Name: Ocena dwuwymiarowych prób krystalizacji białek o małej błonie do badań biologii strukturalnej za pomocą krystalografii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę oceny dwuwymiarowych prób krystalizacji białek błonowych przy użyciu krystalografii elektronowej. Technika ta umożliwia wyznaczenie struktury białek poprzez przetwarzanie obrazów komputerowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy naszym współpracownikom za dostarczenie cennych próbek białek, które przyczyniły się do zdobycia doświadczenia i sformułowania obserwacji w niektórych z naszych metod. Günther Schmalzing uprzejmie umożliwił FR dołączenie do tego projektu. Dziękujemy Barbarze Armbruster, Jacobowi Brinkowi i Deryckowi Millsowi za wyjątkową pomoc i wkład w zakresie aparatury. Finansowanie zostało zapewnione z grantu NIH HL090630.

1. Przygotowanie siatki prób krystalizacji 2D
<ol>
<li>Miedziane siatki EM o oczkach 400, powlekane węglem, są przygotowywane metodą barwienia negatywowego. Często stosuje się octan uranylu, który zapewnia trwałe barwienie, zarówno w kontekście przechowywania roztworu przez kilka miesięcy przed użyciem, jak i długoterminowego przechowywania samych siatek. W przeciwieństwie do niego, inne barwniki negatywowe, takie jak mrówczan uranylu, mimo że zapewniają doskonałe barwienie, muszą być przygotowywane bezpośrednio przed użyciem 1. Do szybkiego przygotowania dużej liczby siatek przeznaczonych do przesiewowych prób krystalizacji 2D stosuje się zmodyfikowaną wersję barwienia negatywowego. Objętość 2 μL próbki jest pipetowana na powlekaną węglem siatkę EM i inkubowana przez 60 s. Następnie nadmiar cieczy jest odsączany z krawędzi za pomocą rozerwanego kawałka papieru filtrowanego Whatman #4 (Rysunek 1; wideo), a następnie natychmiast nanosi się 2 μL 1% octanu uranylu, który po 30 s jest ponownie odsączany z krawędzi siatki. Dotykanie krawędzi siatki rozerwanym brzegiem papieru filtrowanego zapewnia optymalne usunięcie cieczy bez usuwania proteoliposomów. Ponadto osuszanie na krawędzi siatki zapewnia lepszą konserwację filmu węglowego. Należy zachować szczególną ostrożność podczas przygotowania i obchodzenia się z siatkami, ponieważ uszkodzenie delikatnej warstwy węgla uniemożliwia przyleganie próbki i może prowadzić do nieprawidłowej reprezentacji materiału. Choć tradycyjnie do przygotowania siatek rutynowo stosowano i stosuje się większe objętości próbek (5 μL), cenne próbki można oszczędzać, redukując objętość do 2 μL lub mniej 2.</li>
<li>Aby uzyskać membrany o jak największym rozmiarze, niektóre z naszych próbek wymagają obecności wysokich stężeń glicerolu lub sacharozy (10-20%) w buforze do dializy. Może to mieć negatywny wpływ na przygotowanie siatek, ponieważ glicerol lub sacharoza charakteryzują się wysoką lepkością, co utrudnia odpowiednią penetrację buforu przez octan uranylu i w konsekwencji prowadzi do niepełnego zabarwienia membran. W rezultacie potencjalna sieć krystaliczna może zostać przesłonięta. W takim przypadku można wymienić bufor poprzez wirowanie próbek i zastąpienie go buforem wolnym od glicerolu/sacharozy (nie pokazano), lub można przemyć siatki buforem lub buforem wolnym od glicerolu/sacharozy w jednym lub kilku cyklach przed barwieniem negatywowym, podobnie jak w technice stosowanej w cryo-EM 3,4.</li>
</ol>
2. Ocena prób krystalizacji 2D za pomocą EM
<ol>
<li>W zależności od rodzaju uchwytu próbek ładuje się jedną lub kilka siatek. Powiększenie 2-10K, określane tutaj jako powiększenie pośrednie, pozwala na wstępną ocenę średniego rozkładu i stopnia dyspersji membran, ich morfologii oraz rozmiaru, co odnotowuje się w dzienniku laboratoryjnym 5. Odpowiednie obszary są rejestrowane jako reprezentatywne przeglądy za pomocą kamery CCD lub, w przypadku braku kamery CCD, na kliszy.</li>
