Name: Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj obrazowanie arkuszem świetlnym w celu badania struktur mięśnia sercowego u gryzoni. Ta metoda umożliwia analizę mikrostruktur serca bez fizycznego cięcia, zapewniając izotropową rozdzielczość na poziomie mikrometrowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy naszą wdzięczność grupie dr Erica Olsona z UT Southwestern Medical Center za hojne podzielenie się modelami zwierzęcymi. Doceniamy wszystkie konstruktywne uwagi dostarczone przez członków D-inkubatora na UT Dallas. Praca ta była wspierana przez NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) i program UT Dallas STARS (Y.D.).

Protokoły i eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone pod nadzorem Instytucjonalnego Komitetu Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego w Dallas (IACUC #21-03). W badaniu wykorzystano myszy C57BL6, w tym noworodki w 1. dobie po urodzeniu (P1) oraz dorosłe osobniki w wieku 8 tygodni. Nie zaobserwowano różnic między samcami a samicami. Wszystkie procesy pozyskiwania danych i postprocesowania obrazów zostały wykonane przy użyciu oprogramowania open-source lub platform z licencjami badawczymi lub edukacyjnymi. Zasoby są dostępne od autorów na uzasadnioną prośbę.
1. Przygotowanie próbek i utrwalanie tkanek (6 - 10 dni)
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie roztwory chemiczne w Tabela materiałów wymagane dla metody przejrzyszczania tkanek przed rozpoczęciem procedury przejrzyszczania tkanek. 
	UWAGA: Wszystkie procedury należy przeprowadzać w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w szczególności podczas pracy z substancjami toksycznymi.</li>
	<li>Uśmierć zwierzęta za pomocą CO2 poprzez umieszczenie ich w CO2 komorę w wybranych punktach czasowych, takich jak P1 i 8 tydzień, w celu pobrania całego serca, a następnie zanurzyć świeżo wyizolowane serce w temperaturze pokojowej (RT) w 0,2 M KCl, aby zatrzymać je w fazie rozkurczu16.</li>
	<li>Utrwal serce, zanurzając je w 4% paraformaldehydzie (PFA) w 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), przy łagodnym wytrząsaniu na rotatorze przez noc, aby zachować anatomię serca w 4 °Cpatrz Tabela 1. 
	OSTRZEŻENIE: PFA jest toksycznym odczynnikiem chemicznym; procedurę należy przeprowadzać pod wyciągiem (dygestorium).</li>
	<li>Przemyć serce w 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 30 min, powtórzyć 3 razy. 
	UWAGA: Opcjonalnie: Osadź serce w żelu agarozowym, aby stworzyć zespół serca dla systemu LSM zbudowanego na zamówienie w kroku 2, zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1% roztwór agarozy, rozpuszczając agarozę w PBS, a następnie podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej do czasu całkowitego rozpuszczenia. Wlej roztwór do formy, aby utworzyć warstwę dolną, i odstaw do momentu, aż roztwór ochłodzi się do 40 °C.</li>
		<li>Umieść serce w formie i wypełnij ją żelem agarozy, aż do jego stężenia. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z żelu agarozy, aby zminimalizować liczbę artefaktów w obrazowaniu. 
		UWAGA: Zatapianie próbki zmniejsza ryzyko potencjalnego uszkodzenia anatomii serca podczas montowania. 
		OSTRZEŻENIE: Należy zastosować agarozę niskotopliwą i unikać bezpośredniego umieszczania serca w podgrzanej agarozie, aby zminimalizować ryzyko narażenia próbki na wysokie temperatury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnij serce, stosując gradienty metanolu zmieszanego z wodą dejonizowaną (Rycina 1B), przetwarzając przez sekwencyjne stężenia 20%, 40%, 60%, 80% i 100%, zgodnie z opisem w Tabela 1Powtórzyć czynność raz, używając świeżego 100% metanolu, aby zapewnić całkowite odwodnienie. Odwadzać serca noworodków myszy przez 1 h w każdej mieszaninie metanolu z wytrząsaniem. W przypadku serc 8-tygodniowych myszy oraz serc szczura wydłużyć czas inkubacji do 2 h. 
	UWAGA: Metanol jest substancją lotną, drażniącą i łatwopalną.</li>
	<li>Wymień methanol i chłodź serce w świeżym, 100% methanolu przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wymień roztwór i odbarw serce za pomocą 5% nadtlenku wodoru (H2O2) w metanolu, stosując stosunek objętości 1:5 (30% H2O2 do 100% metanolu) przez noc w temperaturze 4 °C aby usunąć pigmenty. 
	UWAGA: Usunięcie pigmentów pozwala zminimalizować absorpcję fotonów, co prowadzi do poprawy jakości obrazu i redukcji artefaktów.</li>
	<li>Wymień roztwór i inkubuj serce w 100% metanolu przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przeprowadź delipidację serca w roztworze zawierającym 66% dichlorometanu (DCM) i 33% metanolu przez 3 h przy jednoczesnym wstrząsaniu. Upewnij się, że pod koniec tego etapu serce opadło na dno probówki. W przeciwnym razie wymień roztwór (66% DCM / 33% metanolu) i wydłuż czas inkubacji (np. o kolejną godzinę), aby uzyskać pełną delipidację. Szybko przenieś serce do świeżego roztworu, aby zapobiec wysuszeniu, ponieważ DCM jest substancją bardzo lotną. 
	UWAGA: Do przeprowadzenia eksperymentu należy używać naczyń z polipropylenu lub szkła, ponieważ DCM nie jest kompatybilny z polistyrenem.</li>
	<li>Do wyrównania współczynnika załamania światła (RI = 1,56) należy wykorzystać eter dibenzylu (DBE). W przypadku serc noworodków myszy proces wyrównywania współczynnika załamania trwa 2 dni, natomiast w przypadku serc myszy w wieku 8 tygodni trwa on 5 dni przy łagodnym wstrząsaniu. Należy wymieniać DBE na świeży i przedłużyć czas inkubacji, aż serce stanie się całkowicie przezroczyste. 
	OSTRZEŻENIE: DBE jest substancją niebezpieczną. Należy unikać jakiegokolwiek kontaktu ze skórą.</li>
</ol>
2. Montowanie próbek (1 dzień)
UWAGA: W przypadku użycia komercyjnego systemu LSM należy postępować zgodnie z protokołem firmy dotyczącym unieruchomienia serca i pominąć kroki 2.1 – 2.9.
