Przygotowanie warstw nośnych próbek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy użyciu bloku flotacyjnego
8 kwietnia 2021
6K wyświetleń
Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) jest znaczącym wąskim gardłem w procesie określania struktury tej metody. W tym miejscu podajemy szczegółowe metody wykorzystania łatwego w użyciu, drukowanego trójwymiarowo bloku do przygotowania folii nośnych do stabilizacji próbek do transmisyjnych badań EM.
- Frank, J. Postępy w dziedzinie krio-mikroskopii elektronowej pojedynczych cząsteczek w ciągu ostatniej dekady. Nature Protocols. 12 (2), 209–212 (2017).
- Lyumkis, D. Wyzwania i możliwości w analizie pojedynczych cząsteczek metodą Cryo-EM. Journal of Biological Chemistry. jbc.REV118.005602 (2019).
- Elmlund, D., Elmlund, H. Krio-mikroskopia elektronowa i analiza pojedynczych cząsteczek. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499–517 (2015).
- Thompson, R.F., Walker, M., Siebert, C.A., Muench, S.P., Ranson, N.A. Wprowadzenie do przygotowania próbek i obrazowania metodą krio-mikroskopii elektronowej w biologii strukturalnej. Methods. 100, 3–15 (2016).
- Arnold, S.A. et al. Miniaturyzacja przygotowania próbek do EM: możliwości, wyzwania i „proteomika wizualna”. Proteomics. 18 (5–6), 1700176 (2018).
- Wu, S., Armache, J.P., Cheng, Y. Pozyskiwanie danych Cryo-EM pojedynczych cząsteczek przy użyciu kamery bezpośredniej detekcji elektronów. Microscopy (Oxford, England). 65 (1), 35–41 (2016).
- Noble, A.J. et al. Rutynowa charakterystyka próbek i siatek do CryoEM pojedynczych cząsteczek za pomocą tomografii. eLife. 7 (2018).
- Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Wyznaczenie nieelastycznej średniej drogi swobodnej w lodzie poprzez badanie pochylonych pęcherzyków i zautomatyzowane obrazowanie najbardziej prawdopodobnej straty. Ultramicroscopy. 63 (3–4), 169–179 (1996).
- Glaeser, R.M. Białka, powierzchnie międzyfazowe i siatki do cryo-EM. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1–8 (2018).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Denaturacja białek na granicy woda-powietrze i sposoby jej zapobiegania. eLife. 8, 400432 (2019).
- Bai, X.C., Fernandez, I.S., McMullan, G., Scheres, S.H.W. Struktury rybosomów w rozdzielczości bliskiej atomowej na podstawie trzydziestu tysięcy cząsteczek cryo-EM. eLife. 2013 (2) (2013).
- Russo, C.J., Passmore, L.A. Kontrola adsorpcji białek na grafenie w cryo-EM przy użyciu niskoenergetycznej plazmy wodorowej. Nature Methods. 11 (6), 649–652 (2014).
- Naydenova, K., Russo, C.J. Pomiar efektów orientacji cząsteczek w celu poprawy wydajności krio-mikroskopii elektronowej. Nature Communications. 8 (1), 8–12 (2017).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C.S. Spotiton: prototyp zintegrowanego systemu dozowania atramentowego i witryfikacji dla cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68–75 (2012).
- Razinkov, I. et al. Nowa metoda witryfikacji próbek do cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190–198 (2016).
- Feng, X. et al. Szybka i skuteczna mikrofluidyczna metoda natryskowo-zanurzeniowa dla wysokorozdzielczej Cryo-EM pojedynczych cząsteczek. Structure. 25 (4), 663-670.e3 (2017).
- Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforowane folie wspierające o zdefiniowanej wielkości, kształcie i rozmieszczeniu otworów. Ultramicroscopy. 74 (1–2), 75–81 (1998).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A.W. Krio-mikroskopia elektronowa wirusów. Nature. 308 (5954), 32–36 (1984).
- Fujiyoshi, Y. Badania strukturalne białek błonowych metodą krystalografii elektronowej. Advances in Biophysics. 35, 25–80 (1998).
