Przygotowanie warstw nośnych próbek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy użyciu bloku flotacyjnego
April 8th, 2021
Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) jest znaczącym wąskim gardłem w procesie określania struktury tej metody. W tym miejscu podajemy szczegółowe metody wykorzystania łatwego w użyciu, drukowanego trójwymiarowo bloku do przygotowania folii nośnych do stabilizacji próbek do transmisyjnych badań EM.
W tym miejscu przedstawiamy ulepszone protokoły przygotowania próbek krio-EM z foliami nośnymi przy użyciu nowatorskiego bloku flotacyjnego, który ułatwia obsługę tak delikatnych folii. Kluczową zaletą tej metody jest to, że próbka jest chroniona przed powierzchnią styku powietrze-woda, gdzie mogą wystąpić szkodliwe skutki, takie jak denaturacja. Jeden z przedstawionych tutaj protokołów pozwala uniknąć wszelkiego rodzaju kosztownych zabiegów, które czynią wykresy hydrofilowymi, zwiększając w ten sposób ich dostępność dla całej społeczności EM.
Małe urządzenia flotacyjne nie są jeszcze powszechnie stosowane w elektromikroskopii w celu dobrego przygotowania. Tak więc te wizualne demonstracje mogą stanowić punkt odniesienia dla ich użycia. Na początek umyj kratki TEM podwójnie destylowaną wodą i octanem ethelu, a następnie wyczyść plazmą.
Następnie dodać 10 do 12 mikrolitrów próbki do studzienki wymiany buforowej, bloku flotacyjnego i 10 do 12 mikrolitrów 2% roztworu octanu pisuaru do sąsiedniej studzienki wymiany bez buforu w celu barwienia ujemnego. Konieczne jest podjęcie odpowiednich środków ostrożności podczas pracy z plamą. Ostrożnie pokrój dwa małe kawałki miki z wstępnie osadzoną folią węglową na wierzchu.
Upewnij się, że fragmenty miki są wystarczająco szerokie, aby zmieścić się w studzience i dłuższe niż długość studzienki, tak aby fragment mógł siedzieć na studni, podczas gdy węgiel unosi się na wodzie i było wystarczająco dużo miejsca, aby poradzić sobie z fragmentem za pomocą pęsety. Zanurz mikę w studzience pod przybliżonym kątem 45 stopni, aż mika usiądzie na rampie studni, a warstwa węgla będzie obserwowana na powierzchni próbki cieczy. Po inkubacji węgla z próbką, należy bardzo powoli wycofać arkusz miki, aby odzyskać warstwę węglową i zminimalizować zatrzymywanie resztkowej próbki lepkości.
Ostrożnie osusz mikę, stukając w dolną powierzchnię niewęglową bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu i zanurz fragment miki w przeciwległej studzience zawierającej 2% roztwór octanu pisuaru, aby wymienić warstwę węgla na ujemne zabarwienie. Odzyskaj pływającą warstwę węgla za pomocą świętej strony pokrytej węglem umytej i oczyszczonej plazmowo siatki EM. Następnie pozostaw siatki do wyschnięcia na powietrzu do czasu obrazowania na TEM, najlepiej zakrywając je, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.
Po oczyszczeniu siatek TEM, jak pokazano wcześniej, należy przygotować zawiesinę tlenku grafenu tuż przed użyciem i dokładnie przemieszać. Następnie dodaj od 10 do 12 mikrolitrów zawiesiny tlenku grafenu do czterech studzienek wymiany bez bufora. wzdłuż bloku flotacyjnego.
Dodaj 10 do 12 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody lub ultraczystej wody do pozostałych czterech studzienek wymiany buforowej bloku. Delikatnie upuść cztery siatki na zawiesinę tlenku grafenu w każdym dołku i inkubuj przez jedną minutę, aby upewnić się, że święta strona pokryta węglem styka się z roztworem. Po jednej minucie ostrożnie odzyskaj każdą siatkę, wsuwając pęsetę w rowek pęsety w każdej studzience wymiany bez bufora.
Delikatnie i krótko popchnij miedzianą, niepokrytą węglem stronę każdej kratki podwójnie destylowaną wodą w sąsiedniej studni, aż kropla wody będzie widoczna na siatce. Następnie ostrożnie przytrzymaj kroplę wody z siatki do góry nogami na kawałku bibuły filtracyjnej. Przykryj kratki i pozostaw je w pęsetzie do wyschnięcia na powietrzu.
Umieść cztery siatki myjące na miedzianym arkuszu graficznym osadzonym na szklanym szkiełku i przykryj każdą siatkę kroplą izopropanolu, aby umożliwić bliski kontakt między jednowarstwowym grafenem a siatką. Po całkowitym odparowaniu izopropanolu należy spławić arkusz grafenu miedzianego z kratkami na roztworze chlorku żelaza w szklanej szalce Petriego. Następnie przykryj naczynie, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza i pozostaw je na noc do wytrawienia w temperaturze pokojowej.
Użyj pętli o średnicy większej niż rozmiar siatki TEM, aby wyłowić siatki unoszące się na monowarstwie grafenu i ostrożnie przenieś je na szklaną szalkę Petriego zawierającą podwójnie destylowaną wodę do mycia. Umyć kratki dwukrotnie w wodzie i przenieść kratki na szalkę Petriego zawierającą bufor do próbek do czasu przygotowania próbki i zamrożenia wgłębnego. Dodać 10 do 12 mikrolitrów próbki do studzienki bloku flotacyjnego.
