Name: Mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj mikrokrystaliczną dyfrakcję elektronów (MicroED) do wyznaczania struktur małych cząsteczek z nanokryształów. Ta metoda pozwala uzyskać struktury atomowe w mniej niż 30 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium Gonen jest wspierane przez fundusze z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health P41GM136508.

1. Przygotowanie próbek małych cząsteczek
<ol>
	<li>Przenieść niewielką ilość (0,01 - 1 mg) proszku, płynu lub ciał stałych do małej fiolki lub probówki.</li>
	<li>W przypadku próbek już w postaci proszku należy zamknąć probówkę za pomocą nakrętki do momentu, gdy próbka będzie potrzebna. Wysuszyć próbki cieczy na proszki przed próbami metody 1 (etap 3) lub 2 (etap 4). 
	UWAGA: Próbki rozpuszczone w cieczy mogą być objęte metodą 3 (5.X) poniżej</li>
</ol>
2. Przygotowanie siatek TEM
UWAGA: Niektóre TEMy z systemami automatycznego ładowania wymagają, aby siatki były przycięte i umieszczone w kasecie przed załadowaniem do kolumny TEM. Clipping polega na fizycznym zamocowaniu siatki TEM 3 mm w metalowym pierścieniu, którym może manipulować automat ładujący. Ten krok i kolejne kroki można wykonać przy użyciu normalnych siatek TEM lub siatek TEM, które zostały przycięte. W przypadku tych eksperymentów często łatwiej jest manipulować siatkami, jeśli zostały one wcześniej przycięte.
<ol>
	<li>Owiń folię z tworzywa sztucznego wokół jednego końca szkiełka podstawowego.</li>
	<li>Umieść siatki TEM na folii na górze szkiełka pokrywy stroną z włókna węglowego skierowaną do góry. Zidentyfikuj dwie strony siatki pod światłem. Strona miedziana błyszczy i wydaje się metaliczna, podczas gdy strona węglowa ma szary, brązowy kolor (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C,D). W przypadku przyciętych siatek strona z włókna węglowego powinna być skierowana w stronę płaskiej powierzchni pierścienia zaciskowego.</li>
	<li>Umieść szkiełko z kratkami w komorze wyładowczej jarzeniowej. Rozładowuj jarzenie przez pokrywę przez około 30 s przy ujemnym ustawieniu na 15 pA. Przechowywać kratki na szkiełku pokrywy wewnątrz szklanej szalki Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną przed dodaniem próbki do kratek.</li>
</ol>
3. Nakładanie próbki na siatki poprzez tworzenie jednorodnego drobnego proszku (Metoda 1)
<ol>
	<li>Usuń rozżarzoną siatkę TEM z zakrytej szalki Petriego za pomocą pęsety. Umieść siatkę na okrągłej bibule filtracyjnej stroną węglową skierowaną do góry.</li>
	<li>Za pomocą małej szpatułki wyjmij bardzo małą miarkę proszku (około 0,1 mg) i umieść ją na małym, kwadratowym, szklanym szkiełku nakrywkowym tuż obok siatki TEM na bibule filtracyjnej. Umieść kolejne małe kwadratowe szkiełko lub szkiełko nakrywkowe na wierzchu proszku.</li>
	<li>Palcami delikatnie przetrzyj ze sobą dwa szklane szkiełka, aby uzyskać drobny proszek.</li>
	<li>Ustaw szkiełka nakrywkowe pod kątem i umieść je tuż nad siatką TEM na bibule filtracyjnej i kontynuuj pocieranie szkiełek nakrywkowych, zaledwie kilka cm powyżej rozżarzonej siatki TEM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Obserwuj, czy proszek spada w kierunku siatki. Odsłoń drobno zmielony proszek, usuwając jedno z dwóch szklanych szkiełek nakrywkowych. Delikatnie zetrzyj drobny proszek z szkiełka nakrywkowego za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej na siatkę TEM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Nakładanie próbki na siatkę metodą "wstrząsania" (Metoda 2)
<ol>
	<li>Chwyć siatkę za pomocą pęsety i wrzuć ją do fiolki lub probówki z próbką proszku. Zamknąć fiolkę za pomocą plastikowej nakrętki, aby upewnić się, że materiał nie wydostanie się na zewnątrz podczas wstrząsu.</li>
	<li>Chwytając fiolkę w dłoń, potrząsnąć fiolką tak, aby proszek i siatka poruszały się przez około 10 - 30 sekund.</li>
	<li>Opróżnij zawartość fiolki na okrągłą bibułę filtracyjną. Chwytając siatkę za krawędź, delikatnie postukaj krawędzią siatki o bibułę filtracyjną, aby usunąć nadmiar materiału z siatki. 
	UWAGA: W zależności od rodzaju i wielkości fiolki można również użyć pęsety do usunięcia siatki TEM bez opróżniania zawartości.</li>
</ol>
5. Nakładanie próbki na siatki metodą odparowywania (Metoda 3)
<ol>
	<li>Umieść siatkę (przypiętą lub nie) na środku okrągłego kawałka bibuły filtracyjnej stroną węglową skierowaną do góry, a miedzianą stroną skierowaną w dół.</li>
	<li>Za pomocą gazoszczelnej strzykawki o pojemności 10 μl nanieść niewielką kroplę (około 1 - 3 μl) rozpuszczonego związku na węglową stronę siatki.</li>
	<li>Delikatnie przenieś bibułę filtracyjną z kratkami do próżniowej komory osuszającej. Przykryj komorę i włącz próżnię. Pozostaw kratki pod odkurzaczem do wyschnięcia na okres do jednego dnia.</li>