- Koning, R.I., Oostergetel, G.T., Brisson, A. Przygotowanie płaskich węglowych folii wspierających. Ultramicroscopy. 94 (3–4), 183–191 (2003).
- Hummers, W.S., Offeman, R.E. Przygotowanie tlenku grafitowego. Journal of the American Chemical Society. 80 (6), 1339 (1958).
- Pantelic, R.S., Meyer, J.C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J.M. Tlenek grafenu: podłoże do optymalizacji przygotowania próbek mrożonych i uwodnionych. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152–156 (2010).
- Pantelic, R.S. et al. Grafen: przygotowanie i wprowadzenie podłoża. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234–238 (2011).
- Li, X. et al. Wielkopowierzchniowa synteza wysokiej jakości i jednolitych folii grafenowych na foliach miedzianych. Science. 324 (5932), 1312–1314 (2009).
- Regan, W. et al. Bezpośredni transfer grafenu o dużej powierzchni warstwy. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008–2011 (2010).
- Brilot, A.F. et al. Ruch indukowany wiązką witryfikowanego preparatu na dziurkowanej folii węglowej. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630–637 (2012).
- de Martín Garrido, N. et al. Bezpośredni transfer próbek do mikroskopii elektronowej na zwilżone folie węglowe i grafenowe za pomocą wspierającego bloku flotacyjnego. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677 (2021).
- Valentine, R.C., Shapiro, B.M., Stadtman, E.R. Regulacja syntetazy glutaminy. XII. Mikroskopia elektronowa enzymu z Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143–2152 (1968).
- Scarff, C.A., Fuller, M.J.G., Thompson, R.F., Iadaza, M.G. Wariacje metod mikroskopii elektronowej z barwieniem negatywowym: narzędzia do radzenia sobie z trudnymi układami. Journal of Visualized Experiments. 2018 (132), 57199 (2018).
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono ulepszone protokoły przygotowania próbek do krio-mikroskopii elektronowej (cryo-EM) z wykorzystaniem nowatorskiego bloku flotacyjnego do manipulowania delikatnymi błonami wsporczymi, takimi jak węgiel amorficzny, grafen i tlenek grafenu. Blok flotacyjny usprawnia przenoszenie i nanoszenie błon wsporczych, minimalizując ręczną manipulację, ograniczając zanieczyszczenia i chroniąc próbki przed szkodliwym wpływem granicy faz powietrze-woda. Przedstawiono szczegółowe procedury przygotowania i nanoszenia tych podłoży, co zwiększa integralność próbek oraz ułatwia prowadzenie badań EM.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM)
- Biologia strukturalna
- Techniki przygotowania próbek
Wstęp
- Wyznaczanie struktur metodą Cryo-EM rozwija się gwałtownie, jednak przygotowanie próbek wciąż stanowi wąskie gardło procesu.
- Próbki makromolekularne najlepiej obrazować w lodzie witryfikowanym, lecz wiele z nich jest wrażliwych na graniczny obszar powietrze-woda, co prowadzi do ich denaturacji.
- Folie wspierające (węgiel amorficzny, grafen, tlenek grafenu) mogą chronić próbki, ale ich obsługa bez ryzyka uszkodzenia lub zanieczyszczenia jest trudna.
- Istniejące metody często wymagają czasochłonnego płukania, czyszczenia lub kosztownych zabiegów w celu nadania podłożom właściwości hydrofilowych.
Cel badania
- Opracowanie i zaprezentowanie protokołów przygotowania próbek do krio-EM z foliami wspierającymi przy użyciu intuicyjnego bloku do flotacji.
- Zminimalizowanie ręcznego przenoszenia i zanieczyszczeń podczas transferu folii wspierającej.
- Zapewnienie przystępnych metod, które nie wymagają kosztownych zabiegów hydrofilowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie i czyszczenie siatek TEM przy użyciu wody destylowanej, octanu etylu oraz czyszczenia plazmowego.
- Nakładanie błon wspierających (węglowych, grafenowych, tlenku grafenu) na siatki przy użyciu bloku flotacyjnego.
