Name: Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj protokół tomografii matrycowej do ukierunkowanego pozyskiwania danych objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Ta metoda skraca czas rejestracji i ułatwia analizę struktur komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy podziękować członkom placówki EM Uniwersytetu w Lozannie za ich wsparcie podczas opracowywania różnych etapów procedury AT. Serdecznie dziękujemy Garethowi Griffithsowi, Marcie Rodrigues, Ursce Repnik, Christel Genoud, Helmutowi Gnaegi, Einat Zelinger, Paoli Moreno-Roman, Lucy O'Brien i Lindsay Lewellyn za dyskusje podczas przygotowywania rękopisu i krytyczną lekturę. Chcemy podziękować grupom, które dostarczyły próbki użyte do zademonstrowania różnych scenariuszy: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat i Fanny Langlet.

UWAGA: Metody przygotowania próbek są opisane gdzie indziej14,30,31, i nie są omówione w tej publikacji. Krótko mówiąc, pokazane przykłady zostały chemicznie utrwalone aldehydem glutarowym, utrwalone po utrwaleniu 1% OsO4, a następnie potraktowane 1% wodnym octanem uranylu przed zatopieniem w żywicy do zatapiania. Alternatywnie próbki można przygotować za pomocą zamrażania pod wysokim ciśnieniem, zamrażania podstawiając 0,1% octanem uranylu w acetonie i zatopić w żywicy akrylowej. Bloki próbki przygotowano przy użyciu metody płaskiego zatapiania, która pozwala na wyraźny widok próbki, ułatwiając jej orientację do przekroju (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).
1. Procedura generowania tablicy
<ol>
	<li>Orientacja i przycinanie osadzonej próbki
	<ol>
		<li>Za pomocą lornetki/mikroskopu zidentyfikuj i zaznacz ROI na powierzchni osadzonego bloku, lekko drapiąc powierzchnię bloku żyletką. Pomoże to zorientować próbkę wewnątrz ultramikrotomu i zmniejszy powierzchnię cięcia.</li>
		<li>Zacisnąć próbkę na uchwycie ultramikrotomu (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
		<li>Przytnij żywicę wokół próbki, najpierw żyletką (przycinanie zgrubne), a następnie kontynuuj za pomocą diamentowego narzędzia do przycinania (dokładne przycinanie; <silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Używaj noży o nachyleniu krawędzi 20° lub 90°, aby upewnić się, że górna i dolna powierzchnia bloku są równoległe do krawędzi tnącej noża. 
		UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla seryjnego cięcia i pozyskiwania prostych taśm.</li>
		<li>Wymieszaj ksylen i klej w proporcji 3:1. Za pomocą rzęsy przymocowanej do wykałaczki nałóż tę mieszankę na górną i dolną krawędź przyciętego bloku. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj wspornik montażowy matrycy A (tj. płytki krzemowe).
	<ol>
		<li>Wytnij kawałek wafla za pomocą narzędzia do rozłupywania płytek (EMS), dostosowując jego rozmiar do celu projektu. 2 cm x 4 cm jest wygodne zarówno do obserwacji mikroskopią świetlną, jak i elektronową.</li>
		<li>Oczyść wafel w wodzie destylowanej, aby pozbyć się zanieczyszczeń.</li>
		<li>Wyładowanie jarzeniowe/plazmowe czyści powierzchnię przy użyciu standardowego wyposażenia. Dokładne parametry będą zależeć od używanej maszyny. Zacznij od parametrów rozładowania kratek i empirycznie dostosuj czas. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla dobrego rozłożenia sekcji na podporze podczas wysychania sekcji i nie należy go pomijać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wspornik montażowy B tablic (tj. szklane szkiełko nakrywkowe)
	<ol>
		<li>Jeśli planujesz eksperymenty z multipleksowym znakowaniem immunologicznym, przenieś próbki na szkiełku nakrywkowym, aby lepiej wykryć sygnał fluorescencyjny. Aby poprawić przyczepność szkiełka nakrywkowego, należy zastosować szczegółową procedurę powlekania żelatyną, która została opisana wcześniej9.</li>
		<li>Zwiększyć przewodność, pokrywając szkiełka tlenkiem indu i cyny (ITO) lub złotem przez odparowanie. Przygotowane szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w czystym miejscu. Wyładować próbki jarzeniowo, jak opisano w ppkt 1.2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Podział próbki na sekcje
<ol>
	<li>Przygotowanie noża AT 
	UWAGA: Do wygenerowania tablic należy użyć zmodyfikowanego noża (ATS), zaprojektowanego w celu ułatwienia pozyskiwania długich wstęg. Noże Histo-Jumbo lub podobne noże przeznaczone do generowania sekcji na dużych podporach mogą również służyć do cięcia AT.
