Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
July 15th, 2021
Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.
Analiza mikroskopii elektronowej jest często złożona. Wierzymy, że nasz protokół ułatwia przetwarzanie i pozyskiwanie danych EM z dużej powierzchni próbki i objętości pośredniej. Nasz protokół pomaga znaleźć docelowe struktury w sekcjach szeregowych.
Rejestrowanie danych jest ograniczone do tego, co jest niezbędne. W porównaniu z akwizycją danych w blokach całych tkanek czas rejestracji jest skrócony, a analiza danych łatwiejsza. Biorąc pod uwagę ogólną łatwość tego podejścia, uważamy, że można je wykorzystać nie tylko do rozwiązywania problemów naukowych, ale także jako narzędzie diagnostyczne.
Aby wygenerować matrycę do analizy, najpierw zaciśnij próbkę na uchwycie ultramikrotomu i użyj żyletki, aby z grubsza przyciąć żywicę wokół próbki. Użyj diamentowego narzędzia do przycinania, aby dokładnie przyciąć próbkę i użyj noży do przycinania o nachyleniu 20 lub 90 stopni, aby upewnić się, że górna i dolna powierzchnia bloku są równoległe do krawędzi tnącej noża. Wymieszaj ksylen i klej w proporcji 3:1 i za pomocą rzęsy dołączonej do wykałaczki nałóż mieszankę na górną i dolną krawędź przyciętego bloku.
Podczas suszenia mieszaniny użyj narzędzia do rozłupywania wafli, aby przyciąć kawałek płytki do odpowiedniego rozmiaru do analizy. Wyczyść wafel w wodzie destylowanej, aby spłukać wszelkie zanieczyszczenia i oczyść powierzchnię plazmą po wyschnięciu wafla. Aby przygotować nóż do tomografii matrycowej, użyj piankowej taśmy klejącej, aby przymocować igłę do dna noża histo jumbo i umieść nóż w uchwycie ultra mikrotomowym pod zerem stopni.
Wyreguluj krawędź noża równolegle do powierzchni bloku i przyłóż przycięty klocek do krawędzi noża w pozycji gotowej do cięcia. Umieść czystą wafel w misce na nóż i napełnij miskę wodą do tego samego poziomu co krawędź noża, a następnie pozwól diamentowej krawędzi noża odpowiednio nawilżyć, używając dołączonej strzykawki do dodawania lub odjmowania wody w razie potrzeby. W przypadku cięcia matrycowego ustaw mikrotom na zakres cięcia od 50 do 100 nanometrów i prędkość cięcia od 6 do 1 milimetra na sekundę, a następnie rozpocznij cięcie, aby uzyskać wstęgę wystarczająco długą, aby pokryć docelową objętość Z.
W zależności od rozmiaru bloku, jednorodności tkanki i rodzaju żywicy, wstążka będzie w przybliżeniu prosta. Użyj czystej, nieklejącej się końcówki rzęsy, aby odczepić wstążki od krawędzi noża. Użyj rzęsy, aby delikatnie przesunąć wstążkę do środka podłoża podporowego.
W razie potrzeby do rozciągnięcia odcinka można użyć chloroformu lub pisaka grzewczego. Po rozciągnięciu należy schować strzykawkę, aby rozpocząć spuszczanie wody. W przypadku delikatniejszych wstążek lub wolniejszego cofania wody, odłącz strzykawkę od węża, aby woda mogła spłynąć.
Gdy poziom wody osiągnie poziom wafla, delikatnie popchnij wstążkę do środka miski i kontynuuj opróżnianie, aż cała pozostała woda zostanie całkowicie usunięta z miski. Pozostaw wafel do wyschnięcia w czystym środowisku. Suszenie trwa około 30 minut.
Gdy próbka jest całkowicie wysuszona, przenieś matrycę do szczelnie zamkniętego pudełka, aby chronić ją przed zanieczyszczeniem brudem. I umieść pudełko w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut. Aby uzyskać mapę poglądową obrazów SEM, która ujawnia lokalizacje sekcji na płytce, użyj wbudowanej kamery optycznej w celu uzyskania obrazu SEM, który obejmuje wstęgę sekcji.
Aby utworzyć mozaikę, kliknij i przeciągnij obraz z kamery próbki i rozpocznij automatyczną akwizycję. Uzyskuj przeglądy w wyższej rozdzielczości, aby znaleźć docelowe struktury. Jeśli konieczne jest zobrazowanie tylko kilku sekcji, użyj przeglądarki z możliwością powiększania, aby wyświetlić uzyskane obrazy w ich oryginalnych lokalizacjach.