- Krokowe przenoszenie błon metodą flotacji na mokro, minimalizujące ekspozycję na powietrze i zanieczyszczenia.
- Protokoły barwienia negatywowego i witryfikacji w celu konserwacji i obrazowania próbek.
Główne wyniki
- Blok flotacyjny umożliwia wydajny i powtarzalny transfer folii wspierających przy minimalnym ryzyku ich przerwania.
- Folie z węgla amorficznego i tlenku grafenu zapewniają dobre pokrycie i chronią próbki przed interfejsem powietrze-woda.
- Siatki z tlenku grafenu można szybko przygotować z surowców, co eliminuje konieczność stosowania obróbki hydrofilowej.
- Blok flotacyjny umożliwia wymianę buforu oraz oczyszczanie powinowactwa bezpośrednio na siatce, co zwiększa jego użyteczność.
Wnioski
- Blok flotacyjny upraszcza przygotowywanie siatek do cryo-EM z foliami wspierającymi, ograniczając liczbę kroków manualnych oraz ryzyko kontaminacji.
- Protokoły są dostępne i nie wymagają specjalistycznego sprzętu do obróbki hydrofilowej.
- Podejście to poprawia integralność próbek i rozszerza możliwości zastosowania folii wspierających w badaniach cryo-EM.
Najczęściej zadawane pytania
Jaka jest główna zaleta stosowania bloku flotacyjnego w przygotowywaniu próbek do krio-EM?
Blok flotacyjny minimalizuje ręczne manipulowanie i zanieczyszczenia, zachowując integralność delikatnych folii wsporczych i chroniąc próbki przed granicą faz powietrze-woda.
Jakie folie wspierające można przygotować przy użyciu opisanych protokołów?
Protokoły obejmują filmy wspierające z węgla amorficznego, grafenu i tlenku grafenu dla siatek do cryo-EM.
Czy metody te wymagają hydrofilowej obróbki grafenu?
Nie, protokoły te unikają kosztownych zabiegów hydrofilizacji, dzięki czemu podłoża grafenowe stają się bardziej dostępne dla społeczności zajmującej się EM.
W jaki sposób blok flotacyjny pomaga ograniczyć zanieczyszczenia?
Dzięki zminimalizowaniu liczby etapów ręcznej obsługi oraz czasu ekspozycji, blok flotacyjny zmniejsza ryzyko kontaminacji powietrznej i odkładania się substancji hydrofobowych na foliach wspierających.
Czy blok flotacyjny może być wykorzystany do wymiany buforu lub oczyszczania powinowactwa?
Tak, blok wypornościowy zawiera porty igłowe do wymiany buforu i obsługuje metody oczyszczania powinowactwa na siatce z wykorzystaniem małych objętości i filmów funkcjonalizowanych.
Jakie są typowe wyniki przy zastosowaniu tych protokołów?
Protokoły te pozwalają na uzyskanie siatek z dobrym pokryciem folii i minimalną liczbą pęknięć, odpowiednich do barwienia negatywowego oraz obrazowania cryo-EM.
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne i powtarzalne przygotowanie próbek do krio-EM jest kluczowe dla procesów biologii strukturalnej, jednak ze względu na kruchość próbek i ryzyko zanieczyszczeń wciąż stanowi ono wąskie gardło. Blok do flotacji nośników umożliwia usprawniony transfer delikatnych folii nośnych, ograniczając manualną manipulację i zachowując integralność próbki dla obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Innowacja ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnych etapach odkryć i wspiera stabilny rozwój portfolio poprzez minimalizację artefaktów oraz strat materiału.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia wiarygodną analizę struktury makromolekularnej poprzez ochronę próbek przed denaturacją na granicy faz powietrze-woda.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez zachowanie natywnych konformacji podczas przygotowywania siatek.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną dzięki minimalizacji uszkodzeń i kontaminacji próbek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych siatek EM do późniejszych etapów przepływów pracy w badaniach strukturalnych.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację nakładania folii wspierającej w różnych partiach.
