Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

Spektrometria mas obrazowania MALDI to unikalne osiągnięcie w dziedzinie metabolomiki, które pozwala nam mierzyć i wizualizować względną obfitość i rozmieszczenie metabolitów, które wskazują na organizmy, stany fizjologiczne i patologiczne. Główną zaletą obrazowania MALDI jest jego zdolność do wykrywania metabolitów w C2 bez konieczności znakowania. Demonstrując procedurę, mamy Sami Saumę, doktoranta z laboratorium dr Patricii Casity.

Yuki Chen i Kelly Veerasammy, studenci z mojego laboratorium. Po zebraniu natychmiast umieść tkankę w ciekłym azocie, schłodzonej łódce z folii aluminiowej i pudełku z polistyrenu. Zamknij pokrywę pudełka z polistyrenu, aby zamrozić tkankę na 2 do 10 minut, w zależności od rozmiaru tkanki.

Gdy tkanka jest wystarczająco zamrożona, użyj kleszczy, aby usunąć łódź i przetransportować tkankę zabezpieczoną w folii na suchym lodzie do kriostatu. Przed przekrojeniem tkanki należy uważać, aby nie oddychać na szkiełkach. Użyć rękawic i woltomierza ustawionego na rezystancję, aby przetestować przewodność odpowiedniej liczby szkiełek ze szkła powlekanego tlenkiem indu i cyny kompatybilnych z MALDI do analizy.

Po oznakowaniu umieść szkiełka na czystym ręczniku papierowym i kriostatzie oczyszczonym w 70% etanolem ustawionym na minus 20 stopni Celsjusza. Umieść próbkę tkanki w kriostacie i ustaw temperaturę komory kriostatu i głowicy próbki, w zależności od rodzaju tkanki. Po pozostawieniu tkanki do zrównoważenia przez 30 minut, użyj związku do zatapiania tkanki kriogenicznej, aby zamontować tkankę na uchwycie.

I umieść i zablokuj czyste ostrze na scenie, Dostosuj położenie stolika i kąt próbki, aby uzyskać żądany kąt cięcia. I przekrój tkankę, aż ujawni się obszar zainteresowania. Po osiągnięciu żądanego obszaru uzyskaj sekcje o grubości od 10 do 12 mikronów, używając wstępnie schłodzonej szczotki, aby ostrożnie, ale szybko zebrać każdą sekcję na oznaczonej stronie każdego szkiełka w miarę ich pozyskiwania.

Umieść palec pod szkiełkami, aby ogrzać sekcje, aby zapewnić bezpieczne zamocowanie do zjeżdżalni. Sekcje staną się przezroczyste w ciągu 5 do 10 sekund i staną się nieprzezroczyste po około 30 do 60 sekundach. Po zebraniu wszystkich skrawków umieść szkiełka w uchwycie szkiełka i przenieś na suchym lodzie do profanatora.

Alternatywnie prowadnice można przewozić w skrzynce próżniowej. Umieść szkiełka w profanatorze ze środkiem osuszającym i susz je próżniowo przez 45 do 60 minut. Po wyschnięciu, jeśli nie zużyć natychmiast, umieść szkiełka w transporterze szkiełek i napełnij transporter azotem.

Uszczelnij uchwyt parafilmem i umieść uchwyt w torbie strunowej. Następnie umieść pierwszą torebkę strunową w drugiej oznaczonej torbie strunowej zawierającej środek osuszający do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do sześciu miesięcy. Po odwodnieniu użyj pogrubionego srebrnego markera, aby umieścić znaki X w pustych miejscach szkiełek poza sekcjami tkanek i użyj czarnego markera z drobnym punktem, aby umieścić drugi X na wierzchu każdego srebrnego X. Załaduj jeden szkiełko do metalowej tarczy szkiełka MALDI i umieść plastikową osłonę na szkiełku.

Obrysuj położenie próbki na plastikowej pokrywie i umieść szkiełko i tarczę MALDI na powierzchni skanera płaskiego. Następnie wyświetl podgląd slajdu i wybierz żądany obszar. Zeskanuj slajd w 16-bitowej skali szarości, w 2 400 punktach na cal i zapisz obraz do późniejszego wykorzystania.

Aby nałożyć matrycę na szkiełka, włącz automatyczny opryskiwacz matrycowy, upewniając się, że zawór jest ustawiony pod obciążeniem, a następnie uruchom oprogramowanie opryskiwacza. Sprawdź, czy wentylator wyciągowy działa prawidłowo i potwierdź na karcie komunikacja, że system komunikuje się prawidłowo. Uruchom pompę rozpuszczalnika z prędkością 100 mikrolitrów na minutę przy przeciwciśnieniu około 500 funtów na cal kwadratowy.