<ol>
	<li>Wykonaj komorę oraz uchwyt odporny na roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła (np. DBE w dostosowanej metodzie iDISCO), korzystając z drukarki 3D i materiałów Onyx (Rysunek 2A)16.</li>
	<li>Przymocuj magnes do dna komory, aby ułatwić szybkie połączenie i dokładną lokalizację w systemie LSM (Rysunek 2B).</li>
	<li>Przymocuj do komory szkiełka nakrywowe o wymiarach 25 mm x 50 mm x 0,17 mm, używając przezroczystego kleju silikonowego, a następnie zweryfikuj szczelność komory, wypełniając ją DBE i sprawdzając występowanie wycieków po 1 dniu.</li>
	<li>Wykonaj uchwyt zaciskowy za pomocą drukarki 3D i przymocuj magnes do montażu zespołu serca wewnątrz komory (Rysunek 2C) lub wprowadź igłę w żel agarozowy w celu zamocowania zespołu serca.</li>
	<li>Opracuj własny system LSM, wykorzystując soczewkę cylindryczną i lasery DPSS (diode-pumped solid-state) z ciągłą falą, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami16,22. Użyj długości fali wzbudzenia 532 nm do rejestracji autofluorescencji mięśnia sercowego (Rysunek 2D).</li>
	<li>Zamocuj komorę na stole 6-wymiarowym i znajdź optymalną pozycję, w której komora jest prostopadła do kierunku propagacji lasera.</li>
	<li>Użyj magnetycznego uchwytu zaciskowego, aby umieścić próbkę na środku komory, a następnie połącz uchwyt z 4-wymiarowym sterowanym silnikowo stołem (X, Y, Z i Yaw; Rysunek 2D).</li>
	<li>Zanurz zespół serca w komorze wypełnionej DBE, korzystając ze sterowanego silnikowo stołu, i określ zakres skanowania wzdłuż osi detekcji (kierunek Z).</li>
	<li>Wyznacz prędkość skanowania (Vz) silnika w kierunku Z na podstawie wielkości kroku (S) i czasu akwizycji obrazu (T), stosując poniższy wzór: 
	<img alt="Wzór obliczenia prędkości, Vz=S/T, równanie." src="/files/ftp_upload/66707/66707eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	UWAGA: Zależność między wielkością kroku a rozdzielczością osiową systemu obrazowania jest zgodna z twierdzeniem Nyquista-Shannona o próbkowaniu. Na przykład wielkość kroku ustawiono na 1 µm, biorąc pod uwagę, że rozdzielczość osiowa wynosiła 2,91 µm, jak wskazano w poprzednim raporcie16.</li>
	<li>Aby zweryfikować rozdzielczość przestrzenną i zminimalizować potencjalne problemy z nieprzezroczystością na różnych głębokościach, zmierz funkcję rozproszenia punktowego (PSF) systemu, obrazując fluorescencyjne kuleczki o średnicy 0,53 µm rozcieńczone w 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia w stężeniu 1:1,5 x 105. Oblicz PSF dla całej próbki, mierząc pełną szerokość połówki maksymalnej (FWHM)16.</li>
</ol>
3. Szycie obrazu (4-8 h)
<ol>
	<li>Oblicz liczbę kafelków potrzebnych do pokrycia całego serca myszy, biorąc pod uwagę ograniczone pole widzenia (FOV). Dla każdego kafelka wymiary odpowiadają FOV systemu LSM. Na przykład noworodkowe serce myszy o wymiarach przekroju 3 x 3,6 mm2 wymaga 2 x 2 kafelków do pokrycia w dostosowanym systemie LSM (Rycina 3A). W przeciwieństwie do tego, serce 8-tygodniowej myszy o wymiarach 5 x 8 mm2 wymaga 3 x 4 kafelków, aby pokryć całą strukturę serca (Rycina 3B). 
	UWAGA: Szycie obrazów (stitching) jest wymagane, jeśli konwencjonalny system LSM ma ograniczone FOV podczas obrazowania całego serca.</li>
	<li>Przejmij obrazy serca, zaczynając od kafelka 1, czyli kafelka w lewym górnym rogu serca (Rycina 3A-B).</li>
	<li>Sekwencyjnie przejmij obrazy pozostałych kafelków z 10% zakładką między kolejnymi kafelkami, aż do pokrycia całego serca, jak zilustrowano na Rycynie 3C.</li>
	<li>Pobierz i zainstaluj oprogramowanie open-source Fiji23. Pobierz i zainstaluj wtyczkę do Fiji, BigStitcher24.</li>
	<li>Przejdź do menu Help, wybierz Update, następnie Manage update site i zaznacz BigStitcher. Następnie kliknij Close, a potem Apply changes. Po zakończeniu pobierania wtyczki zrestartuj oprogramowanie Fiji.</li>
	<li>Otwórz wtyczkę BigStitcher i zaimportuj wszystkie niezbędne kafelki z katalogu plików obrazów. Zapisz zestaw danych jako plik HDF5.</li>
	<li>Uporządkuj kafelki, wybierając Move Tile By Regular Grid, zaznacz wzór użyty do przesuwania serca i wybierz 10% zakładkę między każdym kafelkiem. Zszyj kafelki, korzystając z opcji Stitching Wizard.</li>
	<li>Wyeksportuj zszyte dane za pomocą funkcji Image Fusion, aby wygenerować plik tiff.</li>
</ol>
4. Dekonwolucja wielowymiarowa (5 dni)
<ol>
	<li>Wykorzystaj fluorescencyjne kuleczki do rejestracji obrazów w celu rekonstrukcji wielokątnej wzdłuż serca (Rysunek 3D).
	<ol>
		<li>Przygotuj żywicę25, mieszając eter diglicydylowy bisfenolu A (D.E.R. 332), izoforonodiaminę, 5-amino-1,3,3-trimetylocykloheksanometylaminę (IPDA) oraz eter diglicydylowy glikolu polipropylenowego (D.E.R 736) w stosunku objętościowym 4:1:1.</li>
		<li>Odwirować 10 µL fluorescencyjnych kuleczek przy 161 x g przez 5 min i dodać 20 µL metanolu, aby zastąpić roztwór konserwujący kuleczki. Powtórzyć czynność 3 razy.</li>
		<li>Przygotować 10 mL roztworu o stężeniu kuleczek 1:1 x 105, mieszając roztwór kuleczek w metanolu z żywicą przygotowaną w kroku 4.1.1.</li>
		<li>Odpowietrzyć roztwór w komorze próżniowej przez 3 h, aby usunąć pęcherzyki powietrza i bąbelki.</li>
		<li>Wlać roztwór do formy silikonowej lub plastikowej słomki do napojów i odczekać od 2 do 3 dni do jego utwardzenia. Po 1 dniu, zanim żywica całkowicie stwardnieje, umieścić szklaną rurkę wewnątrz formy i odczekać, aż rurka przylgnie do żywicy. Wyjąć żywicę z formy wraz z rurką szklaną (Rysunek 3D).</li>
		<li>Umieścić serce w szklanej rurce, wypełnić ją DBE i zamontować rurkę szklaną w komorze wypełnionej DBE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechwycić sekwencyjne obrazy serca myszy wraz z kuleczkami z oświetlonego przekroju, przesuwając zespół serca wzdłuż osi detekcji (oś Z; Rysunek 3E-F). 
