Wzorcowa fotostymulacja z wykorzystaniem cyfrowych urządzeń mikrolustrzanych do badania integracji dendrytycznej w obrębie punktów rozgałęzień

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kontrolowanie złożonych wzorów światła w czasie i przestrzeni, aby można było je wykorzystać do stymulacji neuronów. Osiąga się to poprzez umieszczenie w pierwszej kolejności układu DMD w odpowiedniej sprzężonej płaszczyźnie obrazu w torze optycznym mikroskopu. Drugim krokiem procedury jest właściwe oświetlenie układu DMD intensywnym źródłem światła, takim jak laser.

Trzecim krokiem procedury jest wyeliminowanie efektu nakrapiania wynikającego z oświetlenia koherentnego. Ostatnim krokiem procedury jest zintegrowanie graficznego interfejsu użytkownika do sterowania chipem DMD. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące, że eksperymenty, które wcześniej były trudne do przeprowadzenia, mogą teraz zostać stosunkowo łatwo zrealizowane dzięki wielopunktowej lizie klatkowanych neuroprzekaźników z wykorzystaniem systemu DMD.

Witam, jestem Michael Mohammed z laboratorium dr Chaman Tang z Katedry Neurologii Uniwersytetu Maryland. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę generowania złożonych wzorów eliminacji w mikroskopie optycznym. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania integracji dendrytycznej.

Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół zademonstruje działanie systemu oświetlenia opartego na cyfrowym urządzeniu mikrozwierciadeł (DMD) w neuronauce eksperymentalnej. DMD to optyczny układ półprzewodnikowy zawierający kilkaset tysięcy mikroskopijnych, ruchomych zwierciadeł ułożonych w macierz prostokątną; pozycja każdego zwierciadła na jego powierzchni odpowiada pikselowi obrazu.

Każde lustro może być sterowane indywidualnie w celu zmiany nachylenia między dwiema orientacjami. W orientacji wyłączonej (off) światło jest kierowane poza oś optyczną oświetlenia preparatu. W orientacji włączonej (on) światło jest kierowane wzdłuż osi optycznej.

DMD jest bardzo dobrze dostosowany do lizy, ponieważ toleruje bardzo intensywne światło UV, generuje wysokie współczynniki kontrastu między pikselami włączonymi a wyłączonymi oraz może przełączać się między tymi dwoma stanami w czasie liczonym w dziesiątkach mikrosekund. Zastosowanie DMD w badaniach biomedycznych jest wspierane przez szerokie wykorzystanie oprogramowania i sprzętu do manipulacji obrazem, a także przez zainteresowanie komercyjne w dziedzinie wyświetlania obrazów. Komponenty modułowe są oferowane przez firmę Texas Instruments jako zestawy DLP discovery, które zapewniają wspierające sterowniki elektroniczne do adaptacji DMD do systemu mikroskopowego.

Należy zrozumieć podstawowe zasady optyki w mikroskopii. Podstawowy nowoczesny mikroskop fluorescencyjny składa się z toru obrazowania oraz toru oświetlenia. W jego skład wchodzi obiektyw, kostka filtrująca oraz dwie oddzielne soczewki tubusowe dla toru obrazowania i toru oświetlenia.

Mikroskop został zaprojektowany w taki sposób, aby posiadać płaszczyzny sprzężone z płaszczyzną obrazu preparatu, dzięki czemu obiekty znajdujące się w ogniskowej płaszczyźnie preparatu będą również widoczne w ogniskowej na tych sprzężonych płaszczyznach obrazu. Wynikającym z tej koncepcji wnioskiem jest to, że każdy jasny obraz utworzony w sprzężonej płaszczyźnie obrazu zostanie również ostro rzutowany na płaszczyznę obrazu preparatu. Strategia ta jest wykorzystywana do rzutowania komputerowo generowanego wzoru oświetlenia na preparat.

Wiązka laserowa służy jako bardzo jasne źródło światła, które oświetla wzór zaimplementowany przez mikrolustra na chipach DMD umieszczonych w sprzężonej płaszczyźnie obrazu. Konstrukcja systemu oświetlenia DMD zależy od świateł wzbudzających stosowanych w eksperymentach optogenetycznych, które wykorzystują światło o długości fali z zakresu widzialnego. Oświetlony wzór może zostać przesłany przez tor kamery.

W związku z tym chip DMD można po prostu zamontować w jednym z dwóch portów kamer modułu z podwójnym portem kamer. Ilekroć jednak przeprowadzane są eksperymenty z wykorzystaniem światła w zakresie UV, takie jak liza związków klatkowych, światło musi zostać wprowadzone przez tor iluminacji epi i musi zostać utworzona bardziej dostępna sprzężona płaszczyzna obrazu. Wynika to z faktu, że soczewka tubusu obrazującego nie jest przeznaczona do transmisji UV.

Zamiast tego wykorzystuje się soczewkę tubusową oświetlacza do transmisji UV, która zapewnia odpowiednią jakość formowania obrazu. Każde mikrolustro na DMD może przełączać się między dodatnim a ujemnym nachyleniem o 12 stopni względem płaszczyzny układu. W zależności od otrzymanego z komputera sygnału cyfrowego, oś obrotu przebiega wzdłuż przeciwległych narożników każdego lustra, pod kątem 45 stopni względem prostokątnych krawędzi układu.

