Ocena dwuwymiarowych prób krystalizacji białek o małej błonie do badań biologii strukturalnej za pomocą krystalografii elektronowej

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie najbardziej optymalnych warunków krystalizacji 2D do strukturalnego oznaczania białek błonowych za pomocą krystalografii elektronowej. Osiąga się to poprzez użycie najpierw kompatybilnego detergentu podczas oczyszczania w celu rozpuszczenia białka z natywnej dwuwarstwy lipidowej. Drugim etapem procedury jest dodanie egzogennego lipidu i usunięcie detergentu poprzez dializę mieszaniny detergentów z lipidami białkowymi, w wyniku czego w wyniku uzyskano kryształy 2D w ściśle kontrolowanych warunkach.

Trzecim krokiem procedury jest flashowanie, zamrożenie próbek do stanu szklistego. Ostatnim krokiem procedury jest zebranie danych za pomocą kriozamu. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pozwalają uzyskać ostateczną strukturę białka poprzez obliczeniowe przetwarzanie obrazów danych.

Cześć, jestem z laboratorium. Uczę się w Szkole Biologii w Georgia Institute of Technology. Cześć, jestem Tina przerażona.

Pochodzę z Berry Lab w szkole chemii i biochemii oraz z Schmidt Kray Lab w szkole biologii w Georgia Institute of Technology. Nazywam się Matt Johnson i pracuję w laboratorium Ingleborg Schmidt Cry w szkole biologii w Georgia Institute of Technology. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę oceny prób chóralnych 2D przez em.

Używamy tego protokołu w naszym laboratorium do identyfikacji i optymalizacji warunków krystalizacji 2D. Więc zacznijmy Aby rozpocząć tę procedurę, przygotowuje się ujemnie barwione próbki na miedzianej mikroskopii elektronowej z siatką węgla o siatce 400 lub siatkach TEM. Pobrać pipety z dwóch mikrolitrów próbki liposomu protei pod siatką TEM pokrytą węglem i inkubować przez 60 sekund.

Jeśli próbka nie rozprowadza się równomiernie, delikatnie przesuń ją bokiem końcówki pipety. Następny blok od krawędzi z podartym kawałkiem papieru filtracyjnego numer cztery watmana. Zapewnia to optymalne usuwanie cieczy bez nadmiernego usuwania liposomów protei i pomaga zachować delikatny film węglowy.

Bezpośrednio po osuszeniu. Nałóż dwa mikrolitry 1% plamy z octanu pisuaru po 30 sekundach, osusz od krawędzi siatki. Ponownie, jeśli próbka zawiera wysokie stężenia lepkiego glicerolu lub sacharozy, zwykle w zakresie od 10 do 20%, kilka cykli płukania siatki buforem wolnym od glicerolu lub sacharozy przed ujemnym barwieniem może być pomocne, aby umożliwić prawidłowe barwienie roztworem do pisuaru.

Po przygotowaniu siatek stosuje się mikroskopię elektronową do wizualizacji próbki w małym powiększeniu w celu oceny rozkładu występowania i morfologii błony oraz ogólnej jakości siatki. Następnie wykorzystuje się duże powiększenie do uzyskania obrazów i wykonania transformacji RIA obrazów w celu identyfikacji kryształów 2D. Aby rozpocząć niską siatkę w uchwycie próbki mikroskopu elektronowego, aby uzyskać pierwsze wrażenie średniego rozkładu membrany, użyj pośredniego powiększenia od 2000 do 10 000 x.

Zwróć uwagę na zakres rozmieszczenia błon, ich morfologię i wielkość w zeszycie laboratoryjnym. Nagrywaj reprezentatywne widoki za pomocą kamery CCD. Następnie, jeśli to konieczne, obserwuj próbki w małym powiększeniu w zakresie od około 400 do 800 x, aby uzyskać przegląd siatek.

Może to dostarczyć cennych informacji do oceny przygotowania siatki, ujawniając problemy ze stężeniem próbki, nierównomiernym proteą, rozkładem liposomów i częściowym pęknięciem filmu węglowego. Zidentyfikuj obszar zainteresowania siatki przy małym lub średnim powiększeniu. Następnie użyj dużego powiększenia, aby ocenić możliwą kolejność w różnych membranach.

Ma to kluczowe znaczenie na wczesnych etapach prób krystalizacji 2D. W celu zidentyfikowania obiecujących liposomów protei z dobrze uporządkowanymi obszarami i sprawdzenia odtwarzalności podczas późniejszych eksperymentów, w celu określenia optymalnego ustawienia dużego powiększenia do badania przesiewowego kryształów 2D, zacznij od powiększenia od 50 000 do 60 000 x. W zależności od wymiarów kryształu 2D i rozmiaru komórki elementarnej, ustawienie dużego powiększenia może zostać zmniejszone do zaledwie 30 000 lub podniesione do 80 000.