	<ol>
		<li>Przymocuj igłę do dolnej części noża za pomocą piankowej taśmy klejącej i przebij ją (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Umieść nóż ATS w uchwycie ultramikrotomu pod kątem 0°. Wyreguluj krawędź noża równolegle do powierzchni bloku, postępując zgodnie ze standardową procedurą.</li>
		<li>Przyłóż przycięty blok do krawędzi noża w pozycji gotowej do cięcia.</li>
		<li>Umieść wafel/szkiełko nakrywkowe w misce na noże i napełnij ją wodą do tego samego poziomu, co krawędź noża. Pozwól, aby diamentowa krawędź noża odpowiednio nawilżyła i, jeśli to konieczne, pobierz wodę za pomocą dołączonej strzykawki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzielenie i przenoszenie macierzy
	<ol>
		<li>Ustaw mikrotom na żądane parametry cięcia. W przypadku noża ATS wskazany jest zakres 50-100 nm i prędkość cięcia 0,6-1 mm/s. Rozpocznij sekcję (<silna klasa="xfig">Rysunek 2Di).</li>
		<li>Uzyskaj wstęgę o długości, która zakryje docelowy wolumin z i zatrzyma zbieranie. W zależności od rozmiaru bloku, jednorodności tkanki i rodzaju żywicy, wstęga będzie stosunkowo prosta (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D-ii). Wiele próbek nie da prostych wstążek, pomimo zainwestowanego wysiłku i rodzaju użytego noża.</li>
		<li>W zależności od ostatecznego celu wykonaj jedną długą lub kilka krótkich wstążek wyrównanych obok siebie. Wspornik o wymiarach 2 cm x 4 cm może wygodnie pomieścić od 100 do 1 000 sekcji. Ułożenie wstążki na stopniu podparcia to krok, który wymaga zręczności i pewnych rąk. Jednak krzywa uczenia się tej umiejętności jest szybko nabywana.</li>
		<li>Odczep wstążkę od krawędzi noża za pomocą czystej, nieklejącej się końcówki rzęsy przyklejonej do wykałaczki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2Diii).</li>
		<li>Za pomocą rzęsy delikatnie przesuń wstążkę nad środek podłoża podporowego. W tym momencie użyj chloroformu lub pisaka grzewczego do rozciągania sekcji, jeśli to konieczne. Pamiętaj jednak, że ta manipulacja może wywołać zerwanie i deformację wstążki.</li>
		<li>Spuszczanie wody należy rozpocząć od pociągnięcia za strzykawkę. W przypadku delikatniejszych wstążek lub wolniejszego cofania wody, pozwól, aby woda kapała, odłączając strzykawkę od węża. Gdy poziom wody obniża się do poziomu wafla, kontroluj wstążkę i w razie potrzeby zmień jej położenie, delikatnie dociskając wstążkę do środka. Po osadzeniu wstęg na powierzchni wafla kontynuuj opróżnianie, aż pozostała woda zostanie całkowicie wycofana z miski. 
		UWAGA: Jeśli nie używasz dolnego noża ATS do cofania wody, ostrożnie zmniejsz ilość wody z boków noża ATS, aby nie wywoływać turbulencji.</li>
		<li>Pozostaw sekcje na wsporniku wewnątrz wanny do całkowitego wyschnięcia. W zależności od hydrofobowości podłoża i poziomu wilgotności otoczenia, woda będzie parować w różnym tempie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2Div). Ważne jest, aby pozostawić próbkę do powolnego wyschnięcia, aby zmniejszyć lub całkowicie uniknąć wszelkich fałd na próbce.</li>
		<li>Przenieść suchą próbkę do szczelnie zamkniętego pojemnika w celu ochrony przed zanieczyszczeniem brudem i umieścić ją w piecu o temperaturze 60 °C na co najmniej 30 minut. W razie potrzeby przeciwbejcuj sekcje za pomocą metali ciężkich, aby zwiększyć ogólny kontrast.</li>
		<li>Po zakończeniu procedury ostrożnie wyczyść nóż zgodnie z instrukcjami producenta 
		UWAGA: Przenoszenie wielu lub szeregowych sekcji na płytce (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E) w porównaniu z przenoszeniem na siatkę szczelinową (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F) całkowicie zmienia sposób przygotowania EM. Nieprzerwane cięcie i zbieranie sekcji na pojedynczym podporze zmniejsza liczbę błędów związanych z cięciem i zbieraniem sekcji, które są częste w przypadku cięcia szeregowego. Odpowiednik 100 sekcji o wymiarach 1000 μm x 500 μm zebranych na jednej płytce odpowiada 33 siatkom szczelinowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przykładowa obserwacja
UWAGA: Ta sekcja opisuje kroki przepływu pracy zaimplementowane przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania (zobacz Spis materiałów). Można użyć dowolnego oprogramowania do akwizycji obrazu na dowolnym SEM wyposażonym w odpowiednie detektory, jednak konkretne działania użytkownika będą się różnić i często będą bardziej ręczne.