<li>Niskie powiększenie w zakresie około 400-800x stosuje się w sytuacjach, gdy wymagany jest przegląd całej próbki/siatki. Choć nie jest ono stosowane przy każdej siatce, niskie powiększenie dostarcza cennych informacji pomagających w ocenie przygotowania siatki pod kilkoma względami: zarówno w kwestii barwienia negatywowego, jak i potencjalnego częściowego przerwania folii węglowej, stężenia próbki na siatce, a także ewentualnie nierównomiernego rozkładu proteoliposomów. Poszczególne pola siatki można oglądać za pomocą binokularów lub kamery CCD. W niektórych mikroskopach elektronowych (EM) możliwe jest zapisywanie pozycji o szczególnym znaczeniu, które można przywołać do późniejszej inspekcji przy wyższych powiększeniach.</li>
<li>Po zidentyfikowaniu obszaru siatki o szczególnym znaczeniu przy niskim lub pośrednim powiększeniu, zmienia się powiększenie na około 50K-60K. W zależności od rozmiaru membrany, kryształu i komórki elementarnej (jeśli są znane), stosuje się powiększenia od 30K do 80K. Zakres powiększeń 30-80K będzie określany jako powiększenie wysokie w celu przesiewania kryształów 2D. Ustawianie ostrości odbywa się albo w ustawieniu focus w konfiguracji niskiej dawki, z późniejszym przełączeniem na ustawienie obrazu/zdjęcia, albo w bezpośrednim sąsiedztwie obszaru zainteresowania.
<ol class="lalpha">
<li>W przypadku niepewności, czy obszar zainteresowania jest rzeczywiście membraną, sprawdza się, czy nie jest to folia węglowa w rozmiarze proteoliposomów, mika lub inne artefakty. W tym celu krawędzie ujawniają typowe fałdowania i morfologię.</li>
<li>Następnie obszar zainteresowania jest oglądany za pomocą kamery CCD. Obraz CCD jest zbierany przy powiększeniu 30K-80K, w zależności od rozmiaru membrany, białka lub komórki elementarnej, bądź znanego obszaru krystalicznego. Sieć mniejszego i/lub głównie hydrofobowego białka błonowego nie musi być widoczna podczas samej wizualnej oceny obrazu CCD. Wówczas cały obraz jest wykorzystywany do transformaty Fouriera online (FT lub szybkiej transformaty FT – FFT). Ta transformata FT będzie jednak zawierać znaczną ilość szumu, jeśli uporządkowana macierz jest mała. Zatem zmniejszenie rozmiaru ramki obrazu pozwoli na poprawę stosunku sygnału do szumu dla mniejszego kryształu i łatwiejszą identyfikację. W tym celu ramkę przesuwa się nad obrazem i ocenia dynamiczną transformatę FT. 
Intensywność/jasność wiązki jest regulowana z uwzględnieniem warunków niskiej dawki dla próbki oraz ustawień kamery CCD. W zależności od zastosowanej kamery CCD, wartość gamma dynamicznej transformaty FT jest dostrajana w celu optymalnej identyfikacji uporządkowanych macierzy. Zbyt wysoka wartość może przesłonić plamki z powodu udziału szumu, a nadmiernie niska wartość gamma uniemożliwi identyfikację słabszych plamek. Te słabsze plamki mogą wynikać z mniejszych macierzy krystalicznych z plamkami w FT znajdującymi się tuż powyżej poziomu szumu. 
Choć dla niewielkiej liczby próbek zebrano dane o wyższej rozdzielczości 6, zazwyczaj rozdzielczość kryształów 2D barwionych negatywowo jest ograniczona do lub nie powinna być lepsza niż około 15Å. Przy defokusie wynoszącym około -400 nm oczekuje się, że łatwo będzie zidentyfikować nie więcej niż 1-3 rzędy plamek. Próbki zazwyczaj nie są oceniane pod kątem rozdzielczości, ponieważ zbieranie danych cryo-EM dostarczy właściwej informacji o najwyższej osiągalnej rozdzielczości. Odnotowuje się jednak ostrość plamek i możliwą mozaikowość.
</li></ol></li>
