczas pracy z materiałami niebezpiecznymi.
<ol>
	<li>Ekstrahuj RNA za pomocą 600 μl kwasu-fenolu: chloroformu (wymagana objętość kwasu-fenolu: chloroformu jest równa początkowej objętości dodanego 1x DPBS w kroku 4.1).
	<ol>
		<li>Dodać 600 μl kwasowo-fenolowo-chloroformowego do zawiesiny z etapu 4.1. 
		UWAGA: Pobrać kwas-fenol: chloroform z dolnej fazy w butelce, ponieważ górna faza jest mieszana z buforem wodnym. Jeśli interfaza między tymi dwiema fazami zostanie zakłócona, należy odczekać i wycofać kwas-fenol: chloroform tylko wtedy, gdy interfaza ponownie się utrwali, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszaj mieszaninę przez 60 sekund, aby dokładnie wymieszać. Alternatywnie, aby zoptymalizować i zwiększyć ilość RNA w wydajności, wymieszaj za pomocą homogenizatora z ustawieniem na jeden cykl w S4000 i 45 s.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej za pomocą mikrowirówki. Po odwirowaniu interfaza powinna być zwarta. Jeśli nie, powtórz wirowanie. 
	UWAGA: Jeśli interfaza nie może być tak zwarta, jak jest to pożądane, prawdopodobnie z powodu nierównomiernego stosunku objętości początkowej do objętości dodanego kwasu-fenolu: chloroformu, po kilku powtórzeniach wirowania, należy przystąpić do odzyskiwania fazy wodnej z większą ostrożnością, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Odzyskaj fazę wodną i przenieś ją do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml z nasadką zawiasową (brak zestawu do izolacji miRNA).
	<ol>
		<li>Ostrożnie usunąć fazę wodną (lub górną), nie naruszając fazy dolnej, i przenieść ją do nowej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml z nasadką zawiasową. Zwróć uwagę na przenoszoną objętość (np. ~500 μL). 
		UWAGA: Gdy interfaza jest zwarta, a górna faza jest wyraźnie oddzielona, na wierzchu fazy wodnej może unosić się kilka maleńkich cząstek resztkowych. Pipetę należy dokładnie odpipetować, aby uniknąć tych pozostałości i odzyskać tylko widocznie i wyraźnie oddzieloną fazę wodną, aby zapewnić wysokiej jakości wydajność RNA, nawet jeśli można uzyskać tylko niewielką objętość fazy wodnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Końcowa izolacja RNA
<ol>
	<li>Dodać 1,25 objętości 100% etanolu klasy RT ACS do fazy wodnej w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml (np. dodać 625 μl 100% etanolu, jeśli 500 μl fazy wodnej zostanie odzyskane z kroku 5.4). Wir 3 s.</li>
	<li>Załaduj mieszaninę fazy wodnej i etanolu przez wkład filtracyjny znajdujący się w zestawie do izolacji miRNA.
	<ol>
		<li>Dla każdej próbki należy umieścić wkład filtra w jednej z probówek zbiorczych dostarczonych w zestawie.
		<ol>
			<li>Odmierzyć pipetą i załadować 600 μl mieszaniny fazy wodnej i etanolu do wkładu filtrującego. 
			UWAGA: Krótko wymieszać mieszaninę, aby dokładnie wymieszać etanol z fazą wodną przed pipetowaniem. Jednorazowo można załadować nie więcej niż 700 μl mieszaniny fazy wodnej i etanolu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wirować przy 10 000 x g przez 90 s, aby przefiltrować mieszaninę. Wirowanie z większą prędkością może spowodować uszkodzenie filtra.</li>
		<li>Odrzucić filtrat i powtarzać kroki 6.2.1-6.2.2, aż cała mieszanina zostanie przefiltrowana przez tę samą membranę filtracyjną w kolejnych zastosowaniach. Zachowaj i ponownie użyj tej samej probówki zbiorczej do poniższych etapów mycia.</li>
		<li>Umyj filtr 700 μl roztworu do płukania miRNA 1, 
		UWAGA: miRNA Wash Solution 1 zawiera tiocyjanian guanidyny, który może powodować podrażnienie skóry i poważne uszkodzenie oczu. Nosić niezbędne środki ochrony osobistej, na przykład: rękawice, osłonę twarzy, ochronny fartuch laboratoryjny. W razie potrzeby często zmieniaj rękawice.
		<ol>
			<li>Do wkładu filtracyjnego nanieść 700 μl miRNA Wash Solution 1, roztworu roboczego przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS.</li>
			<li>Wirować przez 60 s, aby przefiltrować roztwór do płukania miRNA 1 przez wkład filtra.</li>
			<li>Wyrzuć filtrat z probówki zbiorczej i umieść ten sam wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umyj filtr roztworem myjącym 2/3 jeden raz w objętościach kolejno 700 μl, 500 μl i 250 μl.
		<ol>
			<li>Do wkładu filtracyjnego nanieść 700 μl roztworu myjącego 2/3, roztworu roboczego przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS.
			<ol>
				<li>Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.</li>
				<li>Wyrzuć filtrat z probówki zbiorczej i umieść ten sam wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Nałożyć 500 μl roztworu myjącego 2/3 do wkładu filtra.
			<ol>
				<li>Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.</li>
				<li>Wyrzuć filtrat z probówki zbiorczej i umieść ten sam wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Nałożyć 250 μl roztworu myjącego 2/3 do wkładu filtra.
			<ol>
				<li>Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.</li>
				<li>Wyrzucić filtrat z probówki zbiorczej.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej i obracaj zespołem przez 5 minut, aby usunąć resztki płynu z filtra.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Elute RNA za pomocą 50 μL wody wolnej od nukleaz
<ol>
	<li>Przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej. Odpipetować 50 μl wody wolnej od nukleaz do środka filtra i zakryć probówkę zbiorczą.
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 8,000 x g, aby odzyskać RNA do nowej probówki zbiorczej.</li>
		<li>Określ stężenie i czystość odzyskanego RNA w kale za pomocą fluorometru. Odzyskane RNA kału można przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+RNA+communication+consortium%3A+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li>
<li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+%26+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li>
<li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li>
<li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028(2009).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+win+the+battle+with+RNase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857(2019).</li>
<li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li>
<li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn%27s+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Crohn%27s+%26+Colitis%22%5BJournal%5D)">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's & Colitis. 2 (1), 003(2020).</li>
<li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li>
<li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70(2019).</li>
<li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Square%22%5BJournal%5D)">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li>
<li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li>
<li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faecal+microRNAs%3A+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Beneficial+Microbes%22%5BJournal%5D)">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li>
<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak istotnych lub istotnych interesów finansowych, które są związane z metodą badawczą opisaną w niniejszym dokumencie.