<ol>
	<li>Uzyskaj mapę poglądową obrazów SEM, która ujawnia lokalizacje sekcji na płytce. Wbudowany obraz z kamery optycznej pomaga w definiowaniu mozaiki obrazów SEM, która obejmuje wstęgę sekcji lub wszystkie sekcje. Utwórz mozaikę, klikając i przeciągając myszą w prawo na obrazie z kamery próbki i rozpocznij Automatyczną Akwizycję. 
	UWAGA: Wystarczą bardzo zgrubne ustawienia obrazowania, tj. rozmiar piksela 1-2 μm i czas przebywania 1 μs. Proces ten jest zilustrowany w materiałach uzupełniających (strony 2-7).</li>
	<li>Zlokalizuj sekcje za pomocą funkcji automatycznego wykrywania Section Finder lub zlokalizuj je ręcznie. Pozycje i kontury przekrojów są pobierane automatycznie za pomocą tego oprogramowania na podstawie dopasowania obrazu. Aby zilustrować ten proces, zobacz Materiały dodatkowe (strony 8 - 15).</li>
	<li>W przypadku, gdy obrazy przeglądowe nie pokazują wyraźnie zwrotu z inwestycji, uzyskaj obrazy sekcji w wyższej rozdzielczości. Użyj funkcji Podgląd sekcji, aby automatycznie tworzyć i pobierać obrazy. Proces ten jest zilustrowany w materiałach uzupełniających, strony 16-18. Ustawienia obrazowania muszą być wybrane zgodnie z charakterem i wielkością zwrotu z inwestycji, którego szuka użytkownik.
	<ol>
		<li>Aby znaleźć optymalne ustawienia, aktywuj obrazowanie na żywo w oprogramowaniu sterującym mikroskopem i przejdź do jednego zwrotu z inwestycji. Zmieniaj ustawienia obrazowania, aż obrazy wyraźnie pokażą zwrot z inwestycji, ale akwizycja obrazu nie będzie zbyt długa. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Definiowanie regionów obrazowania 
	UWAGA: Zaproponowano kilka różnych strategii.
	<ol>
		<li>Jeśli konieczne jest zobrazowanie tylko kilku sekcji, użyj obrazów utworzonych do tej pory sekcji, aby przejść do odpowiednich sekcji i użyj przeglądarki Zoomable, która pokazuje wszystkie uzyskane obrazy w ich oryginalnych lokalizacjach względnych, aby spojrzeć na wszystkie sekcje. Po znalezieniu sekcji, która powinna zostać zobrazowana w wysokiej rozdzielczości, utwórz region obrazowania za pomocą kliknięcia i przeciągnięcia. Wybierz ustawienia obrazowania w wysokiej rozdzielczości i zapisz je w szablonie. Użyj tego szablonu ponownie w dalszych sekcjach.</li>
		<li>Aby znaleźć szczególnie małe lub trudne do wykrycia rzadkie zdarzenia, należy zastosować metodę badania przesiewowego bocznego. Ręcznie utwórz region obrazowania z ustawieniami obrazowania o wysokiej rozdzielczości na co dziesiątej sekcji lub na jednej sekcji na wstążkę i uzyskaj obrazy. Przejrzyj obrazy i zaznacz sekcje, które zawierają zwrot z inwestycji w oprogramowaniu lub zanotuj.
		<ol>
			<li>Zaczynając od sekcji, które zawierają zwrot z inwestycji, poruszaj się do przodu i do tyłu przez zestaw sekcji i twórz regiony obrazowania o wysokiej rozdzielczości w tych samych lokalizacjach względnych tak długo, jak długo struktura jest nadal widoczna w przekroju. Można to zrobić ręcznie lub korzystając z procedury opisanej w kolejnych krokach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uzyskuj obrazy w więcej niż dziesięciu kolejnych sekcjach. Kliknij przycisk Rozpocznij zawężanie pozycji po powiększeniu obrazu, aby zwiększyć precyzję rejestrowanych lokalizacji sekcji zgodnie z opisem w instrukcji. Zmniejsza to zmienność położenia serii obrazów. Procedura jest zilustrowana i wyjaśniona w materiałach uzupełniających na stronach 19-21.</li>
		<li>Kliknij i przeciągnij dowolną sekcję, aby zdefiniować region obrazowania, przytrzymując Alt, a następnie wybierz opcję Utwórz tablicę zestawów kafelków z menu kontekstowego, które otwiera się po zwolnieniu przycisku myszy. Następnie oprogramowanie tworzy obszary obrazowania w tym samym względnym położeniu we wszystkich sekcjach, które zostały wcześniej znalezione lub oznaczone. Możliwe jest ograniczenie obrazowania do określonego zakresu przekrojów za pomocą suwaka Rozpiętość sekcji. 