Gdy próbka jest gotowa w bloku, należy pobrać siatkę pokrytą grafenem z roztworu buforowego za pomocą czystej pęsety i umieścić ją na powierzchni studzienki zawierającej próbkę. Po odpowiednim okresie inkubacji podnieś siatkę za pomocą czystej pęsety do zamrażania i przystąp do osuszania i witryfikacji. Siatki barwione ujemnie przygotowane za pomocą wsporczego bloku flotacyjnego są zwykle pokryte węglem amorficznym na całej powierzchni siatki.
Chociaż w niektórych przypadkach dochodzi do pęknięcia filmu węglowego, duża liczba kwadratów siatki jest nieskazitelna i dlatego nadaje się do barwienia negatywowego. Podobnie, dobre pokrycie folią jest rutynowo osiągane w całej sieci przy użyciu protokołu tlenku grafenu. Siatki z tlenku grafenu można szybko przygotować z surowców i zapewniają one wysoką ochronę próbki.
Utrzymywanie grafenu w stanie mokrym i nałożenie próbki na miejscu tuż przed zamrożeniem jest wystarczające do wytworzenia odpowiednich warstw lodu dla cryo-EM. Protokół ten nie wymaga sprzętu do uczynienia grafenu hydrofilowym i zapewnia przewagę w odzyskiwaniu próbek. Blok flotacyjny nośny ma dwa porty igłowe w miejscu każdej studzienki, które umożliwiają rozszerzanie bufora w C2, co jest bardzo przydatne w przypadku próbek pochodzących z gradientów glicerolu.
Blok flotacyjny umożliwił zbadanie metod oczyszczania powinowactwa do sieci poprzez wykorzystanie kontrolowanego przepływu o małych objętościach, a także funkcjonalizowanych folii nośnych.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia ulepszone protokoły przygotowywania próbek do mikroskopii kryoelektronowej (cryo-EM) przy użyciu nowego bloku flotacyjnego. Metoda chroni próbki przed uszkodzeniami na stykach powietrze-woda i poprawia dostępność dla społeczności zajmującej się EM.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia kryoelektronowa
- Techniki przygotowywania próbek
- Biologia strukturalna
Tło
- Przygotowanie próbek jest węzłem krytycznym w procesach kryo-EM.
- Filmy podtrzymujące są kluczowe dla stabilizacji delikatnych próbek.
- Obecne metody mogą być drogie i skomplikowane.
- Nowe bloki flotacyjne mogą uprościć proces.
Cel badania
- Aby zapewnić dostępne protokoły przygotowywania próbek do kryo-EM.
- Aby zademonstrować użycie bloków flotacyjnych w obsłudze filmów podtrzymujących.
- Aby poprawić stabilność próbek i zmniejszyć ryzyko denaturacji.
Stosowane metody
- Mycie i czyszczenie plazmowe siatek TEM.
- Użycie bloków flotacyjnych do aplikacji próbek i barwienia ujemnego.
- Włączenie tlenku grafenu dla zwiększonej ochrony próbek.
- Ostrożne przechowywanie i przenoszenie siatek podczas przygotowywania.
Główne wyniki
- Ulepszona stabilność próbek z zmniejszonym ryzykiem denaturacji.
- Sukces w zastosowaniu tlenku grafenu do kryo-EM.
- Zadokumentowana skuteczność bloków flotacyjnych w przygotowywaniu próbek.
- Protokoły są dostępne i nie wymagają drogich zabiegów.
Wnioski
- Metoda z użyciem bloku flotacyjnego poprawia przygotowanie próbek do kryo-EM.
- Protokoły mogą być przyjęte przez szerokie grono społeczności zajmującej się EM.
- Ulepszone metody ułatwiają lepszą analizę strukturalną próbek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient and reproducible sample preparation for cryo-EM is critical for structural biology pipelines, yet remains a bottleneck due to sample fragility and contamination risks. The support flotation block enables streamlined transfer of delicate support films, reducing manual handling and preserving sample integrity for high-resolution imaging. This innovation enhances predictive confidence in early discovery and supports robust portfolio progression by minimizing artifacts and sample loss.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reliable interrogation of macromolecular structure by protecting samples from air-water interface denaturation.
- Supports functional target validation by maintaining native conformations during grid preparation.
- Reduces mechanistic ambiguity by minimizing sample damage and contamination.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated EM grids for downstream structural screening workflows.
- Improves reproducibility and standardization of support film application across batches.
- Enables rapid, scalable preparation of grids with amorphous carbon, graphene, or graphene oxide supports.
Translational & Preclinical Research
- Preserves sample integrity for translational studies requiring high-fidelity structural data.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust imaging of challenging samples.
- Mitigates risk of false negatives due to sample denaturation or contamination.
Pipeline & Workflow Integration
The flotation block method integrates at the sample preparation stage, bridging early discovery and lead identification with preclinical imaging workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling high-quality structural data acquisition.
- Screening: Delivers reproducible, contamination-minimized grids for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, high-integrity imaging outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains sample fidelity for downstream biomarker or mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable protocol adaptable to various support films and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces structural ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows, reduces manual steps, and minimizes contamination risk.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by improving data quality and reproducibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by reducing sample loss and preparation failures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid handling and support film transfer.
- Needs access to flotation block, plasma cleaning, and standard EM preparation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible results across projects.
- Adaptable to carbon, graphene, and graphene oxide supports as demonstrated.
- Potential limitations include occasional film breakage and need for careful contamination control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Preparation of Negatively Stained Samples with Amorphous Carbon Support
2:21
Preparation of Graphene Oxide-coated TEM Grids
3:27
Preparation of Samples on Monolayer-graphene Films Using the Flotation Block
4:44
Results: Examples of Sample Support Films Prepared Using the Floatation Block
5:34
Conclusion