Ważne jest, aby stosować technikę wolną od RNaz, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą podczas izolacji7. Po odwirowaniu i utworzeniu zwartej interfazy kluczowe jest unikanie interfazy, dolnej fazy i zanieczyszczenia cząstkami unoszącymi się na wierzchu fazy wodnej podczas odzyskiwania fazy wodnej. Dodatkowo dodawane są dwa etapy mycia z 500 μl i 250 μl roztworu myjącego 2/3 w celu wyeliminowania zanieczyszczeń z membrany filtracyjnej w celu uzyskania optymalnej jakości. Ponadto nie zaleca się stoso...

Zewnątrzkomórkowe RNA jest uznawane za istotny czynnik pośredniczący w wielu procesach biologicznych1. Zewnątrzkomórkowe RNA w kale zostało po raz pierwszy zgłoszone w 2008 roku jako marker raka jelita grubego i aktywnego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego2, a ostatnio ujawniono, że jest normalnym składnikiem światła jelita i kału oraz pośredniczy w komunikacji między gospodarzem a mikrobem3,4,5. Celem tego protokołu izolacji RNA jest ekstrakcja wysokiej jakości zewnątrzkomórkowego RNA z próbek kału pobranych od zwierząt i ludzi. Protokół został zaadaptowany z komercyjnego zestawu do izolacji miRNA. Pozyskane RNA jest wykorzystywane do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie RNA, RT-PCR i mikromacierz. Protokół zawiera kilka ważnych i przydatnych wskazówek, jak zmaksymalizować ilość i jakość RNA znajdującego się w kale zwierząt i ludzi. Powodem opracowania i optymalizacji tej metody izolacji RNA (w tym mikroRNA) jest zmniejszenie drobnoustrojowego RNA w kale, ograniczenie zmiennych w badaniach naukowych i analiza składu RNA w jelitach bez uwzględniania różnych czynników zakłócających i źródeł zanieczyszczenia. Warto zauważyć, że ta izolacja RNA minimalizuje uwalnianie RNA z żywej komórki i żywych drobnoustrojów (komórkowego RNA). Koncentruje się na zewnątrzkomórkowych RNA, które zostały uwolnione przez komórki jelitowe lub zostały nabyte poprzez spożycie pokarmu. Zasadniczo metoda ta nie nadaje się do badań, w których bada się transkryptom drobnoustrojów.