	<li>Wyłącz próżnię i pozwól komorze odpocząć przez 5 minut. Odpowietrzenie komory zapobiega przesuwaniu się lub odlatywaniu kratek, gdy jest odkryta.</li>
</ol>
6. Zamrażanie i wczytywanie siatek do TEM
<ol>
	<li>Chwyć krawędź siatki TEM za pomocą zestawu pęsety, upewniając się, że końcówki nie przebijają żadnego z kwadratów siatki. Podnieś siatkę 1-2 cm nad bibułę filtracyjną i ustaw ją pod kątem 90° w stosunku do bibuły poniżej. Delikatnie postukaj w pęsetę, trzymając siatkę mocno napiętą, aby usunąć luźny proszek.</li>
	<li>Zamroź siatkę, przesuwając ręcznie końcówkę pęsety z siatką bezpośrednio do pojemnika na ciekły azot. Ten pojemnik jest zazwyczaj stacją załadunku siatki dla TEM, ale może to być dowolny bezpieczny pojemnik, taki jak bezpieczny termos z ciekłym azotem, który jest dopuszczalny do przenoszenia lub przechowywania. Ciekły azot ma temperaturę -196 °C.</li>
	<li>Poczekaj, aż siatka i pęseta przestaną wrzeć przed dalszymi manipulacjami.</li>
	<li>Pod ciekłym azotem lub w oparach azotu umieścić siatkę w uchwycie próbki stroną z włókna węglowego zorientowaną w taki sposób, aby próbka została uderzona przez wiązkę przed folią nośną z węgla.</li>
	<li>Załadować uchwyt próbki do TEM, upewniając się, że siatka jest przez cały czas utrzymywana w temperaturze ciekłego azotu.
	<ol>
		<li>W przypadku systemów automatycznego ładowania należy umieścić przycięte kratki w kasecie w pojemniku chłodzonym ciekłym azotem. Kaseta ta jest przenoszona do kontenera wahadłowego, co pozwala robotom automatycznego podajnika na przyjęcie kasety, jednocześnie zapewniając bezpieczeństwo próbek do transportu między automatycznym podajnikiem a kolumną.</li>
		<li>W przypadku konfiguracji TEM z bocznym wejściem przymocuj siatkę do komercyjnego uchwytu TEM z bocznym wejściem. Uchwyty te są wyposażone w pojemnik do przygotowania próbki, który jest wypełniony ciekłym azotem, aby umożliwić przeniesienie siatki do uchwytu bez podgrzewania próbki. Uchwyt z bocznym wejściem wkłada się do TEM bezpośrednio, a próbka jest zabezpieczona na końcu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Zbieranie danych MicroED
<ol>
	<li>Lokalizowanie i badania przesiewowe nanokryształów
	<ol>
		<li>Otwórz zawory kolumny TEM. Dostosuj powiększenie za pomocą paneli dłoni do najniższego możliwego powiększenia. Znajdź wiązkę, regulując pokrętło intensywności na panelach dłoni tak, aby na ekranie fluorescencyjnym widoczny był okrągły, jasny obszar.</li>
		<li>Wykonaj atlas całej siatki w małym powiększeniu (50 - 300x) za pomocą odpowiedniego oprogramowania14,15,16 (Rysunek 2). Upewnij się, że mikroskop jest dobrze ustawiony zarówno do obrazowania w małym, jak i dużym powiększeniu przed zebraniem danych MicroED o wysokiej rozdzielczości.</li>
		<li>Zidentyfikuj kwadraty siatki bez połamanego węgla i z widocznym czarnym lub ciemnym materiałem/ziarnami na folii (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Poruszaj się po siatce, fizycznie za pomocą joysticka na panelach dłoni lub wirtualnie na zebranym Atlasie, aby wyszukać kwadraty siatki, które nie są złamane i zawierają mikrokryształy.</li>
		<li>Dodaj środek każdego z tych kwadratów do listy lokalizacji siatki do zbadania. Lokalizacje te można dodać do notebooka, w interfejsie użytkownika mikroskopu lub w oprogramowaniu do automatyzacji mikroskopu.</li>
		<li>Zwiększ powiększenie do 500-1,300x i dostosuj wysokość eucentryczną w każdym zapisanym miejscu siatki i zaktualizuj zapisaną wartość Z do pozycji zanotowanych w 7.1.4.</li>
		<li>Szukaj na ekranie fluorescencyjnym lub w szybkim aparacie przy tym większym powiększeniu małych czarnych punktów/ziaren na siatce. Dobra próbka często ma ostre krawędzie przy dużym powiększeniu, co sugeruje porządek krystaliczny.</li>
		<li>Przesuń zlokalizowany kryształ potencjału na środek ekranu i zwiększ powiększenie tak, aby TEM przeszedł w tryb dużego powiększenia. 
		UWAGA: Jest to określane jako tryb dużego powiększenia, Zoom2 lub SA w różnych instrumentach i zazwyczaj odpowiada powiększeniom 3,000x lub wyższym.</li>
		<li>Wstawianie otworu zaznaczonego obszaru. Zmień przysłonę na większy lub mniejszy, aby upewnić się, że wybrany obszar jest po prostu większy niż kryształ (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Przełącz się w tryb dyfrakcji, naciskając przycisk dyfrakcji na panelach ręcznych TEM, upewniając się, że ekran fluorescencyjny jest włożony. Dostosuj długość kamery za pomocą pokrętła powiększenia tak, aby krawędź miała rozdzielczość co najmniej 1 A. 
		UWAGA: Kalibracja długości dyfrakcji powinna być wykonana przez inżyniera serwisu przy użyciu złotej kraty waflowej lub znanej próbki przed przystąpieniem do eksperymentów MicroED.</li>
		<li>Dostosuj ostrość dyfrakcyjną tak, aby centralny punkt był jak najbardziej ostry i mały. Za pomocą pokręteł zmiany biegów dyfrakcyjnych przesuń wiązkę środkową do środka ekranu fluorescencyjnego</li>
		<li>Włóż ogranicznik belki i upewnij się, że belka znajduje się za nim. Podnieś ekran fluorescencyjny. Wykonaj krótką (około 1 s) ekspozycję na kamerze (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
		<li>Sprawdź odpowiedni wzór dyfrakcyjny. Dobry kandydat do zebrania pełnego zbioru danych będzie miał ostre punkty, które są regularnie ułożone w kolumnach i rzędach, a dyfrakcja będzie rozciągać się poza 2 A, najlepiej co najmniej do 1 A (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Zapisz współrzędne kryształu w interfejsie użytkownika TEM lub zapisując je.</li>
		<li>Powtórz badanie dyfrakcyjne dla wszystkich potencjalnych kryształów będących przedmiotem zainteresowania na bieżącym kwadracie siatki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie danych
	<ol>
		<li>Wyśrodkuj ekranowany kryształ na ekranie przy dużym powiększeniu (> 1,000x). Dostosuj eucentryczną wysokość kryształu za pomocą procedury automatycznej lub ręcznie.</li>
		<li>Wstaw otwór wybranego obszaru, który najlepiej pasuje do rozmiaru i kształtu kryształu, jak określono w 7.1.8 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Przechyl stolik w kierunku ujemnym i dodatnim, aż obraz zostanie zasłonięty przez paski siatki (Rysunek 3). Zanotuj te kąty w celu zbierania danych.</li>
		<li>Określ liczbę klatek, które będą wymagane do rozciągnięcia całkowitego klina kątowego zestawu danych. Typowe jest użycie klinów 0,5 - 1,0° dla każdej klatki, przy czym klatki są odczytywane co 1 do 5 sekund, w zależności od czułości kamery. Na przykład klin o rozpiętości od -30° do +30°, obracający się ze stałą prędkością 1° s-1 z klatką odczytywaną co 1 s, wymagałby łącznie 60 klatek.</li>
		<li>Biorąc pod uwagę maksymalny całkowity zakres pochylenia od -72° do +72°, rozpocznij obracanie stolika ze stałą szybkością 1° s-1, a następnie zacznij odczytywać dane co 1 s w nowoczesnym aparacie z trybem odczytu rolling shutter (Film 1). Proces ten można wykonać ręcznie lub za pomocą specjalnego oprogramowania TEM.
		<ol>
			<li>Ustaw prędkość obrotową, określając % maksymalnej prędkości pochylenia i czas zatrzymania w interfejsie użytkownika mikroskopu lub dedykowanym oprogramowaniu. W tym badaniu zmierzono wartość 0,3° s-1 na każdy % prędkości maksymalnej, ale będzie to musiało zostać niezależnie zweryfikowane dla każdego mikroskopu. 
			UWAGA: Przechylanie i zbieranie danych z kamery są tutaj konfigurowane niezależnie, ale programy14 mogą to koordynować, aby uprościć proces.</li>
			<li>Odrzuć około 1° z każdej strony określonego klina w większości przypadków jako czas martwy, w którym stage albo rośnie, albo zwalnia do żądanej prędkości obrotowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapisuj dane w różnych formatach jako pojedyncze klatki lub jako stos obrazów (Film 1).</li>
		<li>Przekształć te ramki dyfrakcyjne do typowego formatu krystalograficznego za pomocą narzędzi MicroED - dostępnych tutaj (https://cryoem.ucla.edu). Obrazy dyfrakcyjne zapisane w formacie SMV są łatwo przetwarzane za pomocą udokumentowanego oprogramowania krystalograficznego17,18.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345(2013).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li>
<li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li>
<li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+A+Foundations+and+Advances%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+limitations+of+neutrons%2C+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li>
<li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109(2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li>
<li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li>
<li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li>
<li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-%C3%A5ngstr%C3%B6m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li>
<li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li>
<li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+with+SerialEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li>
<li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+catalase+determined+by+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600(2014).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie próbki jest zazwyczaj procesem iteracyjnym, w którym optymalizacje są dokonywane po sesjach badań przesiewowych i zbierania danych. W przypadku próbek małocząsteczkowych często rozsądnie jest najpierw podjąć próbę przygotowania siatki bez rozładowania jarzeniowego, ponieważ wiele farmaceutyków ma tendencję do hydrofobowości10,11. Jeśli siatki mają zbyt mało nanokrystalicznych osadów, dobrym pomysłem jest ponowienie próby po pierwszym rozładowaniu ja...