<li>Różne membrany, jak i morfologie membran, są oceniane pod kątem uporządkowania przy wysokim powiększeniu. Jest to szczególnie krytyczne na początku lub w pośrednich etapach prób krystalizacji 2D, ponieważ mniejsze, a nie większe proteoliposomy lub fragmenty membran mogą zawierać najbardziej obiecujące obszary. Bardzo niski odsetek kryształów 2D będzie wymagał akwizycji obrazów i wykonania FT lub dyfrakcji optycznej dla dużej liczby zdjęć, ponieważ wstępna identyfikacja uporządkowanych macierzy często prowadzi do szybkiej poprawy rozmiaru i jakości 2,4,7.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Idealnie uporządkowane proteoliposomy wykazują łatwo rozpoznawalne, wyraźne plamki. Duże i dobrze uporządkowane kryształy można łatwo zidentyfikować za pomocą analizy online-FT obrazów CCD lub dyfrakcji optycznej mikrografii.
Przykład przedstawia kryształy 2D małego białka błonowego o masie 18kDa, które osiągają rozmiary do kilku mikronów. Plamki na FT są wyraźne i łatwo identyfikowalne. Ruch ramki live-FT pokazuje, że sieć jest ciągła i pozbawiona mozaikowości. Sieć większego białka z bardziej rozbudowaną domeną rozpuszczalną można zidentyfikować na małym ekranie EM. Gromadzenie obrazów CCD oraz FT jest niezbędne, aby zapewnić lepszą ocenę i uzyskać informacje np. o ewentualnej mozaikowości (pokaż FT). Podczas obliczania FT proteoliposomu, który nie jest uporządkowany, szum może zostać początkowo pomylony z plamkami. Jednakże podczas przesuwania ramki live-FT plamki te znikną. Z drugiej strony, w przypadku małych struktur o wątpliwej krystaliczności, plamki pozostaną stacjonarne, nawet gdy ramka live-FT zostanie lekko przesunięta nad obszarem obrazu. Co więcej, małe kryształy można rozpoznać po tym, że zazwyczaj mają takie same rozmiary komórki elementarnej, a odległości między plamkami w różnych FT można mierzyć na różne sposoby, np. za pomocą okręgu o określonej wielkości. Kryształy lipidów wykazują odmienną morfologię sieci i FT.
W początkowych próbach często zdarza się występowanie osadu. Należy jednak odróżnić wytrącanie białek bez rekonstytucji od małych agregatów lipidowych. Próbki, które przy niskim powiększeniu sprawiają wrażenie osadu, po obejrzeniu przy większym powiększeniu często okazują się być agregatami lipidowymi. Podczas inspekcji przy 30-50K krawędzie tych ciemnych struktur ujawniają, że składają się one z membran, bez wytrącania białka. Są to istotne obserwacje, ponieważ w kolejnych eksperymentach agregaty lipidowe mogą powiększyć się do postaci dużych membran.
Słabe wyniki podczas oceny próbek są niekiedy związane z niskim stężeniem błon, co uniemożliwia właściwy i szybki screening. Można temu często zaradzić, stosując wyższe stężenie białka podczas krystalizacji 2D metodą dializy. Alternatywnie, podczas przechowywania można pozostawić błony na kilka dni, aby osadziły się na dnie probówki Eppendorf. W niektórych przypadkach następuje szybkie lub niemal natychmiastowe osadzanie się błon, a pipetowanie z dna probówki pozwoli uzyskać większą gęstość błon na siatce. Inną, znacznie szybszą opcją jest wirowanie próbek (przy 3000-8000 rpm przez 1-3 minuty) z późniejszym pobraniem materiału z dna probówki.
Próbki przygotowane w optymalnych warunkach będą zawierać wysoki odsetek kryształów 2D. Homogeniczny wygląd membran nie jest konieczny, ponieważ do gromadzenia danych wybiera się wizualnie największe i najlepiej uporządkowane kryształy 2D. Próbki tego typu będą łatwo rozpoznawalne podczas powtarzania prób krystalizacji, a także podczas ich wykorzystania do gromadzenia danych w krio-EM, co pozwoli na uzyskanie maksymalnej liczby obrazów o wysokiej rozdzielczości.
<img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="Schemat procesu osuszania; pokazuje usuwanie nadmiaru cieczy z siatki za pomocą papieru filtracyjnego i pęsety." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Na tym rysunku przedstawiono osuszanie krawędzi siatki za pomocą kawałka papieru filtracyjnego Whatman #4.