<table><tbody><tr><td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Rękawice Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVana Zestaw do izolacji miRNA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek bez nukleaz (1,5 ml, 2 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pipety i końcówki do pipet bez nukleaz (z filtrem)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator PowerLyzer 24</td><td>QIAGEN</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Roztwór do dekontaminacji RNazy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td><td></td> wirowa</tr></tbody></table>

izolacja kałowego (mikro) rna

Fecal (micro) RNA Isolation

Staje się jasne, że RNA istnieje w świetle jelit i kale u zwierząt i ludzi. Opisany poniżej protokół izoluje całkowite RNA, w tym mikroRNA, z próbek kału zwierząt i ludzi. Celem jest wyizolowanie całkowitego RNA o wysokiej czystości i ilości do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie RNA, RT-PCR i mikromacierze. Zaletami tego zoptymalizowanego protokołu izolacji miRNA są możliwości izolowania wysoko oczyszczonych produktów RNA z opisanymi dodatkowymi etapami mycia, zwiększona ilość RNA uzyskana za pomocą ulepszonej metody ponownego zawieszania próbki oraz ważne wskazówki dotyczące odkażania. Jednym z ograniczeń jest niemożność przetworzenia i oczyszczenia większej próbki powyżej 200 mg, ponieważ takie rozmiary próbek spowodowałyby trudności w wyraźnym tworzeniu interfazy. W związku z tym duży rozmiar próbki może zanieczyścić fazę wodną, która ma być wyekstrahowana, zgodnie z opisem w protokole, substancjami organicznymi, które wpływają na jakość wyizolowanego RNA na końcu. Jednak izolaty RNA z próbki do 200 mg są wystarczające do większości dalszych analiz.

Reprezentatywny RNA wyizolowano odpowiednio z 50 mg próbek kału mysiego (2 pellety kału mysiego) oraz 100 mg próbek kału ludzkiego, a następnie eluowano w 50 µL wody wolnej od nukleaz. Analiza stężenia za pomocą spektrofotometru wskazuje, że wyizolowano odpowiednio całkowitą ilość 49 µg i 16 µg RNA (Tabela 1). Czystość RNA była wysoka, o czym świadczy stosunek A260/A280 wynoszący ~2,0 oraz stosunek A260/A230 wynoszący ~1,8 (Tabela 1). Jak donoszono3, większość czą...

Ten protokół izoluje wysokiej jakości całkowite RNA z próbek kału zwierząt i ludzi. Komercyjny zestaw do izolacji miRNA jest używany ze znaczną adaptacją do izolowania czystego RNA ze zoptymalizowaną ilością i jakością. Izolaty RNA są dobre dla większości dalszych testów RNA, takich jak sekwencjonowanie, mikromacierz i RT-PCR.

Izolacja kałowego (mikro) RNA

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Przedstawiamy protokół izolacji RNA z próbek kału w celu badania mikroRNA. Protokół ten może być stosowany do izolowania RNA z kału o wysokiej jakości i ilości. Minimalizuje RNA z żywych drobnoustrojów.Ważne jest, aby podkreślić, że bufor powiązania nie jest używany w tym protokole. Ten protokół jest prosty i nieskomplikowany. Zacznij od ponownego zaparcia od 25 do 100 miligramów próbek kału w 600 mikrolitrach sterylnego 1X DPBS w dwumililitrowej probówce wirówkowej.Inkubować probówkę zawierającą próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie rozgnieć mieszaninę za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety i dobrze zwirować. Zawiesić mieszaninę w homogenizatorze z ustawieniem na jeden cykl z prędkością 4 000 obrotów na minutę przez 45 sekund, aby zoptymalizować i zwiększyć ilość i jakość RNA.Dodać 600 mikrolitrów kwaśnego roztworu chloroformu fenolowego do próbki i wirować mieszaninę przez 60 sekund. Alternatywnie, aby zoptymalizować zwiększoną ilość RNA w plonie, wymieszaj go z homogenizatorem. Odwirować próbkę przez 15 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej.Powtarzaj wirowanie, aż interfejs będzie zwarty. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną, nie naruszając dolnej fazy, do nowej dwumililitrowej probówki wirówkowej z nasadką zawiasową. Dodaj 100% etanol klasy ACS o stężeniu 1,25 x objętość nabytej fazy wodnej i wiruj przez trzy sekundy.Umieść wkład filtra w rurkach zbiorczych. Załaduj 600 mikrolitrów każdej z próbek do wkładu filtracyjnego dostarczonego w zestawie do izolacji mikroRNA. Wirować przy 10 000 x g przez 90 sekund, aby przefiltrować mieszaninę przez wkład.Następnie wyrzucić filtrat. Powtarzaj tę czynność, aż cała objętość mieszaniny zostanie przefiltrowana przez tę samą membranę filtracyjną w kolejnych aplikacjach. Po wszystkim próbka jest filtrowana.dodać 700 mikrolitrów roztworu płuczącego mikroRNA 1 do tego samego wkładu filtrującego. Wirować przez 60 sekund, aby przefiltrować roztwór płuczący przez wkład filtra. Wyrzucić filtrat i umieścić wkład filtra na tej samej probówce zbiorczej.Umyj wkład filtra 700 mikrolitrami roztworu płuczącego 2/3 przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS i odwiruj przy 10 000 x g przez minutę. Wyrzuć uzyskany filtrat i umieść wkład filtra w tej samej probówce. Umyj wkład filtra 500 mikrolitrami roztworu płuczącego 2/3 i odwiruj przy 10 000 x g przez minutę.Wyrzuć uzyskany filtrat i umieść wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej. Umyć wkład filtra 250 mikrolitrami roztworu myjącego 2/3 przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS i odwirować przy 10 000 x g przez minutę. Wyrzuć uzyskany filtrat i umieść wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.Na koniec przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej i obracaj zespołem przez pięć minut, aby usunąć pozostały płyn. Przenieś wkład filtra do nowej probówki zbiorczej, a następnie dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do środka filtra i zakryj rurkę. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie obracaj probówkę przez pięć minut w temperaturze 8 000 x g, aby odzyskać RNA do nowej probówki zbiorczej. Test elektroforezy RNA oparty na chipach sugeruje, że reprezentatywne izolaty RNA z kału myszy i człowieka mają niską zawartość lub brak kompozycji rRNA 18S i 28S, a rozmiar izolatów RNA mieści się w małym regionie RNA. Dalsza elektroforeza małego RNA z elektroforezą opartą na chipie ujawniła, że duża część RNA ma rozmiar mikroRNA.Czystość wyekstrahowanego RNA była wysoka, na co wskazuje współczynnik absorbancji wynoszący 2,0 dla długości fal 260 i 280 nanometrów oraz wartość współczynnika 1,8 dla absorbancji przy 260 i 230 nanometrach. Aby zapewnić powodzenie ekstrakcji organicznej, upewnij się, że powierzchnie są oczywiste i przenoszą tylko górną fazę wodną bez zakłócania dolnej fazy, nawet kosztem zmniejszonej objętości naszej fazy wodnej.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano niezawodną metodę izolacji RNA z Pseudomonas aeruginosa wyizolowanej z kątnic myszy. Odzyskane RNA charakteryzuje się ilością i jakością wystarczającą do późniejszych eksperymentów qPCR, profilowania transkrypcyjnego oraz sekwencjonowania RNA (RNA Seq). Technikę tę można dostosować do izolacji RNA z innych drobnoustrojów jelitowych.