Dyfrakcja elektronów mikrokrystalicznych (MicroED) to metoda kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) służąca do określania struktur o rozdzielczości atomowej z kryształów o rozmiarach submikrometrowych1,2. Kryształy są nakładane na standardowe siatki transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) i zamrażane przez zanurzenie w ciekłym etanie lub ciekłym azocie. Siatki są następnie ładowane do TEM pracującego w temperaturach kriogenicznych. Kryształy są umieszczane na siatce i przesiewane pod kątem początkowej jakości dyfrakcji. Dane MicroED o ciągłej rotacji są zbierane z podzbioru przesiewanych kryształów, gdzie dane są zapisywane za pomocą szybkiej kamery jako movie3. Filmy te są konwertowane do standardowego formatu krystalograficznego i przetwarzane prawie identycznie jak eksperyment z krystalografią rentgenowską4.
MicroED został pierwotnie opracowany do badania mikrokryształów białek1,2. Wąskim gardłem w krystalografii białek jest hodowanie dużych, dobrze uporządkowanych kryształów do tradycyjnych eksperymentów dyfrakcji synchrotronowej promieniowania rentgenowskiego. Ponieważ elektrony oddziałują z materią o rzędy wielkości silniej niż promieniowanie rentgenowskie, ograniczenia rozmiaru kryształu potrzebnego do wytworzenia wykrywalnej dyfrakcji są znacznie mniejsze5. Dodatkowo, stosunek zdarzeń rozpraszania sprężystego do nieelastycznego jest korzystniejszy dla elektronów, co sugeruje, że można zebrać bardziej użyteczne dane przy mniejszej ogólnej ekspozycji5. Ciągły rozwój pozwolił na zbieranie danych MicroED z najtrudniejszych mikrokryształów6,7,8,9.
Ostatnio okazało się, że MicroED jest potężnym narzędziem do określania struktur małocząsteczkowych farmaceutyków z pozornie amorficznych materiałów10,11,12,13. Proszki te mogą pochodzić prosto z butelki zakupionego odczynnika, kolumny oczyszczającej, a nawet z rozdrobnienia pigułki na drobny proszek10. Proszki te wydają się amorficzne na oko, ale mogą być albo w całości złożone z nanokryształów, albo zawierać tylko śladowe ilości osadów nanokrystalicznych w większej niekrystalicznej, amorficznej frakcji. Nakładanie materiału na siatkę jest łatwe, a kolejne etapy identyfikacji kryształów, badań przesiewowych i zbierania danych mogą zostać nawet zautomatyzowane w niedalekiej przyszłości14. Podczas gdy inni mogą stosować różne metody przygotowania próbek i zbierania danych, tutaj szczegółowo opisano protokoły opracowane i stosowane w laboratorium Gonen do przygotowywania próbek małych cząsteczek do MicroED i do zbierania danych.