<ol><li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li>
<li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+of+membrane+proteins%3A+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li>
<li>Wang, D. N., Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a%2Fb-protein+complex+in+three+different+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li>
<li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins%3A+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li>
<li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+%26gamma%3B-glutamyl+carboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li>
<li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament%3A+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li>
<li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li>
<li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li>
</ol>

Prawidłowa ocena próbek wymaga starannego przeanalizowania wystarczającej liczby membran. Na przykład próbki, w których jedynie 2% obrazowanych proteoliposomów (spośród ponad 180) wykazywało obecność struktur krystalicznych, dostarczyły kluczowych informacji pozwalających na szybką optymalizację warunków krystalizacji 2D 7.
W przypadku wystąpienia wytrącania białka, siatka może zostać odrzucona z dalszego przesiewu po inspekcji przy niskim powiększeniu, choć sporadycznie zdarza się...

<table><tbody><tr><td>siatki TEM miedziane 400-mesh pokryte warstwą węgla</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pincety: standardowe i antykapilarne</td><td></td><td></td><td>Dumont #5 i Dumont N5AC lub podobne</td></tr><tr><td>Mikropipeta i końcówki do pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>papier filtracyjny Whatman #4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% octan uranylu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>próbka dializowana do badania pod kątem kryształów 2D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bufor do dializy bez glicerolu/sacharozy</td><td></td><td></td><td>Opcjonalnie</td></tr><tr><td>transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) JEOL-1400</td><td></td><td></td><td>podobny TEM 80 &amp;#8211; 120kV wyposażony w włókno Lab6 lub wolframowe oraz kamery filmowe i/lub CCD (kamery CCD Gatan Orius SC1000 i/lub UltraScan1000 oraz pakiet oprogramowania Gatan Digital Micrograph lub kamery Tietz (TVIPS))</td></tr></tbody></table>

ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Krystalografia elektronowa ewoluowała jako metoda, która może być stosowana alternatywnie lub w połączeniu z krystalizacją trójwymiarową i krystalografią rentgenowską w celu badania zależności między strukturą a funkcją białek błonowych, a także białek rozpuszczalnych. Przesiewanie kryształów dwuwymiarowych (2D) za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (EM) jest krytycznym etapem w wyszukiwaniu, optymalizacji i wyborze próbek do zbierania danych o wysokiej rozdzielczości metodą cryo-EM. W niniejszym materiale opisujemy podstawowe kroki identyfikacji zarówno dużych i uporządkowanych, jak i małych macierzy 2D, które mogą dostarczyć kluczowych informacji niezbędnych do optymalizacji warunków krystalizacji.
Dzięki pracy z różnymi powiększeniami w EM uzyskuje się dane dotyczące szeregu krytycznych parametrów. Niższe powiększenie dostarcza cennych informacji o morfologii i rozmiarze błon. Przy wyższych powiększeniach określa się możliwy stopień uporządkowania oraz wymiary kryształów 2D. W tym kontekście opisano, w jaki sposób kamery CCD oraz transformacje Fouriera w czasie rzeczywistym są wykorzystywane przy wyższych powiększeniach do oceny uporządkowania i rozmiaru proteoliposomów.
Choć dwuwymiarowe (2D) kryształy białek błonowych najczęściej hoduje się poprzez rekonstytucję z wykorzystaniem dializy, opisana technika przesiewowa ma jednak jednakowe zastosowanie w przypadku kryształów otrzymywanych przy użyciu monowarstw, natywnych kryształów 2D oraz uporządkowanych macierzy białek rozpuszczalnych. Ponadto metody opisane w niniejszym opracowaniu można stosować do przesiewania kryształów 2D białek błonowych o jeszcze mniejszej, jak i większej masie cząsteczkowej; w przypadku białek mniejszych identyfikacja wymaga takiej samej staranności jak w przedstawionych przykładach, natomiast sieć krystaliczna większych białek może być łatwiejsza do zidentyfikowania na wcześniejszych etapach przesiewania.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Krystalografia elektronowa wyewoluowała jako metoda, która może być stosowana alternatywnie lub w połączeniu z krystalizacją trójwymiarową i rentgenografią...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie optymalnych warunków krystalizacji 2D w celu strukturalnego oznaczenia białek błonowych za pomocą krystalografii elektronowej. Osiąga się to najpierw poprzez zastosowanie kompatybilnego detergentu podczas oczyszczania, aby solubilizować białko z natywnej dwuwarstwy lipidowej. Drugim krokiem procedury jest dodanie egzogennych lipidów i usunięcie detergentu poprzez dializę mieszaniny białka, lipidów i detergentu, co prowadzi do powstania kryształów 2D w ściśle kontrolowanych warunkach.Trzecim krokiem procedury jest gwałtowne zamrożenie próbek w celu uzyskania stanu szklistego. Ostatnim etapem procedury jest zebranie danych za pomocą cryo-EM. W efekcie, dzięki komputerowemu przetwarzaniu obrazów z uzyskanych danych, można wyznaczyć ostateczną strukturę białka.Witajcie, reprezentuję laboratorium ze Szkoły Biologii na Georgia Institute of Technology. Nazywam się Tina dreaded.Reprezentuję laboratorium Berry w szkole chemii i biochemii oraz laboratorium Schmidt Kray w szkole biologii w Georgia Institute of Technology. A ja jestem Matt Johnson z laboratorium Ingleborg Schmidt Cry w szkole biologii w Georgia Institute of Technology. Dzisiaj przedstawimy procedurę oceny prób koloryzacji 2D za pomocą em.W naszym laboratorium stosujemy ten protokół w celu identyfikacji i optymalizacji warunków krystalizacji 2D. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować próbki barwione negatywnie na miedzianych siatkach do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) o gęstości 400 mesh, pokrytych warstwą węgla. Należy nanieść pipetą 2 µL próbki proteoliposomów pod pokrytą węglem siatkę TEM i inkubować przez 60 sekund.Jeśli próbka nie rozłoży się równomiernie, należy ją delikatnie rozmazać bokiem końcówki pipety. Następnie krawędź należy zablokować odartym kawałkiem papieru filtracyjnego Watman nr 4. Zapewnia to optymalne usunięcie cieczy bez nadmiernego usuwania liposomów proteiny i pomaga zachować delikatną warstwę węglową.Bezpośrednio po osuszaniu. Po 30 sekundach nanieś dwa mikrolitry 1% barwnika octanu uranylu, a następnie odsącz nadmiar od krawędzi siatki. Ponownie, jeśli próbka zawiera wysokie stężenia lepkiego glicerolu lub sacharozy, zazwyczaj w zakresie od 10 do 20%, pomocne może być przeprowadzenie kilku cykli płukania siatki buforem wolnym od glicerolu lub sacharozy przed barwieniem negatywowym, aby umożliwić prawidłowe barwienie roztworem octanu uranylu.Po przygotowaniu siatek wykorzystuje się mikroskopię elektronową do wizualizacji próbki przy niskim powiększeniu, aby ocenić rozmieszczenie oraz morfologię błon, a także ogólną jakość siatki. Następnie stosuje się duże powiększenie w celu uzyskania obrazów i wykonania transformacji RIA tych obrazów w celu zidentyfikowania kryształów 2D. Aby rozpocząć analizę siatki w uchwycie próbek mikroskopu elektronowego i uzyskać wstępne wyobrażenie o średnim rozkładzie błon, należy zastosować średnie powiększenie od 2000 do 10 000 