Name: Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Poznaj metodę serialowej krystalografii synchrotronowej z użyciem stałych targetów w linii I24 Diamond Light Source. Protokół obejmuje przygotowanie krzemowych chipów, ich precyzyjne ustawienie oraz zbieranie danych z małych ilości próbek białkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansowany z programu Horyzont 2020 Komisji Europejskiej.

1. Przygotowanie i ładowanie chipa
UWAGA: Proces zachodzi w środowisku o kontrolowanej wilgotności (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), zazwyczaj między 80% a 90% lub wyższą wilgotnością względną, aby zapobiec wysychaniu kryształów białka. Po załadowaniu i zapieczętowaniu kryształy mogą przetrwać nawet 24 godziny. Może się to jednak znacznie różnić w zależności od systemu kryształowego. W komorze wymagana jest pompa próżniowa o małej mocy podłączona do stopnia ładowania, w której znajduje się chip krzemowy (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1), chip krzemowy, uchwyt na wióry z folią poliestrową (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2), pipeta p200, końcówki do pipet 200 μl, pęseta, bibuła filtracyjna i zawiesina kryształów białka.
<ol>
	<li>Przygotuj uchwyt na wióry.
	<ol>
		<li>Pokrój dwa arkusze folii poliestrowej na kwadraty o wymiarach około 6 cm x 6 cm.</li>
		<li>Połóż arkusze poliestru na dwóch płytach podstawy (dużej i małej).</li>
		<li>Zamocuj arkusze poliestrowe na miejscu za pomocą metalowych pierścieni uszczelniających.</li>
		<li>Ostrożnie pociągnij za nadmiar folii poliestrowej, aby usunąć wszelkie zagniecenia i ułatwić późniejszą wizualizację i wyśrodkowanie próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz chip krzemowy z aperturami o odpowiedniej wielkości (7-30 μm) w stosunku do wielkości kryształów.</li>
	<li>Żar rozładowuje chip przez 25 sekund pod ciśnieniem 0,39 mBar i przy użyciu prądu 15 mA, aby umożliwić łatwe rozprowadzanie mikrokryształów na chipie.</li>
	<li>Umieść chip silikonowy na etapie ładowania chipa za pomocą pęsety z podniesionymi prętami skierowanymi w dół.</li>
	<li>Nanieść 200 μl zawiesiny mikrokrystalicznej na płaską stronę chipa za pomocą pipety.</li>
	<li>Rozprowadź krystaliczną zawiesinę, aby pokryć wszystkie "bloki miejskie" chipa.</li>
	<li>Jeśli chip jest uszkodzony, zakryj wszystkie otwory małym kawałkiem folii poliestrowej lub końcówką pipety filtrującej, aby zapewnić równomierne podciśnienie.</li>
	<li>Zastosuj delikatne odkurzanie, aż cały nadmiar płynu zostanie zaessany przez chip.</li>
	<li>Usuń wiór ze sceny ładowania wiórów za pomocą pęsety.</li>
	<li>Ostrożnie osusz spód chipa bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu.</li>
	<li>Umieść załadowany wiór na większej połowie uchwytu na wióry między znacznikami prowadzącymi płaską stroną do dołu.</li>
	<li>Uszczelnij chip, umieszczając małą połowę uchwytu na wióry na górze.
	<ol>
		<li>Dwie połówki uchwytu na wióry zatrzasną się na swoim miejscu. Jeśli druga połowa nie jest równo osadzona, obróć uchwyt o 180°, aby prawidłowo ustawić magnesy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykręć uchwyt wióra sześciokątnymi, aby bezpiecznie zamocować wiór na miejscu. 
	UWAGA: Alternatywnie, "bezwiórowy" chip może być załadowany w podobny sposób, z mniejszą objętością krystalicznej zawiesiny (~15 μL) umieszczoną między dwiema warstwami folii poliestrowej w uchwycie na wióry <klasa sup = "xref">37, lub mniejszą objętość można załadować za pomocą dwustronnego dystansu samoprzylepnego o grubości 50 μm nałożonego bezpośrednio na folię poliestrową, jak opisano wcześniej <klasa sup = "xref">38. Zastosowanie przekładek samoprzylepnych pozwala również na załadowanie wielu próbek (lub wariantów próbek, takich jak nasączenia ligandami) na każdy chip bez wiórów. Komplementarne podejście do ładowania wykorzystujące akustyczny wyrzut kropli (ADE) do ładowania chipów krzemowych może być również stosowane w Diamond39. ADE umożliwia ładowanie wiórów przy użyciu mniejszych objętości zawiesiny krystalicznej niż ładowanie pipet. Jest to szczególnie przydatna technika, gdy próbki są rzadkie, chociaż należy wziąć pod uwagę skład chemiczny i lepkość gnojowicy.</li>
</ol>
2. GUI i ustawienia na linii badawczej
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie wyrównania i ustawienia chipów w celu zbierania danych za pomocą prostego graficznego interfejsu użytkownika (GUI) EPICS Display Manager (edm) (Rysunek 3a). Zapewnia to interfejs typu "wskaż i kliknij" do oprzyrządowania linii badawczej i zapewnia parametry wejściowe do zbierania danych w oparciu o język Python. Okna podrzędne zapewniają dodatkową kontrolę nad pobieraniem próbek z podregionów uchwytu próbki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3b) lub eksperymentów z laserową/diodową sondą LED (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3c).</li>
</ol>
3. Wyrównywanie układu scalonego
<ol>
	<li>Umieść załadowany chip na stoliku XYZ na linii badawczej (pokazanej na Rysunek 4a) za pomocą mocowań kinematycznych.
	<ol>
		<li>Uważaj, aby nie ciągnąć stopni zgodnie z ich kierunkiem jazdy. Magnesy w mocowaniach kinematycznych są dość mocne, więc można to dość łatwo zrobić przez przypadek.</li>
		<li>Zbliżając się do uchwytu, uchwyt na wióry powinien być trzymany pod niewielkim kątem (±30°). Gdy magnesy się zetkną, pozwól uchwytowi na wióry obrócić się równolegle do podłogi (0°), a uchwyt na wióry zatrzaśnie się na swoim miejscu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4b).</li>
		<li>Podczas rozładowywania wióra postępuj zgodnie z odwrotną ścieżką. Obróć i odchyl wiór od stolików przed odciągnięciem uchwytu na wióry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z systemu podglądu na osi linii badawczej i graficznego interfejsu użytkownika wyrównania chipa, zlokalizuj lewy górny punkt odniesienia chipa. Fiducials to trzy kwadraty, dwa małe i jeden duży, ustawione względem siebie pod kątem prostym (Rysunek 5a). Chip jest podświetlany z tyłu, więc chip będzie wyglądał na ciemny, a otwory będą wyglądały na białe kwadraty.</li>
	<li>Wyśrodkuj się na zerze odniesienia w X, Y i Z (<silna klasa="xfig">Rysunek 5b). Wyrównaj X i Y, przesuwając odpowiednio w lewo/w prawo i w górę/w dół. Wyrównaj Z, przesuwając chip do wewnątrz i na zewnątrz ostrości.</li>
	<li>Kliknij opcję Ustaw zero odniesienia.</li>
	<li>Powtórz krok 3.2 dla pierwszego odniesienia (u góry po prawej, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 5c) i drugiego odniesienia (u dołu po lewej, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 5d), aby wyrównać wszystkie powierniki z wiązką promieniowania rentgenowskiego.</li>
	<li>Wygeneruj macierz współrzędnych, naciskając przycisk make coordinate system, który oblicza przesunięcie, nachylenie, przechylenie i odchylenie chipa względem stopni, umożliwiając wykonanie wszystkich kolejnych ruchów w układzie współrzędnych chipa.</li>
	<li>Kliknij przycisk Block Check (Sprawdzanie bloków), aby przesunąć stolik XYZ do pierwszej studni w każdym bloku miejskim w celu wizualnego potwierdzenia, że układ scalony jest dobrze wyrównany.</li>
	<li>Jeśli celownik rentgenowski pokrywa się z otworami, chip jest wyrównany. Jeśli nie, powtórz kroki 3.2-3.3. 
