Name: 2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania powinowactwa do równoległej analizy interakcji białko-białko i białko-metabolit w komórkach Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia identyfikację nowych ligandów białek w warunkach zbliżonych do in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy serdecznie podziękować Prof. Dr. Lotharowi Willmitzerowi za jego zaangażowanie w projekt, produktywne dyskusje i wspaniały nadzór. Jesteśmy wdzięczni dr Danielowi Vehelowi za pomoc w pomiarach proteomicznych SM. Jesteśmy wdzięczni Pani Änne Michaelis, która zapewniła nam nieocenioną pomoc techniczną przy pomiarach LC-MS. Ponadto dziękujemy dr Monice Kosmacz i dr Ewelinie Sokołowskiej za pomoc i zaangażowanie w prace nad oryginalnym rękopisem oraz Weronice Jasińskiej za wsparcie techniczne.

<ol><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+as+global+regulators%3A+A+new+view+of+protein+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li>
<li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li>
<li>Ramírez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson%27s+disease-associated+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161(2017).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
<li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li>
<li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li>
<li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li>
<li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li>
<li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397(2010).</li>
<li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21699588">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Transcription+Factors%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. -E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301(2016).</li>
<li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUBAcon%3A+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li>
<li>Katajamaa, M., Orešič, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STITCH+5%3A+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li>
<li>Tanaka, K. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN%3A+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Drug+Monitoring%22%5BJournal%5D)">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół pozwala na równoległą identyfikację kompleksów PP i PM docelowego białka. Od klonowania do ostatecznych wyników, eksperyment można zakończyć w ciągu zaledwie 8-12 tygodni. Pełne AP zajmuje około 4-6 godzin dla zestawu od 12 do 24 próbek, dzięki czemu nasz protokół nadaje się do analizy średnioprzepustowej.
Protokół, mimo że jest ogólnie prosty, składa się z kilku krytycznych kroków. (i) Wystarczająca ilość białka wejściowego i kulek powinowactwa ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia dynamicznego zakresu wykrywania metabolitów. Skuteczna liza komórek jest zatem kluczowym krokiem w procedurze. Słaba wydajność białka może być konsekwencją niedostatecznego sproszkowania materiału lub nieoptymalnego stosunku lizy buforu do materiału. (ii) Należy zadbać o to, aby stosowane odczynniki były przyjazne dla stwardnienia rozsianego. Należy unikać silnych detergentów, glicerolu lub nadmiernych ilości soli, ponieważ zakłócają one wykrywanie stwardnienia rozsianego. (iii) Kulki agarozy nie powinny być nadmiernie suszone podczas etapów mycia, a podczas korzystania z kolektora próżniowego ważne jest, aby stosować powolne natężenie przepływu, aby nie zniszczyć kulek ani nie wpłynąć na złożoną stabilność.
Istnieje kilka ważnych możliwych modyfikacji przedstawionego protokołu: (i) Używamy konstytutywnego promotora CaMV35S, aby zmaksymalizować ilość białka przynęty. Nadekspresja, choć bardzo przydatna, może mieć poważny wpływ na homeostazę komórkową28 i prowadzić do powstawania fizjologicznie nieistotnych interakcji. Ekspresja znakowanych białek przy użyciu natywnych promotorów i, jeśli to możliwe, w tle utraty funkcji, jest uważana za lepszą w odzyskiwaniu prawdziwych interakcji biologicznych. W przypadku białek, które normalnie nie ulegają ekspresji w kulturach komórek roślinnych, tło roślinne może okazać się niezbędne do zidentyfikowania odpowiednich interaktorów. (ii) Podczas pracy z białkami błonowymi bufor do lizy musi być uzupełniony detergentem kompatybilnym ze MS. (iii) Wprowadzenie drugiego etapu oczyszczania powinowactwa mogłoby poprawić stosunek wyników fałszywie dodatnich do prawdziwie dodatnich i wyeliminować potrzebę kontroli EV29. Nowatorski znacznik tandemowy z dwoma niezależnymi miejscami rozszczepienia proteazy stanowi atrakcyjną alternatywę dla etapu chromatografii wykluczającej rozmiar dodanego przez Maedę i wsp. 201411, który jest zarówno pracochłonny, jak i czasochłonny.