x.Stopień rozmieszczenia membran, ich morfologię oraz rozmiar należy odnotować w dzienniku laboratoryjnym. Reprezentatywne obrazy należy zarejestrować za pomocą kamery CCD. Następnie, w razie potrzeby, próbki należy obserwować przy niskim powiększeniu, w zakresie od około 400 do 800 x, aby uzyskać ogólny obraz siatek.Może to dostarczyć cennych informacji do oceny przygotowania siatki, ujawniając problemy z stężeniem próbki, nierównomiernym rozkładem protei i liposomów oraz częściowym przerwaniem filmu węglowego. Zidentyfikuj obszar siatki budzący zainteresowanie przy niskim lub średnim powiększeniu. Następnie użyj dużego powiększenia, aby ocenić możliwy uporządkowanie w różnych membranach.Jest to kluczowe na wczesnych etapach prób krystalizacji 2D. Aby zidentyfikować obiecujące liposomy białkowe z obszarami dobrze uporządkowanymi oraz zweryfikować powtarzalność podczas późniejszych eksperymentów w celu określenia optymalnego ustawienia dużego powiększenia do przesiewania kryształów 2D, należy rozpocząć od powiększenia między 50,000 a 60,000 x. W zależności od wymiarów kryształu 2D i wielkości komórki elementarnej, ustawienie dużego powiększenia może zostać zmniejszone nawet do 30,000 lub zwiększone do 80,000.Następnie, w obszarze przyległym do badanego fragmentu obrazu, ustawiamy defocus na około minus 400 nanometrów lub więcej, jeśli istnieje niepewność co do tego, czy badany obszar jest rzeczywiście błoną. Należy sprawdzić próbkę pod kątem obecności fragmentów folii węglowej, miką lub innych artefaktów, które mogłyby zostać pomylone z proteoliposomami. Należy również obserwować krawędzie, aby rozpoznać typowe fałdowanie i morfologię błon.Następnie należy obejrzeć obszar zainteresowania za pomocą kamery CCD. Przy zbieraniu obrazu CCD przy optymalnym, wysokim powiększeniu, sieć mniejszego i/lub głównie hydrofobowego białka błonowego może nie być widoczna podczas wizualnej oceny samego obrazu CCD. W takim przypadku cały obraz jest wykorzystywany do obliczenia transformaty Fouriera (FT) w czasie rzeczywistym.Jeśli jednak uporządkowana macierz jest mała, ta transformata Fouriera (FT) będzie zawierać znaczną ilość szumu. Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, zmniejsz rozmiar zaznaczonego obszaru obrazu, przesuń zmniejszony obszar nad obrazem i wykonaj FT w czasie rzeczywistym, a następnie dostosuj funkcję gamma dla FT w czasie rzeczywistym w celu optymalnej identyfikacji uporządkowanych macierzy. Zbyt wysoka wartość gamma może przesłonić plamki z powodu wpływu szumu, podczas gdy zbyt niska wartość uniemożliwi zidentyfikowanie słabszych plamek. Przewidywana rozdzielczość kryształów 2D barwionych negatywnie powinna wynosić około 15 angstroms przy DFO wynoszącym minus 400 nanometers.Należy spodziewać się zidentyfikowania od jednego do trzech rzędów plamek. Zwróć uwagę na ostrość plamek oraz występowanie mozaiki. Kryształy 2D małego białka błonowego o masie 18 kilodalton osiągają rozmiary do kilku mikronów.Ostre i łatwo identyfikowalne przesunięcia plamek na FT wykazują, że sieć jest ciągła i pozbawiona mozaikowości. Sieć większego białka o bardziej rozległej domenie rozpuszczalnej można zidentyfikować na małym ekranie systemu zbierania obrazów T-E-M-C-C-D, jednak FT są niezbędne do lepszej oceny jakości sieci, w tym cech takich jak szum mozaikowy w FT nieuporządkowanego białka. Liposomy mogą zostać pomylone ze słabymi plamkami; należy ustalić, czy plamki wynikają z obecności małych dwuwymiarowych kryształów białka, czy z szumu.Przesuń pudełko dla żywego ft. Jeśli plamki znikają natychmiast, są one szumem, ale jeśli pozostają niezmienione nawet na niewielkim obszarze, prawdopodobnie obecne są kryształy, ponieważ kryształy lipidów wykazują odrębną morfologię i ft. Kryształy lipidów można również rozpoznać poprzez wizualną inspekcję obrazu oraz spójne rozmiary komórek elementarnych.W początkowych próbach może dojść do wytrącenia osadu. Inspekcja przy dużym powiększeniu służy do rozróżnienia wytrącania białek od agregatów lipidowych. W przypadku agregatów lipidowych rekonstytucja mogła w rzeczywistości nastąpić, a kolejne eksperymenty będą wymagały jedynie dostosowania parametrów niezbędnych do zwiększenia rozmiaru błon i uzyskania uporządkowania, a nie indukcji rekonstytucji przy 30 000 do 50 000 x.Krawędzie tych ciemnych struktur ujawniają, że składają się one z membran pozbawionych białek. Próbki wytrącania w optymalnych warunkach będą zawierać wysoki odsetek kryształów 2D. Dążenie do uzyskania homogenicznego wyglądu membran nie jest konieczne, ponieważ do gromadzenia danych wybierane są wizualnie największe i najlepiej uporządkowane kryształy 2D.Tego rodzaju próbki będą łatwo rozpoznawalne, gdy krystalizacja takich próbek zostanie wykorzystana do zbierania danych w krio-EM, aby uzyskać maksymalną liczbę obrazów o wysokiej rozdzielczości. W ramach tej procedury pokażemy, jak przeprowadzić przesiewanie 2D kryształów małych białek błonowych za pomocą TEM. Ważne jest, aby działać skrupulatnie i nie przeoczyć obiecujących warunków krystalizacji, ponieważ do tego momentu zainwestowali już Państwo znaczną ilość czasu i wysiłku.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

