Name: Wzorzysta fotostymulacja za pomocą cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej między punktami rozgałęzień (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj wzorzystą fotostymulację za pomocą cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej między punktami rozgałęzień. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę pobudzania neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant RO1 z NIH oraz Merit Reviews z VA Research Service dla C.-M. T., a także indywidualny grant NRSA dla C.W.L.

Ogólne uwagi dotyczące projektu
Jeśli długość fali fotostymulacji mieści się w zakresie widzialnym, jak ma to miejsce w eksperymentach optogenetycznych, układ systemu będzie znacznie prostszy niż w przypadku eksperymentów z fotolizą UV. Wystarczy zakupić moduł podwójnego portu kamery, który jest dostępny u wszystkich producentów mikroskopów. Płaszczyzna DMD może zostać umieszczona w płaszczyźnie obrazu sprzężonej z dowolnym z dwóch portów kamery. Jednak w fotolizie UV światło pochodzące z DMD musi zostać wprowadzone poprzez drogę epiluminacji (Ryc. 3A), ponieważ soczewka tubusowa obrazująca prowadząca do kamery w żadnym z dostępnych komercyjnie mikroskopów nie jest skorygowana dla długości fali UV. Aberracja sferyczna soczewki tubusowej przy 350 nm jest na tyle silna, że uniemożliwia skupienie światła w małym punkcie i uzyskanie wystarczającej rozdzielczości przestrzennej. Problem ten nie występuje w mikroskopii konfokalnej, ponieważ soczewka tubusowa jest usuwana, gdy kolimowana wiązka laserowa jest wprowadzana wzdłuż tej samej osi optycznej. Problem oświetlenia UV można rozwiązać, wprowadzając światło przez drogę epifluorescencyjną, ponieważ soczewki tubusowe w tym torze są w stopniu częściowym skorygowane pod kątem aberracji sferycznej dla długości fali UV. Możemy rozwinąć opis optyki mikroskopów w takim zakresie, jakiego wymaga czasopismo. Społeczność naukowa zazwyczaj wykazuje duże zainteresowanie tym tematem, a źródeł, które wyjaśniają go w przystępny sposób, jest niewiele.
Aby zminimalizować modyfikacje mikroskopu oraz ze względu na ograniczenia przestrzenne w jednostce epifluorescencyjnej, DMD został umieszczony w nowo utworzonej sprzężonej płaszczyźnie obrazu, stworzonej za pomocą soczewki przekaźnikowej (wskaż położenie jednostki DMD w stosunku do mikroskopu). Zakupiono komercyjną soczewkę przekaźnikową z korekcją UV (Specialty Optics) (wskaż ją na schemacie i na mikroskopie).
Oświetlenie DMD
Po otrzymaniu sygnału wejściowego mikrolustro może przełączyć się między dodatnim a ujemnym pochyleniem o 12° względem płaszczyzny układu. Oś obrotu przebiega wzdłuż przeciwległych narożników każdego lustra (pod kątem 45° do krawędzi układu). Kierunek obrotu lustra jest wyznaczony przez złoty trójkąt znajdujący się w jednym z narożników na przedniej powierzchni układu. Kąt pochylenia mikrolustra determinuje ustawienie kąta nachylenia (pitch) i azymutu przychodzącej wiązki oświetlającej. Kąt nachylenia wiązki oświetlającej musi wynosić 24° względem osi prostopadłej do układu DMD, a azymut musi być prostopadły do osi obrotu lustra. Precyzyjne ustawienie wiązki jest kluczowe dla wydajnej pracy. W systemie prototypowym zaprojektowaliśmy wiele ręcznych regulacji pochylenia, które pozwoliły nam skorygować niedoskonałości konstrukcyjne i obróbcze. Skutkowało to systemem znacznie bardziej masywnym niż był to konieczny. Możliwe jest zastosowanie alternatywnego, bardziej kompaktowego układu doprowadzenia światła (pokazać alternatywną konstrukcję, jeśli zostanie uznana za przydatną).
Do eksperymentów z fotolizy wymagane jest źródło laserowe w celu wytworzenia wiązki o wysokim natężeniu światła i małej średnicy ogniska, co jest niezbędne do szybkiego uwalniania cząsteczek (uncaging). W przypadku eksperymentów optogenetycznych, w których nie jest wymagane światło o wysokim natężeniu i ostrym skupieniu, odpowiednie byłoby niespójne źródło światła. W opisanym tutaj eksperymencie z fotolizy zastosowano quasi-ciągły laser DPSS (diode pumped solid state) z potrojeniem częstotliwości na kryształku NdVO4 (1 W, 35 nm). (Szczegółową dyskusję na temat wyboru źródeł światła do fotolizy przedstawiono w odniesieniu 2). W opisanych tutaj badaniach wymagany jest laser o stosunkowo wysokiej mocy, ponieważ przy zastosowaniu systemu DMD tylko niewielka część mocy wyjściowej lasera dociera do preparatu. Ilość światła dostarczanego do preparatu jest proporcjonalna do stosunku liczby zwierciew w pozycji ON do luster w pozycji OFF w obszarze oświetlanym przez wiązkę lasera.