Najpoważniejszą wadą AP jest wysoki odsetek fałszywych alarmów. Powodów jest wiele. Wspomniano już o konstytutywnej nadekspresji. Innym źródłem fizjologicznie nieistotnych interakcji, chyba że pracuje się z izolowanymi organellami, jest otrzymywanie lizatów całokomórkowych zawierających mieszaniny białek i metabolitów z różnych przedziałów subkomórkowych. Lokalizacja subkomórkowa powinna być używana do filtrowania prawdziwych interaktorów. Niemniej jednak większość wyników fałszywie dodatnich wynika z niespecyficznego wiązania między białkami a żywicami agarozowymi. Wprowadzenie drugiego etapu oczyszczania, jak opisano powyżej, oferuje najlepsze rozwiązanie problemu, jednak wiąże się z kosztem czasu i przepustowości. Co więcej, słabsza interakcja może zostać utracona wraz z wydłużaniem się protokołu. Kolejnym zastrzeżeniem AP jest to, że pomimo wyczerpujących informacji, które dostarcza na temat interaktomii białka docelowego, rozróżnienie między bezpośrednimi i pośrednimi celami białka przynęty jest niemożliwe. Potrzebne są ukierunkowane podejścia bimolekularne, aby potwierdzić interakcje.
AP w połączeniu z metabolomiką opartą na stwardnieniu rozsianym wykorzystano do zbadania kompleksów białkowych w S. cerevisiae12. Praca ta, wraz z naszą wcześniejszą obserwacją13 , że podobnie jak lipidy, związki polarne i półpolarne pozostają związane z kompleksami białkowymi wyizolowanymi z lizatów komórkowych, dostarczyły koncepcyjnych podstaw dla przedstawionego protokołu. Nasz protokół charakteryzuje się trzema unikalnymi punktami: (i) W przeciwieństwie do drożdży12, pokazuje, że AP nadaje się do pobierania nie tylko hydrofobowych, ale także hydrofilowych ligandów białkowych. (ii) Wprowadzając protokół ekstrakcji "trzy w jednym", pojedynczy AP może być wykorzystany do badania interakcji białek i metabolitów białka przynęty. (iii) Dostosowaliśmy protokół do komórek roślinnych.
Przyszłe wysiłki będą koncentrować się na stworzeniu nowatorskiego znacznika tandemowego z dwoma niezależnymi miejscami rozszczepienia proteazy. Chcielibyśmy również zbadać przydatność protokołu do małych cząsteczek o niskiej liczebności, takich jak hormony roślinne.

Opisana tutaj metoda ma na celu identyfikację metabolitów i partnerów białkowych wybranego białka w warunkach lizatu komórkowego bliskiego in vivo. Spekuluje się, że znacznie więcej metabolitów niż obecnie scharakteryzowanych pełni ważną funkcję regulacyjną1. Metabolity mogą działać jak przełączniki biologiczne, zmieniając aktywność, funkcjonalność i/lub lokalizację białek receptorowych2,3,4. W ostatniej dekadzie opracowano kilka przełomowych metod, umożliwiających identyfikację PMI in vivo lub w warunkach bliskich in vivo5. Dostępne podejścia można podzielić na dwie grupy. Pierwsza grupa obejmuje techniki, które rozpoczynają się od przynęty zawierającej znane metabolity w celu schwytania nowych partnerów białkowych. Metody obejmują chromatografię powinowactwa6, test powinowactwa do leku reagujący na stabilność celu7, chemo-proteomics8 oraz termiczne profilowanie proteomu9. Druga grupa składa się z pojedynczej metody, która zaczyna się od znanego białka w celu identyfikacji ligandów małocząsteczkowych10,11.
AP w połączeniu z lipidomiką opartą na MS został użyty do analizy kompleksów białkowo-lipidowych u Saccharomyces cerevisiae12. Jako punkt wyjścia autorzy wykorzystali szczepy drożdży wykazujące ekspresję 21 enzymów biorących udział w biosyntezie ergosteroli i 103 kinazy połączone ze znacznikiem oczyszczania tandemowego powinowactwa (TAP). Stwierdzono, że 70% enzymów i 20% kinaz wiąże różne hydrofobowe ligandy, rzucając światło na skomplikowaną sieć interakcji białkowo-lipidowych.