<table><tbody><tr><td>0,1-1,5 ml probówki Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-282-300</td><td>Każda fiolka lub probówka będzie odpowiednia.</td></tr><tr><td>Klipsy z automatyczną siatką</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036173</td><td>Siatki przycięte nie są wymagane w przypadku MicroED. Są one wymagane w przypadku maszyn TEM Thermo-Fisher wyposażonych w system automatycznego ładowania.</td></tr><tr><td>Pierścienie C z automatyczną siatką</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazapine</td><td>Sigma</td><td>C4024-1G</td><td>Do tych eksperymentów wystarczy dowolna ilość</td></tr><tr><td>Detektor oparty na CMOS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>CetaD 16M</td><td>Użyliśmy CetaD 16M, ale każdy detektor z trybem rolling shutter lub wystarczająco szybkim odczytem jest dopuszczalny.&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Delphi</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie w systemach TEM Thermo-Fisher, które pozwala na ręczne obracanie stolika na próbkę</td></tr><tr><td>Oprogramowanie EPU-D</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Komercyjne oprogramowanie do pozyskiwania danych MicroED</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Hampton</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Wyładowarka żarowa</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>High PrecisionPęseta</td><td>EMS</td><td>78325-AC</td><td>Każda precyzyjna pęseta zrobi to</td></tr><tr><td>: Naczynie z ciekłym azotem</td><td>Spear Lab</td><td>FD-800</td><td>Standardowe naczynie piankowe do przenoszenia próbek pod ciekłym azotem - 800 ml</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SerialEM</td>, <td>UC Boulder</td><td>N/A</td><td>Darmowe oprogramowanie dystrybuowane przez D. Mastronarde. Zakład Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwoju Siatki</td></tr><tr><td>TEM</td> Zastosowano tutaj siatki <td>Quantifoil/EMS</td><td>Q310CMA</td><td>Multi-A 300 mesh, ale wszelkie cienkie siatki węglowe będą działać. W przypadku tych małych cząsteczek sugerujemy rozpoczęcie od węgla ciągłego.&nbsp;</td></tr><tr><td>transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)</td><td>Bibuła filtracyjna okrągła Thermo-Fisher</td><td>Talos Arctica</td><td></td></tr><tr><td>Whatman</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>90 mm lub większa</td></tr></tbody></table>

mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Opisano szczegółowy protokół przygotowania próbek małych cząsteczek do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED). MicroED został opracowany do rozwiązywania struktur białek i małych cząsteczek przy użyciu standardowego sprzętu do kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM). W ten sposób małe cząsteczki, peptydy, rozpuszczalne białka i białka błonowe zostały ostatnio określone w wysokich rozdzielczościach. Przedstawiono tu protokoły przygotowania siatek farmaceutyków małocząsteczkowych na przykładzie leku karbamazepiny. Przedstawiono protokoły badań przesiewowych i zbierania danych. Dodatkowe kroki w całym procesie, takie jak integracja danych, określanie struktury i udoskonalanie, są przedstawione w innym miejscu. Szacuje się, że czas potrzebny do przygotowania siatek drobnocząsteczkowych wynosi mniej niż 30 minut.

MicroED to metoda cryoEM wykorzystująca silne oddziaływania między elektronami a materią, co pozwala na badanie niezwykle małych kryształów12,13. Po wykonaniu tych kroków oczekuje się uzyskania filmu dyfrakcyjnego w formacie krystalograficznym, zarejestrowanego z mikrokryształów (Film 1). W tym przypadku technika została zademonstrowana z użyciem karbamazepiny12. Wyniki przedstawiają zestaw danych MicroED z ciągłą rotacją ...

Tutaj opisujemy procedury opracowane w naszym laboratorium do przygotowywania proszków z małych kryształów molekularnych do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED).

Mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

W tej procedurze pokazujemy, jak w ciągu kilku minut przejść od proszku o małej cząsteczce do trójwymiarowej struktury. Jest to technika transformacyjna dla społeczności chemicznej. Wiele związków nie rośnie łatwo w duże kryształy.Dzięki MicroED możemy określić struktury o rozdzielczości atomowej na podstawie kryształów o rozmiarach nanometrów. Procedurę zademonstruje dr Mike Martynowycz, który jest profesorem na UCLA. Na początek przenieś niewielką ilość proszku, płynu lub ciał stałych do małej fiolki lub probówki.W przypadku próbek już w postaci proszku należy zamknąć probówkę za pomocą nakrętki do momentu, gdy próbka będzie potrzebna. Podobnie wysuszyć próbki cieczy na proszki. Owiń folię z tworzywa sztucznego wokół jednego końca szkiełka podstawowego.Umieść siatki TEM na folii na szkiełku okładkowym brązową stroną z węgla skierowaną do góry. Następnie umieść szkiełko z kratkami w komorze rozżarzenia i rozładowuj jarzenie szkiełka pokrywowego przez około 30 sekund, używając ujemnego ustawienia na 15 pikomerów. Kratki na szkiełku pokrywy należy przechowywać na szklanej szalce Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną przed dodaniem próbki do kratek.Usuń siatkę TEM z rozżarzonej płytki Petriego za pomocą pęsety i umieść ją na okrągłej bibule filtracyjnej stroną węglową skierowaną do góry. Za pomocą małej szpatułki wyjmij bardzo małą miarkę proszku i umieść ją na małym kwadratowym szklanym szkiełku nakrywkowym tuż obok siatki TEM na bibule filtracyjnej. Umieść kolejny mały kwadratowy szkiełko lub szkiełko nakrywkowe na wierzchu proszku.Palcami delikatnie przetarć o siebie dwa szklane szkiełka, aby uzyskać drobny proszek. Ustaw szkiełka nakrywkowe pod kątem i umieść je tuż nad siatką TEM na bibule filtracyjnej i kontynuuj pocieranie szkiełek nakrywkowych zaledwie kilka centymetrów powyżej rozżarzonej siatki TEM. Obserwuj, czy proszek spada w kierunku siatki.Odkryj drobno zmielony proszek, usuwając jedno z dwóch szkiełek nakrywkowych. Następnie delikatnie zetrzyj drobny proszek z szkiełka nakrywkowego na siatkę TEM za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej. Chwyć krawędź siatki TEM za pomocą zestawu pęset, upewniając się, że końcówki nie przebijają żadnego z kwadratów siatki.Podnieś siatkę o jeden do dwóch centymetrów ponad bibułę filtracyjną i ustaw siatkę pod kątem 90 stopni w stosunku do bibuły poniżej. Delikatnie postukaj w pęsetę, trzymając siatkę mocno napiętą, aby usunąć luźny proszek. Zamroź siatkę, przesuwając ręcznie końcówkę pęsety z kratką bezpośrednio do pojemnika na ciekły azot i poczekaj, aż kratka i pęseta przestaną wrzeć.Pod ciekłym azotem umieść siatkę w uchwycie próbki z stroną węglową zorientowaną w taki sposób, aby próbka została uderzona przez wiązkę przed folią nośną z węgla. Załadować uchwyt próbki do TEM, upewniając się, że siatka jest zawsze utrzymywana w temperaturze ciekłego azotu. W przypadku systemów automatycznego podajnika należy umieścić przycięte siatki w kasecie w pojemniku chłodzonym ciekłym azotem, co pozwala robotom z automatyczną ładowarką przyjąć kasetę, jednocześnie zapewniając bezpieczeństwo próbek do transportu między automatyczną ładowarką a kolumną.Otwórz zawory kolumny TEM i wyreguluj powiększenie za pomocą paneli ręcznych na najmniejsze możliwe powiększenie. Znajdź wiązkę, regulując pokrętło intensywności na panelach dłoni tak, aby na ekranie fluorescencyjnym widoczny był okrągły, jasny obszar. Wykonaj atlas całej siatki przy małym powiększeniu za pomocą odpowiedniego oprogramowania, upewniając się, że mikroskop jest dobrze ustawiony zarówno do obrazowania w małym, jak i dużym powiększeniu, przed zebraniem danych MicroED o wysokiej rozdzielczości.Zidentyfikuj kwadraty siatki bez połamanego węgla i widocznych czarnych lub ciemnych ziaren na folii. Poruszaj się po siatce, fizycznie za pomocą joysticka na panelach ręcznych lub wirtualnie w zebranym atlasie, aby wyszukać kwadraty siatki, które nie są uszkodzone i zawierają mikrokryształy. Dodaj środek każdego z tych kwadratów do listy lokalizacji siatki do badania, którą można dodać do notatnika w interfejsie użytkownika mikroskopu lub w oprogramowaniu do automatyzacji mikroskopu.Ustaw powiększenie w zakresie od 500 do 1300x. Dostosuj wysokość środka ciężkości w każdej zapisanej lokalizacji siatki i zaktualizuj zapisaną wartość Z do zanotowanych pozycji. Szukaj na ekranie fluorescencyjnym lub na płaskiej kamerze małych czarnych plam lub ziaren na siatce.Dobra próbka często będzie miała ostre krawędzie przy dużym powiększeniu, co sugeruje, że kryształ jest w porządku. Przesuń znajdujący się kryształ potencjału na środek ekranu i zwiększ powiększenie tak, aby TEM przeszedł w tryb dużego powiększenia. Wstaw otwór wybranego obszaru i zmień przysłonę na większy lub mniejszy, aby upewnić się, że wybrany obszar jest większy niż kryształ.Przełącz na tryb defrakcji, naciskając przycisk defrakcji na panelach ręcznych TEM, upewniając się, że ekran fluorescencyjny jest włożony. Dostosuj długość kamery za pomocą pokrętła powiększenia tak, aby krawędź miała rozdzielczość co najmniej jednego angstrema. Dostosuj ostrość dyfrakcyjną tak, aby centralny punkt był jak najbardziej ostry i mały.Za pomocą pokręteł zmiany biegów dyfrakcyjnych przesuń wiązkę środkową do środka ekranu fluorescencyjnego. Włóż ogranicznik belki, upewniając się, że belka znajduje się za nim. Podnieś ekran fluorescencyjny i zrób krótką ekspozycję na aparacie.Sprawdź odpowiedni wzór defrakcji, upewniając się, że wzór będzie miał ostre punkty, które są regularnie ułożone w kolumnach i rzędach. Zapisz współrzędne kryształu w interfejsie użytkownika TEM lub zapisując je, a następnie powtórz badanie dyfrakcyjne dla wszystkich potencjalnych kryształów zainteresowania na bieżącym kwadracie siatki. Wyśrodkuj ekranowany kryształ pod kątem powiększenia większym niż 1000x i dostosuj wysokość środka kryształu za pomocą procedury automatycznej lub ręcznie.Wstaw otwór wybranego obszaru, który najlepiej pasuje do rozmiaru i kształtu kryształu. Przechylaj stół montażowy w kierunku ujemnym i dodatnim, aż obraz zostanie zasłonięty przez paski siatki. Zanotuj te kąty w celu gromadzenia danych, odczytując dane co sekundę w nowoczesnym aparacie z trybem odczytu migawki typu rolling shutter.Ustaw szybkość obrotową, określając procent maksymalnej prędkości pochylania i czas zatrzymania w interfejsie użytkownika mikroskopu lub dedykowanym oprogramowaniu. Zapisuj dane w różnych formatach, na przykład pojedyncze klatki lub jako stos obrazów. Film defrakcji w formacie krystalograficznym zebrany z mikrokryształów pokazuje ciągły zestaw danych MicroED o ciągłej rotacji z mikrokryształu karbamazepiny zidentyfikowanego na siatce TEM.Po zebraniu, integracji i uporządkowaniu danych określana jest struktura o wysokiej rozdzielczości, a jej przejrzystość zależy od jakości i kompletności danych. Zastosowanie próbki do siatki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych danych. Zgodnie z tą metodą dane mogą być dalej przetwarzane za pomocą standardowego oprogramowania krystalograficznego.Wykazanie, że mikroED jest potężną metodą dla małych cząsteczek, otworzyło jej zastosowanie na całym świecie do rozwiązywania nowych struktur krytycznie ważnych cząsteczek.

