Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source
February 26th, 2021
Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.
Szeregowa krystalografia synchrotronowa (SSX) jest stosunkowo nową i szybko rozwijającą się dziedziną MX.Bardzo dobrze nadaje się do eksperymentów z niską dawką i temperaturą pokojową, ale co być może najważniejsze, naprawdę dobrze nadaje się do śledzenia dynamiki. Pozwala to na tworzenie filmów poklatkowych z białkami w akcji. W I24 dostępnych jest wiele trybów SSX.
Protokół ten koncentruje się na SSX o stałym celu, co pozwala na szeroki zakres eksperymentów seryjnych przy użyciu ograniczonych ilości próbek. Chipy silikonowe mogą ulec uszkodzeniu podczas ich ładowania i czyszczenia, jeśli ich nie znasz. Ponadto protokół wyrównania chipów jest całkowicie nowy dla wielu krystalografów, a przetwarzanie danych różni się nieco od standardowych danych rotacji.
Aby przygotować uchwyt na wióry, pokrój dwa arkusze folii poliestrowej na kwadraty o wymiarach około 6 na 6 centymetrów i umieść arkusze na dwóch płytach podstawy. Za pomocą metalowych pierścieni uszczelniających przymocuj arkusze na miejscu, a następnie ostrożnie pociągnij za nadmiar folii, aby usunąć wszelkie zagniecenia. Następnie wybierz chip krzemowy z aperturami o odpowiedniej wielkości w stosunku do wielkości kryształów, które mają być analizowane.
Żar rozładowuje chip przez 25 sekund pod ciśnieniem 0,39 milibara, prądem o natężeniu 15 miliamperów. Użyj pęsety, aby umieścić chip silikonowy na etapie ładowania chipów, z podniesionymi prętami skierowanymi w dół. Następnie za pomocą pipety nanieś 200 mikrolitrów zawiesiny mikrokrystalicznej na płaską stronę chipa, rozprowadzając zawiesinę tak, aby pokryła wszystkie miejskie bloki chipa.
Jeśli wiór jest uszkodzony, zakryj wszelkie otwory małym kawałkiem folii poliestrowej, aby zapewnić równomierne podciśnienie. Następnie zastosuj delikatne podciśnienie, aby zassać cały nadmiar płynu przez chip. Usuń wiór z etapu ładowania wiórów i ostrożnie osusz spód chipa bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu.
Umieść załadowany wiór na większej połowie uchwytu wiórów między znacznikami prowadzącymi, płaską stroną do dołu. Umieść małą połowę uchwytu na wióry na chipie, aby go uszczelnić. Dwie połówki uchwytu na wióry powinny zatrzasnąć się na swoim miejscu.
Następnie za pomocą sześciokątnych zamocuj wiór na miejscu. Aby wyrównać chip, trzymaj uchwyt chipa pod kątem 30 stopni, zbliżając się do uchwytu. Następnie użyj mocowań kinematycznych, aby umieścić załadowany chip na stoliku XYZ na linii belki.
Gdy magnesy się zetkną, pozwól uchwytowi wiórów obrócić się równolegle do przepływu i zatrzaśnij na swoim miejscu. Po umieszczeniu chipa użyj systemu wyświetlania na osi linii badawczej i graficznego interfejsu użytkownika wyrównywania chipów, aby zlokalizować lewy górny poziom odniesienia chipa. Aby wyśrodkować na referencyjnym 0 w X, Y i Z, przesuwaj się do środka i poza ostrość, aby wyrównać Z, w górę iw dół, aby wyrównać Y, oraz w lewo i w prawo, aby wyrównać X.Następnie kliknij Ustaw wartość odniesienia 0"Po wyrównaniu odniesienia 1 i 2 z wiązką promieniowania rentgenowskiego w ten sam sposób, kliknij Utwórz układ współrzędnych"aby wygenerować macierz współrzędnych.
Następnie kliknij Block Check", aby przenieść etap XYZ do pierwszej studni każdego bloku miejskiego. Jeśli celownik rentgenowski zrówna się z otworami, chip jest wyrównany. W tej graficznej reprezentacji wyników wyszukiwania punktów z DIALS można zaobserwować aktualizowany wykres współczynnika trafień.
Jeśli klikniesz trafienie, odpowiedni obraz dyfrakcyjny zostanie wyświetlony w przeglądarce obrazów DIALS. W tej tabeli można wizualizować aktualne wskaźniki indeksowania i integracji, które aktualizują się w czasie rzeczywistym w miarę zbierania danych podczas wizyty. Wizualizacja parametrów komórki elementarnej może ujawnić polimorfy.
Można również tworzyć dwuwymiarowe wykresy użytecznych parametrów, aby ujawnić różnice, które powstają w wyniku efektów obciążenia lub odwodnienia. Projekcje stereograficzne mogą ujawnić obecność lub brak preferowanych orientacji, które mogą być wprowadzone z powrotem do protokołu ładowania. Na przykład w tej projekcji można zaobserwować skutki przeciążenia chipa kryształami lizozymu.
Podczas ładowania chipa powoli pipetuj pipetę i użyj palca, aby oprzeć pipetę nad chipem. Zapobiega to dotykaniu chipa i przypadkowemu wbijaniu w krzemie. Podczas przetwarzania danych należy korzystać z dostępnych zautomatyzowanych potoków.
