Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source
26 lutego 2021
Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.
Szeregowa krystalografia synchrotronowa (SSX) jest stosunkowo nową i szybko rozwijającą się dziedziną MX.Bardzo dobrze nadaje się do eksperymentów z niską dawką i temperaturą pokojową, ale co być może najważniejsze, naprawdę dobrze nadaje się do śledzenia dynamiki. Pozwala to na tworzenie filmów poklatkowych z białkami w akcji. W I24 dostępnych jest wiele trybów SSX.
Protokół ten koncentruje się na SSX o stałym celu, co pozwala na szeroki zakres eksperymentów seryjnych przy użyciu ograniczonych ilości próbek. Chipy silikonowe mogą ulec uszkodzeniu podczas ich ładowania i czyszczenia, jeśli ich nie znasz. Ponadto protokół wyrównania chipów jest całkowicie nowy dla wielu krystalografów, a przetwarzanie danych różni się nieco od standardowych danych rotacji.
Aby przygotować uchwyt na wióry, pokrój dwa arkusze folii poliestrowej na kwadraty o wymiarach około 6 na 6 centymetrów i umieść arkusze na dwóch płytach podstawy. Za pomocą metalowych pierścieni uszczelniających przymocuj arkusze na miejscu, a następnie ostrożnie pociągnij za nadmiar folii, aby usunąć wszelkie zagniecenia. Następnie wybierz chip krzemowy z aperturami o odpowiedniej wielkości w stosunku do wielkości kryształów, które mają być analizowane.
Żar rozładowuje chip przez 25 sekund pod ciśnieniem 0,39 milibara, prądem o natężeniu 15 miliamperów. Użyj pęsety, aby umieścić chip silikonowy na etapie ładowania chipów, z podniesionymi prętami skierowanymi w dół. Następnie za pomocą pipety nanieś 200 mikrolitrów zawiesiny mikrokrystalicznej na płaską stronę chipa, rozprowadzając zawiesinę tak, aby pokryła wszystkie miejskie bloki chipa.
Jeśli wiór jest uszkodzony, zakryj wszelkie otwory małym kawałkiem folii poliestrowej, aby zapewnić równomierne podciśnienie. Następnie zastosuj delikatne podciśnienie, aby zassać cały nadmiar płynu przez chip. Usuń wiór z etapu ładowania wiórów i ostrożnie osusz spód chipa bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu.
Umieść załadowany wiór na większej połowie uchwytu wiórów między znacznikami prowadzącymi, płaską stroną do dołu. Umieść małą połowę uchwytu na wióry na chipie, aby go uszczelnić. Dwie połówki uchwytu na wióry powinny zatrzasnąć się na swoim miejscu.
Następnie za pomocą sześciokątnych zamocuj wiór na miejscu. Aby wyrównać chip, trzymaj uchwyt chipa pod kątem 30 stopni, zbliżając się do uchwytu. Następnie użyj mocowań kinematycznych, aby umieścić załadowany chip na stoliku XYZ na linii belki.
Gdy magnesy się zetkną, pozwól uchwytowi wiórów obrócić się równolegle do przepływu i zatrzaśnij na swoim miejscu. Po umieszczeniu chipa użyj systemu wyświetlania na osi linii badawczej i graficznego interfejsu użytkownika wyrównywania chipów, aby zlokalizować lewy górny poziom odniesienia chipa. Aby wyśrodkować na referencyjnym 0 w X, Y i Z, przesuwaj się do środka i poza ostrość, aby wyrównać Z, w górę iw dół, aby wyrównać Y, oraz w lewo i w prawo, aby wyrównać X.Następnie kliknij Ustaw wartość odniesienia 0"Po wyrównaniu odniesienia 1 i 2 z wiązką promieniowania rentgenowskiego w ten sam sposób, kliknij Utwórz układ współrzędnych"aby wygenerować macierz współrzędnych.
Następnie kliknij Block Check", aby przenieść etap XYZ do pierwszej studni każdego bloku miejskiego. Jeśli celownik rentgenowski zrówna się z otworami, chip jest wyrównany. W tej graficznej reprezentacji wyników wyszukiwania punktów z DIALS można zaobserwować aktualizowany wykres współczynnika trafień.