Tutaj, w sąsiedniej lokalizacji W stosunku do obszaru zainteresowania obrazu, rozogniskowujemy o około minus 400 nanometrów lub więcej, jeśli istnieje niepewność, czy obszar zainteresowania jest rzeczywiście membraną. Sprawdź próbkę pod kątem kawałków filmu węglowego, MICA lub innych artefaktów, które można pomylić z liposomami protei. Obserwuj również krawędzie, aby dostrzec typowe fałdy błony i morfologię.

Następnie sprawdź obszar zainteresowania za pomocą kamery CCD. Zbierając obraz CCD przy optymalnym ustawieniu dużego powiększenia, sieć mniejszego i lub w większości hydrofobowego białka błonowego może nie być widoczna przez wizualną ocenę samego obrazu CCD. W tym przypadku cały obraz jest używany do internetowej transformacji foer lub ft.

Jeśli jednak uporządkowana tablica jest mała, ta FT będzie zawierać znaczną ilość szumu, aby poprawić stosunek sygnału do szumu, zmniejszyć rozmiar obrazu w ramce, przesunąć zmniejszone pole na obraz i wykonać na żywo ft, dostosować funkcję gamma FT na żywo w celu optymalnej identyfikacji uporządkowanych tablic. Zbyt wysoka wartość gamma może zasłaniać miejsca z powodu udziału szumu, podczas gdy zbyt niska wartość uniemożliwi identyfikację słabszych punktów. Spodziewaj się, że rozdzielczość ujemnie barwionych kryształów 2D wyniesie około 15 angstremów przy DFO minus 400 nanometrów.

Spodziewaj się, że zidentyfikujesz od jednej do trzech kolejności miejsc. Zwróć uwagę na ostrość plam i ewentualnej mozaiki. Kryształy 2D małego 18-kilodaltonowego białka błonowego mają wielkość do kilku mikronów.

Plamy na FTS, ostry i łatwy do zidentyfikowania ruch na żywo FT box pokazują, że siatka jest ciągła bez mozaiki. Sieć większego białka z bardziej rozległą rozpuszczalną domeną można zidentyfikować na małym ekranie kolekcji obrazów T-E-M-C-C-D, a FT są niezbędne do lepszej oceny jakości sieci, w tym cech takich jak szum mozaiki w FT nieuporządkowanej protei. Liposom można pomylić ze słabymi punktami, aby określić, czy plamki są spowodowane małymi kryształami białka 2D, czy szumem.

Przesuń pole na żywy ft. Jeśli plamy znikają natychmiast, są szumem, ale jeśli pozostaną niezmienione nawet na niewielkim obszarze, prawdopodobnie obecne są kryształy, ponieważ kryształy lipidów wykazują wyraźną morfologię i ft. Te kryształy lipidów można również rozpoznać po oględzinach obrazu i spójnych rozmiarach komórek jednostkowych.

Opady mogą wystąpić w początkowych próbach. Inspekcja w dużym powiększeniu służy do rozróżnienia między wytrącaniem się białek a agregatami lipidowymi. W przypadku agregatów lipidowych rekonstytucja mogła faktycznie nastąpić, a następne eksperymenty będą wymagały jedynie dostosowania parametrów niezbędnych do zwiększenia rozmiaru błony i wytworzenia porządku, a nie do wywołania rekonstytucji w temperaturze od 30 000 do 50 000 x.

Krawędzie tych ciemnych struktur ujawniają, że składają się one z błon bez białka. Próbki strącające w optymalnych warunkach będą zawierały duży procent kryształów 2D. Nie jest konieczne dążenie do jednorodnego wyglądu membran, ponieważ największe i najbardziej uporządkowane kryształy 2D są wybierane wizualnie do zbierania danych.

Tego typu próbki będą łatwo rozpoznawalne, gdy krystalizacja, takie próbki są wykorzystywane do zbierania danych krioelektromagnetycznych, aby uzyskać maksymalną liczbę obrazów o wysokiej rozdzielczości. Pokażemy Ci tylko, jak podczas wykonywania tej procedury przeprowadzić badanie przesiewowe w poszukiwaniu kryształu 2D małych białek pamięci za pomocą TEM. Ważne jest, aby pamiętać, aby być dokładnym, aby nie przeoczyć obiecującego warunku krystalizacji, ponieważ do tej pory zainwestowałeś już znaczną ilość czasu i wysiłku.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.