To da ci dobre wyobrażenie o postępach twojego eksperymentu i czy musisz coś zmienić. Metodę tę można zastosować do dowolnego układu białkowego, który może być krystalizowany w znacznych ilościach. A reakcja może być wywołana przez lekkie promieniowanie rentgenowskie lub szybkie mieszanie.
Badania dynamiczne nad szeregiem struktur mogą dostarczyć informacji na temat funkcjonowania białek.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia kompleksowy przewodnik po przygotowaniu próbki z nieruchomym celem, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla synchronicznej krystalografii szeregowej w wiązce Diamond I24. Podkreśla metodologię prowadzenia eksperymentów z ograniczonymi ilościami próbki przy jednoczesnym zapewnieniu integralności chipów.
Kluczowe Składowe Badań
Obszar Nauki
- Biologia Strukturalna
- Krystalografia
- Dynamika Białek
Tło
- Synchroniczna krystalografia szeregowa (SSX) to rozwijający się obszar w krystalografii makromolekularnej.
- Jest odpowiednia do eksperymentów z niską dawką i temperaturą pokojową.
- SSX umożliwia badania dynamiczne białek, umożliwiając wizualizację ich akcji.
- SSX z nieruchomym celem może skutecznie wykorzystywać ograniczone ilości próbki.
Cel Badań
- Dostarczenie szczegółowego protokołu SSX z nieruchomym celem w wiązce Diamond I24.
- Zapewnienie prawidłowego przygotowania i ustawienia chipów w celu optymalnego zbierania danych.
- Wskazanie różnic w przetwarzaniu danych w porównaniu ze standardowymi danymi rotacyjnymi.
Wykorzystane Metody
- Przygotowanie chipów krzemowych z wykorzystaniem folii poliestrowej i technik uszczelniających.
- Nakładanie zawiesiny mikrokryształów na chipy i odsysanie próżniowe.
- Ustawianie chipów za pomocą graficznego interfejsu użytkownika w wiązce.
- Wizualizacja i przetwarzanie danych w czasie rzeczywistym przy użyciu zautomatyzowanych potoków.
Główne Wyniki
- Pomyślne ustawienie chipów prowadzi do dokładnego zbierania danych.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym wskaźników indeksowania i integracji podczas eksperymentów.
- Wizualizacja parametrów komórki elementarnej ujawnia polimorfy i efekty obciążenia.
- Badania dynamiczne dostarczają wglądu w funkcjonalność białek.
Wnioski
- Protokół zwiększa efektywność eksperymentów SSX z nieruchomym celem.
- Prawidłowa obsługa i ustawienie chipów są kluczowe dla pomyślnego zbierania danych.
- Badania dynamiczne przy użyciu SSX mogą znacznie poszerzyć naszą wiedzę na temat zachowania białek.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Fixed-target serial synchrotron crystallography enables structural biologists to conduct dynamic studies of proteins using limited sample quantities, supporting target validation through high-resolution structural insights. This method reduces sample consumption while maintaining data quality, which is critical for early-stage discovery where protein expression and purification are bottlenecks. By facilitating room-temperature and time-resolved experiments, it enhances mechanistic understanding of protein function, informing lead optimization and de-risking efforts in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing protein conformations in action, supporting functional target validation.
- Operational Value: Reduces dependency on large crystal volumes, allowing screening of challenging targets with limited expression yields.
- Predictive Confidence: Provides structural data that informs binding site characterization and mechanism of action, improving target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electron density maps from microcrystals, enabling precise ligand-binding assessments.
- Operational Value: Standardizes sample mounting and alignment via chip-based systems, improving reproducibility across screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces real-time hit-rate and indexing metrics that support go/no-go decisions during fragment or compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals polymorphic forms and conformational changes that may impact drug binding or stability, informing formulation strategies.
- Operational Value: Captures time-resolved structural data that can correlate with functional assays, strengthening translational biomarker alignment.
- Risk Mitigation: Identifies loading-induced artifacts or dehydration effects early, reducing risk of misinterpretation in downstream optimization.
Pipeline & Workflow Integration
Fixed-target SSX integrates into the discovery workflow following target identification and assay development, providing structural insights that guide lead identification and preclinical validation. It supports iterative design-make-test-analyze cycles by delivering rapid structural feedback on compound binding and protein dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing ligand-induced conformational changes and protein dynamics relevant to mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chip preparation and alignment, ensuring consistent data quality across compound screens.
- Analytics: Delivers quantitative outputs including unit cell parameters, hit rates, and integration metrics that allow objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural observations to functional outcomes by revealing dynamics that may influence bioavailability or target engagement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing revalidation efforts in multi-project environments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing high-resolution, time-resolved structural data under near-physiological conditions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized chip handling, alignment protocols, and automated data processing pipelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample consumption and enabling rapid iteration in structural optimization campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in macromolecular crystallography and familiarity with synchrotron-based sample handling techniques.
- Depends on access to beamline infrastructure with kinematic mounting, on-axis viewing, and automated data pipelines such as DIALS.
- Necessitates cross-team standardization of chip preparation, vacuum aspiration, and alignment procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations for different crystal sizes and space groups, requiring adjustment of aperture selection and spreading techniques.
- Includes practical limitations such as chip fragility during loading and cleaning, and sensitivity to dehydration effects that may alter crystal quality over time.
