Mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek
March 15th, 2021
Tutaj opisujemy procedury opracowane w naszym laboratorium do przygotowywania proszków z małych kryształów molekularnych do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED).
W tej procedurze pokazujemy, jak w ciągu kilku minut przejść od proszku o małej cząsteczce do trójwymiarowej struktury. Jest to technika transformacyjna dla społeczności chemicznej. Wiele związków nie rośnie łatwo w duże kryształy.
Dzięki MicroED możemy określić struktury o rozdzielczości atomowej na podstawie kryształów o rozmiarach nanometrów. Procedurę zademonstruje dr Mike Martynowycz, który jest profesorem na UCLA. Na początek przenieś niewielką ilość proszku, płynu lub ciał stałych do małej fiolki lub probówki.
W przypadku próbek już w postaci proszku należy zamknąć probówkę za pomocą nakrętki do momentu, gdy próbka będzie potrzebna. Podobnie wysuszyć próbki cieczy na proszki. Owiń folię z tworzywa sztucznego wokół jednego końca szkiełka podstawowego.
Umieść siatki TEM na folii na szkiełku okładkowym brązową stroną z węgla skierowaną do góry. Następnie umieść szkiełko z kratkami w komorze rozżarzenia i rozładowuj jarzenie szkiełka pokrywowego przez około 30 sekund, używając ujemnego ustawienia na 15 pikomerów. Kratki na szkiełku pokrywy należy przechowywać na szklanej szalce Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną przed dodaniem próbki do kratek.
Usuń siatkę TEM z rozżarzonej płytki Petriego za pomocą pęsety i umieść ją na okrągłej bibule filtracyjnej stroną węglową skierowaną do góry. Za pomocą małej szpatułki wyjmij bardzo małą miarkę proszku i umieść ją na małym kwadratowym szklanym szkiełku nakrywkowym tuż obok siatki TEM na bibule filtracyjnej. Umieść kolejny mały kwadratowy szkiełko lub szkiełko nakrywkowe na wierzchu proszku.
Palcami delikatnie przetarć o siebie dwa szklane szkiełka, aby uzyskać drobny proszek. Ustaw szkiełka nakrywkowe pod kątem i umieść je tuż nad siatką TEM na bibule filtracyjnej i kontynuuj pocieranie szkiełek nakrywkowych zaledwie kilka centymetrów powyżej rozżarzonej siatki TEM. Obserwuj, czy proszek spada w kierunku siatki.
Odkryj drobno zmielony proszek, usuwając jedno z dwóch szkiełek nakrywkowych. Następnie delikatnie zetrzyj drobny proszek z szkiełka nakrywkowego na siatkę TEM za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej. Chwyć krawędź siatki TEM za pomocą zestawu pęset, upewniając się, że końcówki nie przebijają żadnego z kwadratów siatki.
Podnieś siatkę o jeden do dwóch centymetrów ponad bibułę filtracyjną i ustaw siatkę pod kątem 90 stopni w stosunku do bibuły poniżej. Delikatnie postukaj w pęsetę, trzymając siatkę mocno napiętą, aby usunąć luźny proszek. Zamroź siatkę, przesuwając ręcznie końcówkę pęsety z kratką bezpośrednio do pojemnika na ciekły azot i poczekaj, aż kratka i pęseta przestaną wrzeć.
Pod ciekłym azotem umieść siatkę w uchwycie próbki z stroną węglową zorientowaną w taki sposób, aby próbka została uderzona przez wiązkę przed folią nośną z węgla. Załadować uchwyt próbki do TEM, upewniając się, że siatka jest zawsze utrzymywana w temperaturze ciekłego azotu. W przypadku systemów automatycznego podajnika należy umieścić przycięte siatki w kasecie w pojemniku chłodzonym ciekłym azotem, co pozwala robotom z automatyczną ładowarką przyjąć kasetę, jednocześnie zapewniając bezpieczeństwo próbek do transportu między automatyczną ładowarką a kolumną.
Otwórz zawory kolumny TEM i wyreguluj powiększenie za pomocą paneli ręcznych na najmniejsze możliwe powiększenie. Znajdź wiązkę, regulując pokrętło intensywności na panelach dłoni tak, aby na ekranie fluorescencyjnym widoczny był okrągły, jasny obszar. Wykonaj atlas całej siatki przy małym powiększeniu za pomocą odpowiedniego oprogramowania, upewniając się, że mikroskop jest dobrze ustawiony zarówno do obrazowania w małym, jak i dużym powiększeniu, przed zebraniem danych MicroED o wysokiej rozdzielczości.