Po zidentyfikowaniu sekcji, która powinna zostać zobrazowana w wysokiej rozdzielczości, kliknij i przeciągnij, aby utworzyć region obrazowania, a następnie wybierz opcję Ustawienia obrazowania w wysokiej rozdzielczości i zapisz ustawienia w szablonie Aby znaleźć szczególnie małe lub trudne do wykrycia rzadkie zdarzenia, użyj ustawień obrazowania o wysokiej rozdzielczości w co 10. sekcji lub w jednej sekcji na wstążce, aby ręcznie utworzyć region obrazowania i uzyskać obrazy. Następnie przejrzyj obrazy i zaznacz sekcje, które zawierają obszar zainteresowania. Aby uzyskać więcej niż 10 kolejnych sekcji, użyj wyszukiwarki sekcji, aby automatycznie zlokalizować wszystkie sekcje.
Jeśli obrazy przeglądowe nie pokazują wyraźnych obszarów zainteresowania, uzyskaj obrazy sekcji w wyższej rozdzielczości i użyj funkcji podglądu przekroju, aby automatycznie utworzyć i pobrać obrazy. Aby określić optymalne ustawienia obrazowania, aktywuj obrazowanie na żywo w oprogramowaniu sterującym mikroskopem i przejdź do jednego obszaru zainteresowania, a następnie dostosuj ustawienia obrazowania, aż obrazy pokażą wyraźne obszary zainteresowania, ale bez nadmiernie długiego pozyskiwania obrazu, zgodnie z wytycznymi producenta. Aby zoptymalizować położenie obszarów obrazowania na kolejnych sekcjach, powiększ obraz zainteresowania i kliknij przycisk Rozpocznij zawężenie pozycji, aby zwiększyć precyzję rejestrowanych lokalizacji sekcji.
Aby zdefiniować region obrazowania, kliknij i przeciągnij dowolną sekcję, przytrzymując Alt, a następnie wybierz opcję Utwórz zestaw kafelków z wyskakującego menu kontekstowego. Oprogramowanie utworzy obszary obrazowania w tym samym względnym położeniu we wszystkich sekcjach, które zostały znalezione lub wcześniej oznaczone. Następnie w razie potrzeby skonfiguruj liczbę pikseli, rozmiar pikseli, układ kafelków i czas przebywania pikseli w każdej serii obrazów.
Aby skonfigurować funkcję auto, należy utworzyć osobną serię obrazów dla funkcji automatycznych, jak pokazano, i przenieść serię obrazów do pozycji w sekcji, która zawiera struktury o wysokim kontraście. Ustaw serię obrazów na 1024 x 884 pikseli i wybierz rozmiar piksela odpowiadający najwyższej rozdzielczości użytej w serii obrazów. Na liście funkcji automatycznych zaznacz Autofokus i Autostygmat.
Wybierz opcję Bisection (Przekrój) w kontrolkach sekwencji akwizycji i upewnij się, że obraz funkcji automatycznej jest pierwszym elementem na liście, a następnie kliknij przycisk Acquire All (Uzyskaj wszystko), aby rozpocząć pobieranie obrazu. Po utworzeniu i skonfigurowaniu wszystkich serii obrazowania zostaną one wyświetlone w kolejce zadań. Akwizycja w niskiej rozdzielczości może być wykonywana ręcznie lub automatycznie bezpośrednio na wybranych częściach sekcji lub całej sekcji za pomocą obrazowania pojedynczego lub mozaikowego, a następnie zszywania.
Obrazy z wybranego obszaru można następnie uzyskać przy użyciu parametrów o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji mitochondriów, jąder i mikrokosmków, na przykład Po wybraniu automatycznego pozyskiwania map mozaiki w rozdzielczości można wyciąć kilka obszarów zainteresowania lub użyć ich do zdefiniowania dodatkowych lokalnych obszarów obrazowania w regionach. Chociaż różne wyspecjalizowane typy komórek w jelicie Drosophila są rozmieszczone losowo, można je wizualnie odróżnić po przesiewaniu obrazów przy użyciu parametrów o wysokiej rozdzielczości, albo z pojedynczych sekcji, albo jako zbiór obrazów seryjnych. Po wyrównaniu stosy mogą być renderowane przy użyciu różnych rozwiązań programowych.
Analiza tomografii matrycowej pozwala na wygenerowanie wielu sekwencyjnych sekcji na pojedynczej płytce i ich przesiewanie przy użyciu parametrów o niskiej rozdzielczości w celu zlokalizowania ogólnych obszarów zainteresowania. Obszary te mogą być ukierunkowane na dalszą analizę przy użyciu zaawansowanych parametrów akwizycji. Na przykład podziały mitotyczne w notum nie są łatwe do zlokalizowania na poziomie ultrastrukturalnym, ponieważ komórki są stosunkowo duże w porównaniu ze strefą odcięcia.
Jednak przy użyciu tej metody można wykorzystać automatyczne obrazy przeglądowe o średniej rozdzielczości skoków od 20 do 40 sekcji do lokalizacji dzielących się komórek. Procedura tomografii matrycowej zapewnia prostszą analizę danych z mikroskopii elektronowej. Zachęcamy widzów do zainwestowania w opanowanie regeneracji i zapoznania się z pracą związaną z mapami Z naszego doświadczenia wynika, że niewiele tematów badawczych wymaga ultrastrukturalnej analizy całych zwierząt lub całych narządów.
Nasza metoda pomaga w szybkiej lokalizacji komórek i ich partnerów interakcji w tkankach.
Przegląd
To badanie przedstawia protokół przygotowania taśm przekrojów szeregowych do analizy Tomografii Tablicowej przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazów w skaningowym mikroskopie elektronovym (SEM). Metoda umożliwia efektywne przesiewanie i odzyskiwanie zlokalizowanych, rzadkich zdarzeń w dużych objętościach próbek, znacząco zmniejszając czas rejestracji danych w porównaniu z tradycyjnymi metodami przekroju całej tkanki.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Mikroskopia elektronowa
- Techniki akwizycji obrazu
- Metodologia przygotowania próbek
Tło
- Złożoność analizy danych mikroskopii elektronowej
- Znaczenie ukierunkowanego przetwarzania obrazu dla rzadkich struktur
- Potrzeba poprawy efektywności przetwarzania próbek
Zastosowane metody
- Przygotowanie ultracienkich przekrojów szeregowych
- Wykorzystanie ultramikrotomu i noży diamentowych
- Zautomatyzowane protokoły przetwarzania obrazów SEM
Główne wyniki
- Ustandaryzowany protokół przygotowania i przetwarzania obrazów przekrojów szeregowych
- Skrócony czas przetwarzania obrazów z ulepszonymi możliwościami analizy danych
- Skuteczna metoda w identyfikacji docelowych struktur
Konkluzje
- Protokół wykazuje znaczące zalety w pozyskiwaniu danych mikroskopii elektronowej
- Stanowi narzędzie diagnostyczne dla naukowych badań struktur komórkowych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Array tomography in SEM enables precise localization of target structures within large sample volumes, reducing unnecessary data acquisition and improving efficiency in discovery workflows. This approach supports rapid identification of rare cellular events, enhancing predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The method facilitates translational continuity by preserving samples for repeated imaging and enabling scalable, reproducible analysis across discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise localization of target areas in serial sections.
- Operational Value: Reduces data acquisition time by focusing imaging on relevant fractions of sample volume.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by providing nanometer-resolution structural insights for organelle-level questions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream SEM imaging workflows.
- Operational Value: Enables array sectioning on wafers for standardized, repeatable sample preparation.
- Scalability: Supports creation of section libraries ready for repeated imaging and automated acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Conserves array tomography samples during imaging, allowing reuse for validation studies.
- Mechanistic De-risking: Provides quantitative structural data on mitochondria, nuclei, and microvilli to inform preclinical decisions.
- Predictive Confidence: Enables alignment of imaging data with disease-relevant systems through high-resolution parameter screening.
Pipeline & Workflow Integration
The array tomography workflow integrates into the discovery continuum by enabling early target localization, supporting lead identification through targeted high-resolution imaging, and informing preclinical validation via reproducible structural analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying rare events such as mitotic divisions in tissue samples.
- Screening: Delivers assay readiness through low-resolution overview imaging to localize areas of interest before high-resolution acquisition.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via mosaic maps and aligned stacks for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through rendered sections that support biomarker alignment and structural validation.
- Enterprise Reuse: Positions the method as a reusable capability via section libraries stored in tightly-closed boxes and oven-stabilized for repeated imaging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through nanometer-resolution imaging of cellular and structural details.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via automated SEM imaging protocols and section finder tools.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization enabled by efficient acquisition of volume information from large sample surfaces.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ultramicrotome operation, diamond knife handling, and wafer preparation techniques.
- Depends on instrumentation including ultramicrotome, plasma cleaner, syringe-based humidity control, and SEM with optical camera.
- Necessitates cross-team standardization of section thickness (50–100 nm), cutting speed (6–1 mm/s), and water basin protocols.
- Involves adaptation considerations for varying block size, tissue homogeneity, and resin type affecting ribbon straightness.
- Includes practical limitations such as the need for manual ribbon detachment using eyelash tips and water retraction timing for delicate samples.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Array Generation
1:42
Sample Sectioning
2:23
Array Sectioning and Transfer
3:53
Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:16
Imaging Region Definition
6:37
Auto Function Configuration and Image Acquisition
7:27
Results: Representative Targeted Acquisition of Volume Information
9:02
Conclusion