	UWAGI: W przypadku trudności z wyrównaniem (uszkodzone wzorce), różne otwory na chipie mogą być użyte do wyrównania za pomocą menu rozwijanego "typ wyrównania". Dostępnych jest wiele różnych typów chipów do zbierania danych o stałych celach. Różne typy żetonów są obsługiwane za pomocą menu rozwijanego "typ żetonu". Najpopularniejszymi typami chipów używanymi w I24 są chipy "Oxford" i "custom". Liczba i odstępy między otworami i powiernikami na chipie są odczytywane ze słownika chipów zdefiniowanego za pomocą menu rozwijanego. Niestandardowy chip umożliwia definiowanie odstępów między otworami w locie, co jest szczególnie przydatne w przypadku cienkowarstwowych chipów typu arkusz na arkuszu lub innych "bezwiórowych" chipów, w których kryształy są losowo rozmieszczone w poprzek uchwytu37. Nowy graficzny interfejs użytkownika w Pythonie, oferujący funkcję "przesuń po kliknięciu" i automatyczne wyrównywanie chipów, jest obecnie w fazie rozwoju, ale nie jest jeszcze gotowy do rutynowego użycia w momencie pisania tego manuskryptu.</li>
</ol>
4. Konfiguracja zbierania danych
UWAGA: Konfiguracja zbierania danych będzie zależała od badanego systemu i eksperymentu, który ma być przeprowadzony. Może to być zarówno najprostszy eksperyment SSX, zbierający strukturę o niskiej dawce, jak i eksperyment z rozdzielczością czasową przy użyciu laserów lub szybkiego mieszania w celu zainicjowania reakcji, która będzie wymagała wielu kompletnych zestawów danych w różnych opóźnieniach czasowych. Aby skonfigurować zbieranie danych, należy zdefiniować następujące parametry.
<ol>
	<li>Zmienne eksperymentalne: Wypełnij odpowiednio folder, nazwę pliku, czas ekspozycji, transmisję, odległość detektora i liczbę zdjęć na przysłonę.</li>
	<li>Typ chipa: Jak opisano powyżej, dopasuj typ chipa do używanego chipa.
	<ol>
		<li>Jeśli używany jest chip cienkowarstwowy lub "bezwiórowy", ustaw typ chipa na Brak.</li>
		<li>Zdefiniuj liczbę kroków i rozmiar kroku zarówno w x, jak i y w graficznym interfejsie użytkownika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw typ mapy: pozwala to na wybranie podsekcji chipa do zbierania danych (Rysunek 3b). "Brak" oznacza, że dane są zbierane z każdej apertury chipa. "Lite" oznacza, że dane są zbierane z wybranych bloków miejskich na chipie (Rysunek 3b). Może to być przydatne, jeśli na przykład wiadomo, że obszar chipa jest słabo załadowany lub pusty. "Pełny" umożliwia wybór poszczególnych przysłon do zbierania danych. W takim przypadku należy dostarczyć poprawnie sformatowany plik tekstowy. Szczegóły oraz wzór można uzyskać od pracowników linii badawczej.</li>
	<li>Pompa-sonda: Wybierz typ eksperymentu z sondą pompy i żądane opóźnienie czasowe. Wyzwolenie pompy (zwykle diody LED lub lasera) jest często specyficzne dla konkretnego eksperymentu, więc nie zostanie tutaj szczegółowo opisane.
	<ol>
		<li>"Krótkie" opóźnienia odnoszą się do eksperymentów, w których na każdym otworze między pompą a sondą występuje przerwa (tj. pompa, sonda, "przejście do następnej próbki"). Opóźnienia są zwykle rzędu 1 sekundy lub kilkudziesięciu milisekund.</li>
		<li>Długie opóźnienia odnoszą się do strategii excite and visit again (EAVA), w której otwory są odwiedzane dwukrotnie, z określonym opóźnieniem czasowym między wizytami (tj. pompa, ruch, pompa, ruch, ruch, sonda, sonda, sonda itp.). Opóźnienie czasowe jest obliczane i czasy ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3c) i zwykle wynosi ~1 sekundę lub więcej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Typowe metody zbierania danych
UWAGA: Poniżej znajdują się kluczowe parametry, które definiują rodzaj przeprowadzanego eksperymentu. W tej sekcji założono, że inne ustawienia z protokołu 3 "Konfiguracja zbierania danych" zostały zdefiniowane.
<ol>
	<li>Scenariusz 1: Gromadzenie danych dotyczących niskich dawek. Zbieranie pojedynczego obrazu dyfrakcyjnego z każdego wybranego otworu na uchwycie próbki.
	<ol>
		<li>Ustaw liczbę zdjęć na przysłonę na 1.</li>
		<li>Ustaw sondę pompy na Brak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scenariusz 2: Seria dawek, zbierająca kolejno n obrazów z każdej wybranej apertury na uchwycie próbki. Chip jest nieruchomy na każdej aperturze, podczas gdy każdy zestaw n obrazów jest zbierany.
	<ol>
		<li>Ustaw liczbę zdjęć na przysłonę na "n". Należy pamiętać, że przetwarzanie jest uproszczone, jeśli n = 5, 10, 20 lub inna wielokrotność 10. Trudno jest ustalić trendy, jeśli n < 5. Warto wziąć pod uwagę całkowity czas potrzebny na pokrycie chipa i liczbę plików graficznych tworzonych po zwiększeniu n.</li>
		<li>Ustaw sondę pompy na Brak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scenariusz 3: Metody pompa-sonda
	<ol>
		<li>Wybierz metodę z menu rozwijanego Pump Probe (Sonda pompy), aby otworzyć Centrum Sterowania Wzbudzeniem Laserowym.</li>
		<li>W przypadku eksperymentu z sondą pompy wypełnij pole Laser Dwell przy każdej opcji przysłony.</li>
		<li>W przypadku EAVA wypełnij pole Zatrzymanie lasera przy każdej przysłonie i ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, a następnie kliknij przycisk Oblicz.</li>
		<li>Wybierz odpowiednią opcję Powtórz w menu rozwijanym sondy pompy z graficznym interfejsem użytkownika edm dla żądanego czasu opóźnienia.</li>
		<li>Jeśli eksperyment wymaga etapu wstępnego oświetlenia, wypełnij sekcję Laser 2 Dwell.</li>
		<li>Po zdefiniowaniu wszystkich zmiennych eksperymentalnych naciśnij Ustaw parametry i utwórz krótką listę. Spowoduje to załadowanie zmiennych eksperymentalnych do kontrolera geobrick. Po wykonaniu tej czynności naciśnięcie przycisku Start spowoduje wsunięcie czujnika, wyłączenie podświetlenia i rozpoczęcie zbierania danych. Na wszystkich etapach konfigurowania zbierania danych przydatne jest otwarte okno terminala, w którym drukowane są informacje zwrotne na temat stanu i wyniku każdego z kroków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przetwarzanie danych
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, przetwarzanie danych można podzielić na trzy grupy w zależności od pilności, z jaką wymagana jest informacja zwrotna. Szybka informacja zwrotna jest potrzebna, aby pokazać, czy kryształy są obecne i ulegają dyfrakcji, a jeśli tak, to w jakiej liczbie. Powinno to nadążyć za gromadzeniem danych. Wykonywanie indeksowania i integracji danych, które może być wolniejsze, ale nadal powinno być wykonywane w porównywalnych skalach czasowych z gromadzeniem danych. Scalanie i skalowanie intensywności odbicia do pliku mtz w celu rozwiązania struktury i generowania map gęstości elektronów stanowi ostatni krok i może być jeszcze wolniejsze. Tutaj omówione zostaną początkowe potoki w I24 tylko dla pierwszych dwóch etapów, ponieważ są one wymagane do informacji zwrotnej w czasie rzeczywistym, aby pokierować eksperymentem, chociaż należy pamiętać, że metryki takie jak wskaźniki trafień i statystyki skalowania nie zastępują kontroli gęstości elektronów, która może stanowić jedyne potwierdzenie, że ligand się związał lub zaszła reakcja. w Crystallo.
<ol>
	<li>Szybka informacja zwrotna
	<ol>
		<li>W celu załadowania modułów przetwarzania danych należy załadować i24-ssx do terminala na dowolnej stacji roboczej beamline.</li>
		<li>Aby uruchomić analizę typu hit-finding wpisz i24-ssx /path/to/visit/directory/ do terminala: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ 
		UWAGA: Spowoduje to otwarcie trzech okien terminala, a po zapisaniu danych na dysku, graficznej reprezentacji wyników wyszukiwania punktów z integracji dyfrakcyjnej dla zaawansowanych źródeł światła (DIALS) 40,41(Rysunek 6a).
