Name: Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metodę krystalizacji białek na chipie kwarcowym i automatyczną dyfrakcję szeregową w temperaturze pokojowej. Technika ta umożliwia badanie dynamicznych stanów konformacyjnych białek bez konieczności kriokrystalografii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Korzystanie z Advanced Photon Source, obiektu Office of Science User Facility obsługiwanego dla Departamentu Energii USA przez Argonne National Laboratory, było wspierane przez kontrakt DE-AC02-06CH11357. Wykorzystanie BioCARS było wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach grantu nr R24GM111072. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Wykorzystanie LS-CAT Sector 21 było wspierane przez Michigan Economic Development Corporation i grant Michigan Technology Tri-Corridor 085P1000817. Prace te są wspierane przez granty Uniwersytetu Illinois w Chicago, National Institutes of Health (R01EY024363) i National Science Foundation (MCB 2017274) dla XY.

1. Wstępny montaż urządzenia
<ol>
	<li>Oznaczyć etykietą pierścień zewnętrzny (o średnicy 30 mm) w celu identyfikacji próbki. W razie potrzeby podaj nazwę projektu, numer urządzenia, warunki krystalizacji i datę (Rysunek 1A). Umieść zewnętrzny pierścień do góry nogami na czystej powierzchni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) i ostrożnie umieść jeden wafel kwarcowy wewnątrz pierścienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Ten pierwszy wafel kwarcowy służy jako okno wejściowe dla padających promieni rentgenowskich.</li>
	<li>Wlej niewielką ilość mikroskopowego olejku immersyjnego (lepkość 150 cSt) na szalkę Petriego. Zanurz podkładkę w oleju i upewnij się, że obie strony podkładki są odpowiednio naoliwione (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Usuń nadmiar oleju, wcierając podkładkę w czystą powierzchnię.</li>
	<li>Umieść naoliwioną podkładkę na wierzchu pierwszego wafla kwarcowego (<klasa mocna="xfig">Rysunek 1E). 
	UWAGA: Olejek immersyjny jest doskonałym uszczelniaczem, który chroni komorę krystalizacji przed potencjalną utratą pary. Prawidłowo zmontowane wióry zwykle wytrzymują tygodnie bez widocznego suszenia. Ten etap montażu wstępnego odbywa się przy oświetleniu pomieszczenia. W przypadku próbek wrażliwych na światło wszystkie kolejne etapy, w tym ładowanie próbki, przechowywanie urządzenia i obserwacja, muszą być wykonywane przy świetle ostrzegawczym.</li>
</ol>
2. Ładowanie próbki i montaż urządzenia
<ol>
	<li>Za pomocą pipety dokładnie wymieszaj roztwór białka i bufor krystalizacyjny na pierwszej płytce kwarcowej. Stosunek objętości między próbką białka a buforem zwykle waha się od 2:1 do 1:2 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F). Upewnij się, że całkowita objętość roztworu krystalizacyjnego nie przekracza maksymalnej pojemności komory krystalizacji określonej przez rozmiar i grubość podkładki. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas mieszania. 
	UWAGA: Skład buforu krystalizacyjnego różni się w zależności od eksperymentu. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z warunkami krystalizacji.</li>
	<li>Umieść drugą płytkę kwarcową na zmieszanym roztworze, gdy roztwór zacznie się rozprzestrzeniać (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1G). Ta druga płytka kwarcowa służy jako okno wyjściowe dla dyfrakcyjnego promieniowania rentgenowskiego.</li>
	<li>Lekko postukaj w drugą płytkę kwarcową o krawędź, aby pomóc rozprowadzić olej, jednocześnie wypychając powietrze. Zabezpiecz urządzenie, wkręcając pierścień ustalający w pierścień zewnętrzny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H). W razie potrzeby użyj narzędzia do dokręcania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I). Należy pamiętać, że zbyt mocne dokręcenie może spowodować deformację lub nawet pęknięcie delikatnych wafli kwarcowych.</li>
</ol>
3. Optymalizacja pamięci masowej i krystalizacji urządzeń
<ol>
	<li>Przechowuj zmontowane urządzenia (<klasa silna="xfig">Rysunek 1J) w pudełku w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze z kontrolą temperatury. 
	UWAGA: Kryształy białka mogą pojawić się w ciągu kilku godzin do kilku dni po zmontowaniu urządzenia do krystalizacji. Typowe wyniki krystalizacji na chipie przedstawiono dla kilku reprezentatywnych próbek białek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Monitoruj wzrost kryształów, obserwując urządzenie do krystalizacji pod mikroskopem. W razie potrzeby zoptymalizuj warunki krystalizacji poprzez iteracje sekcji 1-3.</li>
</ol>
4. Kalibracja
UWAGA: Programy i polecenia wymienione w poniższych sekcjach są uruchamiane w oprogramowaniu inSituX.
<ol>
	<li>Zainstaluj cienki kryształ granatu itrowo-aluminiowego na uchwycie chipów (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Zamontuj ogranicznik belki. Wykonaj zdjęcia fluorescencji rentgenowskiej wiązki bezpośredniej, uruchamiając program: 
	burnmark.py <device>.param 
	gdzie <urządzenie> to wybrana przez użytkownika nazwa urządzenia do krystalizacji. <device>.param to nazwa pliku zawierająca parametry sterujące specyficzne dla urządzenia. Wartości domyślne będą stopniowo zastępowane określonymi wartościami wzdłuż protokołu. Przykładowy plik <device>.param jest pokazany w pliku uzupełniającym 1.</li>
	<li>Znajdź dokładne położenie bezpośredniej wiązki promieniowania rentgenowskiego, uruchamiając program do montażu profilu belki: 
	beam.py <nagraj obraz> -d <device> 
	gdzie <obraz z nagraniem> to nazwa pliku obrazu fluorescencji rentgenowskiej (Rysunek 4). 
	UWAGA: Ten program oblicza dokładne bezpośrednie pozycje belki, a także rozmiar belki. Pozycja wiązki wyznacza miejsce docelowe translokacji dla wszystkich kryształów z tego samego urządzenia. Rozmiar wiązki jest również używany do planowania celów.</li>
</ol>
5. Skanowanie optyczne
<ol>
	<li>Umieść urządzenie do krystalizacji w uchwycie chipa i zabezpiecz je śrubą skrzydełkową (Rysunek 3A).</li>
	<li>Zamontuj uchwyt chipa na stoliku translacyjnym dyfraktometru za pomocą mechanizmu kinematycznego (Rysunek 3B).</li>
	<li>Zainstaluj odpowiednie źródło światła do wykonywania mikrofotografii z okienka optycznego urządzenia. Światło białe, światło podczerwone lub inne światło z wyboru może być używane w zależności od wrażliwości próbki białka na światło, a także celu eksperymentu.</li>
	<li>Uruchom program skanujący: 
	scan.py <device>.param 
	Ten program przechwytuje zestaw mikrofotografii, które są automatycznie przesyłane do określonych komputerów użytkowników.</li>
	<li>Uruchom program do kafelkowania na komputerze użytkownika: 
	tile.py <urządzenie> -x <x> -y <y> 
	gdzie <x> i <y> są początkowymi wartościami odpowiednio przemieszczeń kolumn i wierszy mikrofotografii. Ten program łączy wszystkie mikrofotografie w montaż o rozdzielczości 1-3 μm/piksel (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). 
	UWAGA: Kroki 5.4 i 5.5 zwykle zajmują kilka minut. Łączna liczba mikrofotografii waha się od kilkudziesięciu do kilkuset w zależności od obszaru skanowania i powiększenia.</li>
	<li>Uruchom program do znajdowania kryształów: 
	findX.py <montaż> -c <długość> <szerokość> -w <klin> -x <rozmiar belki> 
	gdzie <montaż> to obraz podzielony kafelkami. Ten program wykonuje rozpoznawanie kryształów i planowanie ujęć. <długość> i <szerokość> wskazują rozmiar kryształu, który ma zostać znaleziony. Jeśli użytkownik chce uniknąć mniejszych kryształów, <szerokość> może być użyta jako punkt odcięcia, ustawiając liczbę większą niż rozmiary niechcianych małych kryształów. <klin> to wartość kątowa, która określa tolerancję dla kryształów o nieregularnym kształcie. <Rozmiar belki> odnosi się do bezpośredniego rozmiaru belki uzyskanego z powyższego łącznika profilu (krok 4.2; <silna klasa="xfig">Rysunek 4). Użytkownicy mogą również ustawić wartość nominalną, aby jeszcze bardziej rozmieścić celowane strzały. Te kluczowe parametry umożliwiają specyficzny wybór kryształów i planowanie celów (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
</ol>
6. Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego
<ol>
	<li>Usuń źródło światła i zainstaluj ogranicznik wiązki. Ustaw odpowiednią odległość czujnika. Postępuj zgodnie z protokołem bezpieczeństwa linii badawczej, aby przeszukać klatkę rentgenowską. Otwórz migawkę rentgenowską i migawkę laserową, jeśli ma to zastosowanie.</li>
	<li>Uruchom program do zbierania danych dla dyfrakcji szeregowej: 
	collect.py <device>.param -l <czas trwania> 
	To polecenie uruchamia zbieranie danych, w którym wszystkie zaplanowane ujęcia są odwiedzane jedno po drugim zgodnie z zaprogramowaną sekwencją. Każdy docelowy kryształ jest przemieszczany do pozycji wiązki (krok 4.2). Przy każdym zatrzymaniu wykonywana jest ekspozycja na promieniowanie rentgenowskie z oświetleniem laserowym lub bez niego z zaplanowanym opóźnieniem czasowym. Film 1 pokazuje automatyczną sekwencję zbierania danych działającą z częstotliwością 1 Hz. Rutynowo dziesiątki do setek obrazów dyfrakcyjnych są zbierane z pojedynczego urządzenia krystalizacyjnego (Film 2). 
	UWAGA: Kalibracja sekcji 4 i sekcja 5 skanowania optycznego są niezależne od platformy inSituX, dzięki czemu można je w pełni przenieść na inną linię badawczą. Sekcja 6 Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego musi obejmować pewne szczegóły w działaniu linii badawczej.</li>
</ol>

<ol><li>Brändén, G., Neutze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+time-resolved+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography.</a> Science. 373, (2021).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).</li>
<li>Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+X-rays%3A+an+overview+of+emerging+structural+biology+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).</li>
<li>Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+before+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Diffraction before destruction.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313(2014).</li>
<li>Kisselman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-CHIP%3A+an+integrated+platform+for+high-throughput+protein+crystallization+and+on-the-chip+X-ray+diffraction+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combined+crystallization+plate+for+high-throughput+crystal+screening+and+in+situ+data+collection+at+a+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).</li>
<li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+serial+Laue+diffraction+on+a+microfluidic+crystallization+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device.</a> Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal-on-crystal+chips+for+in+situ+serial+diffraction+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature.</a> Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).</li>
<li>Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+in+situ+serial+crystallography+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature.</a> IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).</li>
<li>Croes, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+solving+traveling+salesman+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Operations+Research%22%5BJournal%5D)">A method for solving traveling salesman problems.</a> Operations Research. 6, 791-812 (1958).</li>
<li>Bandara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+far-red-sensing+cyanobacteriochrome+reveals+an+atypical+bilin+conformation+and+spectral+tuning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118(2021).</li>
<li>Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+molecular+logic+OR+in+a+dual-sensor+histidine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).</li>
<li>Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-scan+cryocrystallography+reveals+reaction+intermediates+in+bacteriophytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome.</a> Nature. 479, 428-432 (2011).</li>
<li>Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+prokaryotic+%286-4%29+photolyase+with+an+Fe-S+cluster+and+a+6%2C7-dimethyl-8-ribityllumazine+antenna+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+crystallography+reveals+early+signaling+events+in+ultraviolet+photoreceptor+UVR8%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8.</a> Nature Plants. 1, 14006(2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+base+selectivity+from+the+1.8+%C3%85+resolution+structure+of+an+RB69+DNA+polymerase+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex.</a> Biochemistry. 50, 581-590 (2011).</li>
<li>Rodgrs, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Cryocrystallography.</a> Structure. 2, 1135-1140 (1994).</li>
<li>Zhao, F. -Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+sample+delivery+systems+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22TheFEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to sample delivery systems for serial crystallography.</a> TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).</li>
</ol>

ZR jest wynalazcą chipów typu kryształ po krysztale, które są objęte amerykańskim patentem 9632042 przyznanym firmie Renz Research, Inc.

Krystalografia białek we wczesnych latach prowadzona w temperaturze pokojowej napotykała ogromne trudności w walce z uszkodzeniami spowodowanymi promieniowaniem rentgenowskim. W związku z tym została ona wyparta przez bardziej niezawodną metodę kriokrystalografii, ponieważ synchrotronowe źródła promieniowania rentgenowskiego stały się łatwodostępne20. Wraz z pojawieniem się rentgenowskich laserów na swobodnych elektronach, krystalografia białek w temperaturze pokojowej została w ostatnich latach o...

Ze względu na jonizujące efekty promieniowania rentgenowskiego, krystalografia białek, w dużym stopniu, została ograniczona do warunków kriogenicznych w ciągu ostatnich trzech dekad. W związku z tym obecna wiedza na temat ruchów białek podczas ich funkcji w dużej mierze wynika z porównań między strukturami statycznymi obserwowanymi w różnych stanach w warunkach kriogenicznych. Jednak temperatury kriogeniczne nieuchronnie utrudniają postęp reakcji biochemicznej lub interkonwersji między różnymi stanami konformacyjnymi, gdy działają cząsteczki białka. Aby bezpośrednio obserwować dynamikę strukturalną białek w rozdzielczości atomowej za pomocą krystalografii, potrzebne są solidne i rutynowe metody przeprowadzania eksperymentów dyfrakcyjnych w temperaturze pokojowej, co wymaga innowacji technicznych w dostarczaniu próbek, gromadzeniu danych i analizie danych a posteriori. W tym celu ostatnie postępy w krystalografii szeregowej otworzyły nowe możliwości rejestrowania obrazów molekularnych produktów pośrednich i krótkożyciowych związków strukturalnych w temperaturze pokojowej1,2,3. W przeciwieństwie do strategii "jeden kryształ-jeden zestaw danych" szeroko stosowanej w konwencjonalnej kriokrystalografii, krystalografia szeregowa przyjmuje strategię gromadzenia danych podobną do tej stosowanej w mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek. W szczególności dane eksperymentalne w krystalografii szeregowej są zbierane w małych frakcjach z dużej liczby pojedynczych próbek, po czym następuje intensywne przetwarzanie danych, w którym frakcje danych są oceniane i łączone w kompletny zestaw danych do określania struktury 3D4. Ta strategia "jeden kryształ jeden strzał" skutecznie łagodzi uszkodzenia kryształów białek w temperaturze pokojowej spowodowane promieniowaniem rentgenowskim poprzez strategię dyfrakcji przed zniszczeniem5.
Ponieważ krystalografia szeregowa wymaga dużej liczby kryształów białkowych do skompletowania zestawu danych, stanowi to poważne wyzwanie techniczne dla wielu systemów biologicznych, w których próbki białek są ograniczone i/lub w grę wchodzi delikatne obchodzenie się z kryształami. Inną ważną kwestią jest to, jak najlepiej zachować integralność kryształów w eksperymentach dyfrakcji szeregowej. Metody dyfrakcji in situ rozwiązują te problemy, umożliwiając kryształom białek dyfrakcję bezpośrednio z miejsca, w którym rosną, bez naruszania uszczelnienia komory krystalizacji6,7,8,9. Te bezobsługowe metody są oczywiście kompatybilne z dyfrakcją szeregową na dużą skalę. Niedawno informowaliśmy o zaprojektowaniu i wdrożeniu urządzenia do krystalizacji dyfrakcji in situ w oparciu o koncepcję kryształ na krysztale - kryształy białka hodowane bezpośrednio na monokrystalicznym kwarcu 11. To urządzenie typu "kryształ na krysztale" ma kilka zalet. Po pierwsze, posiada przezroczyste okno rentgenowskie i świetlne wykonane z monokrystalicznego podłoża kwarcowego, które wytwarza niewielkie rozpraszanie tła, co skutkuje doskonałym stosunkiem sygnału do szumu w obrazach dyfrakcyjnych z kryształów białkowych. Po drugie, monokrystaliczny kwarc jest doskonałą paroizolacją równoważną szkłu, zapewniając w ten sposób stabilne środowisko do krystalizacji białek. W przeciwieństwie do tego, inne urządzenia do krystalizacji wykorzystujące podłoża na bazie polimerów są podatne na wysychanie ze względu na paroprzepuszczalność, chyba że materiał polimerowy ma znaczną grubość, co w konsekwencji przyczynia się do wysokiego rozpraszania tła10. Po trzecie, urządzenie to umożliwia dostarczanie dużej liczby kryształów białka do wiązki promieniowania rentgenowskiego bez jakiejkolwiek formy manipulacji kryształami lub ich zbierania, co ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności kryształów11.
Aby usprawnić seryjne eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej przy użyciu urządzeń kryształ na krysztale, opracowaliśmy prototyp dyfraktometru, który ułatwia przełączanie między trybami skanowania optycznego i dyfrakcji rentgenowskiej12. Ten dyfraktometr ma niewielkie rozmiary i był używany do szeregowego zbierania danych na dwóch liniach badawczych Advanced Photon Source (APS) w Argonne National Laboratory. W szczególności użyliśmy BioCARS 14-ID-B do dyfrakcji Laue i LS-CAT 21-ID-D do oscylacji monochromatycznej. Ten sprzęt dyfraktometru nie jest wymagany, jeśli synchrotronowa lub rentgenowska linia laserowa na swobodnych elektronach jest wyposażona w dwie kluczowe funkcje: (1) zmotoryzowane pozycjonowanie próbki z zakresem ruchu ±12 mm wokół wiązki promieniowania rentgenowskiego we wszystkich kierunkach; oraz (2) wbudowaną w oś kamerę cyfrową do oglądania kryształów w świetle oświetlonym, która jest bezpieczna dla badanych kryształów białkowych. Monokrystaliczne urządzenie kwarcowe wraz z przenośnym dyfraktometrem i oprogramowaniem sterującym do skanowania optycznego, rozpoznawania kryształów i automatycznego gromadzenia danych in situ tworzą razem platformę inSituX do krystalografii szeregowej. Chociaż rozwój ten jest przede wszystkim motywowany zastosowaniami krystalografii dynamicznej wykorzystującymi polichromatyczne źródło promieniowania rentgenowskiego, wykazaliśmy potencjał tej technologii do obsługi monochromatycznych metod oscylacji10,12. Dzięki automatyzacji platforma ta oferuje wysokowydajną metodę szeregowego gromadzenia danych w temperaturze pokojowej przy przystępnym spożyciu białka.
W tym artykule szczegółowo opisujemy, jak skonfigurować krystalizację na chipie w mokrym laboratorium i jak przeprowadzić szeregowe zbieranie danych rentgenowskich na linii synchrotronowej za pomocą platformy inSituX.
Metoda wsadowa jest używana do ustawienia krystalizacji na chipie w warunkach podobnych do metody dyfuzji parowej uzyskanej dla tej samej próbki białka (Tabela 1). Jako punkt wyjścia zalecamy użycie środka strącającego o stężeniu 1,2-1,5x większym niż ten dla metody dyfuzji parowej. W razie potrzeby warunki krystalizacji partii można dodatkowo zoptymalizować za pomocą dokładnego przesiewania siatkowego. Wafle kwarcowe nie są niezbędne do prób optymalizacyjnych; Zamiast tego można użyć szkiełek nakrywkowych (patrz poniżej). Częściowo załadowane urządzenia do krystalizacji są zalecane w celu prowadzenia prób optymalizacyjnych na mniejszą skalę. Szereg próbek białek udało się skrystalizować na takich urządzeniach przy użyciu metody wsadowej10 (Tabela 1).
Samo urządzenie składa się z następujących części: 1) zewnętrznego pierścienia; 2) dwie wafle kwarcowe; 3) jedna podkładka przypominająca podkładkę z tworzywa sztucznego lub stali nierdzewnej; 4) pierścień ustalający; 5) olejek immersyjny mikroskopowy jako uszczelniacz (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1). Całkowita objętość roztworu krystalizacyjnego załadowanego na jeden chip zależy od celu eksperymentu. Pojemność komory krystalizacyjnej można regulować, wybierając podkładkę o różnej grubości i/lub średnicy wewnętrznej. Rutynowo ustawiamy urządzenia do krystalizacji o pojemności 10-20 μl za pomocą podkładek o grubości 50-100 μm. Typowe urządzenie może wyprodukować dziesiątki do tysięcy kryształów białkowych odpowiednich do szeregowego zbierania danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
Gdy się powiedzie, krystalizacja na chipie wytworzy dziesiątki do setek, a nawet tysięcy kryształów białka na każdym urządzeniu kwarcowym, gotowych do dyfrakcji rentgenowskiej. Na linii synchrotronowej takie urządzenie jest zamontowane na trójosiowym stopniu translacji dyfraktometru za pomocą mechanizmu kinematycznego. Okno krystalizacji zamontowanego urządzenia jest skanowane optycznie i obrazowane na dziesiątkach do setek mikrofotografii. Mikrofotografie te są następnie łączone w montaż o wysokiej rozdzielczości. W przypadku kryształów światłoczułych skanowanie optyczne można przeprowadzić w świetle podczerwonym (IR), aby uniknąć niezamierzonej fotoaktywacji. Opracowano oprogramowanie do rozpoznawania obrazów w celu identyfikacji i lokalizacji kryształów białek losowo rozmieszczonych na urządzeniu. Kryształy te są następnie klasyfikowane zgodnie z ich rozmiarem, kształtem i położeniem, aby informować lub kierować strategią gromadzenia danych w krystalografii szeregowej. Na przykład, pojedyncze lub wielokrotne strzały mogą być umieszczone na każdym docelowym krysztale. Użytkownicy mogli zaplanować pojedyncze przejście lub wiele tras przez wybrane kryształy. Wdrożyliśmy oprogramowanie do obliczania różnych tras przejazdu. Na przykład najkrótsza trasa jest obliczana przy użyciu algorytmów, które rozwiązują problem komiwojażera13. W przypadku dynamicznych zastosowań krystalograficznych z pompą-sondą można wybrać czas i czas trwania zdjęć laserowych (pompa) i rentgenowskich (sonda). Zautomatyzowane szeregowe zbieranie danych jest zaprogramowane tak, aby przemieszczać każdy docelowy kryształ do wiązki promieniowania rentgenowskiego jeden po drugim.
Kluczowe elementy dyfraktometru insituX to: 1) uchwyt urządzenia; 2) etap tłumaczenia trójosiowego; 3) źródło światła do skanowania optycznego; 4) zatrzymanie wiązki promieniowania rentgenowskiego; 5) pompować lasery, jeśli badane są białka wrażliwe na światło; 6) Mikrokomputer Raspberry Pi wyposażony w kamerę czułą na podczerwień; 7) Oprogramowanie sterujące do synchronizacji silników, kamery, źródeł światła, lasera pompy oraz do interfejsu ze sterowaniem linią badawczą.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie analityczne</td><td>Opracowany</td><td></td><td></td>przez nas</tr><tr><td>granat itrowo-aluminiowy domieszkowany cerem</td><td>MSE Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td>Ce: Y3Al5O12, podłoża monokrystaliczne YAG</td></tr><tr><td>Uchwyt na chipy</td><td>Opracowane</td><td></td><td></td>przez nas</tr><tr><td>oprogramowanie sterujące</td><td>Opracowany</td><td></td><td></td>przez nas</tr><tr><td>olejek immersyjny</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Typ A niski lepkość 150 cSt</td></tr><tr><td>platforma inSituX</td><td>Opracowane</td><td></td><td></td>przez nas</tr><tr><td>źródło światła IR</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED ze szklaną soczewką, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Pierścień zewnętrzny</td><td>Opracowana</td><td></td><td></td>przez nas</tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>Pump lasers</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, & 9 mm, E Pin Code, Dioda laserowa</td></tr><tr><td>Raspberry</td><td>Pi Pierścień ustalający Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>Pierścień ustalający SM1 do &Oslash; Tubusy i mocowania soczewek 1"</td></tr><tr><td>Bezpestkowy kryształ kwarcu</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>Średnica 25,4 mm Z-cut 0,05 mm grubość dwustronny połysk 8 mm na -X</td></tr><tr><td>Podkładka</td><td>Opracowany</td><td></td><td></td>przez nas</tr><tr><td>Ogranicznik wiązki promieniowania rentgenowskiego</td><td>opracowany przez nas</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Reakcje biochemiczne i procesy biologiczne można najlepiej zrozumieć, pokazując, jak białka przechodzą między swoimi stanami funkcjonalnymi. Ponieważ temperatury kriogeniczne są niefizjologiczne i mogą zapobiegać, powstrzymywać, a nawet zmieniać dynamikę strukturalną białek, wysoce pożądana jest solidna metoda rutynowych eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Urządzenie typu kryształ na krysztale oraz towarzyszący mu sprzęt i oprogramowanie używane w tym protokole zostały zaprojektowane tak, aby umożliwić dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego in situ w temperaturze pokojowej dla kryształów białek o różnych rozmiarach bez jakiejkolwiek manipulacji próbką. W tym miejscu przedstawiamy protokoły dla kluczowych etapów, od montażu urządzenia, krystalizacji na chipie, skanowania optycznego, rozpoznawania kryształów po planowanie zdjęć rentgenowskich i automatyczne gromadzenie danych. Ponieważ platforma ta nie wymaga zbierania kryształów ani żadnej innej manipulacji próbkami, setki do tysięcy kryształów białek wyhodowanych na chipie można wprowadzić do wiązki promieniowania rentgenowskiego w programowalny i wysokoprzepustowy sposób.

W ciągu ostatnich kilku lat opublikowano kilka reprezentatywnych zbiorów danych10,12 wraz z wynikami krystalograficznymi i odkryciami naukowymi dotyczącymi zróżnicowanego zakresu próbek białek, w tym białek fotoreceptorowych i enzymów, na przykład roślinnego fotoreceptora UV-B UVR8, napędzanej światłem fotoliazy naprawiającej DNA PhrB10, nowego białka wyczuwającego światło dalekiej czerwieni z wielodomenowej sensorycznej kinazy histydynowe...

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Protokół ten demonstruje krystalizację białka na urządzeniu podobnym do chipa w pamięci danych dyfrakcji rentgenowskiej. To urządzenie nazywa się kryształem na krysztale, ponieważ kryształy białka rosną na pojedynczym krysztale kwarcu. Po pomyślnym wyhodowaniu kryształów białkowych na takich urządzeniach, tysiące obrazów dyfrakcyjnych są zbierane z każdego urządzenia w temperaturze pokojowej, nawet nie dotykając kryształów białka.Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego w temperaturze pokojowej jest bardzo istotna do badania funkcji białek obejmujących wiele stanów konformacyjnych. Te informacyjne zmiany białka lub działania białek mogą zostać zamrożone, a zatem niewykrywalne w kriokrystalografii. Urządzenia te mogą być wykorzystywane do badania procesów sygnalizacyjnych indukowanych światłem i zmian redoks.Tylko garstka urządzeń zapewnia kompletne i nadmiarowe zestawy danych. Aby rozpocząć wstępny montaż urządzenia, oznacz etykietą pierścień zewnętrzny w celu identyfikacji próbki. W razie potrzeby podaj nazwę projektu, numer urządzenia, warunki krystalizacji i datę.Następnie umieść oznaczony pierścień do góry nogami na czystej powierzchni i umieść jedną wafel kwarcowy wewnątrz zewnętrznego pierścienia. Następnie wlej niewielką ilość olejku immersyjnego do mikroskopu na szalkę Petriego i zanurz podkładkę w oleju, upewniając się, że obie strony podkładki są dobrze pokryte. Usuń nadmiar oleju, wcierając podkładkę w czystą powierzchnię.Następnie umieść naoliwioną podkładkę na wierzchu pierwszego wafla kwarcowego. Wymieszaj roztwór białka i bufor krystalizacyjny na pierwszej płytce kwarcowej za pomocą pipety. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza podczas mieszania.Całkowita objętość roztworu krystalizacyjnego nie powinna przekraczać maksymalnej pojemności komory krystalizacji określonej przez rozmiar i grubość podkładki. Umieść drugą wafel kwarcowy na zmieszanym roztworze. Rozwiązanie rozprzestrzeni się spontanicznie.Następnie lekko postukaj w drugą płytkę kwarcową o krawędź, aby pomóc rozprowadzić olej, jednocześnie wypychając powietrze. Zabezpiecz urządzenie, wkręcając pierścień ustalający w pierścień zewnętrzny. W razie potrzeby użyj narzędzia do dokręcania.Unikaj nadmiernego dokręcania, ponieważ może to spowodować deformację lub pękanie delikatnych wafli kwarcowych. Przechowuj zmontowane urządzenia w pudełku w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą. Po kilku godzinach lub dniach umieść urządzenie do krystalizacji pod mikroskopem i monitoruj wzrost kryształów.W razie potrzeby zoptymalizuj warunki krystalizacji zgodnie z opisem w manuskrypcie. W celu kalibracji zainstaluj cienki kryształ YAG na uchwycie chipa, a następnie zainstaluj ogranicznik wiązki. Następnie otwórz oprogramowanie Insitux i uruchom wskazany program, aby wykonać obrazy fluorescencji rentgenowskiej wiązki bezpośredniej, gdzie urządzenie jest wybraną przez użytkownika nazwą urządzenia i urządzenia do krystalizacji.param to nazwa pliku, która zawiera parametry sterujące specyficzne dla urządzenia. Następnie znajdź dokładne położenie bezpośredniej wiązki promieniowania rentgenowskiego, uruchamiając program do dopasowywania profilu wiązki, gdzie obraz wypalenia jest nazwą pliku obrazu fluorescencji rentgenowskiej. W przypadku skanowania optycznego umieść urządzenie krystalizujące w uchwycie chipa i zabezpiecz śrubą skrzydełkową.Następnie zamontuj uchwyt chipa na stoliku translacyjnym dyfraktometru za pomocą mechanizmu kinematycznego. W zależności od wrażliwości próbki białka na światło i celu eksperymentu, zainstaluj źródło światła białego lub podczerwonego, aby pobrać mikrofotografie z okna optycznego urządzenia. Gdy konfiguracja jest gotowa, uruchom program skanujący, wprowadzając wskazane polecenie skanowania w ruchu na linii wiązki.Następnie uruchom program do kafelkowania na komputerze użytkownika, gdzie x jest wartością początkową kolumny, a y jest wartością początkową dla nieuczciwych przemieszczeń mikrofotografii. Program łączy wszystkie mikrofotografie w montaż o rozdzielczości od jednego do trzech mikrometrów pikseli. Po zszyciu mikrofotografii wprowadź wskazane polecenie, aby uruchomić program do wyszukiwania kryształów.Program ten wykonuje rozpoznawanie kryształów i planowanie strzałów, a kluczowe parametry w tym programie umożliwiają określony wybór kryształu i planowanie celu. Usuń źródło światła i ustaw ogranicznik wiązki. Następnie uruchom program do zbierania danych do dyfrakcji szeregowej.Sugerowane polecenie uruchamia zbieranie danych poprzez odwiedzenie zaplanowanych ujęć w zaprogramowanej sekwencji. Każdy docelowy kryształ jest przemieszczany do pozycji wiązki. Przy każdym zatrzymaniu wykonywana jest ekspozycja promieniowania rentgenowskiego z oświetleniem laserowym lub bez niego z zaplanowanym opóźnieniem czasowym.W pracy porównano warunki krystalizacji między dyfuzją pary a wsadem na chipie. Przedstawiono tutaj cztery studia przypadków krystalizacji w układzie scalonym i reprezentatywne zestawy danych zebrane bezpośrednio z urządzeń kwarcowych. Eksperymenty z dynamiczną krystalografią ujawniły wywołane światłem zmiany w białku fotoreceptora dalekiej czerwieni, porównując dane z 4 352 kryształów w ciemności i 8 287 kryształów po oświetleniu światłem.Ciemny zestaw danych z seryjnej dyfrakcji Laue in situ zaowocował lepszymi gęstościami elektronów, umożliwiając pewne zbudowanie modelu chromoforu bilinowego w konformacji znaku Z. Mapy różnic wywołanych światłem ujawniły skoordynowane ruchy w centralnym arkuszu beta, co sugeruje znaczenie układania pi-pi między pierścieniami pirolu chromoforu a kilkoma resztami aromatycznymi. Ta platforma nazywa się Insitux.Unikalną zaletą tej platformy jest to, że po zakończeniu krystalizacji nie trzeba wykonywać żadnej manipulacji kryształami. Konieczne jest zebranie wielu zestawów danych w zmieniających się warunkach, aby uchwycić ruchy białek. Staje się to możliwe dzięki Insitux, ponieważ umożliwia on gromadzenie danych na dużą skalę z tysięcy kryształów białek w temperaturze pokojowej.Dzięki tym nowym możliwościom, w tym krystalografii, systemy wrażliwe na światło mogą być uruchamiane wewnątrz urządzenia, a system obojętny na światło może być badany, jeśli urządzenie kryształ po krysztale zostanie przekształcone w wypływy.

on-chip-crystallization-large-scale-serial-diffraction-at-room

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Opisano wszechstronne urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia krystalizację enzymu za pomocą metody przeciwdyfuzyjnej, wprowadzenie substratu do kryształów poprzez moczenie, oraz określenie struktury 3D kompleksu enzym:substrat poprzez seryjną analizę kryształów wewnątrz chipa w temperaturze pokojowej.

Krystalizacja i oznaczanie strukturalne kompleksu enzyma:substrat za pomocą krystalografii szeregowej w uniwersalnym chipie mikroprzepływowym

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jednoznaczną metodą pomiaru wolnych rodników. Zastosowanie selektywnych sond spinowych pozwala na wykrywanie wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawiamy praktyczną, efektywną metodę pobierania próbek biologicznych, która ułatwia obróbkę, przechowywanie i przenoszenie próbek do pomiarów EPR.

Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji dużych ilości rekombinowanego RNA w Escherichia coli poprzez współekspresję chimerycznego RNA, który zawiera interesujące RNA w rusztowaniu wiroidowym i roślinnej ligazie tRNA. Głównym produktem jest okrągła cząsteczka, która ułatwia oczyszczanie do jednorodności.

Produkcja na dużą skalę rekombinowanych RNA na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w Escherichia coli

Poznaj metodę krystalizacji białek na chipie kwarcowym i automatyczną dyfrakcję szeregową w temperaturze pokojowej. Technika ta umożliwia badanie dynamicznych stanów konformacyjnych białek bez konieczności kriokrystalografii.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Przeglądaj więcej filmów