assessing-two-dimensional-crystallization-trials-small-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena prób dwuwymiarowej krystalizacji małych białek błonowych dla badań biologii strukturalnej za pomocą elektronowym krystalografii

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Bicele są mieszaninami lipidów i amfifili, które utrzymują białka błonowe (MPs) w obrębie dwuwarstwy lipidowej, lecz wykazują unikalne zachowanie fazowe, co ułatwia wysokoprzepustowe przesiewy za pomocą robotów krystalizacyjnych. Technika ta pozwoliła na uzyskanie wielu struktur o wysokiej rozdzielczości pochodzących zarówno z organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Niniejszy film opisuje protokoły przygotowania lipidowej mieszaniny bicel, wprowadzania białek błonowych do mieszaniny...

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

W niniejszym opracowaniu opisano zrobotyzowane podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych, przeznaczone do wyznaczania struktur za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Przedstawiono trzy roboty zdolne do pracy z lepką i kleistą mezofazą zawierającą białka, która jest nieodzownym elementem tej metody.

Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

W niniejszym opracowaniu opisano procedury wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran Caffreya w celu zbioru i kriochłodzenia kryształów białek błonowych hodowanych w lipidowych fazach kubicznych i gąbczastych, przeznaczonych do wyznaczania struktur metodą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej.

Pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Poznaj metodę oceny dwuwymiarowych prób krystalizacji białek błonowych przy użyciu krystalografii elektronowej. Technika ta umożliwia wyznaczenie struktury białek poprzez przetwarzanie obrazów komputerowych.

Ocena dwuwymiarowych prób krystalizacji białek o małej błonie do badań biologii strukturalnej za pomocą krystalografii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów