Wzorzysta fotostymulacja za pomocą cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej między punktami rozgałęzień

Ogólnym celem tej procedury jest kontrolowanie złożonych wzorów światła w czasie i przestrzeni, tak aby można je było wykorzystać do stymulacji neuronów. Osiąga się to poprzez uprzednie umieszczenie chipa DMD w odpowiedniej sprzężonej płaszczyźnie obrazu na ścieżce optycznej mikroskopu. Drugim krokiem zabiegu jest odpowiednie oświetlenie DMD intensywnym źródłem światła, takim jak laser.

Trzecim krokiem zabiegu jest wyeliminowanie efektu plamkowania spójnego oświetlenia. Ostatnim krokiem procedury jest zintegrowanie graficznego interfejsu użytkownika w celu manipulowania chipem DMD. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że eksperymenty, które wcześniej były trudne do przeprowadzenia, można teraz stosunkowo łatwo przeprowadzić poprzez wielomiejscową lizę neuroprzekaźnika klatkowego z wykorzystaniem systemu DMD.

Cześć, nazywam się Michael Mohammed i pracuję w laboratorium dr Chamana Tanga na Wydziale Neurologii Uniwersytetu Maryland. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę generowania złożonych wzorów eliminacji w mikroskopie optycznym. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania integracji dendrytycznej.

Więc zacznijmy. Protokół ten zademonstruje działanie cyfrowego urządzenia z mikrolustrem lub systemu oświetlenia DMD dla eksperymentalnej neuronauki. DMD to optyczny układ półprzewodnikowy z kilkuset tysiącami mikroskopijnych ruchomych luster ułożonych w prostokątny układ Na jego powierzchni położenie każdego lustra odpowiada pikselowi obrazu.

Każde lustro może być indywidualnie sterowane, aby przechylać się między dwiema orientacjami. W orientacji wyłączonej światło jest kierowane z dala od osi optycznej oświetlenia próbki. W orientacji włączonej światło jest kierowane wzdłuż osi optycznej.

DMD dobrze nadaje się do lizy, ponieważ toleruje bardzo intensywne światło UV, generuje wysokie współczynniki kontrastu między pikselami włączania i wyłączania i może przełączać się między tymi dwoma stanami w ciągu kilkudziesięciu mikrosekund. Zastosowanie DMD w badaniach biomedycznych jest wspomagane przez szerokie zastosowanie oprogramowania i sprzętu do manipulacji obrazem oraz przez komercyjne zainteresowanie dziedziną wyświetlania obrazu. Komponenty modułowe są sprzedawane przez Texas Instruments jako zestawy do wykrywania DLP, które zapewniają pomocnicze sterowniki elektroniczne w celu dostosowania DMD do systemu mikroskopijnego.

Należy zrozumieć podstawowe pojęcia dotyczące optyki mikroskopii. Podstawowy nowoczesny mikroskop fluorescencyjny składa się ze ścieżki obrazowania i ścieżki oświetlenia. Składa się z obiektywu, sześcianu filtrującego i dwóch odrębnych soczewek tubusu dla ścieżki obrazowania i oświetlenia.

Mikroskop został zaprojektowany tak, aby miał pozycje, które są sprzężone z płaszczyzną obrazu próbki, gdzie obiekty wyostrzone na płaszczyźnie próbki będą również wyświetlane w ostrości na tych sprzężonych płaszczyznach obrazu. Konsekwencją tej koncepcji jest to, że każdy jasny obraz utworzony na płaszczyźnie obrazu sprzężonego byłby również ostro rzutowany na płaszczyznę obrazu próbki. Strategia ta służy do rzutowania wygenerowanego komputerowo wzoru oświetlenia na próbkę.

Wiązka laserowa służy jako bardzo jasne źródło światła, które oświetli wzór realizowany przez mikrolustra na chipach DMD umieszczonych na sprzężonej płaszczyźnie obrazu. Konstrukcja systemu oświetlenia DMD zależy od świateł wzbudzających używanych w eksperymentach optogenetycznych, które wykorzystują światło w widzialnej długości fali. Podświetlony wzór można przeprowadzić przez ścieżkę kamery.

Dlatego układ DMD można po prostu zamontować na jednym z dwóch portów kamery w module z dwoma portami kamery. I odwrotnie, w przypadku eksperymentów wykorzystujących światło w zakresie UV, takich jak liza związków w klatkach, światło musi zostać doprowadzone przez ścieżkę oświetlenia epi i należy utworzyć bardziej dostępną sprzężoną płaszczyznę obrazu. Dzieje się tak, ponieważ soczewka rurki obrazowej nie jest przystosowana do transmisji promieniowania UV.

Zamiast tego soczewka rurki oświetleniowej jest wykorzystywana do transmisji UV i wykonuje odpowiednią pracę w tworzeniu obrazu. Każde mikrolustro na DMD może przełączać się między dodatnim i ujemnym nachyleniem 12 stopni w stosunku do płaszczyzny chipa. W zależności od wejścia cyfrowego, które otrzymuje z komputera, oś obrotu przebiega wzdłuż ukośnych rogów każdego lustra, 45 stopni do prostokątnych boków chipa.

Orientacja nachylenia lustra jest oznaczona złotym trójkątem w jednym rogu na przedniej powierzchni chipa. Nachylenie mikrolustra decyduje o ustawieniu wysokości i azymutu wpadającej wiązki świetlnej. Aby oświetlić DMD, najpierw skonfiguruj skok wiązki świetlnej na 24 stopnie od prostopadłej osi chipa DMD i ustaw azymut tak, aby był prostopadły do osi obrotu lustra.

Precyzyjne wyrównanie wiązki ma kluczowe znaczenie dla wydajnej pracy. Do eksperymentów z lizą. Użyj źródła laserowego, aby wygenerować wiązkę o wysokiej intensywności, która jest niezbędna do szybkiego rozpakowania.

W tym przypadku stosuje się quasi-ciągły laser półprzewodnikowy pompowany diodą o potrojonej częstotliwości ND, użyj lasera o stosunkowo dużej mocy, ponieważ tylko niewielka część mocy wyjściowej lasera jest faktycznie dostarczana do próbki. Korzystając z systemu DMD, uruchom wyjście lasera do światłowodu wielomodowego, aby można go było łatwo ustawić i zorientować wzdłuż właściwej osi w celu oświetlenia DMD, aby zapewnić rozwiązanie plamki. Problem generowany przez koherentne oświetlenie przepuszcza światło przez światłowód.

Włókno jest nawinięte wokół naciągów z włókna elektrycznego pazo, które są napędzane do oscylacji około 40 kiloherców. Mikroskopijne rozciągnięcie włókna jest wystarczające, aby wielokrotnie przesunąć wzór plamki w ciągu milisekundy każdego impulsu fotostymulacji, skutecznie eliminując w ten sposób plamki. Na koniec wyjście światłowodu jest zestawiane z obiektywem mikroskopu UV w celu oświetlenia DMD w celu współzarejestrowania piksela CCD z oprogramowaniem do obrazu DMD, które koreluje poszczególne lustra DMD z określonymi pikselami obrazowania kamery CCD.

Graficzny interfejs użytkownika w oprogramowaniu umożliwia użytkownikowi przypisanie orientacji lustra DMD, która odpowiada regionowi na obrazie CCD za pomocą myszy komputerowej za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Oznacz lokalizację do stymulacji fotograficznej, przesuwając kursor nad obrazem wyświetlanym na ekranie komputera i kliknij oznaczony obszar zainteresowania, aby zaprogramować sklep z wzorcami dostarczania światła. Wzór oznaczony na ekranie komputera jako seria oddzielnych obrazów programuje w oprogramowaniu czas impulsów laserowych dla każdego wzoru przestrzennego.

Spowoduje to integrację z programem do akwizycji danych P clamp. Na koniec użyj programu do akwizycji danych, aby skoordynować czas elektroniki DMD, bramkowanie lasera i akwizycję sygnału elektrycznego z neuronem docelowym. W tym miejscu pokazana jest kalibracja rozdzielczości układu optycznego.

Minimalny rozmiar plamki jest pokazany jako mierzony od tarczy fluorescencyjnej. Efektywna rozdzielczość fizjologiczna jest mierzona amplitudą przepływu prądu w funkcji fotostymulacji. Pozycja punktowa tutaj, glutaminian w klatce został sfotografowany w sąsiedztwie gałęzi dendrytycznej o średnicy dwóch mikrometrów.

Gdy miejsce zostało przeniesione. Przedstawiono prostopadle w poprzek dite reakcje elektryczne na fotostymulację o różnej intensywności. Pokazane są odpowiedzi zaciśnięte napięciem w funkcji intensywności lizy.

Rozproszona stymulacja dendrytyczna może być łatwo zrealizowana za pomocą systemu opartego na DMD. W tym przypadku intensywność wejściowa została zróżnicowana poprzez zwiększenie liczby punktów stymulacji zdjęć oznaczonych jako okręgi na dwóch gałęziach dendrytycznych. Sumowanie przestrzenne może być nieliniowe w punktach rozgałęzień.

Staje się coraz bardziej liniowy wraz ze wzrostem amplitud wejściowych docierających do dwóch drzwi do gałęzi. Wyniki te wyraźnie ilustrują nieliniowy sposób sumowania punktów rozgałęzień dendrytycznych. Nadliniowość jest w dużej mierze pośredniczona przez receptory NMDA, a nie przez kanały bramkowane napięciem.

Można to wykazać, ponieważ zastosowanie dwóch antagonistów NMDA, A, PV i MK 8, 0, 1, w dużej mierze eliminuje zachowanie nieliniowe. Właśnie pokazaliśmy Ci podstawową konstrukcję i działanie systemu opartego na DMD do fotostymulacji wzorców tkanki nerwowej. System może być przystosowany do stymulacji światłem widzialnym, np. wykorzystywanym do eksperymentów optogenetycznych.

Może być również adaptacyjny do świateł bliskich UV, takich jak używany do lizy pojedynczych fotonów. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że jeśli ma być używane światło o długości fali mniejszej niż 400 nanometrów i większość ludzi przechodzi przez ścieżkę oświetlenia epi, to precyzyjne ustawienie wiązki świetlnej w zakresie kilku stopni ma kluczowe znaczenie, a jeśli stosuje się spójne światło, plamki muszą być skutecznie wyeliminowane. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.