microcrystal-electron-diffraction-of-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten artykuł zawiera szczegółową metodę charakteryzowania mikrostruktury ultra-drobnoziarnistych i nanokrystalicznych materiałów za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w standardowy system dyfrakcji elektronów wstecznie rozproszonych. Stopy metali i minerały o wyrafinowanej mikrostrukturze są analizowane przy użyciu tej techniki, ukazując różnorodność jej możliwych zastosowań.

Charakterystyka materiałów ultradrobnoziarnistych i nanokrystalicznych z wykorzystaniem transmisyjnej dyfrakcji Kikuchiego

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Opisujemy eksperyment mający na celu zbadanie uszkodzeń elektronowych indukowanych w nanokryształach buckminsterfullerenu (C60) przez intensywne, femtosekundowe impulsy promieniowania rentgenowskiego. Eksperyment wykazał, że dynamika elektronów indukowana promieniowaniem rentgenowskim w C60 nie jest stochastyczna, ale silnie skorelowana, rozciągając się na setki komórek elementarnych w obrębie kryształów1.

Pomiary korelacji elektronowych dalekiego zasięgu podczas eksperymentów dyfrakcji femtosekundowej wykonywanych na nanokryształach buckminsterfullerenu

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Opisujemy konfigurację linii badawczej przeznaczoną do przeprowadzania szybkiej dwuwymiarowej fluorescencji rentgenowskiej i mapowania mikrodyfrakcji rentgenowskiej próbek monokryształów lub proszków za pomocą dyfrakcji Laue (promieniowanie polichromatyczne) lub proszkowej (promieniowanie monochromatyczne). Wynikowe mapy dostarczają informacji o odkształceniu, orientacji, rozkładzie fazowym i odkształceniu plastycznym.

Synchrotronowe obrazowanie mikrodyfrakcji rentgenowskiej i fluorescencji próbek minerałów i skał

Prezentowany jest tutaj protokół oznaczania białek błonowych w komórkach ssaków i pokrywania próbki grafenem do skanowania w fazie ciekłej transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Za pomocą tego protokołu można również badać stabilność próbek w stosunku do uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem.

Grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej

Przedstawiamy ogólny zarys metod mikroanalizy ilościowej do szacowania zajętości zanieczyszczeń i ich stanów chemicznych, wykorzystując zjawiska kanalizacji elektronów w warunkach padającego kołysania wiązką elektronów, które niezawodnie wydobywają informacje o gatunkach mniejszościowych, pierwiastkach lekkich, wolnych miejscach tlenu i innych defektach punktowych/liniowych/płaskich.

Ilościowa analiza miejsc atomowych funkcjonalnych domieszek/defektów punktowych w materiałach krystalicznych za pomocą mikroanalizy wzmocnionej kanałem elektronowym

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Poznaj mikrokrystaliczną dyfrakcję elektronów (MicroED) do wyznaczania struktur małych cząsteczek z nanokryształów. Ta metoda pozwala uzyskać struktury atomowe w mniej niż 30 minut.

Mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów