Name: Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj otwartoźródłowy potok IDBac do analizy danych MALDI TOF-MS, który integruje profile białkowe i metabolitowe bakterii. To narzędzie wspiera identyfikację mikroorganizmów oraz badania ekologiczne i farmaceutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Grant Islandzkiego Funduszu Badawczego 152336-051; oraz fundusze start-upowe Uniwersytetu Illinois w Chicago. Dziękujemy również następującym współpracownikom: dr Amandzie Bulman za pomoc w parametrach akwizycji białka MALDI-TOF MS; Dr Terry Moore i dr Atul Jain za rekrystalizację matrycy kwasu alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA).

<ol><li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li>
<li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li>
<li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass-spectrometry+%28MALDI-TOF+MS%29+based+microbial+identifications%3A+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359(2016).</li>
<li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li>
<li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li>
<li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li>
<li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., Böttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods%3A+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li>
<li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li>
<li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li>
<li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoWizard%3A+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534(2008).</li>
<li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół IDBac szczegółowo opisuje gromadzenie i analizę danych dotyczących białek bakteryjnych i wyspecjalizowanych metabolitów nawet 384 izolatów bakteryjnych w ciągu 4 godzin przez jednego badacza. Dzięki IDBac nie ma potrzeby ekstrakcji DNA z izolatów bakteryjnych ani generowania specjalistycznych ekstraktów metabolitowych z płynnych bulionów fermentacyjnych i analizowania ich za pomocą metod chromatograficznych. Zamiast tego dane dotyczące białek i wyspecjalizowanych metabolitów są gromadzone poprzez proste rozprowadzenie materiału z kolonii bakteryjnych bezpośrednio na płytce docelowej MALDI. To znacznie skraca czas i koszty związane z alternatywnymi technikami, takimi jak sekwencjonowanie genu 16S rRNA i LCMS9.
Ważne jest, aby dodać ślepą próbę matrycy i punkty kalibracyjne do płytki MALDI i zalecamy użycie odpowiedniej liczby powtórzeń w celu zapewnienia odtwarzalności i pewności statystycznej. Liczba powtórzeń będzie zależała od eksperymentu. Na przykład, jeśli użytkownik zamierza odróżnić tysiące kolonii od zbioru płytek różnorodności środowiskowej, może być konieczna mniejsza liczba powtórzeń (nasze laboratorium zbiera trzy kontrpróby techniczne na kolonię). Alternatywnie, jeśli użytkownik chce utworzyć niestandardową bazę danych szczepów z określonych taksonów bakteryjnych w celu szybkiego określenia klasyfikacji podgatunków nieznanych izolatów, wówczas odpowiednie jest więcej powtórzeń (nasze laboratorium zbiera osiem powtórzeń biologicznych na szczep).
IDBac to narzędzie do szybkiego różnicowania wysoce powiązanych izolatów bakteryjnych w oparciu o przypuszczalne informacje taksonomiczne i wyspecjalizowaną produkcję metabolitów. Może uzupełniać lub służyć jako prekursor metod ortogonalnych, takich jak dogłębne analizy genetyczne, badania dotyczące produkcji i funkcji metabolitów lub charakterystyka wyspecjalizowanej struktury metabolitów za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego i/lub LC-MS/MS.
Wyspecjalizowana produkcja metabolitów (IDBac MANs) jest wysoce podatna na warunki rozwoju bakterii, zwłaszcza przy użyciu różnych pożywek, co stanowi potencjalne ograniczenie metody. Jednak cechy te mogą być wykorzystane przez użytkownika, ponieważ IDBac może łatwo generować MAN pokazujące różnice w wyspecjalizowanej produkcji metabolitów w różnych warunkach wzrostu. Ważne jest, aby zauważyć, że podczas gdy wyspecjalizowane odciski palców metabolitów mogą się różnić w zależności od warunków wzrostu, wcześniej wykazaliśmy, że odciski palców białek pozostają stosunkowo stabilne w odniesieniu do tych zmiennych (patrz Clark i wsp.6). W przypadku płytek różnorodności środowiskowej zalecamy oczyszczenie izolatów bakteryjnych przed analizą, aby zmniejszyć możliwy wpływ sąsiednich przesłuchów bakteryjnych.
Wreszcie, brak przeszukiwalnej publicznej bazy danych odcisków palców białek MS jest poważnym mankamentem w stosowaniu tej metody do klasyfikowania nieznanych bakterii środowiskowych. Mając to na uwadze, stworzyliśmy IDBac i uwzględniliśmy automatyczną konwersję danych do akceptowanego przez społeczność formatu open source (mzML)10,11,12 oraz zaprojektowaliśmy oprogramowanie umożliwiające wyszukiwanie, udostępnianie i tworzenie niestandardowych baz danych. Jesteśmy w trakcie tworzenia dużej publicznej bazy danych (>10 000 w pełni scharakteryzowanych szczepów), która pozwoli na klasyfikację niektórych izolatów do poziomu gatunku, w tym linki do numerów akcesyjnych GenBank, jeśli będą dostępne.
IDBac jest oprogramowaniem typu open source, a kod jest dostępny dla każdego, kto może dostosować swoje potrzeby w zakresie analizy i wizualizacji danych. Zalecamy, aby użytkownicy zapoznali się z obszerną literaturą (Sauer i wsp.7, Silva i wsp.5), aby pomóc w opracowaniu i opracowaniu celów eksperymentalnych. Udostępniamy forum dyskusyjne pod adresem: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac oraz sposób zgłaszania problemów z oprogramowaniem pod adresem: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Główną przeszkodą dla badaczy zajmujących się badaniem funkcji bakterii jest możliwość szybkiej i jednoczesnej oceny tożsamości taksonomicznej mikroorganizmu i jego zdolności do produkcji wyspecjalizowanych metabolitów. Uniemożliwiło to znaczne postępy w zrozumieniu związku między filogenezą bakteryjną a wyspecjalizowaną produkcją metabolitów u większości bakterii wyizolowanych ze środowiska. Chociaż metody oparte na stwardnieniu rozsianym, które wykorzystują odciski palców białek do grupowania i identyfikacji bakterii, są dobrze opisane1,2,3,4, badania te były na ogół przeprowadzane na małych grupach izolatów, w sposób specyficzny dla gatunku. Co ważne, informacje na temat wyspecjalizowanej produkcji metabolitów, głównego czynnika wpływającego na funkcjonowanie mikroorganizmów w środowisku, pozostały nieuwzględnione w tych badaniach. Silva et al.5 niedawno dostarczyli obszerną historię szczegółowo opisującą niedostateczne wykorzystanie MALDI-TOF MS do analizy wyspecjalizowanych metabolitów i niedobór oprogramowania, które mogłoby złagodzić obecne wąskie gardła w bioinformatyce. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, stworzyliśmy IDBac, potok bioinformatyczny, który integruje zarówno tryby liniowe, jak i reflektronowe MALDI-TOF MS6. Pozwala to użytkownikom na szybką wizualizację i różnicowanie izolatów bakteryjnych na podstawie odcisków palców zarówno białek, jak i wyspecjalizowanych metabolitów MS.
IDBac jest opłacalny, wysokoprzepustowy i przeznaczony dla laików. Jest ogólnodostępny (chasemc.github.io/IDBac) i wymaga jedynie dostępu do spektrometru mas MALDI-TOF (tryb reflektronowy będzie wymagany do specjalistycznej analizy metabolitów). Przygotowanie próbki opiera się na prostej metodzie "rozszerzonego transferu bezpośredniego"7,8, a dane są zbierane za pomocą kolejnych akwizycji liniowych i reflektronowych w jednym miejscu docelowym MALDI. Dzięki IDBac możliwa jest analiza przypuszczalnej filogenezy i wyspecjalizowanej produkcji metabolitów setek kolonii w czasie krótszym niż cztery godziny, w tym przygotowanie próbki, akwizycja danych i wizualizacja danych. Daje to znaczną przewagę czasową i kosztową w porównaniu z tradycyjnymi metodami identyfikacji bakterii (takimi jak sekwencjonowanie genów) i analizą wyników metabolicznych (chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas [LCMS] i podobne metody chromatograficzne).
Korzystając z danych uzyskanych w analizie liniowej, IDBac wykorzystuje hierarchiczne grupowanie do przedstawienia pokrewieństwa widm białek. Ponieważ widma reprezentują głównie zjonizowane białka rybosomalne, zapewniają one reprezentację różnorodności filogenetycznej obecnej w próbce. Ponadto IDBac wykorzystuje dane w trybie reflektronu do wyświetlania wyspecjalizowanych odcisków palców metabolitów jako sieci asocjacyjnych metabolitów (MAN). MAN to dwuczęściowe sieci, które pozwalają na łatwą wizualizację wspólnej i unikalnej produkcji metabolitów między izolatami bakteryjnymi. Platforma IDBac umożliwia naukowcom analizowanie zarówno danych dotyczących białek, jak i wyspecjalizowanych metabolitów w tandemie, ale także indywidualnie, jeśli pozyskiwany jest tylko jeden typ danych. Co ważne, IDBac przetwarza surowe dane z instrumentów Bruker i Xiamen, a także txt, tab, csv, mzXML i mzML. Eliminuje to konieczność ręcznej konwersji i formatowania zestawów danych oraz znacznie zmniejsza ryzyko błędu użytkownika lub niewłaściwej obsługi danych MS.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher</td><td>60-002-65</td><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td></tr><tr><td>Auto Speed LEF Przyrząd MALDI-TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Daltonics Standard testu bakteryjnego</td><td>Fisher</td><td>NC0884024</td><td>Bruker Daltonics 8604530</td></tr><tr><td>Wzorzec kalibracji peptydów Bruker</td><td>Fisher</td><td>NC9846988</td><td>Bruker Daltonics 8206195</td></tr><tr><td>Formid Acid</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td>99,5 +%, Optima LC/MS Grade</td></tr><tr><td>MALDI-TOF Tarcza docelowa</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A456-500</td><td>Optima LC/MS Grade</td></tr><tr><td>Wykałaczki</td><td></td><td></td><td>dowolne jest ok</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Fisher</td><td>AC293810010</td><td>99,5%, do biochemii, ACROS Organics</td></tr><tr><td>Water</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>LC-MS</td></tr><tr><td>&alpha;-Kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy</td><td>Sigma</td><td>28166-41-8</td><td>(C2020-25G) &ge; 98% (TLC), proszek</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie potoku idbac maldi tof-ms o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Aby zobrazować związek między filogenezą bakteryjną a wyspecjalizowaną produkcją metabolitów kolonii bakteryjnych rosnących na agarze odżywczym, opracowaliśmy IDBac - tanią i wysokoprzepustową metodę laserowej desorpcji/jonizacji spektrometrii mas czasu przelotu wspomaganej matrycą (MALDI-TOF MS). Oprogramowanie IDBac jest przeznaczone dla osób niebędących ekspertami, jest ogólnodostępne i jest w stanie analizować od kilku do tysięcy kolonii bakteryjnych. W tym miejscu przedstawiamy procedury przygotowania kolonii bakteryjnych do analizy MS MALDI-TOF, obsługi instrumentu MS oraz przetwarzania i wizualizacji danych w IDBac. W szczególności instruujemy użytkowników, jak grupować bakterie w dendrogramach na podstawie odcisków palców białek MS i interaktywnie tworzyć sieci asocjacji metabolitów (MAN) na podstawie specjalistycznych danych metabolitowych.