		<ol>
			<li>Ustawienia domyślne oceniają co 10obraz i odświeżają się co kilka sekund, aby zminimalizować obciążenie obliczeniowe.</li>
			<li>Zmień wartość domyślną, dodając argument na końcu powyższego polecenia. Na przykład "i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2" i24-ssx uruchomi wyszukiwanie trafień na co drugim obrazie. Może to jednak nadmiernie obciążyć klaster (zasób współdzielony!) i spowolnić czas przetwarzania. Wykres jest oznaczony kolorem na podstawie prawdopodobieństwa pomyślnego indeksowania, czerwony pokazuje, że znaleziono co najmniej 15 plamek Bragga (duża szansa na indeksowanie), niebieski pokazuje niewielką lub żadną użyteczną dyfrakcję.</li>
			<li>Przeglądaj interesujące obrazy dyfrakcyjne w przeglądarce obrazów DIALS, klikając miejsca w interfejsie wyszukiwarki miejsc.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Informacje zwrotne dotyczące indeksowania i integracji 
	UWAGA: Indeksowanie i integracja danych dyfrakcyjnych odbywa się za pomocą DIALS za pomocą funkcji dials.still_process 40,41. W związku z tym szczegółowe informacje dotyczące twojego kryształu (oczekiwana grupa przestrzeni kryształów, komórka elementarna i geometria eksperymentu) powinny być umieszczone w pliku tekstowym .phil.
	<ol>
		<li>Załaduj moduły POKRĘTŁA, wpisując moduły ładowania diali w terminalu.</li>
		<li>Aby rozpocząć przetwarzanie zestawu danych, wpisz dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. Postęp wszystkich nadal przetwarzanych zbiorów danych można monitorować, uruchamiając skrypt stills_monitor, wpisując monitor_stills_process.py (po wykonaniu obciążenia modułu i24-ssx i zmianie katalogu na bieżącą wizytę) (Rysunek 6b).</li>
		<li>Rozkład komórek elementarnych indeksowanych danych dyfrakcyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 7a) można monitorować za pomocą polecenia ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true Jest to szczególnie przydatne do identyfikowania i rozpoznawania polimorfów komórek elementarnych, jak omówiono wcześniej 42.</li>
		<li>'Visualzie' czy i w jaki sposób ten rozkład zmienia się w ustalonym celu, tworząc wykres 2D (<silna klasa="xfig">Rysunek 7b) za pomocą polecenia python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.</li>
		<li>Utwórz projekcje stereograficzne wszystkich indeksowanych danych dyfrakcyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 7c) za pomocą polecenia DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt. 
		UWAGA: Jest to powszechna patologia podczas przetwarzania danych nieruchomych z kryształów, w których symetria sieci Bravaisa jest wyższa niż symetria grupy przestrzennej, które łączą dane wyglądają jak idealne bliźniaki. Algorytmy przetwarzania danych ewoluowały, aby rozwiązać tę patologię 43,44,45,46, ale użytkownicy powinni o tym pamiętać podczas przetwarzania swoich danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Szeregowe zbieranie danych synchrotronowych jest stosunkowo nową techniką na liniach badawczych MX, wypełniającą lukę między ultraszybkimi zbieraniami danych wykonywanymi obecnie na XFEL a tradycyjnymi synchrotronami MX. Niniejszy manuskrypt ma na celu przedstawienie przeglądu tego, jak skutecznie zbierać dane szeregowe o ustalonym celu na linii badawczej I24, Diamond Light Source dla niskich dawek, serii dawek i eksperymentów z rozdzielczością czasową. Podobnie jak w przypadku standardowej krystalografii, przygotowanie próbki jest głównym wąskim gardłem w roztworze strukturalnym. Nie inaczej jest w przypadku SSX, a przygotowanie jednorodnej zawiesiny kryształów w wystarczających ilościach nie skorzystało jeszcze z kilkudziesięciu lat badań i udoskonaleń, tak jak wzrost pojedynczych dużych kryształów białkowych. Przygotowanie tych gnojowic wykracza jednak poza zakres niniejszego artykułu i zostało podsumowane w innym miejscu36. Krytyczny krok w opisanym tutaj podejściu polega na starannym wykorzystaniu dostępnej próbki przy użyciu łatwych w użyciu interfejsów GUI (krok 3) i zautomatyzowanych potoków przetwarzania danych (krok 6) w celu poinformowania o ładowaniu chipów (krok 1) i o tym, jak powinien przebiegać eksperyment.
Szybki potok informacji zwrotnych to potężne narzędzie, które pozwala użytkownikom ocenić początkowe wskaźniki trafień podczas zbierania danych w celu poinformowania o kolejnych protokołach ładowania chipów w celu pomyślnego gromadzenia danych. W obliczu niskiego współczynnika trafień (<5%) użytkownicy ryzykują zbieranie niekompletnych danych i/lub marnowanie czasu na dodatkowe kolekcje. W takim przypadku próbkę można połączyć, zagęścić przez delikatne odwirowanie i/lub załadować większe objętości w kroku 1.5. Wyższy współczynnik trafień jest ogólnie korzystny, jednak istnieje punkt malejącego zwrotu, w którym przeciążenie prowadzi do wielu kryształów w tej samej studni. DIALS jest w stanie poradzić sobie z danymi dyfrakcji wielosieciowej50, ale większym problemem niż indeksowanie i integracja jest szkodliwy wpływ, jaki grupowanie kryształów może mieć na równomierną aktywację kryształów przez światło laserowe lub szybkie mieszanie w celu precyzyjnych eksperymentów z rozdzielczością czasową. W związku z tym należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć przeciążenia ustalonych celów dla eksperymentów z rozdzielczością czasową.
Etap przetwarzania indeksowania i całkowania tworzy wykres, na którym środkowy krzyż reprezentuje kierunek belki, każdy punkt reprezentuje kierunek odbicia poszczególnych sieci hkl 001, a zewnętrzny pierścień okręgu reprezentuje obrót o 90° od osi belki. Pokaże to, czy twoje kryształy mają preferowaną orientację, co może mieć wpływ na kompletność danych i wskazywać na potrzebę zebrania większej ilości danych lub zmiany protokołu ładowania. W lewym panelu rysunku 7c pokazano efekt przeciążenia układu scalonego kryształami HEWL. Gdy otwory wypełniają się większą liczbą kryształów, przylegają one do kątowych ścianek otworów, zamiast klinować się u podstawy w losowej orientacji. Dwie ortogonalne elipsy są wynikiem kryształów leżących na wewnętrznych ściankach chipa, które znajdują się pod kątem ~35° w kierunku wiązki. Zmniejsza to objętość ładowanych kryształów, zmniejsza współczynnik trafień i radykalnie zmniejsza frakcję kryształów leżących w tych preferowanych płaszczyznach.
Należy zauważyć, że w I24 dostępne są inne podejścia seryjne, takie jak wytłaczarki LCP i chipy mikroprzepływowe. Używają one podobnych graficznych interfejsów użytkownika i tych samych potoków przetwarzania, więc wiele z powyższych będzie miało zastosowanie, nawet jeśli zostanie użyta inna technika. Istnieje wiele podejść szeregowych zarówno dla SSX, jak i SFX, poza opisanym tutaj podejściem do stałego celu, każde z nich ma pewne zalety w zależności od eksperymentu, który ma być przeprowadzony, i linii badawczej użytej w eksperymencie. Ponieważ podejścia seryjne szybko się rozwijają, zaleca się sprawdzanie najnowszych aktualizacji na stronach internetowych linii badawczych (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) i rozmowę z personelem linii badawczej na jak najwcześniejszym etapie planowania czasu badania. Dostęp do I24 dla eksperymentów standardowych i seryjnych jest bezpłatny w miejscu użytkowania. W przypadku użytkowników z Wielkiej Brytanii i UE koszty podróży i zakwaterowania są częściowo pokrywane przez iNEXT Discovery.

Szeregowa krystalografia synchrotronowa (SSX) to nowa metoda zbierania danych, która została zainspirowana laserami na swobodnych elektronach rentgenowskich (XFEL)1,2,3. W XFEL pojedynczy wzór dyfrakcyjny jest rejestrowany z zwykle bardzo małego kryształu białka, zanim kryształ zostanie zniszczony przez niezwykle jasny impuls promieniowania rentgenowskiego. Oznacza to, zazwyczaj, że nowy kryształ musi zostać wprowadzony do wiązki promieniowania rentgenowskiego, aby uzyskać kolejny wzór dyfrakcyjny4. Ta potrzeba ciągłego uzupełniania kryształów doprowadziła do rozwoju wielu technik seryjnego dostarczania próbek5.
W synchrotronach powszechnie stosowane są klasyczne (nieszeregowe) metody krystalografii rotacyjnej, wykorzystujące pojedynczy duży kryształ, który jest obracany w wiązce promieniowania rentgenowskiego za pomocą goniometru w celu zebrania kompletnego zestawu danych dla rozwiązania strukturalnego6. W celu wydłużenia czasu życia kryształów, tak aby można było zebrać kompletny zestaw danych7,8, a także w celu ułatwienia wysyłki i automatycznego transferu próbek, kryształy są chłodzione kriogenicznie do ~100 K w celu zebrania danych. Przy intensywnych liniach mikrofokusowych często stosuje się strategie wielokryształowe, ponieważ uszkodzenia spowodowane promieniowaniem mogą uniemożliwić zebranie kompletnego zestawu danych z pojedynczego kryształu9,10,11. Pomimo ograniczeń narzuconych przez uszkodzenia spowodowane promieniowaniem, liczba użytych kryształów pozostaje stosunkowo skromna, a zastosowane podejście jest zasadniczo identyczne jak w eksperymencie z monokryształami.
SSX, z drugiej strony, wykorzystuje seryjne dostarczanie próbek do uzyskania pojedynczych, nieruchomych wzorów dyfrakcyjnych z tysięcy losowo rozmieszczonych kryształów w celu wygenerowania kompletnego zestawu danych. Zauważono, że techniki szeregowe wykorzystujące rotację kryształów są w trakcie opracowywania12,13, chociaż skupiamy się na zbliżaniu się do zera. Istnieje wiele różnych systemów dostarczania próbek o różnych zaletach i wadach14, począwszy od dostarczania strumienia kryształów w strumieniu skoncentrowanym na przepływie/lepkim15,16,17, mikroprzepływowy chip18,19, lub kryształy na stałym celu, takim jak wytrawiony układ krzemowy20,21. Zazwyczaj kryształy są utrzymywane w temperaturze pokojowej, co pozwala na zaobserwowanie większej różnorodności konformacyjnej i zapewnia bardziej fizjologicznie odpowiednie środowisko22. SSX umożliwia gromadzenie zestawów danych o bardzo niskich dawkach23, ponieważ całkowita dawka zestawu danych jest równoważna pojedynczej krótkiej ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie jednego kryształu. Kolejną ważną zaletą SSX jest badanie dynamiki białek za pomocą metod czasowo-rozdzielczych, z reakcjami wyzwalanymi przez ekspozycję na światło lasera24,25,26,27lub przez mieszanie kryształów i ligandu/substratu28,29. Użycie mniejszych kryształów oznacza, że światło laserowe może przenikać przez cały kryształ, równomiernie inicjując reakcję bez absorpcji wielofotonowej, aby zapewnić dobrze zdefiniowane produkty pośrednie reakcji dla danych dyfrakcyjnych pobranych w różnych punktach czasowych27. Stosowanie większych kryształów i metod gromadzenia danych opartych na rotacji wiąże się z ograniczoną głębokością penetracji lasera, niejednorodną lub wielofotonową aktywacją, uszkodzeniem promieniowania i czasem mechanicznego narzutu w trakcie przemiatania danych, co skutkuje mieszanką produktów pośrednich reakcji, które mogą okazać się trudne lub niemożliwe do zinterpretowania przy większych prędkościach reakcji. Mniejsze kryształy zapewniają podobną przewagę w eksperymentach mieszania, ponieważ ligandy mogą szybko i bardziej równomiernie dyfundować w krysztale, co ponownie pozwala na rejestrowanie zdefiniowanych produktów pośrednich reakcji z różnymi opóźnieniami czasowymi30,31,32.
Na linii badawczej I24 firmy Diamond można przeprowadzać zarówno konwencjonalne eksperymenty obrotowe, jak i SSX. W tym miejscu przedstawiono kompleksowy protokół przygotowania próbek SSX i zbierania danych przy użyciu stałych celów w I24 oraz protokoły do analizy danych szeregowych w Diamond. Podczas gdy manuskrypt i towarzyszące mu filmy powinny pozwolić użytkownikom na przeprowadzenie udanego eksperymentu SSX w I24, należy zauważyć, że jest to szybko rozwijająca się dziedzina, a podejścia stale ewoluują. Należy również zauważyć, że metody szeregowe są dostępne w innych źródłach synchrotronowych, w tym między innymi w Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI i PXII)34 i NSLS (FMX)35. Chociaż specyfika szeregowego gromadzenia i przetwarzania danych będzie się różnić w zależności od źródła, podstawowe zasady pozostaną takie same. Poniższe protokoły powinny być postrzegane jako punkt wyjścia i ścieżka do bazy, a nie szczyt tego, co można osiągnąć.
Ten protokół zakłada, że użytkownicy mają białkowy lub małocząsteczkowy system kryształowy, z którego wyprodukowano mikrokrystaliczną zawiesinę rzędu 0,5-2,0 ml o dobrej gęstości mikrokryształów na ml. Protokoły otrzymywania zawiesin kryształów zostały opisane wcześniej 36. Dostępnych jest wiele różnych typów stałych celów, z których najczęściej używane w I24 wykorzystują precyzyjnie zdefiniowany układ krzemowy. W celu odróżnienia od innych układów chipów, poniżej i w interfejsie linii badawczej jest on określany jako "chip Oxford". Jak opisano wcześniej, układ chipowy Oxford składa się z 8×8 "bloków miejskich", z których każdy zawiera 20×20 otworów, co daje łącznie 25 600 otworów20,21.