Izolacja RNA z Pseudomonas aeruginosa kolonizującej przewód pokarmowy myszy

Protokół zubożenia rybosomalnego RNA (rRNA) został opracowany w celu wzbogacenia informacyjnego RNA (mRNA) dla sekwencyjnego RNA metatranskryptomu jelita komara. Z komara i jego mikroorganizmów jelitowych stworzono sondy rRNA specyficzne dla próbki, które użyto do usunięcia rRNA poprzez odejmowanie. Działanie protokołu może skutkować usunięciem około 90-99% rRNA.

Zubożenie rybosomalnego RNA dla metagenomicznego RNA-seq jelit komarów

Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.

Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA i kwantyfikacji bakterii kałowych metodą qPCR.

Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Obecny protokół opisuje izolację mikroRNA z gruczołów ślinowych kleszczy i oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Jest to uniwersalna procedura, która łączy w sobie powszechnie używane odczynniki i materiały eksploatacyjne. Metoda pozwala również na użycie niewielkiej liczby kleszczy, co skutkuje wysokiej jakości mikroRNA, które można łatwo zsekwencjonować.

Izolacja mikroRNA z kultur gruczołów ślinowych ex vivo kleszczy i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten protokół zapewnia prostą, opłacalną metodę izolacji DNA do analizy zmian mikroflory jelitowej myszy podczas rozwoju choroby autoimmunologicznej.

Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA

Celem jest tutaj nakreślenie protokołu do badania mechanizmów dysbiozy w chorobach sercowo-naczyniowych. W artykule omówiono, jak aseptycznie pobierać i przeszczepiać próbki kału myszy, izolować jelita i stosować metodę "Swiss-roll", a następnie techniki barwienia immunologicznego w celu zbadania zmian w przewodzie pokarmowym.

Izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty

Opisano metodę interferencji RNA (RNAi) poprzez wstrzykiwanie dsRNA do niekarmionych kleszczy. RNAi jest najszerzej stosowaną techniką wyciszania genów u kleszczy, w przypadku których zastosowanie innych metod manipulacji genetycznych było ograniczone.

Interferencja RNA u kleszczy

Naucz się izolować wysokiej jakości RNA z próbek kałowych przy minimalnym zanieczyszczeniu mikroorganizmami. Ta metoda zapewnia optymalną wydajność i czystość izolatu do zastosowań w sekwencjonowaniu i RT-PCR.

Izolacja kałowego (mikro) RNA

Przeglądaj więcej filmów