	UWAGA: W kroku 3 zaimplementować zszywanie obrazów (stitching), aby wygenerować poszczególne stosy obrazów, jeśli rozmiar serca przekracza pole widzenia (FOV).</li>
	<li>Obrócić serce myszy o 60° wzdłuż osi Y, aby przechwycić kolejne stosy pod różnymi kątami, tj. 0°, 60°, 120°, 180°, 240° i 300° (Rysunek 3E-F).</li>
	<li>Otworzyć wtyczkę BigStitcher i zaimportować wszystkie obrazy z katalogu plików obrazów. Zapisać zbiór danych jako plik HDF5.</li>
	<li>Wybrać opcję Detect Interest Points i ręcznie zaznaczyć kuleczki istotne dla rejestracji.</li>
	<li>Wybrać model transformacji Affine dla rejestracji. Wybrać Point Spread Function i przypisać PSF do wszystkich widoków.</li>
	<li>Kliknąć Multiview Deconvolution i wybrać typ iteracji Efficient Bayesian. Zdefiniować liczbę iteracji jako 10 i uruchomić proces26.</li>
	<li>Kliknąć Image Fusion, aby wyeksportować plik tiff. 
	UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje na temat dekonwolucji wielokątnej można znaleźć w innych raportach lub protokołach24,27,28.</li>
</ol>
5. Sprzęt systemu arkusza światła z przesuwaniem osiowym (1 dzień)
<ol>
	<li>Zainstaluj elektryczną soczewkę regulowaną (ETL) w płaszczyźnie Fouriera soczewki cylindrycznej (CL)27 (Rysunek 2D), aby skanować wiązkę laserową osiowo14. Upewnij się, że interfejs cieczy w ETL jest poziomy, aby zapobiec zniekształceniom czoła fali wywołanym przez grawitację. Precyzyjnie wyrównaj ETL, aby zminimalizować decentrację wiązki i aberracje optyczne wyższego rzędu30.</li>
	<li>Zainstaluj kartę DAQ w stacji roboczej i podłącz kabel BNC do karty DAQ, aby zsynchronizować czas ekspozycji kamery ze skanowaniem ETL.</li>
	<li>Otwórz obudowę sterownika ETL i zdejmij pokrywę (Rysunek 4).</li>
	<li>Przylutuj przewód sygnałowy kabla BNC do pinu Analog in B, zgodnie z oznaczeniem na dole płytki PCB (Rysunek 4).</li>
	<li>Przylutuj przewód uziemiający kabla BNC do pinu GND; następnie podłącz drugi koniec kabla BNC do wyjścia AO (Analog Output) w karcie DAQ (Rysunek 4).</li>
	<li>Podłącz sterownik ETL do portu USB stacji roboczej, połącz sterownik z ETL za pomocą kabla Hirose i zainstaluj oprogramowanie Lens Driver Controller Software.</li>
	<li>Zmień tryb pracy (Operation mode) w oprogramowaniu Lens Driver Controller Software na Analog, aby sterować ETL za pomocą wyzwalacza generowanego przez kartę DAQ.</li>
	<li>W oprogramowaniu kamery sCMOS przełącz tryb przechwytywania (Capture mode) na External (Light-sheet). Upewnij się, że kierunek skanowania aktywnych pikseli jest prostopadły do kierunku skanowania laserowego, aby wspomóc synchronizację.</li>
	<li>Podłącz zewnętrzny port wyzwalacza z tyłu kamery sCMOS do wyjścia AO karty DAQ za pomocą kabla BNC (Rysunek 4).</li>
</ol>
6. Synchronizacja systemu światłowodowego z przesunięciem osiowym (7 dni)
<ol>
	<li>Zdefiniuj czas ekspozycji na podstawie dopuszczalnego stosunku sygnału do tła (SBR), który dla proponowanego badania wynosi co najmniej 10. Zwiększ czas ekspozycji, jeśli SBR jest niższy niż 10. 
	UWAGA: Czas ekspozycji w zakresie od 10 do 50 ms zapewnia dopuszczalny SBR w tym projekcie.</li>
	<li>Zdefiniuj czas akwizycji obrazu (T) oraz odstęp linii (L) na podstawie czasu ekspozycji (E) dla kamery oraz częstotliwości ETL (f), korzystając z następujących równań: 
	<img alt="Wzór na okres T=1/2f; przedstawia zależność matematyczną; edukacyjne wyjaśnienie wzoru." src="/files/ftp_upload/66707/66707eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> 
	<img alt="Równowaga statyczna; wzór L=(T−E)/P; zwięzłe równanie; zastosowanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/66707/66707eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"> 
	Gdzie P oznacza liczbę kolumn pikseli w sensorze kamery. Parametry reprezentatywne dla odniesienia to odpowiednio f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms oraz L = 243 µs.</li>
	<li>W programie LabVIEW Trigger Generator.vi wygeneruj triggery prostokątne i trójkątne w celu synchronizacji (Rysunek 5). 
	UWAGA: Spersonalizowany program LabVIEW jest dostępny od autorów na uzasadnioną prośbę.</li>
	<li>Zamontuj koraliki fluorescencyjne rozcieńczone w 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia16 o stężeniu 1:1 x 103, aby zlokalizować pozycję przerwy wiązki na obrazie (Rysunek 6A).</li>
	<li>W programie zidentyfikuj punkty początkowy i końcowy wiązki lasera w polu widzenia (FOV), zmieniając napięcie w kierunku skanowania.</li>
	<li>Aby zsynchronizować kamerę sCMOS i ETL, zeskanuj wiązkę lasera wzdłuż osi X oraz aktywne piksele wzdłuż osi Y, aby wygenerować obraz 2D (Rysunek 6B). Jaśniejsze i ostrzejsze koraliki wzdłuż przekątnej obrazu wskazują na precyzyjną synchronizację między sCMOS a ETL. 
	UWAGA: Synchronizacja prędkości skanowania ETL i aktywacji pikseli sCMOS jest kluczowa dla jakości obrazu. Różne typowe błędy asynchroniczności podsumowano na Rysunku 6C-F.</li>
	<li>Po ustaleniu optymalnych parametrów synchronizacji, obróć kamerę sCMOS o 90° wokół osi Z, aby wyrównać kierunek aktywnych pikseli z kierunkiem skanowania lasera.</li>
	<li>Powtórz krok 2.10 i zmierz FWHM funkcji PSF. Zastosuj tę samą metodę, która została wskazana w poprzednim raporcie16; średnie rozdzielczości boczna i osiowa ASLM wynoszą odpowiednio 2,18 µm i 2,88 µm (Rysunek 7). 
	UWAGA: Jednorodne oświetlenie i rozdzielczość w całym polu widzenia FOV są możliwe do osiągnięcia w idealnych warunkach (Rysunek 7A-B). Asynchroniczna praca ETL z kamerą sCMOS, a także niewspółosiowość oświetlenia i detekcji, mogą prowadzić do niejednorodnej rozdzielczości przestrzennej (Rysunek 7C-D).</li>
	<li>W przypadku obrazowania serca, po wyrównaniu systemu i ustaleniu optymalnych parametrów synchronizacji systemu, przejdź do kroków od 2.6 do 2.9.</li>
</ol>

