Izolacja kałowego (mikro) RNA
October 28th, 2020
Ten protokół izoluje wysokiej jakości całkowite RNA z próbek kału zwierząt i ludzi. Komercyjny zestaw do izolacji miRNA jest używany ze znaczną adaptacją do izolowania czystego RNA ze zoptymalizowaną ilością i jakością. Izolaty RNA są dobre dla większości dalszych testów RNA, takich jak sekwencjonowanie, mikromacierz i RT-PCR.
Przedstawiamy protokół izolacji RNA z próbek kału w celu badania mikroRNA. Protokół ten może być stosowany do izolowania RNA z kału o wysokiej jakości i ilości. Minimalizuje RNA z żywych drobnoustrojów.
Ważne jest, aby podkreślić, że bufor powiązania nie jest używany w tym protokole. Ten protokół jest prosty i nieskomplikowany. Zacznij od ponownego zaparcia od 25 do 100 miligramów próbek kału w 600 mikrolitrach sterylnego 1X DPBS w dwumililitrowej probówce wirówkowej.
Inkubować probówkę zawierającą próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie rozgnieć mieszaninę za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety i dobrze zwirować. Zawiesić mieszaninę w homogenizatorze z ustawieniem na jeden cykl z prędkością 4 000 obrotów na minutę przez 45 sekund, aby zoptymalizować i zwiększyć ilość i jakość RNA.
Dodać 600 mikrolitrów kwaśnego roztworu chloroformu fenolowego do próbki i wirować mieszaninę przez 60 sekund. Alternatywnie, aby zoptymalizować zwiększoną ilość RNA w plonie, wymieszaj go z homogenizatorem. Odwirować próbkę przez 15 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej.
Powtarzaj wirowanie, aż interfejs będzie zwarty. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną, nie naruszając dolnej fazy, do nowej dwumililitrowej probówki wirówkowej z nasadką zawiasową. Dodaj 100% etanol klasy ACS o stężeniu 1,25 x objętość nabytej fazy wodnej i wiruj przez trzy sekundy.
Umieść wkład filtra w rurkach zbiorczych. Załaduj 600 mikrolitrów każdej z próbek do wkładu filtracyjnego dostarczonego w zestawie do izolacji mikroRNA. Wirować przy 10 000 x g przez 90 sekund, aby przefiltrować mieszaninę przez wkład.
Następnie wyrzucić filtrat. Powtarzaj tę czynność, aż cała objętość mieszaniny zostanie przefiltrowana przez tę samą membranę filtracyjną w kolejnych aplikacjach. Po wszystkim próbka jest filtrowana.
dodać 700 mikrolitrów roztworu płuczącego mikroRNA 1 do tego samego wkładu filtrującego. Wirować przez 60 sekund, aby przefiltrować roztwór płuczący przez wkład filtra. Wyrzucić filtrat i umieścić wkład filtra na tej samej probówce zbiorczej.
Umyj wkład filtra 700 mikrolitrami roztworu płuczącego 2/3 przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS i odwiruj przy 10 000 x g przez minutę. Wyrzuć uzyskany filtrat i umieść wkład filtra w tej samej probówce. Umyj wkład filtra 500 mikrolitrami roztworu płuczącego 2/3 i odwiruj przy 10 000 x g przez minutę.
Wyrzuć uzyskany filtrat i umieść wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej. Umyć wkład filtra 250 mikrolitrami roztworu myjącego 2/3 przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS i odwirować przy 10 000 x g przez minutę. Wyrzuć uzyskany filtrat i umieść wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.
Na koniec przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej i obracaj zespołem przez pięć minut, aby usunąć pozostały płyn. Przenieś wkład filtra do nowej probówki zbiorczej, a następnie dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do środka filtra i zakryj rurkę. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Następnie obracaj probówkę przez pięć minut w temperaturze 8 000 x g, aby odzyskać RNA do nowej probówki zbiorczej. Test elektroforezy RNA oparty na chipach sugeruje, że reprezentatywne izolaty RNA z kału myszy i człowieka mają niską zawartość lub brak kompozycji rRNA 18S i 28S, a rozmiar izolatów RNA mieści się w małym regionie RNA. Dalsza elektroforeza małego RNA z elektroforezą opartą na chipie ujawniła, że duża część RNA ma rozmiar mikroRNA.
Czystość wyekstrahowanego RNA była wysoka, na co wskazuje współczynnik absorbancji wynoszący 2,0 dla długości fal 260 i 280 nanometrów oraz wartość współczynnika 1,8 dla absorbancji przy 260 i 230 nanometrach. Aby zapewnić powodzenie ekstrakcji organicznej, upewnij się, że powierzchnie są oczywiste i przenoszą tylko górną fazę wodną bez zakłócania dolnej fazy, nawet kosztem zmniejszonej objętości naszej fazy wodnej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia prostą metodę izolacji wysokiej jakości RNA z próbek kałowych, minimalizując skażenie przez żywe mikroby. Jest on zaprojektowany zarówno dla zwierząt, jak i ludzi, zapewniając zoptymalizowaną wydajność i czystość dla dalszych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Mikrobiologia
- Biologia molekularna
Tło
- Izolacja RNA z próbek kałowych jest kluczowa dla badania microRNA.
- Tradycyjne metody mogą prowadzić do skażenia przez RNA mikrobiologiczną.
- Wysokiej jakości RNA jest niezbędna dla dokładnych dalszych analiz.
- Ten protokół adaptuje komercyjny zestaw do izolacji miRNA dla uzyskania lepszych wyników.
Cel badania
- Dostarczenie niezawodnej metody ekstrakcji RNA z kału.
- Poprawa jakości i ilości izolowanych RNA.
- Ułatwienie badań nad microRNA w różnych kontekstach biologicznych.
Stosowane metody
- Resuspendowanie próbek kałowych w sterylnym 1X DPBS.
- Użycie dwumilimetrowej mikrocentryfugowej probawki do przetwarzania.
- Adaptacja komercyjnego zestawu do izolacji miRNA.
- Minimalizacja skażenia RNA przez żywe mikroby.
Główne wyniki
- Udana izolacja wysokiej jakości całkowitego RNA z próbek kałowych.
- Optymalizowany protokół daje RNA nadające się do sekwencjonowania i RT-PCR.
- Wykazana skuteczność w zmniejszaniu skażenia RNA mikrobiologiczną.
- Protokół jest prosty i bezpośredni dla badaczy.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę ekstrakcji RNA z próbek kałowych.
- Wysokiej jakości RNA jest kluczowa dla dalszych zastosowań.
- Adaptacje komercyjnych zestawów mogą poprawić wydajność i czystość RNA.