Przeanalizowaliśmy sześć szczepów Micromonospora chokoriensis i dwa szczepy Bacillus subtilis, które zostały wcześniej scharakteryzowane6, wykorzystując dane dostępne pod adresem DOI: 10.5281/zenodo.2574096. Postępując zgodnie z instrukcjami w zakładce Starting with Raw Data, wybraliśmy opcję Click here to convert Bruker files i zastosowaliśmy instrukcje dostarczone przez IDBac dla każdego zestawu danych (Rysunek 14).
Po zakończeniu automatycznej konwersji oraz etapów preprocessingu i wyznaczania pików (peak-picking), przystąpiono do utworzenia nowego, połączonego eksperymentu IDBac poprzez przeniesienie próbek z dwóch eksperymentów do jednego, zawierającego próbki Bacillus oraz Micromonospora (Rysunek 15). Przeprowadzona analiza polegała na porównaniu widm białek za pomocą wykresów lustrzanych, przedstawionych na Rysunku 16, co było pomocne w ocenie jakości widm i dostosowaniu ustawień wyznaczania pików. Rysunek 17 przedstawia zrzut ekranu z wynikami klastrowania białek przy wybranych ustawieniach domyślnych. Dendrogram został pokolorowany poprzez dostosowanie progu na wykresie (widocznego jako linia przerywana). Należy odnotować wyraźne oddzielenie rodzajów, przy czym izolaty M. chokoriensis i B. subtilis tworzyły osobne klastry.
Rysunek 18, Rysunek 19 oraz Rysunek 20 obrazują możliwość generowania sieci MAN dla wybranych przez użytkownika obszarów poprzez kliknięcie i przeciągnięcie kursora po dendrogramie białek. Dzięki temu mogliśmy szybko tworzyć sieci MAN w celu porównania wyłącznie szczepów B. subtilis (Rysunek 18), wyłącznie szczepów M. chokoriensis (Rysunek 19) oraz wszystkich szczepów jednocześnie (Rysunek 20). Główną funkcją tych sieci jest dostarczenie badaczom szerokiego przeglądu stopnia pokrywania się wyspecjalizowanych metabolitów pomiędzy bakteriami. Dysponując tymi danymi, badacze mogą teraz podejmować świadome decyzje na podstawie zaledwie niewielkiej ilości materiału pobranego z kolonii bakteryjnej.
<img alt="Rycina 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg" /> 
Rycina 14: Przetwarzanie widm. Pobrane widma Bruker autoFlex zostały przekonwertowane i przetworzone przy użyciu IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg" /> 
Rysunek 15: Połączony eksperyment IDBac. Ponieważ widma Micromonospora i Bacillus zostały zebrane na różnych płytkach docelowych MALDI, dwa eksperymenty zostały następnie połączone w jeden eksperyment – „Bacillus_Micromonsopora”. Zostało to wykonane w zakładce „Work with Previous Experiments”, zgodnie z instrukcjami w menu „Transfer samples from previous experiments to new/other experiments”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg" /> 
Rysunek 16: Porównanie. Widma Micromonspora i Bacillus porównano za pomocą wykresów lustrzanych na stronie „Protein Data Analysis”. Ostatecznie wybrano domyślne ustawienia piku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg" /> 
Rysunek 17: Grupowanie hierarchiczne. Grupowanie hierarchiczne, przy użyciu ustawień domyślnych, poprawnie pogrupowało izolaty Bacillus i Micromonospora. Dendrogram został pokolorowany poprzez „cięcie” dendrogramu na dowolnej wysokości (wyświetlonej jako linia przerywana), a 100 powtórzeń bootstrap zastosowano w celu wykazania pewności rozgałęzień. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg" /> 
Rycina 18: MAN stworzony poprzez wybór szczepów Bacillus sp. z dendrogramu białkowego wykazał zróżnicowaną produkcję wyspecjalizowanych metabolitów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg" /> 
Rycina 19: Analiza MAN przeprowadzona z wybranymi sześcioma szczepami Micromonospora sp. na podstawie dendrogramu białek wykazała zróżnicowaną produkcję metabolitów wyspecjalizowanych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg" /> 
Rycina 20: Analiza sieciowa (MAN) szczepów Bacillus sp. i Micromonospora sp. wykazująca zróżnicowaną produkcję metabolitów wyspecjalizowanych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

IDBac to open-source'owy potok bioinformatyczny oparty na spektrometrii mas, który integruje dane zarówno z nienaruszonych białek, jak i wyspecjalizowanych widm metabolitów, zebrane na materiale komórkowym zeskrobanym z kolonii bakteryjnych. Procedura ta pozwala naukowcom szybko zorganizować setki lub tysiące kolonii bakteryjnych w przypuszczalne grupy taksonomiczne i dalej je różnicować w oparciu o wyspecjalizowaną produkcję metabolitów.

Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac łączy dane masowe z białek i wyspecjalizowanych regionów metabolitów nieznanych izolatów bakteryjnych, aby szybko rozróżnić izolaty zarówno na podstawie ich tożsamości, jak i potencjalnej funkcji środowiskowej. Nasze oprogramowanie biurowe rozszerza użyteczność istniejących strategii identyfikacji drobnoustrojów opartych na MALDI TOF. To rozszerzenie obejmuje analizę wyspecjalizowanego metabolizmu jako dodatkowego sposobu różnicowania kolonii o podobnych fenotypach.Dużym wyzwaniem w charakterystyce nieznanych mikroorganizmów jest rozróżnienie blisko spokrewnionych izolatów. IDBac zapewnia naukowcom łatwy i szybki sposób charakteryzowania izolatów poprzez profilowanie białek i małych cząsteczek. IDBac zapewnia wizualne porównanie wyspecjalizowanej produkcji metabolitów w próbce bakteryjnej i może zapewnić wgląd w szeroki zakres tematów badawczych, od badań ekologicznych po odkrywanie ołowiu leków.Istnieje wiele sposobów zapisywania danych MALDI między instrumentami. Jeśli masz problemy z uruchomieniem plików z usługą IDBac, zgłoś problem do usługi GitHub firmy IDBac. Za pomocą sterylnej wykałaczki przenieś niewielką porcję kolonii bakteryjnej w odpowiednie miejsce na czystej płytce MALDI.Rozprowadź kolonię bakteryjną równomiernie w miejscu, tak aby plamka wydawała się jak najbardziej płaska. Nałóż jeden mikrolitr kwasu mrówkowego o stężeniu 70% spektrometrii mas na próbkę i plamki kontrolne matrycy i pozostaw kwas do wyschnięcia na powietrzu w chemicznym dygestoriach. Następnie dodać jeden mikrolitr wcześniej przygotowanego roztworu matrycy MALDI do plam kontrolnych próbki i pożywki matrycowej i pozostawić do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.Po skonfigurowaniu spektrometru masowego MALDI TOF, uzyskaj widma. Zapisz widma białek w jednym folderze, a wyspecjalizowane widma metabolitów w drugim oddzielnym folderze. Aby rozpocząć tę procedurę, pobierz oprogramowanie IDBac.Kliknij dwukrotnie pobrany install_idbac, aby uruchomić instalator. Następnie kliknij dwukrotnie skrót IDBac na pulpicie, aby uruchomić IDBac, który domyślnie otworzy się na karcie wprowadzenia. Kliknij kartę Starting with Raw Data (Rozpoczynanie od danych pierwotnych) i wybierz z menu tworzenia eksperymentu IDBac typ danych, które mają być używane z IDBac.Podczas konfigurowania konwersji i przetwarzania plików danych wprowadź opisową nazwę eksperymentu w miejscu, w którym zostanie wyświetlony monit, a następnie kliknij folder z surowymi danymi i wybierz odpowiedni folder. Następnie kliknij Przetwarzaj dane. Po przekonwertowaniu plików i przetworzeniu ich za pomocą IDBac przejdź do strony pracy z poprzednimi eksperymentami i wybierz eksperyment, z którym chcesz pracować.Dodaj informacje o próbkach za pomocą menu, kliknij tutaj, aby zmodyfikować wybrany eksperyment. Wprowadź informacje do automatycznie wypełnionego arkusza kalkulacyjnego i naciśnij Zapisz. Gdy wszystko będzie gotowe do rozpoczęcia analizy, upewnij się, że eksperyment do pracy jest wybrany.Następnie wybierz analizę danych dotyczących białek. Na stronie analizy danych białkowych wybierz ustawienia pików i oceń widma białek próbek za pomocą wyświetlonych wykresów lustrzanych. Dostosować