Light-Sheet Microscopy and Tissue Clearing for Comprehensive Cardiac Imaging

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Postęp w dziedzinie metod obrazowania, obliczeń i oczyszczania tkanek zapewnił niezrównaną możliwość dogłębnego zbadania struktury i funkcji serca. Ma to ogromny potencjał w zakresie pogłębienia naszej wiedzy na temat morfogenezy i patogenezy serca przy użyciu nienaruszonego modelu serca gryzonia. W przeciwieństwie do badań in vivo serca danio pręgowanego przy użyciu podobnego podejścia 40,41,42,43, integracja zaawansowanych technik LSM i metod oczyszczania tkanek pozwala nam przezwyciężyć wyzwania między rozdzielczością przestrzenną a głębokością penetracji podczas obrazowania modelu gryzoni 9,44. Techniki oczyszczania tkanek sprawiają, że serca stają się optycznie przezroczyste poprzez usuwanie lipidów i innych elementów rozpraszających światło, co umożliwia głębszą penetrację obrazowania45. W połączeniu z LSM jesteśmy w stanie zobrazować mięsień sercowy. Ta kombinacja zwiększa głębokość obrazowania i pozwala na obserwację skomplikowanej mikrostruktury mięśnia sercowego. Chociaż opracowano wiele metod oczyszczania18, dostosowaliśmy iDISCO20 tak, aby szybko uczyniło nienaruszone serce przezroczystym w porównaniu z innymi metodami oczyszczania tkanek15, dzięki czemu jest łatwo dostępne do obrazowania autofluorescencji mięśnia sercowego. W celu specyficznego znakowania fluorescencyjnego, oryginalne protokoły iDISCO i Adipo-Clear46 można połączyć z barwieniem immunologicznym w tym dostosowanym do potrzeb systemu obrazowania, pomimo dłuższej inkubacji. Tymczasem w proponowanym badaniu preferowane są metody, które zachowują endogenną fluorescencję i wymagają krótszego czasu przetwarzania. W przeciwieństwie do innych metod, ta platforma oferuje następujące zalety. Po pierwsze, wykorzystujemy dostosowany protokół iDISCO do oczyszczania tkanek, umożliwiając szybkie uczynienie serca przezroczystym w czasie krótszym niż 1 tydzień przy zachowaniu autofluorescencji mięśnia sercowego. Po drugie, włączamy metody obliczeniowe, takie jak łączenie obrazów i dekonwolucja wielu widoków, do tego uznanego systemu arkuszy świetlnych do obrazowania serca. Na koniec projektujemy i synchronizujemy system ASLM w celu zwiększenia rozdzielczości osiowej w dużym polu widzenia, umożliwiając wieloskalowe obrazowanie i analizę zagęszczenia mięśnia sercowego i trabekulacji w rozdzielczości bliskiej izotropowej.
Aby uchwycić obrazy serca modelu gryzonia, przedstawiliśmy cztery podejścia oparte na LSM: i) konwencjonalna metoda do celów przesiewowych19, ii) łączenie obrazów, iii) dekonwolucja wielowidokowa oraz iv) skanowanie ASLM. Biorąc pod uwagę różnice w wielkości serca w różnych modelach, staraliśmy się rozwiązać problem fundamentalnego kompromisu w zakresie rozdzielczości przestrzennej, szybkości akwizycji i pola widzenia. Podczas gdy łączenie obrazów umożliwia uzyskanie dużego pola widzenia z obniżoną rozdzielczością przestrzenną, połączenie go z dekonwolucją wielu widoków lub ASLM zapewnia rozdzielczość niemal izotropową w całym rozszerzonym polu widzenia, aby pokryć całe dorosłe serce myszy. Co więcej, integracja tych metod poprawia jakość obrazu i kontrast w tkance głębokiej, umożliwiając kompleksową cyfrową rekonstrukcję modeli 3D mikrostruktur, takich jak trabekulacja mięśnia sercowego i zagęszczenie wewnątrz komór. Jednak zalew zbiorów danych, znaczne koszty przetwarzania obliczeniowego, potrzeba precyzyjnej rejestracji obrazu oraz potencjał artefaktów w dekonwolucji wielu widoków i łączeniu obrazów utrudniają ich szerokie zastosowanie. Chociaż ASLM jest nową alternatywą, złożoność synchronizacji systemu, strategie skanowania laserowego i poleganie na przezroczystości tkanek stanowią wyzwania, które mogą wpłynąć na niezawodność systemu i zwiększyć ryzyko fotouszkodzenia serca.
Podsumowując, ta metodologia, obejmująca obrazowanie LSM i oczyszczanie tkanek, stanowi punkt wyjścia do badania struktury serca od noworodków do dorosłych. Ma potencjał do lokalizacji rozmieszczenia wyspecjalizowanych linii serca i ich funkcji podczas rozwoju serca47. Wraz z rozwojem analizy obliczeniowej dostosowanej do zastosowań kardiologicznych 6,48,49,50,51,52,53 ramy te można rozszerzyć w celu zbadania procesów przebudowy serca, szczególnie w odpowiedzi na zawał mięśnia sercowego. Ostatecznie, ta holistyczna strategia ma potencjał, aby rozwikłać mechanizm leżący u podstaw morfogenezy serca i przyspieszyć rozwój interwencji terapeutycznych.