I ustaw zbiornik azotu na 30 funtów na cal kwadratowy, aby rozpocząć przepływ sprężonego powietrza do opryskiwacza matrycowego. Wyreguluj regulator ciśnienia z przodu opryskiwacza na 10 funtów na cal kwadratowy i ustaw temperaturę dyszy opryskiwacza zgodnie z potrzebami. Za pomocą zaworu i położenia obciążenia użyj strzykawki, aby przepłukać pętlę siedmioma mililitrami 70% metanolu przed napełnieniem pętli sześcioma mililitrami matrycy.

Umieść pustą szkiełko szklaną w uchwycie i opryskiwaczu, przyklejając oba końce, aby zapobiec ruchomości i sprawdź, czy natężenie przepływu i temperatura są stabilne. Naciśnij start, aby ustawić temperaturę dyszy i wyregulować natężenie przepływu pompy, aby dopasować ją do wybranej metody. Przełącz zawór z obciążenia na spray i kliknij kontynuuj.

Zezwolono na uruchomienie systemu do końca. Po zakończeniu osadzania przełącz zawór z natrysku na ładowanie i kliknij kontynuuj. Zbadaj wzór kodowania matrycy pod mikroskopem.

Jeśli zaobserwuje się równą warstwę drobnego kryształu matrycy, należy umieścić matrycę na odpowiednich szkiełkach do próbek, jak pokazano poniżej. Po wyczyszczeniu wszystkich szkiełek należy wyczyścić system zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapobiec zatkaniu dyszy opryskiwacza. W tym miejscu pokazano obrazy wyjściowe z analizy danych MALDI MS Imaging widm wyładowań masowych wybranych z każdego przedziału 100 daltonów, wyraźnie przedstawiające użyteczność identyfikacji widm od metabolitów drobnocząsteczkowych do lipidów o dużej masie cząsteczkowej.

Każda droga przedstawia odpowiednie mapy cieplne jonów zawierające zarówno informacje przestrzenne, jak i spektralne określonego gatunku metabolitów w trzech tkankach pobranych w 1, 21 i 60 dniu po urodzeniu. Mocną stroną metodologii MALDI MSI jest zdolność do rozpoznania specyficzności niektórych gatunków identyfikowanych na podstawie stosunku masy do ładunku do kamieni milowych rozwoju lub określonych struktur anatomicznych. W niniejszej analizie zaobserwowano, że niektóre metabolity są wzbogacone u noworodków w pierwszym dniu po urodzeniu lub u dorosłych w 60. dniu po urodzeniu lub w wieku 60 lat, lub że są równomiernie rozmieszczone w badanym wieku.

Zaobserwowano, że inne gatunki molekularne są specyficznie wzbogacone w istotę szarą, istotę białą lub płyn mózgowo-rdzeniowy i komory. Przeanalizowano również rozkład przestrzenny reprezentatywnych metabolitów, w tym hipoksantyny, kwasu glutaminowego, kwasu N-acetyloasparaginowego, kwasu arachidonowego i kilku lipidów. Aby zachować wierność staty metabolicznej, odpowiednie rozwarstwienie próbki, przechowywanie i cięcie cyro mają kluczowe znaczenie dla zapobiegania sztucznym zmianom metabolicznym.

Po przeprowadzeniu eksperymentu MALDI może być konieczne zweryfikowanie tożsamości znalezionych metabolitów. Można to osiągnąć poprzez mikroekstrakcję i chromatografię cieczową tandem MS. Obrazowanie MALDI MS ułatwia badania oparte na metabolomice z rozdzielczością przestrzenną i daje badaczom możliwość ustalenia danych metabolicznych w ośrodku ilościowym i wizualnym. Ostatnio pojawiło się duże zainteresowanie wpływem diety na zaburzenia neurodegeneracyjne, związkiem między mikrobiomem jelitowym a mózgiem.

Badanie metabolizmu w neurobiologii ma ogromne znaczenie, od rozwoju neurologicznego do neurodegeneracji. Główny fakt interakcji jelito-mózg. I to właśnie w tym kontekście pomysł na urządzenie do obrazowania MALDI może naprawdę dostarczyć wyjątkowych technologii do wizualizacji efektu, jaki konkretna manipulacja może mieć w mózgu.