odsetek powtórzeń, w których musi występować pik, aby mógł zostać włączony do analizy.Korzystając z wykresów lustrzanych jako wskazówek wizualnych, dostosuj sygnał do odcięcia szumu, który zachowuje najwięcej prawdziwych szczytów i najmniejszy szum, zauważając, że więcej powtórzeń w wyższej procentowej wartości obecności piku pozwoli na wybór niższego odcięcia sygnału do szumu. Następnie określ dolną i górną masę do odcięcia ładunku, dyktując zakres wartości mas w każdym widmie, które mają być wykorzystane w dalszej analizie przez IDBac. Na stronie analizy danych białkowych wybierz zakładkę Dendrogram, aby umożliwić grupowanie próbek w dendrogram zgodnie z wybranymi przez użytkownika miarami odległości i algorytmami grupowania.Kliknij opcję Wybierz próbki w menu i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby wybrać próbki, które mają zostać uwzględnione w analizie. Tylko próbki zawierające widma białek będą wyświetlane w polu dostępnych próbek. Użyj wartości domyślnych dla algorytmów odległości i klastrowania, a następnie wybierz intensywności jako dane wejściowe.Aby wyświetlić wartości bootstrap w dendrogramie, wprowadź liczbę z przedziału od dwóch do 1 000 w polu boottrap. Aby rozpocząć dostosowywanie dendrogramu, otwórz menu Dostosuj dendrogram. Aby pokolorować linie dendrogramu, wybierz opcję kliknij, aby zmodyfikować linie i wybierz żądane opcje.Aby wykreślić informacje z arkusza kalkulacyjnego obok dendrogramu, wybierz przycisk Uwzględnij informacje o próbkach. Spowoduje to otwarcie panelu, w którym kategoria zostanie wypełniona automatycznie na podstawie wprowadzonych wartości. Aby wstawić próbki z innego eksperymentu, wybierz przycisk menu Wstaw próbki z innego eksperymentu i postępuj zgodnie ze wskazówkami w nowo otwartym panelu.Przejdź do strony analizy danych małych cząsteczek, aby umożliwić wizualizację danych według głównych składników, analizy i metabolicznych sieci asocjacyjnych, które wykorzystują sieci dwudzielne do wyświetlania korelacji masy małych cząsteczek w celu naładowania wartości próbkami. Kliknij i przeciągnij dendrogram, aby podświetlić wybrane próbki do analizy. Jeśli żadna próbka nie zostanie wyróżniona lub nie utworzono dendrogramu białkowego, pojawi się sieć asocjacyjna metabolitów składająca się odpowiednio z losowego podzbioru lub wszystkich próbek.Aby odjąć ślepą próbę podłoża matrycowego w sieci asocjacji metabolitów, otwórz menu, wybierz próbkę do odjęcia i wybierz odpowiednią próbkę, która ma być używana jako próba ślepa. Otwórz menu pokaż/ukryj ustawienia MAN, aby wybrać żądane wartości procentu obecności piku i replikacji, sygnału do szumu oraz górnych i dolnych granic masy. Użyj wykresów lustrzanych małych cząsteczek, aby pokierować wyborem tych ustawień.Aby uzyskać raportowanie wyników, skopiuj tekst w akapicie sugestii dotyczących raportowania analizy MAN, aby zapewnić zdefiniowane przez użytkownika ustawienia używane do generowania utworzonej sieci asocjacji metabolicznej. Sześć szczepów Micromonospora chokoriensis i dwa barwniki Bacillus subtilis przeanalizowano przy użyciu danych w oprogramowaniu IDBac. Postępując zgodnie ze wskazówkami w zakładce Rozpoczynanie od surowych danych, wybrano opcję kliknij tutaj, aby przekonwertować