Niewydolność serca pozostaje główną przyczyną śmiertelności na całym świecie, głównie z powodu braku zdolności regeneracyjnych dojrzałych kardiomiocytów1. Skomplikowana architektura serca odgrywa kluczową rolę w jego funkcjonowaniu i zapewnia wgląd w procesy rozwojowe. Dogłębne zrozumienie struktury serca jest niezbędne do wyjaśnienia podstawowych procesów morfogenezy i przebudowy serca w odpowiedzi na zawał mięśnia sercowego. Niedawny postęp wykazał, że nowonarodzone myszy mogą przywrócić funkcję serca po urazie, podczas gdy dorosłe myszy nie mają takiej zdolności regeneracyjnej2. Stanowi to podstawę do badania wskazówek związanych z nieprawidłowościami strukturalnymi i funkcjonalnymi w modelach mysich. Tradycyjne metody obrazowania, takie jak mikroskopia konfokalna, mają ograniczenia techniczne, w tym ograniczoną głębokość penetracji, powolny schemat skanowania punktowego i uszkodzenia fotograficzne spowodowane długotrwałą ekspozycją na światło laserowe. Utrudniają one kompleksowe trójwymiarowe (3D) obrazowanie nienaruszonego serca. W tym kontekście, mikroskopia arkuszowa światła (LSM) jawi się jako potężne rozwiązanie, oferujące zalety szybkiego obrazowania, zmniejszone uszkodzenia fotograficzne i wyjątkowe możliwości sekcji optycznej3,4,5. Unikalne cechy LSM sprawiają, że jest to obiecująca metoda przezwyciężania ograniczeń konwencjonalnych technik, zapewniająca bezprecedensowy wgląd w procesy rozwoju i przebudowy serca6,7,8.
W tym protokole wprowadzamy strategię obrazowania, która łączy zaawansowany LSM z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek9, umożliwiając obrazowanie całych serc myszy bez potrzeby specjalnego etykietowania i mechanicznego cięcia. Ponadto proponujemy, że konwencjonalne obrazowanie LSM można udoskonalić za pomocą dekonwolucji wielowidokowej10 lub technik mikroskopii arkuszowej (ASLM) z osiowym przemiataniem11,12,13,14,15 w celu poprawy rozdzielczości osiowej. Ponadto integracja łączenia obrazów z którąkolwiek z tych metod może skutecznie przezwyciężyć kompromis między rozdzielczością przestrzenną a polem widzenia (FOV), przyspieszając w ten sposób obrazowanie serc dorosłych myszy. Włączenie wielu metod oczyszczania tkanek, w tym metod hydrofobowych, hydrofilowych i opartych na hydrożelu, umożliwia głębszą penetrację światła w celu uchwycenia morfologii całego serca16,17,18,19.
Chociaż wiele metod oczyszczania jest kompatybilnych z obecnymi systemami LSM, celem jest zminimalizowanie rozpraszania fotonów i zwiększenie penetracji światła w tkankach, takich jak serce, poprzez zastąpienie lipidów medium ściśle odpowiadającym jego indeksowi załamania światła. iDISCO zostało wybrane jako reprezentatywne20,21 i przystosowane do obrazowania autofluorescencyjnego w tym protokole ze względu na szybkie przetwarzanie i wysoką przezroczystość ( <silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Reasumując, połączenie zaawansowanego podejścia LSM z technikami oczyszczania tkanek stanowi obiecujące ramy do rozwikłania skomplikowanej anatomii serca w sercach gryzoni, co ma znaczący potencjał w zakresie pogłębiania naszej wiedzy na temat morfogenezy i patogenezy serca.

<table><tbody><tr><td><silny>1% Agaroza< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td><silny>Chemikalia do oczyszczania tkanek&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-amino-1,3,3-trimetylocykloheksanoamina, mieszanina cis i trans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118184</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&trade; 332</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31185</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&trade; 736</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31191</td><td></td></tr><tr><td>Eter dibenzylowy (DBE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne</td><td>Spherotech</td><td>FP-0556-2</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216736</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>47392</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79383</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie i algorytmy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2021.2</td><td></td></tr><tr><td>BigStitcher</td><td>H&ouml; rl et al.22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>Schindelin et al.20</td><td>1.54f</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>4.6.1.2</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>2017 SP1</td><td></td></tr><tr><td>Kluczowe elementy dostosowanego systemu arkuszy świetlnych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Korpus z zoomem 0,63 - 6,3x</td><td>Olympus</td><td>MVX-ZB10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 10X Illumination</td><td>Nikon</td><td>MRH00105</td><td></td></tr><tr><td>1X Obiektyw detekcyjny</td><td>Olympus</td><td>MV PLAPO 1X/0.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>473nm DPSS Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-PFM-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>532nm DPSS</td><td>Laser Laserglow Technologies</td><td>LRS-0532-PFM-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>589&thinsp; nm DPSS laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0589-GFF-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>Złącze BNC</td><td>National Instrument</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka cylindryczna</td><td>Thorlabs</td><td>ACY254-050-A</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik silnika prądu stałego, 4 osie</td><td>Physik Instrumente</td><td>C-884.4DC</td><td></td></tr><tr><td>ETL</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>ETL ETL</td>Sterownik obiektywu <td>Optotune</td><td>CAB-6-300</td><td></td></tr><tr><td>ETL Filtr</td><td>Optotune</td><td>EL-E-4i</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Filtr Chroma</td><td>ET525/30</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Chroma</td><td>ET585-40</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Chroma</td><td>ET645-75</td><td></td></tr><tr><td>Koło filtrów&nbsp;</td><td>Migawka Instrument</td><td>LAMBDA 10-B</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik translacyjny</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.20DG10</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik translacyjny</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.40DG10</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik translacyjny</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-403.4PD</td><td></td></tr><tr><td>NI wielofunkcyjny I/O</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>Kamera sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>Silnik krokowy</td><td>Pololu</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw tubusu</td><td>Olympus</td><td>MVX-TLU</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Mikroskopia arkuszowa (LSM) odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu skomplikowanej trójwymiarowej (3D) struktury serca, dostarczając kluczowych informacji na temat podstawowej fizjologii serca i patologicznych reakcji. Niniejszym zagłębiamy się w rozwój i implementację techniki LSM w celu wyjaśnienia mikroarchitektury serca w modelach mysich. Metodologia integruje dostosowany system LSM z technikami oczyszczania tkanek, łagodząc rozpraszanie światła w tkankach serca w celu obrazowania wolumetrycznego. Połączenie konwencjonalnego LSM z łączeniem obrazów i podejściami do dekonwolucji wielowidokowej pozwala na uchwycenie całego serca. Aby rozwiązać problem nieodłącznego kompromisu między rozdzielczością osiową a polem widzenia (FOV), wprowadzamy metodę mikroskopii arkuszowej z osiowo zamiatanym światłem (ASLM), aby zminimalizować nieostre światło i równomiernie oświetlić serce w całym kierunku propagacji. Tymczasem metody oczyszczania tkanek, takie jak iDISCO, poprawiają penetrację światła, ułatwiając wizualizację głębokich struktur i zapewniając kompleksowe badanie mięśnia sercowego w całym sercu. Połączenie proponowanego LSM i metod oczyszczania tkanek stanowi obiecującą platformę dla naukowców w zakresie rozwiązywania struktur serca w sercach gryzoni, posiadając ogromny potencjał w zrozumieniu morfogenezy i przebudowy serca.

Wykazano, że LSM sprzyja badaniom kardiologicznym31,32,33,34,35,36,37 ze względu na minimalne ryzyko uszkodzeń fotochemicznych, wysoką rozdzielczość przestrzenną oraz możliwość sekcjonowania optycznego, w przeciwieństwie do innych metod obrazowania optycznego, takich jak obrazowanie w jasnym polu i techniki skanowania punktowego6,8,38,39,40. Aby zatem lepiej zrozumieć trójwymiarową architekturę mięśnia sercowego, opracowaliśmy protokół oparty na podstawowych podejściach, obejmujący dostosowane utlenianie i wyjaśnianie tkanek iDISCO, stitching obrazów, dekonwolucję wielowidokową oraz ASLM. Choć przedstawiliśmy wyniki z wykorzystaniem modeli mysich, należy zaznaczyć, że szczury i inne modele gryzoni również nadają się do proponowanych metod. Dostosowany protokół wyjaśniania tkanek umożliwia uczynienie serca myszy P1 przezroczystym w ciągu 4 dni, a serca myszy 8-tygodniowej w ciągu 7 dni (Rysunek 1B). Krok ten służy jako punkt wyjścia do minimalizacji absorpcji i rozpraszania fotonów w nienaruszonym sercu. Dekonwolucja wielowidokowa pozwala na poprawę rozdzielczości osiowej poprzez łączenie obrazów z wielu perspektyw w jeden model. Po sekwencyjnym zarejestrowaniu obrazów z 6 widoków tego samego serca, metoda dekonwolucji wielowidokowej pozwala uzyskać rozdzielczość niemal izotropową, wynoszącą 4,68 µm w płaszczyźnie bocznej i 5,06 µm w osiowej, po 15 h obliczeń (Rysunek 8A). Aby uniknąć złożoności obliczeniowej, dodatkowo dostosowaliśmy ASLM oparty na ETL do obrazowania serc myszy od okresu noworodkowego do dorosłego. Metoda ta pozwala na skanowanie mięśnia sercowego za pomocą silnie skupionej wiązki laserowej, co minimalizuje tło poza ogniskową i zwiększa kontrast obrazu w porównaniu do konwencjonalnych metod LSM (Rysunek 8B). Przy obecnej konstrukcji ASLM średnie rozdzielczości boczna i osiowa systemu wynoszą odpowiednio 2,18 µm i 2,88 µm, co umożliwia szczegółową analizę trabekulacji mięśnia sercowego w komorach. Ponadto stitching obrazów może być wykorzystywany samodzielnie lub w połączeniu z dekonwolucją wielowidokową lub ASLM w celu zwiększenia pola widzenia (FOV) dla większych próbek. Integracja stitchingu z ASLM pozwala na objęcie całego serca myszy 8-tygodniowej przy jednolitej rozdzielczości (Rysunek 8C), stanowiąc skuteczne rozwiązanie do badania przekroju całego serca.
<img alt="Schemat przejrzystości serca przedstawiający proces odwadniania, delipidacji i dopasowania współczynnika załamania światła w celu uzyskania przezroczystości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Proces przejrzystości tkanki. (A) Metoda hydrofobowa obejmuje odwadnianie tkanki, ekstrakcję lipidów oraz dopasowanie współczynnika załamania światła z użyciem eteru dibenzylowego (DBE) jako rozpuszczalnika organicznego. (B) Serce zanurza się w 4% roztworze formaldehydu (PFA), a następnie odwadnia przy użyciu gradientu mieszanin metanolu i wody dejonizowanej (DI). Serce odbarwia się za pomocą 5% H2O2 w metanolu w temperaturze 4 °C. Następnie przeprowadza się delipidację serca przy użyciu roztworu dichlorometanu (DCM) i metanolu, aż próbka opadnie na dno probówki. Na koniec serce inkubuje się w DBE w celu uzyskania pożądanego współczynnika załamania światła. Linie siatki 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu obrazowania optycznego z magnesem komory i soczewkami do badania oświetlenia serca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat mikroskopii z płaszczyzną światła przesuwaną osiowo (ASLM). (A) Dostosowana komora wydrukowana w 3D, (B) magnes komory, (C) uchwyt zaciskowy i (D) system ASLM. Skróty: CL: soczewka cylindryczna; ETL: elektronicznie regulowana soczewka; IL: soczewka oświetlająca; DL: soczewka detekcyjna; FW: koło filtrowe; TL: soczewka tubusowa. Rysunek zmodyfikowano na podstawie Ref16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ obrazowania serca myszy i kąty skanowania; schemat tomografii; analiza widoku przekroju." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Szycie obrazów i dekonwolucja wielowidokowa. (A-B) Szycie obrazów jest wykorzystywane do pokrycia całych serc myszy, przy czym każdy kafel posiada 10% zakładki pola widzenia (FOV) z sąsiednimi kafelkami. (C) Wzór ruchu serca myszy podczas szycia obrazów. (D) Na końcu szklanej rurki przymocowano koraliki fluorescencyjne w celu ułatwienia rejestracji obrazu, podczas gdy serce umieszczono wewnątrz szklanej rurki zawierającej DBE, co umożliwia jednoczesne obrazowanie serca myszy i koralików fluorescencyjnych. (E) Dekonwolucja wielowidokowa obejmuje akwizycję obrazów z sześciu różnych perspektyw, z których każda zbiera obrazy z unikalnych kierunków. (F) Surowe dane serca myszy P1 i koralików pod różnymi kątami: 0°, 60°, 120°, 180°, 240° i 300°. Paski skali: 500 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie opracowania16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu optycznego z kartą DAQ, złączem BNC, kamerą, ETL i sterownikami silników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schemat blokowy systemu ASLM. Wykorzystanie karty DAQ do synchronizacji ETL i kamery sCMOS. Obudowa sterownika ETL została otwarta w celu przylutowania przewodów sygnałowych i masy do płytki PCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat generatora przebiegów wyzwalających dla wzbudzenia optycznego z ustawieniami napięcia i wykresem przebiegów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Panel sterowania LabView. Panel sterowania LabVIEW służący do generowania sygnałów wyzwalających w celu synchronizacji ETL i aktywowanych pikseli kamery sCMOS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu skanowania laserowego; wizualizacja zmienności czasowej ETL i regulacji ogniskowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Synchronizacja ogniskowej płaszczyzny światła z aktywnymi pikselami. (A) Identyfikacja punktów początkowego i końcowego zakresu skanowania płaszczyzny światła jest realizowana poprzez konfigurację odpowiedniego napięcia wyzwalającego ETL. (B) Synchroniczny wynik dla kulek fluorescencyjnych jest widoczny wzdłuż przekątnej obrazu. (C-F) Niejednorodna rozdzielczość przestrzenna w całym FOV wynika z asynchronicznego działania ETL z kamerą sCMOS. ETL rozpoczyna skanowanie (C) później lub (D) wcześniej niż aktywacja pikseli. (E-F) Obszar ogniskowania nie jest równoległy do przekątnej obrazu, co wskazuje na niezgodność prędkości skanowania i aktywacji. ETL skanuje (E) szybciej lub (F) wolniej niż przesunięcie aktywnych pikseli w sCMOS. Pasek skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces mikroskopii skaningowej laserowej; schematy płaszczyzny ogniskowej, aktywnych pikseli i analizy intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Rozwiązywanie problemów z ASLM. (A) Arkusz światła jest umieszczony dokładnie w odległości ogniskowej soczewki detekcyjnej. ETL skanuje ognisko arkusza światła wzdłuż kierunku propagacji, synchronizując się z aktywnym pikselem sensora sCMOS. (B) Widok XY kulek fluorescencyjnych przy prawidłowym ustawieniu i synchronizacji ETL. (C-D) Wyniki obrazowania kulek fluorescencyjnych w płaszczyźnie ogniskowej i poza nią na przekrojach, wskazujące na rozregulowanie skanowania ETL względem propagacji lasera. Paski skali: 200 µm oraz 10 µm w powiększeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig07large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Anatomia serca w ASLM i LSM; mikroskopia z zaznaczonym przedsionkiem, komorami i siecią beleczek mięśniowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Obrazowanie arkuszem światła serc myszy. (A) Obraz z renderowaniem wolumetrycznym serca myszy P1 po dekonwolucji wielowidokowej, podkreślający trabekulację wewnątrz jamy komory. (B) Obrazy przekrojów poprzecznych serca 8-tygodniowej myszy uzyskane za pomocą konwencjonalnego LSM (lewo) i ASLM (prawo). Obrazy przedstawiono jako dane surowe. (C) Połączenie zszywania obrazów (stitching) i ASL M do obrazowania serca 8-tygodniowej myszy, obejmujące 12 kafelków ułożonych w 3 kolumny i 4 rzędy. Pasek skali: 500 µm. Skróty: LV: lewa komora, LA: lewy przedsionek, RV: prawa komora, RA: prawy przedsionek. Rycina została zmodyfikowana na podstawie Ref16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Procedura</td>
			<td>Czas (serce myszy P1)</td>
			<td>Czas (serce 8-tygodniowej myszy)</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Utrwalenie w 4% PFA</td>
			<td>Przez noc</td>
			<td>Przez noc</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="5">Przygotowanie próbek </td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Przemyć 1x PBS </td>
			<td>30 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Przemyć 1x PBS </td>
			<td>30 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Przemyć 1x PBS </td>
			<td>30 min</td>
			<td>30 min</td>
			<td>RT (transkrypcja odwrotna)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Zatopienie w żelu agarozowym </td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Inkubować w 20% metanolu i 80% wody dejonizowanej</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
			<td rowspan="6">Odwodnienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Inkubować w 40% metanolu i 60% wody dejonizowanej</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT (transkrypcja odwrotna)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Inkubować w 60% metanolu i 40% wody dejonizowanej</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Inkubować w mieszaninie 80% metanolu i 20% wody dejonizowanej</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT (odczynniky/transkrypcja odwrotna)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Inkubować w 100% metanolu</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Inkubować w świeżym, 100% metanolu</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT (transkrypcja odwrotna)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Inkubować w świeżym 100% metanolu</td>
			<td>10 min</td>
			<td>10 min</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="3">Depigmentacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Odbarwianie 5% H2O22O2metanol</td>
			<td>Przez noc</td>
			<td>Przez noc</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Inkubować w 100% metanolu</td>
			<td>1 h</td>
			<td>1 h</td>
			<td>RT (transkrypcja odwrotna)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Przeprowadzić delipidację w mieszaninie 66% DCM/33% metanolu na wytrząsarce</td>
			<td>3 h</td>
			<td>3 h</td>
			<td>RT</td>
			<td>Delipidacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Inkubować w DBE na wytrząsarce</td>
			<td>2 dni</td>
			<td>5 dni</td>
			<td>RT</td>
			<td>dopasowanie współczynnika załamania światła</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Zindywidualizowane kroki przejrzyszczania tkanek dla obrazowania autofluorescencji.

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Nasze badania mają na celu dostosowanie systemu obrazowania opartego na arkuszach świetlnych w celu zbadania struktur mięśnia sercowego nienaruszonego serca gryzonia na poziomie komórkowym. Opracowaliśmy przepływ pracy do badania nienaruszonego mięśnia sercowego z rozdzielczością izotropową na poziomie mikronów, od serca noworodka do dorosłego gryzonia. Nasze badanie wypełnia lukę w badaniu skomplikowanych mikrostruktur mięśnia sercowego, takich jak trabekulacja wewnątrz nienaruszonych komór z wysoką rozdzielczością przestrzenną.Ta strategia obrazowania stanowi punkt wyjścia do oceny mikrostruktury bez fizycznego krojenia, co prowadzi do lepszego zrozumienia rozwoju i przebudowy serca. Skoncentrujemy się na badaniu zmian strukturalnych mięśnia sercowego w odpowiedzi na uszkodzenie serca i przebudowę. Na początek umieść mysie serce zatopione w agarozie w roztworze 20% metanolu na jedną godzinę.Sekwencyjnie przenieś serce do rosnących stężeń metanolu, aby je odwodnić. Umieść roztwory z sercem na mikserze z częstotliwością 60 Hz podczas odwadniania. Przenieś odwodnione serce do świeżego roztworu 100% metanolu.Po zastąpieniu roztworu świeżym 100% metanolem umieść serce w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 10 minut. Teraz odessaj roztwór. Następnie dodaj 200 mililitrów 5% nadtlenku wodoru do metanolu, aby wybielić serce.Inkubuj serce w roztworze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś próbkę do 100% metanolu. Po inkubacji przenieść go do roztworu zawierającego 66% dichlorometanu i 33% metanolu.Serce powinno opaść na dno fiolki. Umieść próbkę w mieszalniku na trzy godziny, aby zapewnić całkowite zniszczenie serca. Na koniec inkubować próbkę w eterze dibenzoilowym w celu dopasowania współczynnika załamania światła.Tkanka serca myszy P1 stała się przezroczysta w ciągu czterech dni, podczas gdy ośmiotygodniowa mysz stała się przezroczysta w ciągu siedmiu dni. Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazu mikroskopu. Oblicz liczbę kafelków potrzebnych do pokrycia całego serca myszy.Uchwyć obrazy serca, zaczynając od pierwszego kafelka. Sekwencyjnie rób obrazy pozostałych płytek z 10% zachodzeniem na siebie kolejnych płytek, aż całe serce zostanie pokryte. Teraz otwórz wtyczkę BigStitcher i zaimportuj wszystkie niezbędne kafelki za pośrednictwem katalogu plików obrazów.Zapisz zestaw danych jako plik HDF5. Użyj funkcji Przenieś kafelek według zwykłej siatki, aby uporządkować płytki, a następnie wybierz wzór używany do przesuwania serca i wybierz 10% zachodzenia na siebie między każdą płytką. Zszyj płytki za pomocą opcji Kreator zszywania.Utwórz plik TIFF za pomocą narzędzia Image Fusion w celu wyeksportowania zszytych danych. Do dekonwolucji Multi-View próbki użyj koralików fluorescencyjnych do rejestracji obrazu Rekonstrukcji Multi-View wzdłuż serca. Zeskanuj zespół serca w poprzek osi wykrywania, aby uchwycić sekwencyjne obrazy serca myszy z podświetlonej sekcji.Obróć serce myszy o 60 stopni wzdłuż osi Y, aby uchwycić kolejne stosy pod różnymi kątami. Następnie otwórz wtyczkę BigStitcher i zaimportuj wszystkie obrazy za pośrednictwem katalogu plików obrazów. Zapisz zestaw danych jako plik HDF5.Wybierz, Wykryj punkty zainteresowania i ręcznie wybierz interesujące Cię koraliki do rejestracji. Wybierz model transformacji afinicznej do rejestracji i przypisz do PSF do wszystkich widoków. Kliknij Multi-View Deconvolution i wybierz typ iteracji jako Efficient Bayesian.Zdefiniuj liczbę iteracji jako 10 i wykonaj ją. Na koniec kliknij Image Fusion, aby wyeksportować plik TIFF. Metoda Multi-View Deconvolution Method osiągnęła rozdzielczość bliską izotropowi po 15 godzinach obliczeń.Mikroskopia świetlna oparta na ETL była w stanie zminimalizować nieostre tło i zwiększyć kontrast obrazu. Integracja zszywania z mikroskopią Axially-Swept Light-Sheet Microscopy pozwoliła na pokrycie całego ośmiotygodniowego serca myszy z jednolitą rozdzielczością. Aby rozpocząć, zainstaluj elektryczną soczewkę gramofonu lub ETL na płaszczyźnie Fouriera soczewki cylindrycznej.Otwórz obudowę sterownika ETL i zdejmij pokrywę. Podłącz sterownik ETL do portu USB stacji roboczej. Następnie podłącz sterownik do ETL za pomocą HIROSE.Następnie zainstaluj oprogramowanie kontrolera sterownika obiektywu. Zmień tryb pracy i oprogramowanie na Analog, aby sterować ETL za pomocą wyzwalacza generowanego z karty DAC. Przełącz tryb przechwytywania na Zewnętrzny w oprogramowaniu kamery sCMOS.Aby zsynchronizować system, zdefiniuj czas ekspozycji na podstawie akceptowalnego stosunku sygnału do tła. Generuj zarówno kwadratowe, jak i trójkątne wyzwalacze do synchronizacji w programie Lab View, Trigger Generator.vi. Zeskanuj wiązkę laserową wzdłuż osi X i aktywne piksele wzdłuż osi Y, aby wygenerować obraz 2D.Jaśniejsze i ostrzejsze koraliki wzdłuż przekątnej obrazu wskazują na precyzyjną synchronizację. Przejdź do obrazu serca.

light-sheet-imaging-to-reveal-cardiac-structure-in-rodent-hearts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Tutaj opisujemy przygotowanie żywotnych wycinków komorowych od dorosłych myszy i ich wykorzystanie do rejestracji potencjału czynnościowego elektrod ostrych. Te wielokomórkowe preparaty zapewniają zachowaną in vivo strukturę tkankową, co czyni je cennym modelem do badań elektrofizjologicznych i farmakologicznych in vitro.

Mysie plastry serca o krótkiej osi do badań elektrofizjologicznych

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół obrazowania do ilościowego oznaczania funkcji i morfologii serca za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości dla małych zwierząt. Pod uwagę brane są zarówno myszy, jak i szczury, omawiając różne wymagania dotyczące środków kontrastowych w tomografii komputerowej dla tych dwóch gatunków.

Pozytonowa tomografia emisyjna serca o wysokiej rozdzielczości/tomografia komputerowa dla małych zwierząt

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to rozwijająca się technologia umożliwiająca obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością i czułością na poziomie komórkowym. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję wizualną dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, obejmującą konfigurację systemu, jego kalibrację, typowe procedury eksperymentalne in vivo oraz schematy obrazowania funkcjonalnego.

Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Ta metoda opisuje użycie Kwantowej Mikrotomografii Komputerowej (MicroCT) do oceny morfologii, funkcji, perfuzji, metabolizmu i żywotności serca za pomocą jodowego środka kontrastowego u myszy z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Technika ta może być stosowana do nieniszczącego, wysokoprzepustowego, podłużnego obrazowania in vivo różnych zwierzęcych modeli chorób ludzkiego serca.

In vivo (in vivo) Ilościowa ocena struktury, funkcji, perfuzji i żywotności mięśnia sercowego za pomocą mikrotomografii komputerowej serca

Poznaj obrazowanie arkuszem świetlnym w celu badania struktur mięśnia sercowego u gryzoni. Ta metoda umożliwia analizę mikrostruktur serca bez fizycznego cięcia, zapewniając izotropową rozdzielczość na poziomie mikrometrowym.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Przeglądaj więcej filmów