Poprzednio mogliśmy wykazać, że podobnie jak w przypadku lipidów, związki polarne i półpolarne również pozostają związane z kompleksami białkowymi wyizolowanymi z lizatów komórkowych13. Na podstawie tych ustaleń zdecydowaliśmy się zoptymalizować metodę AP opublikowaną wcześniej10,11 dla komórek roślinnych i związków hydrofilowych14. W tym celu wykorzystaliśmy wektory TAP opisane przez Van Leene et al. 2010, z powodzeniem stosowane w badaniach PPI roślin15. Aby skrócić czas potrzebny na uzyskanie linii transgenicznych, zdecydowaliśmy się na hodowle komórkowe Arabidopsis. Zastosowaliśmy jednoetapową metodę ekstrakcji eterem metylowo-tert-butylowym (MTBE)/metanolem/wodą, co pozwoliło na scharakteryzowanie białek (granulki), lipidów (faza organiczna) i metabolitów hydrofilowych (faza wodna)16 w pojedynczym eksperymencie oczyszczania powinowactwa. Linie kontrolne EV zostały wprowadzone, aby wykluczyć wyniki fałszywie dodatnie, np. białka wiążące się z samym znacznikiem. Jako dowód słuszności koncepcji oznaczyliśmy trzy (z pięciu) kinazy difosforanowych nukleozydów obecnych w genomie Arabidopsis (NDPK1-NDPK3). Między innymi udało nam się wykazać, że NDPK1 oddziałuje z S-transferazą glutationu i glutationem. W związku z tym możemy udowodnić, że NDPK1 jest poddawany glutationylacji14.
Podsumowując, prezentowany protokół jest ważnym narzędziem do charakteryzowania sieci interakcji białko-białko i białko-małocząsteczka i stanowi duży postęp w stosunku do istniejących metod.

<table><tbody><tr><td>Sole bazalne Murashige i Skoog z minimalną ilością substancji organicznych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 1-naftylooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kinetyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 inhibitor proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Proteaza</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&nbsp; Żel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Tag Przeciwciało (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka trypsyny/Lys-C, klasa specyfikacji masowej</td><td>Promega&nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Tiomocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 Wytrząsarka platformowa</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa (średnica drutu 34 &mikro; M, grubość 55 i mikro; M, otwarta przestrzeń 14%)</td><td>Prosepa</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Lejek szklany, 47 mm, 300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>Butelka filtrująca Top 500 ml 0,2 &micro; M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Młyn miksujący MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol ""Classic"" z 2 różnymi nakrętkami bez filtrów</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>Filtr (mały) 35 &mikro; Wielkość porów M, dla Mobicol M 1002, M1003, M1050 i M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy o zmiennej prędkości SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>Talerze obrotowe do rotatorów SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24-portowe rozdzielacze SPE</td><td>Restek&nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny Finisterre C18/17% SPE 100mg / 1ml</td> Automatyczny podajnik <td>próbek Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Fiolki</td><td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&ouml; r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Uznanie PepMap 100 C18 LC</td><td>Kolumna Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 Chromatograf cieczowy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrydowy kwadrupolowo-orbitrapowy spektrometr</td> masowy <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>System UPLC Acquity&nbsp;</td><td>Wody&nbsp;</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 Kolumna, 100A, 1.8 i mikro; M, 2.1 mM X 100 mM, 1/opk</td><td>Wody&nbsp;</td><td></td><td></td>186003533</tr><tr><td>Ultradźwiękowe kąpiele czyszczące o dużej mocy do wodnych roztworów czyszczących</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 w 1: jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Procesy komórkowe są regulowane przez interakcje między cząsteczkami biologicznymi, takimi jak białka, metabolity i kwasy nukleinowe. Podczas gdy badanie interakcji białko-białko (PPI) nie jest nowością, podejścia eksperymentalne mające na celu scharakteryzowanie endogennych interakcji białko-metabolit (PMI) stanowią raczej nowe osiągnięcie. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół, który pozwala na jednoczesną charakterystykę PPI i PMI wybranego białka, określanego jako przynęta. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek Arabidopsis i łączy oczyszczanie powinowactwa (AP) z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas (MS). Krótko mówiąc, transgeniczne linie Arabidopsis, wyrażające białko przynęty połączone ze znacznikiem powinowactwa, są najpierw poddawane lizie w celu uzyskania natywnego ekstraktu komórkowego. Przeciwciała anty-znacznikowe są używane do ściągania białek i metabolitów będących partnerami białka przynęty. Oczyszczone kompleksy o powinowactwie ekstrahuje się jednoetapową metodą eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE)/metanolu/wody. Podczas gdy metabolity rozdzielają się na fazę polarną lub hydrofobową, białka można znaleźć w osadzie. Zarówno metabolity, jak i białka są następnie analizowane za pomocą ultra-sprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS lub UPLC-MS/MS). Linie kontrolne z pustym wektorem (EV) służą do wykluczania wyników fałszywie dodatnich. Główną zaletą naszego protokołu jest to, że umożliwia on identyfikację białkowych i metabolitowych partnerów białka docelowego równolegle w warunkach zbliżonych do fizjologicznych (lizat komórkowy). Przedstawiona metoda jest prosta, szybka i może być łatwo zaadaptowana do systemów biologicznych innych niż hodowle komórek roślinnych.

W oryginalnym badaniu trzy A. thaliana Geny NDPK wykazano w nadmiernej ekspresji w kulturach zawiesinowych komórek PSB-L pod kontrolą konstytutywnego promotora 35S14 (Rysunek 1). Tandemowy znacznik powinowactwa połączono z końcem karboksylowym lub aminowym białka przynęty. Kompleksy oczyszczone metodą powinowactwa poddano ekstrakcji w układzie MTBE/metanol/woda16Białka i małe cząsteczki wyizolowane metodą affinity-pulling zidentyfikowano za pomocą MS (Tabele S2 i S3).
Aby skorygować wyniki pod kątem fałszywie dodatnich, wykorzystano próbki ślepe w celu wyeliminowania zanieczyszczeń małymi cząsteczkami pochodzącymi z odczynników chemicznych i materiałów laboratoryjnych. Ponadto, metabolity i białka wiążące się z samym tagiem powinowactwa lub żywicą zostały uwzględnione poprzez zastosowanie linii kontrolnych EV. W celu wyłonienia wyników prawdziwie dodatnich zastosowano dwustronny nieparzysty test t Studenta oraz korektę współczynnika odkryć fałszywych Benjamini &amp; Hochberg, aby zidentyfikować metabolity (Tabela S4) i białka (Tabela S5) znacząco wzbogacone w eksperymentach AP z NDPKs (NDPKs z tagami N- i C-końcowymi) w porównaniu z liniami kontrolnymi EV (FDR &lt; 0,1). Należy zauważyć, że w poprzedniej pracy zastosowano kryteria obecności/braku w celu wyznaczenia interaktorów białkowych i małocząsteczkowych.
Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla NDPK1, natomiast dane metaboliczne koncentrują się na dipeptydach, stanowiących nową klasę regulatorów małocząsteczkowych badanych w naszej grupie. Analiza proteomiczna ujawniła 26 domniemanych partnerów białkowych NDPK1. Po dodatkowym przefiltrowaniu białek współlokalizujących się w tym samym przedziale podkomórkowym co NDPK1 (cytozol), lista została zawężona do 13 domniemanych interaktorów białkowych. Wśród zidentyfikowanych białek znalazły się transferaza S-glutationowa, dwa czynniki inicjacji elongacji, tubulina oraz hydrataza akonianowa. Analiza metabolomiczna wykazała cztery dipeptydy: Val-Leu, Ile-Glu, Leu-Ile i Ile-Phe, które specyficznie eluowały wspólnie z NDPK1 (Rysunek 2). Należy zauważyć, że wszystkie cztery dipeptydy posiadają hydrofobowy resztę w swoim N-końcu, co sugeruje wspólną specyficzność wiązania.
W celu poszukiwania znanych kompleksów białko-białko oraz białko-metabolit przeszukaliśmy bazę danych Stitch pod kątem 13 zidentyfikowanych białek i czterech dipeptydów.25 (Rysunek 3). Można było sformułować kilka obserwacji: (i) Żaden z interaktorów nie był wcześniej raportowany dla NDPK1. (ii) Zgłoszono, że ortolog APX1 oddziałuje z członkiem rodziny dehydrogenaz aldehydowych ALDH7B4, natomiast czynnik inicjacji translacji FBR12 z innym czynnikiem inicjacji translacji kodowanym przez gen AT2G40290. (iii) Zidentyfikowane dipeptydy nie mają raportowanych partnerów białkowych. Współeluowane dipeptydy nie były wcześniej raportowane jako powiązane z żadnym z odnalezionych białek roślinnych. Pełnią one jednak istotne role w innych organizmach: Leu-Ile, np.wykazuje efekt aktywujący neurotrofin w ludzkiej linii komórkowej26Należy zauważyć, że eksperyment ten nie pozwala na zidentyfikowanie dokładnej topologii układu. Na przykład dipeptyd może oddziaływać bezpośrednio z NDPK1, ale może być również powiązany z dowolnym z białek współoczyszczonych.
Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że ustalona procedura, wykorzystująca AP wraz ze spektrometrią mas, ułatwia identyfikację interaktorów białko-białko oraz białko-mała cząsteczka i pomaga w generowaniu obszernych informacji na temat interaktomu białka docelowego.
<img alt="Przetwarzanie komórek transgenicznych, oczyszczanie białek z tagiem TAP, chromatografia kolumnowa, analiza LC-MS/MS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Schemat przebiegu analizy AP-MS. (A) Przygotowanie natywnej frakcji rozpuszczalnej z kultury komórek roślinnych. (B) Kolejne etapy procedury AP. Po nałożeniu próbki na kolumnę białko docelowe (POI) połączone z tagiem TAP wiąże się z przeciwciałem IgG unieruchomionym na kuleczkach agarozy. Przemywanie kolumny umożliwia usunięcie nie związanych białek i metabolitów. Po przeprowadzeniu cięcia za pomocą proteazy AcTEV eluowane są kompleksy białka POI z metabolitami. (C) Rozdział kompleksów na frakcję białkową i frakcję metabolitów, a następnie półilościowa analiza MS. Część tego rysunku została powielona z pracy Luzarowski i inni 201714. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres porównania intensywności białek; wykresy słupkowe A-D; ekspresja NDPK w wektorach; analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Dipeptydy współeluujące specyficznie z NDPK1. Średnie intensywności czterech dipeptydów Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C), oraz Ile-Phe (D) wykreślono wyniki pomiarów z eksperymentu AP. Wszystkie cztery dipeptydy wykazują istotne wzbogacenie w próbkach NDPK1 w porównaniu z kontrolą EV (gwiazdki oznaczają FDR &lt; 0,1). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy dla 6 pomiarów (3 powtórzeń białek z tagiem N-końcowym i 3 z tagiem C-końcowym). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat oddziaływań białkowych z odpowiadającymi im strukturami cząsteczkowymi; węzły oznaczone identyfikatorami białek oraz ligandami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Sieć interakcji wszystkich cząsteczek współeluujących z NDPK1, wyszukiwana w bazie danych STITCH z uwzględnieniem wyłącznie wcześniejszych dowodów eksperymentalnych i bazodanowych (poziom ufności &gt; 0.2). Wyższa wiarygodność wskazuje na większe prawdopodobieństwo wystąpienia oddziaływania i jest obliczana na podstawie zgromadzonych danych. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Tabela S1. Tabela wynikowa MaxQuant „parameters.txt”. Tabela zawiera wartości progowe dla identyfikacji i kwantyfikacji, a także informacje o wykorzystanych bazach danych. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela S2. Informacje z tabeli wynikowej MaxQuant „proteinGroups.txt”Tabela zawiera listę wszystkich zidentyfikowanych grup białek, intensywności oraz dodatkowe informacje, takie jak liczba unikalnych peptydów i wynik. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela S3. Plik wynikowy zawierający analizę metabolitów polarnych. Tabela zawiera listę wszystkich zidentyfikowanych cech masowych, charakteryzujących się określonymi wartościami m/z, RT i intensywnością. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela S4. Dipeptydy znalezione w próbkach AP, w których jako przynęta zastosowano NDPK1, NDPK2 lub NDPK3. Z listy wykluczono dipeptydy obecne w próbkach ślepych. Dla każdego NDPK przeprowadzono analizę trzech niezależnych linii (oznaczonych w terminalu N- lub C-) w trzech powtórzeniach. Test t Studenta t-testowanie i dalsza korekta pwartość p przy użyciu metody Benjamini-Hochberga &amp; Metoda Hochberga została wykorzystana do określenia istotnie wzbogaconych partnerów interakcyjnych NDPK (FDR &lt; 0.1). Podano ΔRT obliczone w stosunku do związków odniesienia oraz Δppm w stosunku do masy monoizotopowej podanej w bazie Metlin27. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela S5. Białka współoczyszczone z NDPK1. Dwie niezależne linie (oznaczone w obrębie N- lub C-końca) dla każdej NDPK analizowano w trzech powtórzeniach. Test t Studenta t-testowanie i dalsza korekta pwartość p przy użyciu metody Benjamini-Hochberga &amp; Do wyznaczenia istotnie wzbogaconych partnerów interakcyjnych NDPK wykorzystano metodę Hochberga (FDR &lt; 0.1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Metoda ta może być wykorzystana nie tylko do odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach podstawowych, ale także przyczynić się do rozwoju dziedzin medycznych, farmaceutycznych i biotechnologicznych poprzez nakreślenie nowych małych ligandów molekularnych niezbędnych białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia równoległą analizę białka i partnerów metabolicznych wybranego białka w warunkach zbliżonych do vivo. Ta metoda pomaga wyłowić oddziałujące cząsteczki bez ograniczania się do wstępnie wybranych ligandów.Chociaż metoda ta została opracowana dla roślin, może być również stosowana do innych systemów, takich jak komórki HeLa, E. coli i S. Cerevisiae. Na początek przygotuj pożywkę MSMO i dostosuj pH do 5,7 za pomocą jednego molowego wodorotlenku potasu. Następnie autoklaw roztworu przez 15 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.Dodaj suplementy do podłoża tuż przed rozpoczęciem eksperymentu. Teraz hoduj transgeniczną hodowlę komórkową rzodkiewnika pospolitego PSBL thaliana w 50 mililitrach pożywki MSMO w kolbie o pojemności 100 mililitrów. Następnie umieść kolbę na wytrząsarce platformy orbitalnej i delikatnie mieszaj komórki z prędkością 130 obr./min w temperaturze 20 stopni Celsjusza w świetle.Co siedem dni hoduj komórki w świeżej pożywce w roztworze od jednego do 10. Następnie użyj szklanego lejka z nylonową siatką zamontowaną na stożkowej kolbie, podłączonej do pompy próżniowej, aby zebrać komórki w logarytmicznej fazie wzrostu. Następnie zawiń wysuszone komórki w folię aluminiową i zamroź w ciekłym azocie.Za pomocą wstępnie schłodzonego młyna miksującego, ustawionego na częstotliwość wibracji 20 Hz. Homogenizuj zebrany i zamrożony materiał komórek roślinnych na drobny proszek przez dwie minuty. Następnie porcjować trzy gramy zmielonego proszku na próbkę za pomocą ciekłego azotu, wstępnie schłodzonego sprzętu, aby zapobiec jego rozmrożeniu.Następnie, za pomocą wstępnie schłodzonej zaprawy ciekłym azotem, rozetrzyj zmielony proszek trzema mililitrami lodowatego buforu do lizy, aż się rozmrozi. Rozmrożoną próbkę natychmiast podzielić na dwie mililitrowe mikroprobówki wirówkowe. Odwirować próbki o masie 20,817 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórkowe.Podczas wirowania próbki należy podać 100 mikrolitrów kulek sefarozy IgG na próbkę. Dodaj jeden mililitr buforu do lizy i ponownie zawieś kulki przez wirowanie. Wirować przez trzy sekundy przy 2 000 g i wyrzucić bufor do lizy.Na koniec ponownie zawieś kulki w 400 mikrolitrach buforu do lizy. Po odwirowaniu przenieś trzy mililitry klarownego lizatu roślinnego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Dodaj wstępnie zrównoważone kulki do lizatu roślinnego i inkubuj mieszaninę na obracającym się kole przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieś mieszaninę do strzykawki podłączonej do nasadki z blokadą przynęty na kolumnie wirującej z filtrem o wielkości porów 35 mikrometrów umieszczonym na górze kolektora próżniowego. Przepuść lizat przez urządzenie, włączając pompę próżniową z delikatnym naciskiem, aby uniknąć uszkodzenia kulek. Niezwiązany lizat jest odprowadzany do stacji utylizacji odpadów znajdującej się u podstawy kolektora, a kompleksy białkowe, związane z kulkami, pozostają na filtrze.Po opróżnieniu strzykawki z lizatu komórkowego dodaj 10 mililitrów buforu do mycia, aby umyć kulki. Następnie dodać mililitr buforu elucyjnego, aby wykonać drugi etap płukania. Teraz zdejmij strzykawkę i nasadkę blokującą przynętę.Zamknąć dolną nakrętkę przy kolumnie i dodać 400 mikrolitrów buforu elucyjnego zawierającego 50 jednostek wzmocnionej formy wirusa wytrawiania tytoniu, proteazy, do kulek. Umieść kolumnę na wytrząsarce stołowej, ustawionej na 1 000 obr./min na 30 minut w temperaturze 16 stopni Celsjusza. Następnie dodaj dodatkowe 50 jednostek proteazy do kolumny i inkubuj mieszaninę na wytrząsarce, tak jak w poprzednim kroku.Następnie zdejmij dolną nasadkę i umieść kolumnę w dwumililitrowej probówce do mikrowirówki. Odwirować przy 20 817 g przez jedną minutę w celu zebrania eluatu i przystąpić do ekstrakcji białek i metabolitów. Aby rozpocząć ekstrakcję, dodaj jeden mililitr rozpuszczalnika metanolu metanolu do eluatu trzy do jednego do jednego.Odwrócić probówkę, aby zmieszać ją z próbką. Następnie dodaj 0,4 mililitra od jednego do trzech wodnych roztworów metanolu do mieszaniny i odwróć probówkę, aby wymieszać próbkę. Następnie odwirować próbkę o masie 20,817 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby umożliwić separację faz.Za pomocą jednomililitrowej pipety ręcznej do obsługi cieczy usuń górną fazę zawierającą lipidy. Następnie dodaj 0,2 mililitra metanolu i odwróć probówkę, aby wymieszać próbkę. Odwirować przy 20 817 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i zebrać fazę polarną do nowej probówki w celu pomiaru metabolitów.Pozostaw około 50 mikrolitrów fazy polarnej na dnie probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu białka. Następnie wysuszyć rurkę zawierającą fazę polarną w parowniku odśrodkowym przez noc. Suszyć probówki z granulkami białkowymi przez 30 do 60 minut, aby uniknąć przesuszenia.Za pomocą jednoetapowego oczyszczania powinowactwa wraz ze spektrometrią mas zidentyfikowano interakcje białko-białko i białko-metabolit w transgenicznych hodowlach komórek Arabidopsis thaliana. Hodowle komórkowe wykazujące ekspresję NDPK1 wykazują znaczne wzbogacenie w walinę-leucynę, glutaminian izoleucyny, izoleucynę leucynę i izoleucynę fenyloalaninę w porównaniu z pustym wektorem, próbkami NDPK2 i NDPK3. Aby znaleźć znane interakcje białko-białko i białko-metabolit, 13 białek i cztery dipeptydy współeluujące z NDPK1 są porównywane z bazą danych ściegu.Główne powiązania obserwuje się między ortologiem APX1 i rodziną dehydrogenaz aldehydowych oraz czynnikiem inicjacji translacji, FBR12, z czynnikiem inicjacji translacji o homologu alfa podjednostki translacji. Zidentyfikowane dipeptydy nie wykazują żadnych zgłoszonych partnerów białkowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby próbki, sprzęt i odczynniki były zimne przez cały czas trwania eksperymentu. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak termoforeza mikroskopowa lub test aktywności, w celu określenia bezpośredniej interakcji między cząsteczkami lub wnioskowania o ich ligandzie na aktywność białka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obchodzić się z próbką podczas całej procedury, aby uzyskać wiarygodne wyniki i zidentyfikować ligandy wybranego białka.Nie zapominaj, że praca z metanolem i roztworem MTBE może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem.

2-1-one-step-affinity-purification-for-parallel-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Poznaj metodę oczyszczania powinowactwa do równoległej analizy interakcji białko-białko i białko-metabolit w komórkach Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia identyfikację nowych ligandów białek w warunkach zbliżonych do in vivo.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Przeglądaj więcej filmów