Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Nasze badania mają na celu dostosowanie systemu obrazowania opartego na arkuszach świetlnych w celu zbadania struktur mięśnia sercowego nienaruszonego serca gryzonia na poziomie komórkowym. Opracowaliśmy przepływ pracy do badania nienaruszonego mięśnia sercowego z rozdzielczością izotropową na poziomie mikronów, od serca noworodka do dorosłego gryzonia. Nasze badanie wypełnia lukę w badaniu skomplikowanych mikrostruktur mięśnia sercowego, takich jak trabekulacja wewnątrz nienaruszonych komór z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Ta strategia obrazowania stanowi punkt wyjścia do oceny mikrostruktury bez fizycznego krojenia, co prowadzi do lepszego zrozumienia rozwoju i przebudowy serca. Skoncentrujemy się na badaniu zmian strukturalnych mięśnia sercowego w odpowiedzi na uszkodzenie serca i przebudowę. Na początek umieść mysie serce zatopione w agarozie w roztworze 20% metanolu na jedną godzinę.

Sekwencyjnie przenieś serce do rosnących stężeń metanolu, aby je odwodnić. Umieść roztwory z sercem na mikserze z częstotliwością 60 Hz podczas odwadniania. Przenieś odwodnione serce do świeżego roztworu 100% metanolu.

Po zastąpieniu roztworu świeżym 100% metanolem umieść serce w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 10 minut. Teraz odessaj roztwór. Następnie dodaj 200 mililitrów 5% nadtlenku wodoru do metanolu, aby wybielić serce.

Inkubuj serce w roztworze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś próbkę do 100% metanolu. Po inkubacji przenieść go do roztworu zawierającego 66% dichlorometanu i 33% metanolu.

Serce powinno opaść na dno fiolki. Umieść próbkę w mieszalniku na trzy godziny, aby zapewnić całkowite zniszczenie serca. Na koniec inkubować próbkę w eterze dibenzoilowym w celu dopasowania współczynnika załamania światła.

Tkanka serca myszy P1 stała się przezroczysta w ciągu czterech dni, podczas gdy ośmiotygodniowa mysz stała się przezroczysta w ciągu siedmiu dni. Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazu mikroskopu. Oblicz liczbę kafelków potrzebnych do pokrycia całego serca myszy.

Uchwyć obrazy serca, zaczynając od pierwszego kafelka. Sekwencyjnie rób obrazy pozostałych płytek z 10% zachodzeniem na siebie kolejnych płytek, aż całe serce zostanie pokryte. Teraz otwórz wtyczkę BigStitcher i zaimportuj wszystkie niezbędne kafelki za pośrednictwem katalogu plików obrazów.

Zapisz zestaw danych jako plik HDF5. Użyj funkcji Przenieś kafelek według zwykłej siatki, aby uporządkować płytki, a następnie wybierz wzór używany do przesuwania serca i wybierz 10% zachodzenia na siebie między każdą płytką. Zszyj płytki za pomocą opcji Kreator zszywania.

Utwórz plik TIFF za pomocą narzędzia Image Fusion w celu wyeksportowania zszytych danych. Do dekonwolucji Multi-View próbki użyj koralików fluorescencyjnych do rejestracji obrazu Rekonstrukcji Multi-View wzdłuż serca. Zeskanuj zespół serca w poprzek osi wykrywania, aby uchwycić sekwencyjne obrazy serca myszy z podświetlonej sekcji.

Obróć serce myszy o 60 stopni wzdłuż osi Y, aby uchwycić kolejne stosy pod różnymi kątami. Następnie otwórz wtyczkę BigStitcher i zaimportuj wszystkie obrazy za pośrednictwem katalogu plików obrazów. Zapisz zestaw danych jako plik HDF5.

Wybierz, Wykryj punkty zainteresowania i ręcznie wybierz interesujące Cię koraliki do rejestracji. Wybierz model transformacji afinicznej do rejestracji i przypisz do PSF do wszystkich widoków. Kliknij Multi-View Deconvolution i wybierz typ iteracji jako Efficient Bayesian.

Zdefiniuj liczbę iteracji jako 10 i wykonaj ją. Na koniec kliknij Image Fusion, aby wyeksportować plik TIFF. Metoda Multi-View Deconvolution Method osiągnęła rozdzielczość bliską izotropowi po 15 godzinach obliczeń.

Mikroskopia świetlna oparta na ETL była w stanie zminimalizować nieostre tło i zwiększyć kontrast obrazu. Integracja zszywania z mikroskopią Axially-Swept Light-Sheet Microscopy pozwoliła na pokrycie całego ośmiotygodniowego serca myszy z jednolitą rozdzielczością. Aby rozpocząć, zainstaluj elektryczną soczewkę gramofonu lub ETL na płaszczyźnie Fouriera soczewki cylindrycznej.

Otwórz obudowę sterownika ETL i zdejmij pokrywę. Podłącz sterownik ETL do portu USB stacji roboczej. Następnie podłącz sterownik do ETL za pomocą HIROSE.

Następnie zainstaluj oprogramowanie kontrolera sterownika obiektywu. Zmień tryb pracy i oprogramowanie na Analog, aby sterować ETL za pomocą wyzwalacza generowanego z karty DAC. Przełącz tryb przechwytywania na Zewnętrzny w oprogramowaniu kamery sCMOS.

Aby zsynchronizować system, zdefiniuj czas ekspozycji na podstawie akceptowalnego stosunku sygnału do tła. Generuj zarówno kwadratowe, jak i trójkątne wyzwalacze do synchronizacji w programie Lab View, Trigger Generator.vi. Zeskanuj wiązkę laserową wzdłuż osi X i aktywne piksele wzdłuż osi Y, aby wygenerować obraz 2D.

Jaśniejsze i ostrzejsze koraliki wzdłuż przekątnej obrazu wskazują na precyzyjną synchronizację. Przejdź do obrazu serca.