Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej
March 11th, 2022
Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.
Protokół ten demonstruje krystalizację białka na urządzeniu podobnym do chipa w pamięci danych dyfrakcji rentgenowskiej. To urządzenie nazywa się kryształem na krysztale, ponieważ kryształy białka rosną na pojedynczym krysztale kwarcu. Po pomyślnym wyhodowaniu kryształów białkowych na takich urządzeniach, tysiące obrazów dyfrakcyjnych są zbierane z każdego urządzenia w temperaturze pokojowej, nawet nie dotykając kryształów białka.
Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego w temperaturze pokojowej jest bardzo istotna do badania funkcji białek obejmujących wiele stanów konformacyjnych. Te informacyjne zmiany białka lub działania białek mogą zostać zamrożone, a zatem niewykrywalne w kriokrystalografii. Urządzenia te mogą być wykorzystywane do badania procesów sygnalizacyjnych indukowanych światłem i zmian redoks.
Tylko garstka urządzeń zapewnia kompletne i nadmiarowe zestawy danych. Aby rozpocząć wstępny montaż urządzenia, oznacz etykietą pierścień zewnętrzny w celu identyfikacji próbki. W razie potrzeby podaj nazwę projektu, numer urządzenia, warunki krystalizacji i datę.
Następnie umieść oznaczony pierścień do góry nogami na czystej powierzchni i umieść jedną wafel kwarcowy wewnątrz zewnętrznego pierścienia. Następnie wlej niewielką ilość olejku immersyjnego do mikroskopu na szalkę Petriego i zanurz podkładkę w oleju, upewniając się, że obie strony podkładki są dobrze pokryte. Usuń nadmiar oleju, wcierając podkładkę w czystą powierzchnię.
Następnie umieść naoliwioną podkładkę na wierzchu pierwszego wafla kwarcowego. Wymieszaj roztwór białka i bufor krystalizacyjny na pierwszej płytce kwarcowej za pomocą pipety. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza podczas mieszania.
Całkowita objętość roztworu krystalizacyjnego nie powinna przekraczać maksymalnej pojemności komory krystalizacji określonej przez rozmiar i grubość podkładki. Umieść drugą wafel kwarcowy na zmieszanym roztworze. Rozwiązanie rozprzestrzeni się spontanicznie.
Następnie lekko postukaj w drugą płytkę kwarcową o krawędź, aby pomóc rozprowadzić olej, jednocześnie wypychając powietrze. Zabezpiecz urządzenie, wkręcając pierścień ustalający w pierścień zewnętrzny. W razie potrzeby użyj narzędzia do dokręcania.
Unikaj nadmiernego dokręcania, ponieważ może to spowodować deformację lub pękanie delikatnych wafli kwarcowych. Przechowuj zmontowane urządzenia w pudełku w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą. Po kilku godzinach lub dniach umieść urządzenie do krystalizacji pod mikroskopem i monitoruj wzrost kryształów.
W razie potrzeby zoptymalizuj warunki krystalizacji zgodnie z opisem w manuskrypcie. W celu kalibracji zainstaluj cienki kryształ YAG na uchwycie chipa, a następnie zainstaluj ogranicznik wiązki. Następnie otwórz oprogramowanie Insitux i uruchom wskazany program, aby wykonać obrazy fluorescencji rentgenowskiej wiązki bezpośredniej, gdzie urządzenie jest wybraną przez użytkownika nazwą urządzenia i urządzenia do krystalizacji.
param to nazwa pliku, która zawiera parametry sterujące specyficzne dla urządzenia. Następnie znajdź dokładne położenie bezpośredniej wiązki promieniowania rentgenowskiego, uruchamiając program do dopasowywania profilu wiązki, gdzie obraz wypalenia jest nazwą pliku obrazu fluorescencji rentgenowskiej. W przypadku skanowania optycznego umieść urządzenie krystalizujące w uchwycie chipa i zabezpiecz śrubą skrzydełkową.
Następnie zamontuj uchwyt chipa na stoliku translacyjnym dyfraktometru za pomocą mechanizmu kinematycznego. W zależności od wrażliwości próbki białka na światło i celu eksperymentu, zainstaluj źródło światła białego lub podczerwonego, aby pobrać mikrofotografie z okna optycznego urządzenia. Gdy konfiguracja jest gotowa, uruchom program skanujący, wprowadzając wskazane polecenie skanowania w ruchu na linii wiązki.
Następnie uruchom program do kafelkowania na komputerze użytkownika, gdzie x jest wartością początkową kolumny, a y jest wartością początkową dla nieuczciwych przemieszczeń mikrofotografii. Program łączy wszystkie mikrofotografie w montaż o rozdzielczości od jednego do trzech mikrometrów pikseli. Po zszyciu mikrofotografii wprowadź wskazane polecenie, aby uruchomić program do wyszukiwania kryształów.
Program ten wykonuje rozpoznawanie kryształów i planowanie strzałów, a kluczowe parametry w tym programie umożliwiają określony wybór kryształu i planowanie celu. Usuń źródło światła i ustaw ogranicznik wiązki. Następnie uruchom program do zbierania danych do dyfrakcji szeregowej.
Sugerowane polecenie uruchamia zbieranie danych poprzez odwiedzenie zaplanowanych ujęć w zaprogramowanej sekwencji. Każdy docelowy kryształ jest przemieszczany do pozycji wiązki. Przy każdym zatrzymaniu wykonywana jest ekspozycja promieniowania rentgenowskiego z oświetleniem laserowym lub bez niego z zaplanowanym opóźnieniem czasowym.
W pracy porównano warunki krystalizacji między dyfuzją pary a wsadem na chipie. Przedstawiono tutaj cztery studia przypadków krystalizacji w układzie scalonym i reprezentatywne zestawy danych zebrane bezpośrednio z urządzeń kwarcowych. Eksperymenty z dynamiczną krystalografią ujawniły wywołane światłem zmiany w białku fotoreceptora dalekiej czerwieni, porównując dane z 4 352 kryształów w ciemności i 8 287 kryształów po oświetleniu światłem.
Ciemny zestaw danych z seryjnej dyfrakcji Laue in situ zaowocował lepszymi gęstościami elektronów, umożliwiając pewne zbudowanie modelu chromoforu bilinowego w konformacji znaku Z. Mapy różnic wywołanych światłem ujawniły skoordynowane ruchy w centralnym arkuszu beta, co sugeruje znaczenie układania pi-pi między pierścieniami pirolu chromoforu a kilkoma resztami aromatycznymi. Ta platforma nazywa się Insitux.
Unikalną zaletą tej platformy jest to, że po zakończeniu krystalizacji nie trzeba wykonywać żadnej manipulacji kryształami. Konieczne jest zebranie wielu zestawów danych w zmieniających się warunkach, aby uchwycić ruchy białek. Staje się to możliwe dzięki Insitux, ponieważ umożliwia on gromadzenie danych na dużą skalę z tysięcy kryształów białek w temperaturze pokojowej.
Dzięki tym nowym możliwościom, w tym krystalografii, systemy wrażliwe na światło mogą być uruchamiane wewnątrz urządzenia, a system obojętny na światło może być badany, jeśli urządzenie kryształ po krysztale zostanie przekształcone w wypływy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół demonstruje krystalizację białek na urządzeniu przypominającym chip do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej. Urządzenie kryształ na krysztale umożliwia wzrost kryształów białek na pojedynczym krysztale kwarcu, umożliwiając zautomatyzowaną zbiórkę danych w temperaturze pokojowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Krystalizacja białek
- Dyfrakcja rentgenowska
- Zautomatyzowana zbiórka danych
Tło
- Kryształy białek mogą być hodowane na urządzeniach kryształ na krysztale.
- Dyfrakcja rentgenowska w temperaturze pokojowej jest kluczowa dla badania funkcji białek.
- Stany konformacyjne białek mogą być uchwycone bez kriokrystalografii.
- Ta metoda może być zastosowana do badania procesów sygnałowych indukowanych światłem.
Cel badania
- Ustawienie krystalizacji białek na urządzeniach przypominających chip.
- Przeprowadzenie zautomatyzowanej seryjnej zbiórki danych w temperaturze pokojowej.
- Ułatwienie badania dynamiki i funkcji białek.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie urządzeń kryształ na krysztale do krystalizacji.
- Zautomatyzowana zbiórka tysięcy obrazów dyfrakcyjnych.
- Techniki dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej.
- Analiza stanów konformacyjnych białek.
Główne wyniki
- Udane wyhodowanie kryształów białek na urządzeniach.
- Zbiórka rozległych danych dyfrakcyjnych bez kontaktu fizycznego.
- Demonstracja skuteczności badań w temperaturze pokojowej.
- Wgląd w działania białek i zmiany podczas procesów sygnałowych.
Wnioski
- Urządzenie kryształ na krysztale jest skuteczne w krystalizacji białek.
- Dyfrakcja rentgenowska w temperaturze pokojowej dostarcza cennych informacji.
- Ta metoda może zwiększyć zrozumienie dynamiki białek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Studying protein dynamics at physiological temperatures is critical for understanding functional mechanisms in drug discovery. This platform enables room-temperature X-ray diffraction without crystal manipulation, supporting the capture of conformational states relevant to target validation. It provides a scalable approach to generate high-quality structural data for mechanistic de-risking in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of protein functional states under near-physiological conditions to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Reduces need for cryogenic workflows, simplifying structural analysis of dynamic targets.
- Predictive Value: Facilitates observation of light-induced or redox-driven conformational changes relevant to signaling pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces diffraction-quality crystals directly on chip, eliminating transfer steps that can compromise sample integrity.
- Operational Value: Allows hundreds to thousands of crystals to be screened in an automated, label-free manner.
- Assay Readiness: Generates standardized, diffraction-ready samples for high-throughput structural interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports structural follow-up of hits from phenotypic screens by providing atomic-level insights into mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Enables correlation of structural states with functional outputs in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Improves target validation by revealing conformational ensembles that inform drug binding modes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing structural data that informs mechanistic understanding without perturbing native-state dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven structural biology by enabling time-resolved or condition-specific data collection.
- Screening: Delivers diffraction data from native-state crystals grown in situ, enhancing reliability of structural readouts.
- Analytics: Provides electron density maps and difference maps that quantify structural changes upon perturbation.
- Translational Research: Connects structural observations to functional assays through correlated light- or redox-induced changes.
- Enterprise Reuse: Devices can be replicated across projects and conditions, serving as a structural screening platform.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Captures protein dynamics at room temperature, reducing risk of cryo-induced artifacts in structural interpretation.
- Operational Value: Eliminates crystal harvesting and mounting, increasing throughput and reducing sample loss.
- Strategic Value: Enables rapid iteration between functional and structural assays for iterative design cycles.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target mechanism, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallization, X-ray diffraction, and optical microscopy.
- Depends on access to synchrotron beamlines capable of serial Laue diffraction and fast detectors.
- Necessitates standardized crystallization conditions and device handling protocols across teams.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of chamber dimensions and surface properties.
- Practical limitation: Data quality depends on crystal size and diffraction limit, which varies by target.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Device Pre‐Assembly, Sample Loading, and Device Assembly
2:36
Device Storage, Crystallization Optimization, and Calibration
3:42
Optical Scanning
4:59
X‐Ray Diffraction
5:34
Results: On‐Chip Protein Crystallization Platform for Automated Serial Diffraction Collection
6:45
Conclusion