<table><tbody><tr><td>Uchwyty na chipy</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>Nie dotyczy</td><td>Własna, niestandardowa metalowa podstawa składająca się z 2 magnetycznych płyt podstawy, 2 metalowych pierścieni i mocowania kinematycznego.</td></tr><tr><td>Bezwiórowe przekładki dystansowe</td><td>SWISCII</td><td>N/A</td><td>LCP arkusze samoprzylepne dostępne w asortymencie modułowym LCP</td></tr><tr><td>Geobrick LV-IMS-II</td><td>Delta Tau</td><td>N/A</td><td>A&nbsp; wieloosiowy kontroler/wzmacniacz z niestandardową konfiguracją sprzętową Diamond Light</td></tr><tr><td>Source Kinematic Mounts</td><td>ThorLabs</td><td>KB25/M</td><td>Kwadratowe podstawy z 3 magnesami ułożonymi w trójkąt przymocowanymi do uchwytów na chipy.</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa KNF Laboport Merck</td><td></td><td>Z262285-1EA</td><td>Pompa próżniowa ze stałego PTFE, prędkość pompowania 10 l/min.</td></tr><tr><td>Arkusze Mylar 6 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15360562</td><td>300 ft rolka 6 &; Folia XRF z mylaru o grubości m firmy SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Mylar Sheets 3 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-675-4</td><td>300 ft rolka 3 & mikro; m gruba mylarowa folia XRF firmy SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>91000</td><td>Kompaktowy, samodzielny system wyładowań jarzeniowych używany do produkcji powierzchni hydrofilowych</td></tr><tr><td>Chipy krzemowe</td><td>University of Southampton</td><td>N/A</td><td>Niestandardowe wytrawione chipy silikonowe z otworami 25,6000 dostępne w różnych rozmiarach.</td></tr><tr><td>Etapy translacji</td> Przykładowe stoliki <td>Smaract</td><td>N/A</td><td>XYZ to wspólny projekt Diamond Light Source i SmarAct, zbudowany na zamówienie przez SmarAct, wykorzystujący trzy liniowe stopnie przesuwu 50 mm, precyzyjne skrzyżowane prowadnice rolkowe i zintegrowany czujnik o rozdzielczości do 1 nm</td></tr><tr><td>Nawilżacz 1byOne (701UK-0003 )</td><td>1byOne</td><td>B01DENO0EQ</td><td>Dostępny w handlu nawilżacz ultradźwiękowy o pojemności 1,3 litra</td></tr></tbody></table>

poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w diamond light source

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Szeregowe zbieranie danych to stosunkowo nowa technika dla użytkowników synchrotronów. Instrukcja obsługi do zbierania danych o stałych celach w I24, Diamond Light Source zawiera szczegółowe instrukcje krok po kroku, rysunki i filmy w celu płynnego zbierania danych.

Gromadzenie danych dla niskiej dawki oraz serii dawek 
Dane dla niskiej dawki (Krok 5.1: Scenariusz 1) oraz serii dawek (Krok 5.2: Scenariusz 2) zostały zebrane dla mikrokryształów miedziowej reduktazy azotynowej w linii I24 i zostały opublikowane wcześniej 42. Wszystkie próbki przygotowano zgodnie z opisem w kroku 1, dane zebrano zgodnie z krokami 3, 4 i 5, a następnie przetworzono metodami opisanymi w kroku 6. W niniejszej pracy zebrano szybką serię dawek, wykonując 20 obrazów dyfrakcyjnych dla każdej apertury (tj. n=20 w interfejsie graficznym zbierania danych pokazanym powyżej) przed przejściem do nowej próbki. Na podstawie tych danych zidentyfikowano bimodalny rozkład komórek elementarnych w grupie przestrzennej P213 (a = b = c = 97,25 Å oraz a = b = c = 96,38 Å). Identyfikacja i oddzielenie tych polimorfów komórek elementarnych do dalszej obróbki wykazała wyraźną poprawę wskaźników jakości danych i ujawniła dwie różne struktury w elastycznej pętli między resztami 189-193, zamiast stanu mieszanego zaobserwowanego podczas przetwarzania wszystkich danych razem. Identyfikacja takich polimorfów może mieć kluczowe znaczenie w precyzyjnych badaniach strukturalnych z rozdzielczością czasową, w których oczekiwane są jedynie niewielkie zmiany strukturalne. Ponadto zebrana seria dawek ujawniła zależną od dawki zmianę komórki elementarnej w krysztale, gdzie zwiększenie dawki przesuwa populację na korzyść większej komórki elementarnej.
Podobne prace zostały przeprowadzone przez Ebrahima et al (2019)47, gdzie pobrano serię dawek (Krok 5.2: Scenariusz 2) dla peroksydazy hemowej typu barwnikowego z Streptomyces lividans (DtpAa), aby porównać struktury przy niskich dawkach uzyskane metodą SSX (Krok 5.1: Scenariusz 1) z tymi zmierzonymi w tym samym systemie stałego celu przy użyciu SFX. Dane SFX zebrały na linii BL2 EH3 w SACLA, przy długości impulsu 10 femtosekund i częstotliwości repetycji 30 Hz. Czas trwania impulsu wynoszący 10 femtosekund gwarantuje brak efektów zależnych od dawki w danych SFX. Dane SFX porównano z danymi SSX zebranymi na linii I24, gdzie w każdej pozycji próbki wykonano 10 sekwencyjnych ekspozycji po 10 milisekund (tj. n=10). Zaobserwowano zależną od dawki migrację cząsteczki wody koordynującej żelazo hemowe w kierunku oddalenia od żelaza, a także zmianę konformacyjną jednej z grup propionianowych hemu w serii dawek SSX. Choć seria dawek nie była wolna od uszkodzeń, w przeciwieństwie do struktury SFX, pozwoliła ona na ekstrapolację długości wiązania Fe-O dla zestawu danych przy dawce zero (hem żelazowy), co w granicach błędu eksperymentalnego było zgodne z wartością uzyskaną metodą SFX.
Opisane tutaj metody zbierania danych w krystalografii seryjnej można również łatwo dostosować w celu stworzenia nowych środowisk dla próbek, aby na przykład badać struktury białek beztlenowych w temperaturze pokojowej. Jak opisano w pracy Rabe et al 2020 48, załadowanie próbki typu „sheet-on-sheet” (arkusz na arkuszu) lub „chipless chip” z różnymi foliami uszczelniającymi w komorze beztlenowej umożliwia zbieranie danych strukturalnych z próbek wrażliwych na tlen cząsteczkowy w temperaturze pokojowej.
Pomiar typu Pump-Probe 
Chociaż poniższe reprezentatywne wyniki nie zostały zebrane w linii wiązki I24 w Diamond, metody te zostały opracowane w bliskiej współpracy między ośrodkami w programie iNEXT, aby dążyć do ustandaryzowania metod w rozwoju krystalografii seryjnej. Linia wiązki I24 oferuje lub wkrótce zaoferuje metody pomiarowe równoważne do tych opisanych poniżej, aby umożliwić przeprowadzanie takich eksperymentów zgodnie z metodami opisanymi w powyższych protokołach.
Pompa-Sonda: Szybkie Mieszanie 
Szybkie mieszanie SSX zostało przeprowadzone na linii wiązki T-REXX w PETRA III przez Mehrabi i współpracowników (2019) 28 przy użyciu wstrzykiwacza kropli sterowanego piezoelektrycznie w celu zainicjowania reakcji na stałych celach. Niniejsza praca przedstawia eksperyment dowodzący koncepcji mieszania na chipie, w którym wiązanie GlcNac3 do mikrokryształów lizozymu następuje w ciągu 50 ms od naniesienia kropli o objętości 75 pL na próbkę. Badaniu temu towarzyszyła seria czasowo rozdzielonych struktur (7 struktur) aktywności xylozo-izomerazy, wykazująca wiązanie glukozy w ciągu 15 ms oraz formowanie konformacji z otwartym pierścieniem w cząsteczce glukozy po opóźnieniu czasowym wynoszącym 60 sekund. Odpowiedni układ do wstrzykiwania kropli jest obecnie w fazie opracowywania z myślą o zastosowaniu na linii I24.
Metoda Pump-Probe: aktywacja światłem 
Szeregowy eksperyment pump-probe z aktywacją światłem został przedstawiony w pracy Schulz i wsp. (2018) 49. Dehydrogenaza fluoroacetanu została nasycona fotoklatkowanym fluoroacetanem i poddana impulsom światła laserowego o długości fali 320-360 nm w celu uzyskania struktur w czterech punktach czasowych (t=0, 30, 752 i 2052 ms). Struktura w stanie spoczynku (0 ms) wykazuje pustą stronę aktywną, z wyjątkiem kilku cząsteczek wody, oraz równoważną gęstość między domenami czapy obu podjednostek białka. Po 30 ms i 752 ms od aktywacji światłem można zaobserwować znaczny spadek gęstości elektronowej w domenie czapy podjednostki B w stosunku do podjednostki A. Spadek gęstości elektronowej w domenie czapy podjednostki B zbiega się w czasie z pojawieniem się fluoroacetanu w centrum aktywnym podjednostki A przy t=752 ms. Ostatni zestaw danych przy 2052 ms wykazuje dalszy przegrupowanie strukturalne liganda, co prawdopodobnie ułatwia uzyskanie właściwej geometrii dla ataku SN2, oraz potencjalne utworzenie stanu przejściowego w reakcji. Na linii I24 do aktywacji światłem można wykorzystać przenośny system laserowy Pharos, który jest strojony w zakresie 210-2500 nm i generuje impulsy femtosekundowe. Wstępne eksperymenty wykazały pomyślną aktywację fotoklatki przy wzbudzeniu 308 nm, przy czym zaobserwowano wiązanie uwolnionego liganda z białkiem docelowym. W momencie pisania trwa integracja z systemem bezpieczeństwa personelu linii wiązki, a rutynowe eksperymenty użytkowników są przewidywane na początek 2021 roku. W przypadku eksperymentów wymagających mniej intensywnych impulsów światła, pomyślnie przeprowadzono aktywację światłem za pomocą diod LED sterowanych sygnałem TTL.
<img alt="Układ eksperymentalny do badania równowagi statycznej z komorą rękawicową do przygotowania próbek, systemem próżniowym oraz kontrolą wilgotności powietrza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Sprzęt do wprowadzania próbek zainstalowany w Diamond Light Source. Układ składa się z pompy próżniowej (a), komory rękawicowej (b) oraz nawilżacza (c). Wewnątrz komory rękawicowej wykorzystuje się podciśnienie, aby oddziałać na chip z zawiesiną kryształów umieszczony w bloku próbkowym (d) przymocowanym do kolby Büchnera (e, zielona strzałka), za pośrednictwem regulatora ciśnienia (f, żółta strzałka) podłączonego do kurka (g, niebieska strzałka). Wilgotne powietrze jest pompowane do namiotu przez plastikową rurkę podłączoną do nawilżacza (h), a jego wilgotność jest mierzona za pomocą higrometru (i). Elementy są utrzymywane na miejscu za pomocą statywów z uchwytami (j). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu analizy cienkich warstw XRF z folią Mylar; materiały oznaczone do testów chemicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Uchwyty próbek. Wykorzystują one metalową uszczelkę typu O-ring (a) do zaciskania folii poliestrowej pomiędzy górną (b) a dolną (c) częścią, przy czym dolna część posiada mocowania magnetyczne (d) służące do przytwierdzenia uchwytu do stołków z próbkami. Folia poliestrowa (6 µm (e) lub 3 µm (f)) oraz gumowe uszczelki O-ring (białe strzałki) zapobiegają szybkiemu wysychaniu chipa z naniesionym kryształem w uchwycie, który jest szczelnie zamknięty za pomocą śrub imbusowych (g). Chipy są czyszczone poprzez sekwencyjne 15-minutowe kąpiele w dH2O, 1 M HCl oraz dH2O (h). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania SSX dla celu stałego do zbierania danych i konfiguracji wzbudzenia laserowego; mapowanie, sterowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Interfejs graficzny (GUI) do zbierania danych dla celu stałego w I24. (a) Przedstawia główny interfejs służący do ustawiania chipów i definiowania parametrów zbierania danych, (b) interfejs mapping lite używany do definiowania podregionów chipu do zbierania danych oraz (c) interfejs do definiowania parametrów naświetlania laserowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Sekwencjonowanie DNA, metoda, eksperyment; konfiguracja sekwencjonowania, układ optyczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Proces montażu uchwytu chipa na stolikach, opisany w kroku 3, punkt 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza siatki mikroarray, przedstawiająca wizualizację danych w zakresie wzorców fluorescencji i siatek detekcji plamek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wyrównanie chipa. Wyrównanie chipa odbywa się poprzez kliknięcie trzech markerów fiducjalnych na chipie pokazanym na (a). Widoki markerów 0, 1 i 2 przez system podglądu na osi wiązki przedstawiono na (b), (c) i (d). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces analizy obrazów krystalograficznych; wzór dyfrakcyjny, wykres liczby refleksów, wyniki w tabeli zbioru danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wyświetlone wyniki automatycznego przetwarzania uruchomionego zgodnie z opisem w kroku 6.1. Wyświetlany jest aktualizowany wykres wskaźnika trafień (a, wstawka). Po kliknięciu „trafienia” (hit) w przeglądarze obrazów dials wyświetlany jest odpowiadający mu obraz dyfrakcyjny. Przedstawiono wskaźnik trafień dla bieżącego zbierania danych (w tym przykładzie 29,6%). Panel (b) pokazuje przykład okna z aktualnymi wskaźnikami indeksowania i całkowania dla danych zebranych do tej pory podczas wizyty, które aktualizują się w czasie rzeczywistym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozkład komórek elementarnych krystalografii; wykresy, mapa ciepła, projekcje stereograficzne; 793 kryształy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Bardziej szczegółowa analiza danych. Wizualizacja parametrów komórki elementarnej może ujawnić polimorfy (a). Obliczane są średnie parametry komórki elementarnej; nie obejmuje to jednak jeszcze indywidualnych średnich dla poszczególnych polimorfów. Wizualizacja niewielkiego podzbioru danych (przedstawione dane stanowią podzbiór 793 kryształów miedziowej reduktazy azotynowej z danych opisanych przez Ebrahim et al 2019) jest często wystarczająca do wykrycia trendów. Można również sporządzić dwuwymiarowe wykresy przydatnych parametrów, aby ujawnić wariacje wynikające z efektów ładowania lub odwodnienia, które mogłyby zostać uwzględnione w przyszłych kolekcjach danych (b). Projekcje stereograficzne mogą ujawnić obecność lub brak preferowanych orientacji, co pozwala na modyfikację protokołu ładowania (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.

Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Szeregowa krystalografia synchrotronowa (SSX) jest stosunkowo nową i szybko rozwijającą się dziedziną MX.Bardzo dobrze nadaje się do eksperymentów z niską dawką i temperaturą pokojową, ale co być może najważniejsze, naprawdę dobrze nadaje się do śledzenia dynamiki. Pozwala to na tworzenie filmów poklatkowych z białkami w akcji. W I24 dostępnych jest wiele trybów SSX.Protokół ten koncentruje się na SSX o stałym celu, co pozwala na szeroki zakres eksperymentów seryjnych przy użyciu ograniczonych ilości próbek. Chipy silikonowe mogą ulec uszkodzeniu podczas ich ładowania i czyszczenia, jeśli ich nie znasz. Ponadto protokół wyrównania chipów jest całkowicie nowy dla wielu krystalografów, a przetwarzanie danych różni się nieco od standardowych danych rotacji.Aby przygotować uchwyt na wióry, pokrój dwa arkusze folii poliestrowej na kwadraty o wymiarach około 6 na 6 centymetrów i umieść arkusze na dwóch płytach podstawy. Za pomocą metalowych pierścieni uszczelniających przymocuj arkusze na miejscu, a następnie ostrożnie pociągnij za nadmiar folii, aby usunąć wszelkie zagniecenia. Następnie wybierz chip krzemowy z aperturami o odpowiedniej wielkości w stosunku do wielkości kryształów, które mają być analizowane.Żar rozładowuje chip przez 25 sekund pod ciśnieniem 0,39 milibara, prądem o natężeniu 15 miliamperów. Użyj pęsety, aby umieścić chip silikonowy na etapie ładowania chipów, z podniesionymi prętami skierowanymi w dół. Następnie za pomocą pipety nanieś 200 mikrolitrów zawiesiny mikrokrystalicznej na płaską stronę chipa, rozprowadzając zawiesinę tak, aby pokryła wszystkie miejskie bloki chipa.Jeśli wiór jest uszkodzony, zakryj wszelkie otwory małym kawałkiem folii poliestrowej, aby zapewnić równomierne podciśnienie. Następnie zastosuj delikatne podciśnienie, aby zassać cały nadmiar płynu przez chip. Usuń wiór z etapu ładowania wiórów i ostrożnie osusz spód chipa bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu.Umieść załadowany wiór na większej połowie uchwytu wiórów między znacznikami prowadzącymi, płaską stroną do dołu. Umieść małą połowę uchwytu na wióry na chipie, aby go uszczelnić. Dwie połówki uchwytu na wióry powinny zatrzasnąć się na swoim miejscu.Następnie za pomocą sześciokątnych zamocuj wiór na miejscu. Aby wyrównać chip, trzymaj uchwyt chipa pod kątem 30 stopni, zbliżając się do uchwytu. Następnie użyj mocowań kinematycznych, aby umieścić załadowany chip na stoliku XYZ na linii belki.Gdy magnesy się zetkną, pozwól uchwytowi wiórów obrócić się równolegle do przepływu i zatrzaśnij na swoim miejscu. Po umieszczeniu chipa użyj systemu wyświetlania na osi linii badawczej i graficznego interfejsu użytkownika wyrównywania chipów, aby zlokalizować lewy górny poziom odniesienia chipa. Aby wyśrodkować na referencyjnym 0 w X, Y i Z, przesuwaj się do środka i poza ostrość, aby wyrównać Z, w górę iw dół, aby wyrównać Y, oraz w lewo i w prawo, aby wyrównać X.Następnie kliknij Ustaw wartość odniesienia 0"Po wyrównaniu odniesienia 1 i 2 z wiązką promieniowania rentgenowskiego w ten sam sposób, kliknij Utwórz układ współrzędnych"aby wygenerować macierz współrzędnych.Następnie kliknij Block Check", aby przenieść etap XYZ do pierwszej studni każdego bloku miejskiego. Jeśli celownik rentgenowski zrówna się z otworami, chip jest wyrównany. W tej graficznej reprezentacji wyników wyszukiwania punktów z DIALS można zaobserwować aktualizowany wykres współczynnika trafień.Jeśli klikniesz trafienie, odpowiedni obraz dyfrakcyjny zostanie wyświetlony w przeglądarce obrazów DIALS. W tej tabeli można wizualizować aktualne wskaźniki indeksowania i integracji, które aktualizują się w czasie rzeczywistym w miarę zbierania danych podczas wizyty. Wizualizacja parametrów komórki elementarnej może ujawnić polimorfy.Można również tworzyć dwuwymiarowe wykresy użytecznych parametrów, aby ujawnić różnice, które powstają w wyniku efektów obciążenia lub odwodnienia. Projekcje stereograficzne mogą ujawnić obecność lub brak preferowanych orientacji, które mogą być wprowadzone z powrotem do protokołu ładowania. Na przykład w tej projekcji można zaobserwować skutki przeciążenia chipa kryształami lizozymu.Podczas ładowania chipa powoli pipetuj pipetę i użyj palca, aby oprzeć pipetę nad chipem. Zapobiega to dotykaniu chipa i przypadkowemu wbijaniu w krzemie. Podczas przetwarzania danych należy korzystać z dostępnych zautomatyzowanych potoków.To da ci dobre wyobrażenie o postępach twojego eksperymentu i czy musisz coś zmienić. Metodę tę można zastosować do dowolnego układu białkowego, który może być krystalizowany w znacznych ilościach. A reakcja może być wywołana przez lekkie promieniowanie rentgenowskie lub szybkie mieszanie.Badania dynamiczne nad szeregiem struktur mogą dostarczyć informacji na temat funkcjonowania białek.

fixed-target-serial-data-collection-at-diamond-light-source

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Cyfrowe urządzenia mikrolusterkowe (DMD) mogą generować złożone wzory w czasie i przestrzeni, które służą do kontrolowania pobudliwości neuronalnej. Omówiono kwestie związane z projektowaniem, konstrukcją i eksploatacją systemów DMD. Taki system umożliwił wykazanie nieliniowej integracji w obrębie dystalnych punktów rozgałęzień dendrytycznych.

Wzorcowa fotostymulacja z wykorzystaniem cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej w obrębie punktów rozgałęzień

Larwy Drosophila są wrażliwe na światło i reagują na zmiany w otaczającym świetle. Ten film opisuje test, który testuje ich zdolność do unikania światła, zwany testem plamki świetlnej. Prezentowany protokół pokazuje, jak skonfigurować test z niebieską diodą LED i pokazuje, jak rejestrować zachowanie zwierzęcia w odpowiedzi na spotkanie ze światłem.

Test plamki świetlnej: metoda badania zachowania fototaktycznego Drosophila

W tym raporcie opisujemy szczegółowe procedury przeprowadzania eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej monokryształów z komórką kowadełka diamentowego na linii badawczej GSECARS 13-BM-C w Zaawansowanym Źródle Fotonów. Do analizy danych wykorzystywane są programy ATREX i RSV.

Dyfrakcja monokryształów pod wysokim ciśnieniem w PX^2

Ten protokół wprowadza test plamki świetlnej do zbadania fototaktycznego zachowania larw Drosophila. W tym teście plamka świetlna jest generowana jako stymulacja światłem, a proces unikania światła larwalnego jest rejestrowany przez system obrazowania oparty na świetle podczerwonym.

Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila

Przedstawiono protokół automatycznego naświetlania cienkich złotych folii impulsami laserowymi o wysokiej intensywności. Protokół zawiera szczegółowy opis procesu wytwarzania tarcz do mikroobróbki oraz szczegółowy przewodnik dotyczący sposobu ustawiania celów w ognisku lasera z częstotliwością 0,2 Hz.

Zautomatyzowane dostarczanie mikrofabrykowanych tarcz do intensywnych eksperymentów z napromieniowaniem laserowym

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Niniejszy artykuł opisuje metodę eksperymentalną osiągania długotrwałego, stabilnego uwięzienia i precyzyjnego pozycjonowania dużych metalicznych cząstek w powietrzu za pomocą dynamicznej, łódkowatej pułapki fotoforetycznej. System ten umożliwia kontrolowane manipulowanie, które nadaje się do badań interakcji plazmonowych.

Optyczne uwięzienie dużych metalicznych cząstek w powietrzu za pomocą pułapki 'łódka' z bezpośrednio rysowanymi ściankami bocznymi

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Poznaj metodę serialowej krystalografii synchrotronowej z użyciem stałych targetów w linii I24 Diamond Light Source. Protokół obejmuje przygotowanie krzemowych chipów, ich precyzyjne ustawienie oraz zbieranie danych z małych ilości próbek białkowych w czasie rzeczywistym.

Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Przeglądaj więcej filmów