pliki Bruker i postępowano zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez IDBac dla każdego zestawu danych.Do zautomatyzowanej konwersji i wstępnego przetwarzania etapów szczytowania stworzono połączony eksperyment IDBac poprzez przeniesienie próbek Bacillus i Micromonospora z dwóch eksperymentów do jednego eksperymentu. Uzyskana analiza obejmowała porównanie widm białek przy użyciu wykresów lustrzanych, które były przydatne do oceny jakości widm i dostosowania ustawień szczytowych pików. Zrzut ekranu przedstawiający wyniki grupowania białek z wybranymi ustawieniami domyślnymi jest pokazany tutaj.Dendrogram został pokolorowany poprzez dostosowanie progu na działce. Na uwagę zasługuje wyraźna separacja między rodzajami, przy czym zarówno izolaty M. chokoriensis, jak i B. subtilis grupują się oddzielnie. Klikając i przeciągając po dendrogramie białkowym, możliwe było szybkie stworzenie metabolicznych sieci asocjacyjnych w celu porównania tylko szczepów B.subtilis, tylko szczepów M.chokoriensis i wszystkich szczepów jednocześnie.Podstawową funkcją tych sieci jest zapewnienie naukowcom szerokiego przeglądu stopnia nakładania się wyspecjalizowanych metabolitów między bakteriami. Podczas pracy z nowymi danymi należy korzystać z wykresów lustrzanych IDBac, aby upewnić się, że dane mają sens, a widma są wysokiej jakości. Krytycznie oceniaj swój projekt eksperymentalny i wyniki na każdym etapie.IDBac umożliwia naukowcom tworzenie małych i zróżnicowanych bibliotek mikroorganizmów do dalszych badań. To znacznie obniża koszty związane z tradycyjnie dużymi i nadmiarowymi bibliotekami mikrobiologicznymi. Ponieważ IDBac umożliwia wizualizację wyspecjalizowanego nakładania się metabolitów w bardzo podobnych grupach filogenetycznych, może być używany do generowania pytań badawczych i hipotez, które łączą dwie zazwyczaj niepowiązane ze sobą dziedziny.Kwas mrówkowy jest i należy się z nim obchodzić w dygestorium chemicznym. Niektóre izolaty środowiskowe mogą stanowić potencjalne zagrożenie dla zdrowia, a wszystkie szczepy powinny być traktowane jako drugi poziom bezpieczeństwa biologicznego.

using-open-source-maldi-tof-ms-idbac-pipeline-for-analysis-microbial

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Zastosowanie spektrometrii mas (MS) z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) bezpośrednio do bulionu z hodowli krwi przyspiesza identyfikację bakterii. Przedstawiona metoda jest szybką i wiarygodną metodą identyfikacji bakterii Gram-ujemnych bezpośrednio z bulionu z posiewów krwi.

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

Ta praca szczegółowo opisuje procedury szybkiej identyfikacji bakterii za pomocą MALDI-TOF MS. Procedury identyfikacji obejmują akwizycję widma, budowę bazy danych i analizy następcze. Przedstawiono dwie metody identyfikacji: opartą na współczynniku podobieństwa i metodę opartą na biomarkerach.

Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Poznaj otwartoźródłowy potok IDBac do analizy danych MALDI TOF-MS, który integruje profile białkowe i metabolitowe bakterii. To narzędzie wspiera identyfikację mikroorganizmów oraz badania ekologiczne i farmaceutyczne.

Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

Przeglądaj więcej filmów