Zidentyfikuj kwadraty siatki bez połamanego węgla i widocznych czarnych lub ciemnych ziaren na folii. Poruszaj się po siatce, fizycznie za pomocą joysticka na panelach ręcznych lub wirtualnie w zebranym atlasie, aby wyszukać kwadraty siatki, które nie są uszkodzone i zawierają mikrokryształy. Dodaj środek każdego z tych kwadratów do listy lokalizacji siatki do badania, którą można dodać do notatnika w interfejsie użytkownika mikroskopu lub w oprogramowaniu do automatyzacji mikroskopu.
Ustaw powiększenie w zakresie od 500 do 1300x. Dostosuj wysokość środka ciężkości w każdej zapisanej lokalizacji siatki i zaktualizuj zapisaną wartość Z do zanotowanych pozycji. Szukaj na ekranie fluorescencyjnym lub na płaskiej kamerze małych czarnych plam lub ziaren na siatce.
Dobra próbka często będzie miała ostre krawędzie przy dużym powiększeniu, co sugeruje, że kryształ jest w porządku. Przesuń znajdujący się kryształ potencjału na środek ekranu i zwiększ powiększenie tak, aby TEM przeszedł w tryb dużego powiększenia. Wstaw otwór wybranego obszaru i zmień przysłonę na większy lub mniejszy, aby upewnić się, że wybrany obszar jest większy niż kryształ.
Przełącz na tryb defrakcji, naciskając przycisk defrakcji na panelach ręcznych TEM, upewniając się, że ekran fluorescencyjny jest włożony. Dostosuj długość kamery za pomocą pokrętła powiększenia tak, aby krawędź miała rozdzielczość co najmniej jednego angstrema. Dostosuj ostrość dyfrakcyjną tak, aby centralny punkt był jak najbardziej ostry i mały.
Za pomocą pokręteł zmiany biegów dyfrakcyjnych przesuń wiązkę środkową do środka ekranu fluorescencyjnego. Włóż ogranicznik belki, upewniając się, że belka znajduje się za nim. Podnieś ekran fluorescencyjny i zrób krótką ekspozycję na aparacie.
Sprawdź odpowiedni wzór defrakcji, upewniając się, że wzór będzie miał ostre punkty, które są regularnie ułożone w kolumnach i rzędach. Zapisz współrzędne kryształu w interfejsie użytkownika TEM lub zapisując je, a następnie powtórz badanie dyfrakcyjne dla wszystkich potencjalnych kryształów zainteresowania na bieżącym kwadracie siatki. Wyśrodkuj ekranowany kryształ pod kątem powiększenia większym niż 1000x i dostosuj wysokość środka kryształu za pomocą procedury automatycznej lub ręcznie.
Wstaw otwór wybranego obszaru, który najlepiej pasuje do rozmiaru i kształtu kryształu. Przechylaj stół montażowy w kierunku ujemnym i dodatnim, aż obraz zostanie zasłonięty przez paski siatki. Zanotuj te kąty w celu gromadzenia danych, odczytując dane co sekundę w nowoczesnym aparacie z trybem odczytu migawki typu rolling shutter.
Ustaw szybkość obrotową, określając procent maksymalnej prędkości pochylania i czas zatrzymania w interfejsie użytkownika mikroskopu lub dedykowanym oprogramowaniu. Zapisuj dane w różnych formatach, na przykład pojedyncze klatki lub jako stos obrazów. Film defrakcji w formacie krystalograficznym zebrany z mikrokryształów pokazuje ciągły zestaw danych MicroED o ciągłej rotacji z mikrokryształu karbamazepiny zidentyfikowanego na siatce TEM.
Po zebraniu, integracji i uporządkowaniu danych określana jest struktura o wysokiej rozdzielczości, a jej przejrzystość zależy od jakości i kompletności danych. Zastosowanie próbki do siatki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych danych. Zgodnie z tą metodą dane mogą być dalej przetwarzane za pomocą standardowego oprogramowania krystalograficznego.
Wykazanie, że mikroED jest potężną metodą dla małych cząsteczek, otworzyło jej zastosowanie na całym świecie do rozwiązywania nowych struktur krytycznie ważnych cząsteczek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę przygotowywania proszków małych cząsteczek do eksperymentów dyfrakcji elektronowo-mikrokrystalicznej (MicroED). Ta technika umożliwia oznaczanie struktur o rozdzielczości atomowej z nanometrekowych kryształów, co jest znaczącym postępem dla społeczności chemików.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrokrystalna dyfrakcja elektronowa
- Biologia strukturalna
- Krystalografia małych cząsteczek
Tło
- Wiele związków nie łatwo krystalizuje się w duże kryształy.
- MicroED zapewnia rozwiązanie do oznaczania struktur z małych kryształów.
- Ta metoda może przynieść wyniki w ciągu kilku minut.
- Dr Mike Martynowycz z UCLA demonstruje procedurę.
Cel badania
- Aby zaprezentować przełomową technikę w krystalografii małych cząsteczek.
- Aby umożliwić badaczom szybkie wyznaczanie trójwymiarowych struktur.
- Aby ułatwić badanie związków, które są trudne do krystalizacji.
Stosowane metody
- Przygotowanie proszków małych cząsteczek.
- Przenoszenie proszków do małych fiolek lub probówek.
- Wykorzystanie MicroED do oznaczania struktur.
- Demonstracja przez doświadczonego badacza.
Główne wyniki
- Skuteczna ocena struktur o rozdzielczości atomowej.
- Szybkie przetwarzanie od proszku do trójwymiarowej struktury.
- Zastosowanie MicroED do różnorodnych małych cząsteczek.
- Lepsze zrozumienie związków, które są trudne do krystalizacji.
Wnioski
- MicroED jest cenną techniką w biologii strukturalnej.
- Ta metoda otwiera nowe szlaki dla badań w dziedzinie chemii.
- Znacznie skraca czas potrzebny na wyznaczenie struktury.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microcrystal electron diffraction (MicroED) enables rapid, atomic-resolution structure determination of small molecules directly from nanocrystals, addressing a key bottleneck in pharmaceutical discovery. This capability enhances predictive confidence in early-stage compound characterization and accelerates the transition from chemical synthesis to structural validation. MicroED's compatibility with standard cryo-EM infrastructure positions it as a scalable, enterprise-ready solution for portfolio-wide structural elucidation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct atomic-level structure determination of drug candidates from minimal sample quantities.
- Reduces reliance on large crystal growth, de-risking early-stage compound progression.
- Supports rapid hypothesis testing for molecular identity and conformation.
- Facilitates functional target validation by confirming compound structure prior to downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microcrystal grids for high-throughput structural screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative diffraction data for compound assessment.
- Enables scalable screening of diverse chemical libraries using standardized protocols.
- Supports reliable evaluation of compound purity and polymorphism.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with translational biomarker development when structure-activity relationships are critical.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing definitive molecular structures.
- De-risks advancement decisions by confirming compound integrity before in vivo studies.
- Supports mechanistic studies requiring precise molecular geometry.
Pipeline & Workflow Integration
MicroED integrates into the discovery continuum from early compound synthesis through lead identification and preclinical validation, providing a structural checkpoint that informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming molecular structure at the nanocrystal stage.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible microcrystal grids for downstream structural and functional analyses.
- Analytics: Generates quantitative diffraction patterns and high-resolution structural outputs for comparative assessment.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring structural fidelity of candidate molecules.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol applicable across diverse compound classes and R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in compound characterization.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and reproducible workflows compatible with existing cryo-EM infrastructure.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by minimizing delays in structural validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally confirmed candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM sample handling and TEM operation.
- Depends on access to glow discharge chambers, liquid nitrogen, and high-resolution TEM instrumentation.
- Demands cross-team standardization of grid preparation and data collection protocols.
- Adaptable to a wide range of small molecules, peptides, and pharmaceutical compounds.
- Sample quality and grid preparation are critical for obtaining high-quality diffraction data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Preparing Small Molecule Samples and TEM Grids
1:37
Applying Sample to Grids by Creating a Homogenous Fine Powder
2:51
Freezing and Loading Grids into the TEM
4:12
Locating and Screening Nanocrystals
7:33
Collecting MicroED Data
8:36
Results: Analysis of MicroED Dataset from Carbamazepine Microcrystal
9:10
Conclusion