Jeśli wymagane jest zastosowanie laserowego źródła światła, najlepiej wprowadzić wiązkę lasera do światłowodu wielomodowego, aby można było go łatwo ustawić i zorientować wzdłuż odpowiedniej osi do oświetlenia DMD. Przesyłanie światła przez światłowód rozwiązuje drugi problem: jak wyeliminować wzory plamek (speckle), które są nieodłączną cechą oświetlenia koherentnego. Światłowód jest nawinięty na piezoelektryczny rozciągacz światłowodów (model 915, Canadian Instrumentation &amp; Research, Ltd), który oscyluje z częstotliwością ~40 kHz. (wskazać to w układzie) Mikroskopijne rozciąganie światłowodu jest wystarczające, aby wielokrotnie przemieścić wzór plamek w ciągu milisekundowego czasu trwania każdego impulsu fotostymulacji, co skutecznie eliminuje efekt plamkowania. Wyjście światłowodu jest następnie kolimowane za pomocą obiektywu mikroskopu UV (Olympus DApo20UV). (wskazać to) Kalibracja rozdzielczości optycznej systemu przedstawiona jest na Rys. 3B. Efektywna rozdzielczość fizjologiczna, mierzona jako amplituda przepływu prądu w funkcji położenia punktu fotostymulacji, przedstawiona jest na Rys. 3C. Odpowiedzi prądowe na fotostymulację o różnych intensywnościach zilustrowano na Rys. 3D.
Obsługa systemu:
Współrejestracja pikseli CCD z lustrami DMD
Opracowano wewnętrzne oprogramowanie, które określa odpowiedniość poszczególnych luster DMD względem konkretnych pikseli obrazującej kamery CCD. Graficzny interfejs użytkownika (GUI) w tym oprogramowaniu pozwala użytkownikowi przypisać lustra DMD odpowiadające obszarowi na obrazie CCD wskazanemu za pomocą myszy. W ten sposób miejsce fotostymulacji można oznaczyć, po prostu przesuwając kursor nad obraz wyświetlony na ekranie komputera i klikając wybrany obszar zainteresowania. (Na ekranie komputera zostanie wyświetlony obraz fluorescencyjny drzewa dendrytycznego. Student zaznaczy na obrazie na ekranie komputera kilka lokalizacji).
Programowanie wzorów dostarczania światła
Wzór zaznaczony przez operatora na ekranie komputera jest zapisywany jako seria oddzielnych obrazów. Następnie czas trwania impulsów laserowych dla każdego wzoru przestrzennego jest programowany w oprogramowaniu zintegrowanym z programem do akwizycji danych (pClamp). (zademonstruj to).
Synchronizacja impulsów laserowych z wzorami DMD
Program do akwizycji danych inicjuje i koordynuje czas działania elektroniki DMD, bramkowanie lasera oraz rejestrację sygnału elektrycznego z neuronu docelowego uzyskanego metodą patch-clamp (symuluj tę sekwencję na komputerze).
Dane eksperymentalne:
Nieliniowe sumowanie w punktach rozgałęzień dystalnych dendrytów
Integrację dendrytyczną z elektrodami tradycyjnie przeprowadzano poprzez zmienianie amplitudy stymulacji w poszczególnych punktach, zamiast rozszerzania obszaru stymulacji przy zachowaniu stałej intensywności. Kwestie związane z nasyceniem elektrogenezy oraz rekrutacją kanałów zależnych od lokalizacji mogą wpływać na wyniki i wnioski. Rozproszoną stymulację dendrytyczną można łatwo zaimplementować, wykorzystując system oparty na DMD (Ryc. 4A). Intensywność wejściową zmieniano poprzez zwiększanie liczby punktów fotostymulacji. Można zauważyć, że sumowanie przestrzenne może być nieliniowe w obrębie punktów rozgałęzień, stając się coraz bardziej supraliniowe wraz ze wzrostem amplitud wejściowych docierających do dwóch gałęzi potomnych. Supraliniowość jest w dużej mierze zapośredniczona przez receptory NMDA, a nie przez kanały sterowane napięciem (Ryc. 5)
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej, widok z boku i z góry, pomiary kątów, analiza strukturalna, mechanika przechyłu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Zasada działania mikrolusterek w DMD. (Widok z boku) Siły elektrostatyczne skierowane na poszczególne lusterka powodują ich nachylenie w jednej z dwóch możliwych orientacji 12° od poziomu. W pozycji ON wiązka padająca jest kierowana wzdłuż osi optycznej prostopadle do chipa. W pozycji OFF wiązka padająca jest kierowana 48° poza osią. Światło, które pada na wąskie szczeliny między lustrami, jest kierowane 24° poza osią. (Widok z góry) nachylenie jest zorientowane 45° w odniesieniu do krawędzi luster i chipu.
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="Schemat mikroskopii optycznej, detekcja CCD, oświetlenie lampą łukową, układ do obrazowania fluorescencyjnego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Podstawowy układ współczesnego mikroskopu fluorescencyjnego. Kostka filtra jest umieszczona w „przestrzeni nieskończonej” pomiędzy obiektywem a soczewką tubusem. Istnieje tor obrazowania prowadzący do kamery oraz tor oświetlenia, który doprowadza światło do preparatu. Soczewki tubusowe dla tych dwóch dróg światła różnią się zazwyczaj konstrukcją i ogniskową. Soczewka tubusowa toru oświetlenia, w przeciwieństwie do toru obrazowania, jest zaprojektowana do pracy w spektrum UV.
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="Schemat układu wzbudzenia optycznego; obejmuje laser DPSS, detektor CCD, wyświetlacz LCD oraz lustro dichroiczne do badań spektralnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rycina 3. Układ systemu DMD opartego na promieniowaniu UV. Jeśli oświetlenie znajduje się w spektrum UV, musi ono zostać przeprowadzone przez soczewkę tubusową skorygowaną do UV. Soczewka tubusowa w torze obrazowania nie jest przystosowana do promieniowania UV. Niezbędny jest system przekaźnikowy w celu stworzenia łatwo dostępnej sprzężonej płaszczyzny obrazu. Różne sprzężone płaszczyzny obrazu w mikroskopie zostały zaznaczone czerwonymi liniami przerywanymi. Jasne wzory w jednej płaszczyźnie obrazu są rzutowane na inne płaszczyzny sprzężone. Podczas obrazowania wzór w płaszczyźnie próbki jest rzutowany na detektor/kamerę. W przypadku oświetlenia wzór generowany przez DMD jest rzutowany na próbkę.
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="schemat wzbudzenia optycznego, CCD, DMD, układ spektroskopowy do analizy emisji, źródło w postaci lampy łukowej" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Układ systemu projekcji DMD w świetle widzialnym. Jeśli światło oświetlające znajduje się w zakresie widzialnym, możliwe jest wprowadzenie wzoru świetlnego generowanego przez DMD do ścieżki obrazowania. Można to łatwo zrealizować za pomocą komercyjnych przystawek do podwójnego portu kamery oraz odpowiedniego lustra dichroicznego.
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="Analiza wzorca dyfrakcyjnego; wykresy natężenia światła i prądu szczytowego, wyniki elektrofizjologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rysunek 5. Rozdzielczość boczna systemu. (A) Rozdzielczość optyczna na celu fluorescencyjnym wynosi ok.2 μm(B) Efektywna rozdzielczość mierzona poprzez fotolizę klatkowanego glutaminianu w obrębie dendrytu wynosi ~5 μmZwiększona odległość wynika z połączenia dyfuzji glutaminianu oraz ograniczonej szerokości dendrytu. (C) Fotoliza może naśladować kinetykę zdarzeń synaptycznych. Rodzina odpowiedzi prądowych przy zakleszczonym potencjale wynika ze zmienności energii światła dostarczanej do dendrytu.
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="Obrazowanie sygnałów neuronalnych, mikroskopia fluorescencyjna, elektrofizjologia, skala 10 µm, wykres potencjału błonowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> Rysunek 6. Nieliniowe sumowanie w punktach rozgałęzień dendrytycznych. (A) Rozproszone bodźce wejściowe są przykładane oddzielnie do dwóch gałęzi dendrytycznych. Ich odpowiednie odpowiedzi napięciowe przedstawiono poniżej. (B) Następnie bodźce są podawane jednocześnie. Zmierzona odpowiedź (ślad czerwony) różni się od sumy arytmetycznej dwóch poszczególnych odpowiedzi (ślad szary).
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="Analiza odpowiedzi neuronalnej, porównanie efektu APV, dane elektrofizjologiczne, piki obserwowane a oczekiwane." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> Rysunek 7. Sumowanie supralinearne jest zależne od receptorów NMDA. (A) APV, selektywny antagonista receptorów NMDA, blokuje sumowanie supralinearne. (B) Przedstawiono zależność intensywności bodźca oraz jej wrażliwość na antagonistę receptorów NMDA.

<ol><li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li>
<li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+caged+neurotransmitters%3A+Theory+and+procedures+for+light+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+Technology+Feature%2C+Cell+imaging%3A+Light+activated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li>
<li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li>
<li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+LJ+%22Digital+Light+Processing+and+MEMs%3A+An+overview%22">Digital Light Processing and MEMs: An overview</a>. , Texas Instrument White Papers. Forthcoming.</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Zaleta podejścia do fotostymulacji opartej na DMD jest najbardziej widoczna w sytuacjach, gdy cel zajmuje stosunkowo duży obszar. Jeśli interesujący nas cel jest bardzo mały, na przykład składa się z kilku kolców dendrytycznych, lepszym podejściem będą prawdopodobnie sekwencyjne systemy skanowania konfokalnego i dwufotonowego. Jedną z istotnych słabości metody DMD jest nieefektywne wykorzystanie dostępnego światła. Większość dostępnego światła jest nieuchronnie kierowana na lustra w pozycji OFF i nie zostaje wykorzystana...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<table><tbody><tr><td>Nowoczesny pionowy mikroskop fluorescencyjny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD i oprogramowanie do akwizycji obrazu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komputer i system interfejsu/akwizycji danych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw deweloperski DLP Discovery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interfejs USB ALP3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 + Optyka z LED</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podwójny moduł portów kamer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser NdVO4 z potrojeniem częstotliwości 355nm (~1 W)</td><td>DPSS Laser Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przesłona laserowa Model LS6</td><td>Uniblitz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowe światłowody i rozciągacz światłowodów Model# 915</td><td>Canadian Instrument and Research, Ltd</td><td></td><td>światłowód wielomodowy z rdzeniem 100 um</td></tr><tr><td>Wprowadzacz światłowodu wielomodowego</td><td>Oz Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generator sygnałów</td><td></td><td></td><td>do 50 kHz</td></tr><tr><td>Kolimator wiązki</td><td>Olympus Corporation</td><td>DApo20UV340</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka przekaźnikowa UV</td><td>Special Optics</td><td>#: 54-25-60-355</td><td></td></tr></tbody></table>

wzorcowa fotostymulacja z wykorzystaniem cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej w obrębie punktów rozgałęzień

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Światło jest wszechstronnym i precyzyjnym narzędziem kontroli pobudliwości neuronalnej. Niedawne wprowadzenie efektorów światłoczułych, takich jak kanalorodopsyna i związane z klatkami (caged) neuroprzekaźniki, doprowadziło do wzrostu zainteresowania opracowaniem lepszych metod kontrolowania wzorców światła w przestrzeni i czasie, które byłyby użyteczne w eksperymentalnej neuronauce. Jedna z konwencjonalnych strategii, stosowana w mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, polega na ogniskowaniu światła w punkcie ograniczonym dyfrakcją, a następnie sekwencyjnym skanowaniu tego pojedynczego punktu w obszarze zainteresowania. Podejście to staje się problematyczne, gdy konieczna jest stymulacja dużych obszarów w krótkim oknie czasowym, co jest bardziej istotne w przypadku fotostymulacji niż obrazowania. Alternatywną strategią jest rzutowanie pełnego wzorca przestrzennego na cel przy użyciu cyfrowego urządzenia mikrolusterek (DMD). Podejście z wykorzystaniem DMD jest atrakcyjne, ponieważ komponenty sprzętowe są stosunkowo niedrogie i wspierane przez komercyjnych dostawców. Ponieważ taki system nie jest dostępny dla mikroskopów pionowych, omówimy kluczowe kwestie konstrukcji i eksploatacji takiego systemu DMD. Chociaż będziemy opisywać głównie konstrukcję systemu do fotolizy UV, przedstawione zostaną również modyfikacje pozwalające na zbudowanie znacznie prostszego systemu światła widzialnego do eksperymentów optogenetycznych. System fotolizy UV został wykorzystany do przeprowadzenia eksperymentów badających fundamentalne pytanie w neuronauce: w jaki sposób integrowane są przestrzennie rozłożone sygnały wejściowe w dystalnych punktach rozgałęzień dendrytycznych. Wyniki sugerują, że integracja w punktach rozgałęzień może być nieliniowa, a supraliniowość jest w dużej mierze zapośredniczona przez receptory NMDA.

Cyfrowe urządzenia mikrolusterkowe (DMD) mogą generować złożone wzory w czasie i przestrzeni, które służą do kontrolowania pobudliwości neuronalnej. Omówiono kwestie związane z projektowaniem, konstrukcją i eksploatacją systemów DMD. Taki system umożliwił wykazanie nieliniowej integracji w obrębie dystalnych punktów rozgałęzień dendrytycznych.

Wzorcowa fotostymulacja z wykorzystaniem cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej w obrębie punktów rozgałęzień

Światło jest wszechstronnym i precyzyjnym narzędziem do kontrolowania pobudliwości neuronalnej. Niedawne wprowadzenie efektorów światłoczułych, takich jak kanałorodopsyna...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kontrolowanie złożonych wzorów światła w czasie i przestrzeni, aby można było je wykorzystać do stymulacji neuronów. Osiąga się to poprzez umieszczenie w pierwszej kolejności układu DMD w odpowiedniej sprzężonej płaszczyźnie obrazu w torze optycznym mikroskopu. Drugim krokiem procedury jest właściwe oświetlenie układu DMD intensywnym źródłem światła, takim jak laser.Trzecim krokiem procedury jest wyeliminowanie efektu nakrapiania wynikającego z oświetlenia koherentnego. Ostatnim krokiem procedury jest zintegrowanie graficznego interfejsu użytkownika do sterowania chipem DMD. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące, że eksperymenty, które wcześniej były trudne do przeprowadzenia, mogą teraz zostać stosunkowo łatwo zrealizowane dzięki wielopunktowej lizie klatkowanych neuroprzekaźników z wykorzystaniem systemu DMD.Witam, jestem Michael Mohammed z laboratorium dr Chaman Tang z Katedry Neurologii Uniwersytetu Maryland. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę generowania złożonych wzorów eliminacji w mikroskopie optycznym. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania integracji dendrytycznej.Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół zademonstruje działanie systemu oświetlenia opartego na cyfrowym urządzeniu mikrozwierciadeł (DMD) w neuronauce eksperymentalnej. DMD to optyczny układ półprzewodnikowy zawierający kilkaset tysięcy mikroskopijnych, ruchomych zwierciadeł ułożonych w macierz prostokątną; pozycja każdego zwierciadła na jego powierzchni odpowiada pikselowi obrazu.Każde lustro może być sterowane indywidualnie w celu zmiany nachylenia między dwiema orientacjami. W orientacji wyłączonej (off) światło jest kierowane poza oś optyczną oświetlenia preparatu. W orientacji włączonej (on) światło jest kierowane wzdłuż osi optycznej.DMD jest bardzo dobrze dostosowany do lizy, ponieważ toleruje bardzo intensywne światło UV, generuje wysokie współczynniki kontrastu między pikselami włączonymi a wyłączonymi oraz może przełączać się między tymi dwoma stanami w czasie liczonym w dziesiątkach mikrosekund. Zastosowanie DMD w badaniach biomedycznych jest wspierane przez szerokie wykorzystanie oprogramowania i sprzętu do manipulacji obrazem, a także przez zainteresowanie komercyjne w dziedzinie wyświetlania obrazów. Komponenty modułowe są oferowane przez firmę Texas Instruments jako zestawy DLP discovery, które zapewniają wspierające sterowniki elektroniczne do adaptacji DMD do systemu mikroskopowego.Należy zrozumieć podstawowe zasady optyki w mikroskopii. Podstawowy nowoczesny mikroskop fluorescencyjny składa się z toru obrazowania oraz toru oświetlenia. W jego skład wchodzi obiektyw, kostka filtrująca oraz dwie oddzielne soczewki tubusowe dla toru obrazowania i toru oświetlenia.Mikroskop został zaprojektowany w taki sposób, aby posiadać płaszczyzny sprzężone z płaszczyzną obrazu preparatu, dzięki czemu obiekty znajdujące się w ogniskowej płaszczyźnie preparatu będą również widoczne w ogniskowej na tych sprzężonych płaszczyznach obrazu. Wynikającym z tej koncepcji wnioskiem jest to, że każdy jasny obraz utworzony w sprzężonej płaszczyźnie obrazu zostanie również ostro rzutowany na płaszczyznę obrazu preparatu. Strategia ta jest wykorzystywana do rzutowania komputerowo generowanego wzoru oświetlenia na preparat.Wiązka laserowa służy jako bardzo jasne źródło światła, które oświetla wzór zaimplementowany przez mikrolustra na chipach DMD umieszczonych w sprzężonej płaszczyźnie obrazu. Konstrukcja systemu oświetlenia DMD zależy od świateł wzbudzających stosowanych w eksperymentach optogenetycznych, które wykorzystują światło o długości fali z zakresu widzialnego. Oświetlony wzór może zostać przesłany przez tor kamery.W związku z tym chip DMD można po prostu zamontować w jednym z dwóch portów kamer modułu z podwójnym portem kamer. Ilekroć jednak przeprowadzane są eksperymenty z wykorzystaniem światła w zakresie UV, takie jak liza związków klatkowych, światło musi zostać wprowadzone przez tor iluminacji epi i musi zostać utworzona bardziej dostępna sprzężona płaszczyzna obrazu. Wynika to z faktu, że soczewka tubusu obrazującego nie jest przeznaczona do transmisji UV.Zamiast tego wykorzystuje się soczewkę tubusową oświetlacza do transmisji UV, która zapewnia odpowiednią jakość formowania obrazu. Każde mikrolustro na DMD może przełączać się między dodatnim a ujemnym nachyleniem o 12 stopni względem płaszczyzny układu. W zależności od otrzymanego z komputera sygnału cyfrowego, oś obrotu przebiega wzdłuż przeciwległych narożników każdego lustra, pod kątem 45 stopni względem prostokątnych krawędzi układu.Kierunek nachylenia lustra jest oznaczony złotym trójkątem w jednym z narożników przedniej powierzchni chipu. Nachylenie mikrolusterka determinuje ustawienie kąta pochylenia i azymutu nadchodzącej wiązki oświetlającej. Aby oświetlić DMD, należy najpierw ustawić kąt pochylenia wiązki oświetlającej na 24 stopnie względem osi prostopadłej do chipu DMD, a azymut ustawić prostopadle do osi obrotu lustra.Precyzyjne wyrównanie wiązki jest krytyczne dla wydajnego działania. W przypadku eksperymentów z lizą należy użyć źródła laserowego do wygenerowania wysokointensywnej wiązki skupialnej, niezbędnej do szybkiego uwalniania cząsteczek (uncaging).W tym przypadku zastosowano quasi-ciągły laser Nd:YAG o potrójnej częstotliwości, pompowany diodą w stanie stałym; wykorzystano laser o stosunkowo wysokiej mocy, ponieważ do preparatu dociera jedynie niewielka część mocy wyjściowej lasera. Podczas korzystania z systemu DMD wyjście lasera wprowadza się do włókna wielomodowego, aby można było go łatwo ustawić i zorientować wzdłuż odpowiedniej osi oświetlania DMD, co pozwala rozwiązać problem plamkowania (speckle) generowany przez oświetlenie koherentne; światło jest przesyłane poprzez włókno optyczne.Włókno jest nawinięte na piezoelektryczny rozciągacz włókien, który jest sterowany tak, aby oscylował z częstotliwością około 40 kHz. Mikroskopijne rozciąganie włókna jest wystarczające, aby wielokrotnie przesunąć wzór plamek w czasie trwania każdego milisekundowego impulsu fotostymulacji, co skutecznie eliminuje zjawisko plamkowania. Na koniec wyjście włókna optycznego zostaje skolimowane za pomocą obiektywu mikroskopu UV w celu oświetlenia DMD, aby zarejestrować współrzędne pikseli CCD z oprogramowaniem obrazującym DMD, które koreluje poszczególne lustra DMD z konkretnymi pikselami kamery CCD.Graficzny interfejs użytkownika w oprogramowaniu umożliwia użytkownikowi przypisanie orientacji lustra DMD odpowiadającej obszarowi na obrazie CCD za pomocą myszy komputerowej. Oznacz miejsce fotostymulacji, przesuwając kursor nad obrazem wyświetlanym na ekranie komputera, a następnie kliknij zaznaczony obszar zainteresowania, aby zaprogramować magazyn wzorów dostarczania światła. Wzór zaznaczony na ekranie komputera jako seria oddzielnych obrazów programuje w oprogramowaniu czas trwania impulsów lasera dla każdego wzoru przestrzennego.Będzie to zintegrowane z programem do akwizycji danych P clamp. Na koniec należy użyć programu do akwizycji danych, aby skoordynować czas pracy elektroniki DMD, bramkowanie lasera oraz rejestrację sygnału elektrycznego z neuronu docelowego uzyskanego metodą patch-clamp. Tutaj przedstawiono kalibrację rozdzielczości układu optycznego.Minimalny rozmiar plamki został przedstawiony na podstawie pomiaru z wykorzystaniem celu fluorescencyjnego. Efektywna rozdzielczość fizjologiczna jest mierzona amplitudą przepływu prądu jako funkcją fotostymulacji. W odniesieniu do pozycji plamki, uwięziony glutaminian został poddany fotolizie w sąsiedztwie odgałęzienia dendrytycznego o średnicy 2 µm.Wraz z przemieszczaniem plamki, prostopadle w obrębie miejsca badania, przedstawiono odpowiedzi elektryczne na fotostymulację o różnym natężeniu. Pokazano odpowiedzi w warunkach zaciskania napięcia w funkcji natężenia lizy.Rozproszoną stymulację dendrytyczną można łatwo zrealizować przy użyciu systemu opartego na DMD. W tym przypadku intensywność sygnału wejściowego zmieniano poprzez zwiększanie liczby punktów fotostymulacji, zaznaczonych jako okręgi na dwóch gałęziach dendrytycznych. Sumowanie przestrzenne może mieć charakter nieliniowy w obrębie punktów rozgałęzień.Zależność ta staje się coraz bardziej superliniowa wraz ze wzrostem amplitud sygnałów wejściowych docierających do dwóch gałęzi drzwiowych. Wyniki te wyraźnie ilustrują nieliniowy charakter sumowania w punktach rozgałęzień dendrytycznych. Superliniowość jest w dużej mierze zapośredniczona przez receptory NMDA, a nie przez kanały sterowane napięciem.Można to zademonstrować poprzez zastosowanie dwóch antagonistów receptorów NMDA – APV oraz MK 8 0 1, które w znacznym stopniu eliminują nieliniowe zachowanie. Przedstawiliśmy podstawową konstrukcję i działanie systemu opartego na DMD do fotostymulacji wzorców tkanki nerwowej. System ten można przystosować do stymulacji światłem widzialnym, stosowanym na przykład w eksperymentach optogenetycznych.Może być on również dostosowany do światła bliskiego UV, stosowanego w jednofotonowej lizie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że w przypadku użycia światła o długości fali poniżej 400 nanometrów, które przechodzi przez ścieżkę oświetlenia epifluorescencyjnego, kluczowa jest precyzyjna kalibracja wiązki oświetlającej z dokładnością do kilku stopni, a w przypadku zastosowania światła koherentnego, należy skutecznie wyeliminować efekt ziarnistości (speckle). To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wzorcowa fotostymulacja za pomocą cyfrowych urządzeń mikromirror do badania integracji dendrytycznych w punktach rozgałęzień

Niniejszy artykuł przedstawia podejście łączące fotostymulację za pomocą skanowania laserowego z rejestracją z całej komórki u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta umożliwia szerokie mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów kory mózgowej.

Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo

Ten film demonstruje metodę oceny funkcjonalnych połączeń nerwowo-mięśniowych. Za pomocą bioreaktora zawierającego tkankę mięśniową i neurony ruchowe, wraz z mikroskopią fluorescencyjną, wrażliwe na światło kanały w neuronach są stymulowane do generowania sygnałów elektrycznych, powodując skurcze włókien mięśniowych.

Ocena funkcjonalnego połączenia nerwowo-mięśniowego za pomocą jednoczesnej stymulacji optycznej i nagrywania wideo

Źródło: Kato, D. et. al., Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia technikę obrazowania dwufotonowego w połączeniu z optogenetyką przy użyciu mikroskopii holograficznej. Technika ta, wykorzystująca przestrzenny modulator światła, umożliwia precyzyjną stymulację neuronów polegającą na ekspresji białka wrażliwego na światło czerwone i obrazowanie wapnia przy minimalnym fotouszkodzeniu. Takie podejście...

Dwufotonowa mikroskopia holograficzna do badania aktywności neuronalnej i łączności w modelu mysim

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Opracowaliśmy dwufotonowy mikroskop holograficzny, który może wizualizować, oceniać i manipulować aktywnością neuronalną przy użyciu wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, w celu wyjaśnienia patogenezy zaburzeń neuropsychiatrycznych, które są związane z nieprawidłową aktywnością neuronalną.

Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej

Prezentujemy metodę elastycznej chemicznej i multimodalnej stymulacji oraz rejestrowania jednoczesnej aktywności neuronalnej wielu robaków Caenorhabditis elegans. Metoda ta wykorzystuje mikrofluidykę, sprzęt i oprogramowanie typu open source oraz nadzorowaną automatyczną analizę danych, aby umożliwić pomiar zjawisk neuronalnych, takich jak adaptacja, hamowanie czasowe i przesłuchy bodźców.

Zautomatyzowana stymulacja multimodalna i jednoczesna rejestracja neuronów z wielu małych organizmów

Druk 3D w skali mikrometrycznej umożliwia szybkie prototypowanie urządzeń polimerowych do hodowli komórek neuronalnych. Jako dowód słuszności zasady, połączenia strukturalne między neuronami były ograniczane przez tworzenie barier i kanałów wpływających na rozrost neurytów, podczas gdy funkcjonalne konsekwencje takiej manipulacji zaobserwowano za pomocą elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej.

Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Poznaj wzorzystą fotostymulację za pomocą cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej między punktami rozgałęzień. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę pobudzania neuronów.

Wzorzysta fotostymulacja za pomocą cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej między punktami rozgałęzień (Wideo) | JoVE Journal

Wzorcowa fotostymulacja z wykorzystaniem cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej w obrębie punktów rozgałęzień

Przeglądaj więcej filmów