Jeśli klikniesz trafienie, odpowiedni obraz dyfrakcyjny zostanie wyświetlony w przeglądarce obrazów DIALS. W tej tabeli można wizualizować aktualne wskaźniki indeksowania i integracji, które aktualizują się w czasie rzeczywistym w miarę zbierania danych podczas wizyty. Wizualizacja parametrów komórki elementarnej może ujawnić polimorfy.
Można również tworzyć dwuwymiarowe wykresy użytecznych parametrów, aby ujawnić różnice, które powstają w wyniku efektów obciążenia lub odwodnienia. Projekcje stereograficzne mogą ujawnić obecność lub brak preferowanych orientacji, które mogą być wprowadzone z powrotem do protokołu ładowania. Na przykład w tej projekcji można zaobserwować skutki przeciążenia chipa kryształami lizozymu.
Podczas ładowania chipa powoli pipetuj pipetę i użyj palca, aby oprzeć pipetę nad chipem. Zapobiega to dotykaniu chipa i przypadkowemu wbijaniu w krzemie. Podczas przetwarzania danych należy korzystać z dostępnych zautomatyzowanych potoków.
To da ci dobre wyobrażenie o postępach twojego eksperymentu i czy musisz coś zmienić. Metodę tę można zastosować do dowolnego układu białkowego, który może być krystalizowany w znacznych ilościach. A reakcja może być wywołana przez lekkie promieniowanie rentgenowskie lub szybkie mieszanie.
Badania dynamiczne nad szeregiem struktur mogą dostarczyć informacji na temat funkcjonowania białek.
Przegląd
Niniejszy artykuł stanowi kompleksowy przewodnik po przygotowaniu próbek do krystalografii z ustalonym tarciem, gromadzeniu danych oraz ich przetwarzaniu w ramach seryjnej krystalografii synchrotronowej na linii wiązki I24 w ośrodku Diamond. Szczególny nacisk położono na metodologię prowadzenia eksperymentów przy ograniczonej ilości próbki, przy jednoczesnym zapewnieniu integralności chipa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Krystalografia
- Dynamika białek
Wprowadzenie
- Seryjna krystalografia synchrotronowa (SSX) jest rozwijającą się dziedziną krystalografii makrocząsteczek.
- Nadaje się ona do eksperymentów z niską dawką promieniowania i w temperaturze pokojowej.
- SSX umożliwia dynamiczne badania białek, pozwalając na wizualizację ich działania.
- SSX z celem ustalonym (Fixed-target SSX) pozwala na efektywne wykorzystanie ograniczonych ilości próbek.
Cel badania
- Aby przedstawić szczegółowy protokół dla SSX z nieruchomym celem w linii wiązki I24 w Diamond.
- Aby zapewnić prawidłowe przygotowanie i wyrównanie chipa w celu optymalnego gromadzenia danych.
- Aby podkreślić różnice w przetwarzaniu danych w porównaniu do standardowych danych rotacyjnych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie chipów krzemowych z wykorzystaniem folii poliestrowej i technik uszczelniania.
- Nanoszenie zawiesiny mikrokryształów na chipy i aspiracja próżniowa.
- Wyrównywanie chipów za pomocą graficznego interfejsu użytkownika na linii wiązki.
- Wizualizacja i przetwarzanie danych w czasie rzeczywistym przy użyciu zautomatyzowanych potoków przetwarzania.
Główne wyniki
- Prawidłowe wyrównanie chipów pozwala na dokładne gromadzenie danych.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym szybkości indeksowania i całkowania podczas eksperymentów.
- Wizualizacja parametrów komórki elementarnej pozwala zidentyfikować polimorfy i efekty obciążenia.
- Badania dynamiczne dostarczają informacji o funkcjonalności białek.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa wydajność eksperymentów SSX z wykorzystaniem stałego celu.
- Prawidłowa obsługa i wyrównanie chipa są kluczowe dla pomyślnego zebrania danych.
- Badania dynamiczne z wykorzystaniem SSX mogą znacząco poszerzyć naszą wiedzę na temat zachowania białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Seryjna krystalografia synchrotronowa z nieruchomym celem umożliwia biologom strukturalnym prowadzenie badań dynamicznych białek przy użyciu ograniczonych ilości próbek, wspierając walidację celu poprzez wysokorozdzielcze analizy strukturalne. Metoda ta ogranicza zużycie próbki przy zachowaniu jakości danych, co jest kluczowe na wczesnym etapie odkrywania, gdy ekspresja i oczyszczanie białek stanowią wąskie gardło procesu. Umożliwiając eksperymenty w temperaturze pokojowej oraz badania z rozdzielczością czasową, pozwala ona na lepsze zrozumienie mechanizmów funkcji białek, co wspomaga optymalizację związków wiodących i wysiłki w celu minimalizacji ryzyka w rozwoju przedklinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez utrwalanie konformacji białek w działaniu, co wspiera funkcjonalną walidację celu.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zależność od dużych objętości kryształów, umożliwiając przesiewanie trudnych celów o ograniczonej wydajności ekspresji.