- Umożliwia szybkie i skalowalne przygotowanie siatek z nośnikami z amorficznego węgla, grafenu lub tlenku grafenu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zachowuje integralność próbek w badaniach translacyjnych wymagających wysokiej wierności danych strukturalnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, umożliwiając niezawodne obrazowanie trudnych próbek.
- Minimalizuje ryzyko wyników fałszywie ujemnych wynikających z denaturacji lub kontaminacji próbek.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda bloku flotacyjnego jest integrowana na etapie przygotowania próbek, łącząc wczesne odkrywanie i identyfikację związków wiodących z przepływami pracy w obrazowaniu przedklinicznym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie pozyskiwania wysokiej jakości danych strukturalnych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, zminimalizowane pod kątem zanieczyszczeń siatki do wiarygodnej oceny związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki obrazowania o wysokiej integralności do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Zachowuje wierność próbek dla późniejszych badań nad biomarkerami lub mechanizmami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zstandaryzowany, wielokrotnego użytku protokół, który można dostosować do różnych folii podpierających i rodzajów próbek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność strukturalną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy, ogranicza liczbę kroków manualnych i minimalizuje ryzyko kontaminacji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go poprzez poprawę jakości i powtarzalności danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera postępy skorygowane o ryzyko poprzez ograniczenie utraty próbek i błędów w przygotowaniu.
Kwestie implementacyjne
- Wymaga doświadczenia w obsłudze siatek EM oraz transferze folii nośnej.
- Wymagany dostęp do bloku flotacyjnego, urządzenia do czyszczenia plazmowego oraz standardowej infrastruktury do przygotowania próbek EM.
- Wymagana standaryzacja międzyzespołowa w celu uzyskania powtarzalnych wyników w różnych projektach.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do nośników węglowych, grafenowych oraz tlenku grafenu, co zostało wykazane w pracy.
- Potencjalne ograniczenia obejmują sporadyczne pękanie folii oraz konieczność rygorystycznej kontroli zanieczyszczeń.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Dlaczego testowanie hipotezy zerowej jest istotne w protokołach dotyczących folii podporowych?
Testowanie hipotezy zerowej zapewnia, że zaobserwowane różnice strukturalne wynikają ze zmiennych biologicznych, a nie z artefaktów powstałych w wyniku denaturacji próbek lub kontaminacji podczas przygotowywania folii wspierającej, co zwiększa pewność w zakresie walidacji celu.
W jaki sposób izolacja zmiennych niezależnych wpisuje się w przepływy pracy w blokach flotacyjnych?
Blok flotacyjny umożliwia izolację zmiennych, takich jak rodzaj folii wspierającej i warunki buforu, co pozwala na systematyczną ocenę ich wpływu na integralność próbki oraz wyniki obrazowania w ramach procesu badawczego.
Co umożliwiają ilościowe pomiary zmiennej zależnej podczas przygotowywania siatek do EM?
Ilościowa ocena pokrycia filmu, zanieczyszczeń oraz stanu zachowania próbki umożliwia zespołom porównanie warunków przygotowania i optymalizację protokołów w celu uzyskania powtarzalnych, wysokiej jakości obrazów.
Dlaczego wymagania dotyczące replikacji są kluczowe dla międzyfunkcyjnych zespołów EM?
Replikacja zapewnia, że protokoły dotyczące folii wspierających dają spójne wyniki niezależnie od operatora i projektu, co ułatwia niezawodną wymianę danych oraz międzyfunkcyjną współpracę w ramach procesów biologii strukturalnej.
Jakie możliwości analizy statystycznej są wymagane przed wdrożeniem protokołów blokowania flotacyjnego?
Zespoły powinny opracować metody statystyczne do oceny jakości siatek, integralności filmu oraz wskaźników zanieczyszczeń, co pozwoli na podejmowanie decyzji opartych na danych w zakresie przyjęcia protokołu i integracji z przepływem pracy.
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Preparation of Negatively Stained Samples with Amorphous Carbon Support
2:21
Preparation of Graphene Oxide-coated TEM Grids
3:27
Preparation of Samples on Monolayer-graphene Films Using the Flotation Block
4:44
Results: Examples of Sample Support Films Prepared Using the Floatation Block
5:34
Conclusion