Kierunek nachylenia lustra jest oznaczony złotym trójkątem w jednym z narożników przedniej powierzchni chipu. Nachylenie mikrolusterka determinuje ustawienie kąta pochylenia i azymutu nadchodzącej wiązki oświetlającej. Aby oświetlić DMD, należy najpierw ustawić kąt pochylenia wiązki oświetlającej na 24 stopnie względem osi prostopadłej do chipu DMD, a azymut ustawić prostopadle do osi obrotu lustra.

Precyzyjne wyrównanie wiązki jest krytyczne dla wydajnego działania. W przypadku eksperymentów z lizą należy użyć źródła laserowego do wygenerowania wysokointensywnej wiązki skupialnej, niezbędnej do szybkiego uwalniania cząsteczek (uncaging).

W tym przypadku zastosowano quasi-ciągły laser Nd:YAG o potrójnej częstotliwości, pompowany diodą w stanie stałym; wykorzystano laser o stosunkowo wysokiej mocy, ponieważ do preparatu dociera jedynie niewielka część mocy wyjściowej lasera. Podczas korzystania z systemu DMD wyjście lasera wprowadza się do włókna wielomodowego, aby można było go łatwo ustawić i zorientować wzdłuż odpowiedniej osi oświetlania DMD, co pozwala rozwiązać problem plamkowania (speckle) generowany przez oświetlenie koherentne; światło jest przesyłane poprzez włókno optyczne.

Włókno jest nawinięte na piezoelektryczny rozciągacz włókien, który jest sterowany tak, aby oscylował z częstotliwością około 40 kHz. Mikroskopijne rozciąganie włókna jest wystarczające, aby wielokrotnie przesunąć wzór plamek w czasie trwania każdego milisekundowego impulsu fotostymulacji, co skutecznie eliminuje zjawisko plamkowania. Na koniec wyjście włókna optycznego zostaje skolimowane za pomocą obiektywu mikroskopu UV w celu oświetlenia DMD, aby zarejestrować współrzędne pikseli CCD z oprogramowaniem obrazującym DMD, które koreluje poszczególne lustra DMD z konkretnymi pikselami kamery CCD.

Graficzny interfejs użytkownika w oprogramowaniu umożliwia użytkownikowi przypisanie orientacji lustra DMD odpowiadającej obszarowi na obrazie CCD za pomocą myszy komputerowej. Oznacz miejsce fotostymulacji, przesuwając kursor nad obrazem wyświetlanym na ekranie komputera, a następnie kliknij zaznaczony obszar zainteresowania, aby zaprogramować magazyn wzorów dostarczania światła. Wzór zaznaczony na ekranie komputera jako seria oddzielnych obrazów programuje w oprogramowaniu czas trwania impulsów lasera dla każdego wzoru przestrzennego.

Będzie to zintegrowane z programem do akwizycji danych P clamp. Na koniec należy użyć programu do akwizycji danych, aby skoordynować czas pracy elektroniki DMD, bramkowanie lasera oraz rejestrację sygnału elektrycznego z neuronu docelowego uzyskanego metodą patch-clamp. Tutaj przedstawiono kalibrację rozdzielczości układu optycznego.

Minimalny rozmiar plamki został przedstawiony na podstawie pomiaru z wykorzystaniem celu fluorescencyjnego. Efektywna rozdzielczość fizjologiczna jest mierzona amplitudą przepływu prądu jako funkcją fotostymulacji. W odniesieniu do pozycji plamki, uwięziony glutaminian został poddany fotolizie w sąsiedztwie odgałęzienia dendrytycznego o średnicy 2 µm.

Wraz z przemieszczaniem plamki, prostopadle w obrębie miejsca badania, przedstawiono odpowiedzi elektryczne na fotostymulację o różnym natężeniu. Pokazano odpowiedzi w warunkach zaciskania napięcia w funkcji natężenia lizy.

Rozproszoną stymulację dendrytyczną można łatwo zrealizować przy użyciu systemu opartego na DMD. W tym przypadku intensywność sygnału wejściowego zmieniano poprzez zwiększanie liczby punktów fotostymulacji, zaznaczonych jako okręgi na dwóch gałęziach dendrytycznych. Sumowanie przestrzenne może mieć charakter nieliniowy w obrębie punktów rozgałęzień.

Zależność ta staje się coraz bardziej superliniowa wraz ze wzrostem amplitud sygnałów wejściowych docierających do dwóch gałęzi drzwiowych. Wyniki te wyraźnie ilustrują nieliniowy charakter sumowania w punktach rozgałęzień dendrytycznych. Superliniowość jest w dużej mierze zapośredniczona przez receptory NMDA, a nie przez kanały sterowane napięciem.

Można to zademonstrować poprzez zastosowanie dwóch antagonistów receptorów NMDA – APV oraz MK 8 0 1, które w znacznym stopniu eliminują nieliniowe zachowanie. Przedstawiliśmy podstawową konstrukcję i działanie systemu opartego na DMD do fotostymulacji wzorców tkanki nerwowej. System ten można przystosować do stymulacji światłem widzialnym, stosowanym na przykład w eksperymentach optogenetycznych.

Może być on również dostosowany do światła bliskiego UV, stosowanego w jednofotonowej lizie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że w przypadku użycia światła o długości fali poniżej 400 nanometrów, które przechodzi przez ścieżkę oświetlenia epifluorescencyjnego, kluczowa jest precyzyjna kalibracja wiązki oświetlającej z dokładnością do kilku stopni, a w przypadku zastosowania światła koherentnego, należy skutecznie wyeliminować efekt ziarnistości (speckle). To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.