- Pewność prognostyczna: Dostarcza danych strukturalnych, które pozwalają na charakteryzację miejsca wiązania i mechanizmu działania, co usprawnia decyzje dotyczące wyboru celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe mapy gęstości elektronowej z mikrokryształów, umożliwiając precyzyjną ocenę wiązania ligandów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje montaż i wyrównywanie próbek za pomocą systemów opartych na chipach, co poprawia powtarzalność w kampaniach przesiewowych.
- Gotowość do analizy: Dostarcza w czasie rzeczywistym wskaźniki hit-rate i indeksowania, które wspierają decyzje go/no-go podczas przesiewania fragmentów lub związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ujawnia formy polimorficzne oraz zmiany konformacyjne, które mogą wpływać na wiązanie leku lub jego stabilność, co dostarcza informacji dla strategii formulacji.
- Wartość operacyjna: Pozwala na rejestrację danych strukturalnych rozdzielczych w czasie, które mogą korelować z badaniami funkcjonalnymi, wzmacniając spójność z biomarkerami translacyjnymi.
- Mitygacja ryzyka: Pozwala na wczesną identyfikację artefaktów wywołanych ładowaniem lub efektów odwodnienia, co zmniejsza ryzyko błędnej interpretacji w dalszych etapach optymalizacji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Krystalografia rentgenowska (SSX) z ustalonym celem jest integrowana z procesem badawczym po identyfikacji celu i opracowaniu testu, dostarczając informacji strukturalnych, które kierują identyfikacją związków wiodących oraz walidacją przedkliniczną. Wspiera ona iteracyjne cykle projektowania, syntezy, testowania i analizy (design-make-test-analyze) poprzez szybkie dostarczanie informacji strukturalnych na temat wiązania związków oraz dynamiki białek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez wizualizację indukowanych ligandem zmian konformacyjnych oraz dynamiki białek istotnych dla mechanizmu działania.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki standaryzowanemu przygotowaniu i wyrównaniu chipów, zapewniając spójną jakość danych w badaniach przesiewowych związków.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, w tym parametrów komórki elementarnej, współczynników trafień oraz metryk integracji, co pozwala na obiektywne porównanie warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy obserwacje strukturalne z wynikami funkcjonalnymi poprzez ujawnianie dynamiki, która może wpływać na biodostępność lub interakcję z celem molekularnym.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania strukturalnego dla wielu celów, redukując nakłady na ponowną walidację w środowiskach wieloprojektowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez dostarczenie strukturalnych danych o wysokiej rozdzielczości i rozdzielczości czasowej w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.
- Wartość operacyjna: zwiększa powtarzalność i skalowalność dzięki zestandaryzowanej obsłudze chipów, protokołom wyrównywania oraz zautomatyzowanym potokom przetwarzania danych.
- Wartość strategiczna: poprawia efektywność kapitałową poprzez minimalizację zużycia próbek i umożliwienie szybkiej iteracji w kampaniach optymalizacji strukturalnej.
- Wpływ na portfolio: wspiera decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w oddziaływaniach cel-ligand.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w krystalografii makrocząsteczkowej oraz znajomości technik manipulacji próbkami w synchrotronach.
- Zależność od dostępu do infrastruktury linii wiązki z montażem kinematycznym, możliwości obserwacji w osi wiązki oraz zautomatyzowanych potoków przetwarzania danych, takich jak DIALS.
- Konieczność standaryzacji procedur przygotowania chipów, aspiracji próżniowej i wyrównania między zespołami w celu zapewnienia spójności danych.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych rozmiarów kryształów i grup przestrzennych, co wiąże się z koniecznością dostosowania wyboru apertury oraz technik rozprzestrzeniania.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak kruchość chipów podczas ładowania i czyszczenia oraz wrażliwość na efekty odwodnienia, które mogą z czasem wpłynąć na jakość kryształów.
