2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Metoda ta może być wykorzystana nie tylko do odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach podstawowych, ale także przyczynić się do rozwoju dziedzin medycznych, farmaceutycznych i biotechnologicznych poprzez nakreślenie nowych małych ligandów molekularnych niezbędnych białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia równoległą analizę białka i partnerów metabolicznych wybranego białka w warunkach zbliżonych do vivo. Ta metoda pomaga wyłowić oddziałujące cząsteczki bez ograniczania się do wstępnie wybranych ligandów.

Chociaż metoda ta została opracowana dla roślin, może być również stosowana do innych systemów, takich jak komórki HeLa, E. coli i S. Cerevisiae. Na początek przygotuj pożywkę MSMO i dostosuj pH do 5,7 za pomocą jednego molowego wodorotlenku potasu. Następnie autoklaw roztworu przez 15 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.

Dodaj suplementy do podłoża tuż przed rozpoczęciem eksperymentu. Teraz hoduj transgeniczną hodowlę komórkową rzodkiewnika pospolitego PSBL thaliana w 50 mililitrach pożywki MSMO w kolbie o pojemności 100 mililitrów. Następnie umieść kolbę na wytrząsarce platformy orbitalnej i delikatnie mieszaj komórki z prędkością 130 obr./min w temperaturze 20 stopni Celsjusza w świetle.

Co siedem dni hoduj komórki w świeżej pożywce w roztworze od jednego do 10. Następnie użyj szklanego lejka z nylonową siatką zamontowaną na stożkowej kolbie, podłączonej do pompy próżniowej, aby zebrać komórki w logarytmicznej fazie wzrostu. Następnie zawiń wysuszone komórki w folię aluminiową i zamroź w ciekłym azocie.

Za pomocą wstępnie schłodzonego młyna miksującego, ustawionego na częstotliwość wibracji 20 Hz. Homogenizuj zebrany i zamrożony materiał komórek roślinnych na drobny proszek przez dwie minuty. Następnie porcjować trzy gramy zmielonego proszku na próbkę za pomocą ciekłego azotu, wstępnie schłodzonego sprzętu, aby zapobiec jego rozmrożeniu.

Następnie, za pomocą wstępnie schłodzonej zaprawy ciekłym azotem, rozetrzyj zmielony proszek trzema mililitrami lodowatego buforu do lizy, aż się rozmrozi. Rozmrożoną próbkę natychmiast podzielić na dwie mililitrowe mikroprobówki wirówkowe. Odwirować próbki o masie 20,817 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórkowe.

Podczas wirowania próbki należy podać 100 mikrolitrów kulek sefarozy IgG na próbkę. Dodaj jeden mililitr buforu do lizy i ponownie zawieś kulki przez wirowanie. Wirować przez trzy sekundy przy 2 000 g i wyrzucić bufor do lizy.

Na koniec ponownie zawieś kulki w 400 mikrolitrach buforu do lizy. Po odwirowaniu przenieś trzy mililitry klarownego lizatu roślinnego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Dodaj wstępnie zrównoważone kulki do lizatu roślinnego i inkubuj mieszaninę na obracającym się kole przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieś mieszaninę do strzykawki podłączonej do nasadki z blokadą przynęty na kolumnie wirującej z filtrem o wielkości porów 35 mikrometrów umieszczonym na górze kolektora próżniowego. Przepuść lizat przez urządzenie, włączając pompę próżniową z delikatnym naciskiem, aby uniknąć uszkodzenia kulek. Niezwiązany lizat jest odprowadzany do stacji utylizacji odpadów znajdującej się u podstawy kolektora, a kompleksy białkowe, związane z kulkami, pozostają na filtrze.

Po opróżnieniu strzykawki z lizatu komórkowego dodaj 10 mililitrów buforu do mycia, aby umyć kulki. Następnie dodać mililitr buforu elucyjnego, aby wykonać drugi etap płukania. Teraz zdejmij strzykawkę i nasadkę blokującą przynętę.

Zamknąć dolną nakrętkę przy kolumnie i dodać 400 mikrolitrów buforu elucyjnego zawierającego 50 jednostek wzmocnionej formy wirusa wytrawiania tytoniu, proteazy, do kulek. Umieść kolumnę na wytrząsarce stołowej, ustawionej na 1 000 obr./min na 30 minut w temperaturze 16 stopni Celsjusza. Następnie dodaj dodatkowe 50 jednostek proteazy do kolumny i inkubuj mieszaninę na wytrząsarce, tak jak w poprzednim kroku.

Następnie zdejmij dolną nasadkę i umieść kolumnę w dwumililitrowej probówce do mikrowirówki. Odwirować przy 20 817 g przez jedną minutę w celu zebrania eluatu i przystąpić do ekstrakcji białek i metabolitów. Aby rozpocząć ekstrakcję, dodaj jeden mililitr rozpuszczalnika metanolu metanolu do eluatu trzy do jednego do jednego.

Odwrócić probówkę, aby zmieszać ją z próbką. Następnie dodaj 0,4 mililitra od jednego do trzech wodnych roztworów metanolu do mieszaniny i odwróć probówkę, aby wymieszać próbkę. Następnie odwirować próbkę o masie 20,817 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby umożliwić separację faz.

Za pomocą jednomililitrowej pipety ręcznej do obsługi cieczy usuń górną fazę zawierającą lipidy. Następnie dodaj 0,2 mililitra metanolu i odwróć probówkę, aby wymieszać próbkę. Odwirować przy 20 817 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i zebrać fazę polarną do nowej probówki w celu pomiaru metabolitów.

Pozostaw około 50 mikrolitrów fazy polarnej na dnie probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu białka. Następnie wysuszyć rurkę zawierającą fazę polarną w parowniku odśrodkowym przez noc. Suszyć probówki z granulkami białkowymi przez 30 do 60 minut, aby uniknąć przesuszenia.

Za pomocą jednoetapowego oczyszczania powinowactwa wraz ze spektrometrią mas zidentyfikowano interakcje białko-białko i białko-metabolit w transgenicznych hodowlach komórek Arabidopsis thaliana. Hodowle komórkowe wykazujące ekspresję NDPK1 wykazują znaczne wzbogacenie w walinę-leucynę, glutaminian izoleucyny, izoleucynę leucynę i izoleucynę fenyloalaninę w porównaniu z pustym wektorem, próbkami NDPK2 i NDPK3. Aby znaleźć znane interakcje białko-białko i białko-metabolit, 13 białek i cztery dipeptydy współeluujące z NDPK1 są porównywane z bazą danych ściegu.

Główne powiązania obserwuje się między ortologiem APX1 i rodziną dehydrogenaz aldehydowych oraz czynnikiem inicjacji translacji, FBR12, z czynnikiem inicjacji translacji o homologu alfa podjednostki translacji. Zidentyfikowane dipeptydy nie wykazują żadnych zgłoszonych partnerów białkowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby próbki, sprzęt i odczynniki były zimne przez cały czas trwania eksperymentu. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak termoforeza mikroskopowa lub test aktywności, w celu określenia bezpośredniej interakcji między cząsteczkami lub wnioskowania o ich ligandzie na aktywność białka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obchodzić się z próbką podczas całej procedury, aby uzyskać wiarygodne wyniki i zidentyfikować ligandy wybranego białka.

Nie zapominaj, że praca z metanolem i roztworem MTBE może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem.