Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

IDBac łączy dane masowe z białek i wyspecjalizowanych regionów metabolitów nieznanych izolatów bakteryjnych, aby szybko rozróżnić izolaty zarówno na podstawie ich tożsamości, jak i potencjalnej funkcji środowiskowej. Nasze oprogramowanie biurowe rozszerza użyteczność istniejących strategii identyfikacji drobnoustrojów opartych na MALDI TOF. To rozszerzenie obejmuje analizę wyspecjalizowanego metabolizmu jako dodatkowego sposobu różnicowania kolonii o podobnych fenotypach.

Dużym wyzwaniem w charakterystyce nieznanych mikroorganizmów jest rozróżnienie blisko spokrewnionych izolatów. IDBac zapewnia naukowcom łatwy i szybki sposób charakteryzowania izolatów poprzez profilowanie białek i małych cząsteczek. IDBac zapewnia wizualne porównanie wyspecjalizowanej produkcji metabolitów w próbce bakteryjnej i może zapewnić wgląd w szeroki zakres tematów badawczych, od badań ekologicznych po odkrywanie ołowiu leków.

Istnieje wiele sposobów zapisywania danych MALDI między instrumentami. Jeśli masz problemy z uruchomieniem plików z usługą IDBac, zgłoś problem do usługi GitHub firmy IDBac. Za pomocą sterylnej wykałaczki przenieś niewielką porcję kolonii bakteryjnej w odpowiednie miejsce na czystej płytce MALDI.

Rozprowadź kolonię bakteryjną równomiernie w miejscu, tak aby plamka wydawała się jak najbardziej płaska. Nałóż jeden mikrolitr kwasu mrówkowego o stężeniu 70% spektrometrii mas na próbkę i plamki kontrolne matrycy i pozostaw kwas do wyschnięcia na powietrzu w chemicznym dygestoriach. Następnie dodać jeden mikrolitr wcześniej przygotowanego roztworu matrycy MALDI do plam kontrolnych próbki i pożywki matrycowej i pozostawić do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.

Po skonfigurowaniu spektrometru masowego MALDI TOF, uzyskaj widma. Zapisz widma białek w jednym folderze, a wyspecjalizowane widma metabolitów w drugim oddzielnym folderze. Aby rozpocząć tę procedurę, pobierz oprogramowanie IDBac.

Kliknij dwukrotnie pobrany install_idbac, aby uruchomić instalator. Następnie kliknij dwukrotnie skrót IDBac na pulpicie, aby uruchomić IDBac, który domyślnie otworzy się na karcie wprowadzenia. Kliknij kartę Starting with Raw Data (Rozpoczynanie od danych pierwotnych) i wybierz z menu tworzenia eksperymentu IDBac typ danych, które mają być używane z IDBac.

Podczas konfigurowania konwersji i przetwarzania plików danych wprowadź opisową nazwę eksperymentu w miejscu, w którym zostanie wyświetlony monit, a następnie kliknij folder z surowymi danymi i wybierz odpowiedni folder. Następnie kliknij Przetwarzaj dane. Po przekonwertowaniu plików i przetworzeniu ich za pomocą IDBac przejdź do strony pracy z poprzednimi eksperymentami i wybierz eksperyment, z którym chcesz pracować.

Dodaj informacje o próbkach za pomocą menu, kliknij tutaj, aby zmodyfikować wybrany eksperyment. Wprowadź informacje do automatycznie wypełnionego arkusza kalkulacyjnego i naciśnij Zapisz. Gdy wszystko będzie gotowe do rozpoczęcia analizy, upewnij się, że eksperyment do pracy jest wybrany.

Następnie wybierz analizę danych dotyczących białek. Na stronie analizy danych białkowych wybierz ustawienia pików i oceń widma białek próbek za pomocą wyświetlonych wykresów lustrzanych. Dostosować odsetek powtórzeń, w których musi występować pik, aby mógł zostać włączony do analizy.

Korzystając z wykresów lustrzanych jako wskazówek wizualnych, dostosuj sygnał do odcięcia szumu, który zachowuje najwięcej prawdziwych szczytów i najmniejszy szum, zauważając, że więcej powtórzeń w wyższej procentowej wartości obecności piku pozwoli na wybór niższego odcięcia sygnału do szumu. Następnie określ dolną i górną masę do odcięcia ładunku, dyktując zakres wartości mas w każdym widmie, które mają być wykorzystane w dalszej analizie przez IDBac. Na stronie analizy danych białkowych wybierz zakładkę Dendrogram, aby umożliwić grupowanie próbek w dendrogram zgodnie z wybranymi przez użytkownika miarami odległości i algorytmami grupowania.

Kliknij opcję Wybierz próbki w menu i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby wybrać próbki, które mają zostać uwzględnione w analizie. Tylko próbki zawierające widma białek będą wyświetlane w polu dostępnych próbek. Użyj wartości domyślnych dla algorytmów odległości i klastrowania, a następnie wybierz intensywności jako dane wejściowe.

Aby wyświetlić wartości bootstrap w dendrogramie, wprowadź liczbę z przedziału od dwóch do 1 000 w polu boottrap. Aby rozpocząć dostosowywanie dendrogramu, otwórz menu Dostosuj dendrogram. Aby pokolorować linie dendrogramu, wybierz opcję kliknij, aby zmodyfikować linie i wybierz żądane opcje.

Aby wykreślić informacje z arkusza kalkulacyjnego obok dendrogramu, wybierz przycisk Uwzględnij informacje o próbkach. Spowoduje to otwarcie panelu, w którym kategoria zostanie wypełniona automatycznie na podstawie wprowadzonych wartości. Aby wstawić próbki z innego eksperymentu, wybierz przycisk menu Wstaw próbki z innego eksperymentu i postępuj zgodnie ze wskazówkami w nowo otwartym panelu.

Przejdź do strony analizy danych małych cząsteczek, aby umożliwić wizualizację danych według głównych składników, analizy i metabolicznych sieci asocjacyjnych, które wykorzystują sieci dwudzielne do wyświetlania korelacji masy małych cząsteczek w celu naładowania wartości próbkami. Kliknij i przeciągnij dendrogram, aby podświetlić wybrane próbki do analizy. Jeśli żadna próbka nie zostanie wyróżniona lub nie utworzono dendrogramu białkowego, pojawi się sieć asocjacyjna metabolitów składająca się odpowiednio z losowego podzbioru lub wszystkich próbek.

Aby odjąć ślepą próbę podłoża matrycowego w sieci asocjacji metabolitów, otwórz menu, wybierz próbkę do odjęcia i wybierz odpowiednią próbkę, która ma być używana jako próba ślepa. Otwórz menu pokaż/ukryj ustawienia MAN, aby wybrać żądane wartości procentu obecności piku i replikacji, sygnału do szumu oraz górnych i dolnych granic masy. Użyj wykresów lustrzanych małych cząsteczek, aby pokierować wyborem tych ustawień.

Aby uzyskać raportowanie wyników, skopiuj tekst w akapicie sugestii dotyczących raportowania analizy MAN, aby zapewnić zdefiniowane przez użytkownika ustawienia używane do generowania utworzonej sieci asocjacji metabolicznej. Sześć szczepów Micromonospora chokoriensis i dwa barwniki Bacillus subtilis przeanalizowano przy użyciu danych w oprogramowaniu IDBac. Postępując zgodnie ze wskazówkami w zakładce Rozpoczynanie od surowych danych, wybrano opcję kliknij tutaj, aby przekonwertować pliki Bruker i postępowano zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez IDBac dla każdego zestawu danych.

Do zautomatyzowanej konwersji i wstępnego przetwarzania etapów szczytowania stworzono połączony eksperyment IDBac poprzez przeniesienie próbek Bacillus i Micromonospora z dwóch eksperymentów do jednego eksperymentu. Uzyskana analiza obejmowała porównanie widm białek przy użyciu wykresów lustrzanych, które były przydatne do oceny jakości widm i dostosowania ustawień szczytowych pików. Zrzut ekranu przedstawiający wyniki grupowania białek z wybranymi ustawieniami domyślnymi jest pokazany tutaj.

Dendrogram został pokolorowany poprzez dostosowanie progu na działce. Na uwagę zasługuje wyraźna separacja między rodzajami, przy czym zarówno izolaty M. chokoriensis, jak i B. subtilis grupują się oddzielnie. Klikając i przeciągając po dendrogramie białkowym, możliwe było szybkie stworzenie metabolicznych sieci asocjacyjnych w celu porównania tylko szczepów B.subtilis, tylko szczepów M.chokoriensis i wszystkich szczepów jednocześnie.

Podstawową funkcją tych sieci jest zapewnienie naukowcom szerokiego przeglądu stopnia nakładania się wyspecjalizowanych metabolitów między bakteriami. Podczas pracy z nowymi danymi należy korzystać z wykresów lustrzanych IDBac, aby upewnić się, że dane mają sens, a widma są wysokiej jakości. Krytycznie oceniaj swój projekt eksperymentalny i wyniki na każdym etapie.

IDBac umożliwia naukowcom tworzenie małych i zróżnicowanych bibliotek mikroorganizmów do dalszych badań. To znacznie obniża koszty związane z tradycyjnie dużymi i nadmiarowymi bibliotekami mikrobiologicznymi. Ponieważ IDBac umożliwia wizualizację wyspecjalizowanego nakładania się metabolitów w bardzo podobnych grupach filogenetycznych, może być używany do generowania pytań badawczych i hipotez, które łączą dwie zazwyczaj niepowiązane ze sobą dziedziny.

Kwas mrówkowy jest i należy się z nim obchodzić w dygestorium chemicznym. Niektóre izolaty środowiskowe mogą stanowić potencjalne zagrożenie dla zdrowia, a wszystkie szczepy powinny być traktowane jako drugi poziom bezpieczeństwa biologicznego.