Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.

Szeregowa krystalografia synchrotronowa (SSX) jest stosunkowo nową i szybko rozwijającą się dziedziną MX.Bardzo dobrze nadaje się do eksperymentów z niską dawką i temperaturą pokojową, ale co być może najważniejsze, naprawdę dobrze nadaje się do śledzenia dynamiki. Pozwala to na tworzenie filmów poklatkowych z białkami w akcji. W I24 dostępnych jest wiele trybów SSX.

Protokół ten koncentruje się na SSX o stałym celu, co pozwala na szeroki zakres eksperymentów seryjnych przy użyciu ograniczonych ilości próbek. Chipy silikonowe mogą ulec uszkodzeniu podczas ich ładowania i czyszczenia, jeśli ich nie znasz. Ponadto protokół wyrównania chipów jest całkowicie nowy dla wielu krystalografów, a przetwarzanie danych różni się nieco od standardowych danych rotacji.

Aby przygotować uchwyt na wióry, pokrój dwa arkusze folii poliestrowej na kwadraty o wymiarach około 6 na 6 centymetrów i umieść arkusze na dwóch płytach podstawy. Za pomocą metalowych pierścieni uszczelniających przymocuj arkusze na miejscu, a następnie ostrożnie pociągnij za nadmiar folii, aby usunąć wszelkie zagniecenia. Następnie wybierz chip krzemowy z aperturami o odpowiedniej wielkości w stosunku do wielkości kryształów, które mają być analizowane.

Żar rozładowuje chip przez 25 sekund pod ciśnieniem 0,39 milibara, prądem o natężeniu 15 miliamperów. Użyj pęsety, aby umieścić chip silikonowy na etapie ładowania chipów, z podniesionymi prętami skierowanymi w dół. Następnie za pomocą pipety nanieś 200 mikrolitrów zawiesiny mikrokrystalicznej na płaską stronę chipa, rozprowadzając zawiesinę tak, aby pokryła wszystkie miejskie bloki chipa.

Jeśli wiór jest uszkodzony, zakryj wszelkie otwory małym kawałkiem folii poliestrowej, aby zapewnić równomierne podciśnienie. Następnie zastosuj delikatne podciśnienie, aby zassać cały nadmiar płynu przez chip. Usuń wiór z etapu ładowania wiórów i ostrożnie osusz spód chipa bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu.

Umieść załadowany wiór na większej połowie uchwytu wiórów między znacznikami prowadzącymi, płaską stroną do dołu. Umieść małą połowę uchwytu na wióry na chipie, aby go uszczelnić. Dwie połówki uchwytu na wióry powinny zatrzasnąć się na swoim miejscu.

Następnie za pomocą sześciokątnych zamocuj wiór na miejscu. Aby wyrównać chip, trzymaj uchwyt chipa pod kątem 30 stopni, zbliżając się do uchwytu. Następnie użyj mocowań kinematycznych, aby umieścić załadowany chip na stoliku XYZ na linii belki.

Gdy magnesy się zetkną, pozwól uchwytowi wiórów obrócić się równolegle do przepływu i zatrzaśnij na swoim miejscu. Po umieszczeniu chipa użyj systemu wyświetlania na osi linii badawczej i graficznego interfejsu użytkownika wyrównywania chipów, aby zlokalizować lewy górny poziom odniesienia chipa. Aby wyśrodkować na referencyjnym 0 w X, Y i Z, przesuwaj się do środka i poza ostrość, aby wyrównać Z, w górę iw dół, aby wyrównać Y, oraz w lewo i w prawo, aby wyrównać X.Następnie kliknij Ustaw wartość odniesienia 0"Po wyrównaniu odniesienia 1 i 2 z wiązką promieniowania rentgenowskiego w ten sam sposób, kliknij Utwórz układ współrzędnych"aby wygenerować macierz współrzędnych.

Następnie kliknij Block Check", aby przenieść etap XYZ do pierwszej studni każdego bloku miejskiego. Jeśli celownik rentgenowski zrówna się z otworami, chip jest wyrównany. W tej graficznej reprezentacji wyników wyszukiwania punktów z DIALS można zaobserwować aktualizowany wykres współczynnika trafień.

Jeśli klikniesz trafienie, odpowiedni obraz dyfrakcyjny zostanie wyświetlony w przeglądarce obrazów DIALS. W tej tabeli można wizualizować aktualne wskaźniki indeksowania i integracji, które aktualizują się w czasie rzeczywistym w miarę zbierania danych podczas wizyty. Wizualizacja parametrów komórki elementarnej może ujawnić polimorfy.

Można również tworzyć dwuwymiarowe wykresy użytecznych parametrów, aby ujawnić różnice, które powstają w wyniku efektów obciążenia lub odwodnienia. Projekcje stereograficzne mogą ujawnić obecność lub brak preferowanych orientacji, które mogą być wprowadzone z powrotem do protokołu ładowania. Na przykład w tej projekcji można zaobserwować skutki przeciążenia chipa kryształami lizozymu.

Podczas ładowania chipa powoli pipetuj pipetę i użyj palca, aby oprzeć pipetę nad chipem. Zapobiega to dotykaniu chipa i przypadkowemu wbijaniu w krzemie. Podczas przetwarzania danych należy korzystać z dostępnych zautomatyzowanych potoków.

To da ci dobre wyobrażenie o postępach twojego eksperymentu i czy musisz coś zmienić. Metodę tę można zastosować do dowolnego układu białkowego, który może być krystalizowany w znacznych ilościach. A reakcja może być wywołana przez lekkie promieniowanie rentgenowskie lub szybkie mieszanie.

Badania dynamiczne nad szeregiem struktur mogą dostarczyć informacji na temat funkcjonowania białek.