		UWAGA: Procedurę tę można powtórzyć z dowolną liczbą obszarów obrazowania, dzięki czemu umożliwia rejestrowanie wielu małych obrazów o wysokiej rozdzielczości zamiast rejestrowania pojedynczego większego obrazu na każdej sekcji.</li>
		<li>Po utworzeniu skonfiguruj liczbę pikseli, rozmiar pikseli, układ kafelków, czas przebywania pikseli itp. w każdej serii obrazów zgodnie z potrzebami. Po utworzeniu i skonfigurowaniu serii obrazowania wszystkie są wymienione w podpowiedzi zadania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja funkcji automatycznych i rozpoczęcie akwizycji obrazu
	<ol>
		<li>Utwórz osobną serię obrazów dla funkcji automatycznych, korzystając z tej samej metody, która została opisana w poprzednim kroku. Przenieś serię obrazów do miejsca w sekcji, która zawiera struktury o wysokim kontraście.</li>
		<li>Ustaw serię obrazów na 1024 x 884 pikseli i wybierz rozmiar piksela odpowiadający najwyższej rozdzielczości używanej w serii obrazów skonfigurowanej w poprzednich krokach. Na liście funkcji automatycznych sprawdź Auto Focus i Auto Stigmator.</li>
		<li>Wybierz opcję Według sekcji w kontrolkach sekwencji akwizycji i upewnij się, że obraz funkcji automatycznych jest pierwszym elementem na liście. Rozpocznij pobieranie obrazu, klikając przycisk Uruchom obok podpowiedzi zadania. Procedury te są zilustrowane w materiałach uzupełniających, strony 22-23. 
		UWAGA: Nie ma potrzeby ręcznego wstępnego ustawiania ostrości na każdej sekcji. Podczas sesji nagrywania, za każdym razem, gdy mikroskop przejdzie do nowej sekcji, funkcje automatyczne zostaną wykonane przed zarejestrowaniem wszystkich innych obrazów w tej sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wyrównanie i analiza danych
<ol>
	<li>Eksport danych
	<ol>
		<li>Upewnij się, że dane są zapisane w .tif formacie, więc nie ma potrzeby korzystania z dedykowanej funkcji eksportu. Sortowanie danych w strukturze folderów, która odpowiada bezpośrednio warstwom i elementom w drzewie warstw.</li>
		<li>Po zarejestrowaniu mozaiki obrazów użyj funkcji StitchAll, aby automatycznie zszyć wszystkie płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównywanie i kadrowanie stosu w Fidżi 
	NUTA. Do pracy z danymi tomografii matrycowej można wykorzystać wiele pakietów oprogramowania (bezpłatnych i komercyjnych). Poniższe kroki są pokazane za pomocą programu typu open source Fiji32, ponieważ jest on powszechnie dostępny i zawiera wszystkie wymagane funkcje.
	<ol>
		<li>Zaimportuj stos obrazów (lub zszytych obrazów) na Fidżi jako stos wirtualny.</li>
		<li>Jeśli konieczna jest normalizacja kontrastu/jasności, wybierz polecenie Zwiększony kontrast... z menu Proces. Ustaw opcję Nasycone piksele na 0,1 lub mniej, a następnie zaznacz opcję Przetwarzaj wszystkie plasterki.</li>
		<li>Z menu Wtyczki wybierz Rejestracja | Liniowe wyrównanie stosu za pomocą SIFT.</li>
		<li>Wybierz opcję Sztywny lub Nierafinowany z menu rozwijanego Oczekiwana transformacja. W przeciwnym razie zachowaj ustawienia domyślne. Rozpocznij wyrównywanie, klikając przycisk OK. 
		UWAGA: Załadowanie danych jako wirtualnego stosu umożliwia Fidżi obsługę stosów o dowolnym rozmiarze. Dane wyjściowe wyrównania są tworzone w pamięci RAM; Może to jednak ograniczyć maksymalny rozmiar stosów, które mogą być przetwarzane. W takim przypadku należy użyć opcji Register Virtual Stack Slices, która jest implementacją tego samego algorytmu rejestracji typu folder-folder. Po zakończeniu rejestracji załaduj dane wyjściowe jako stos wirtualny.</li>
		<li>Przytnij stos obrazów, klikając Przytnij, aby zawierał tylko zwrot z inwestycji.</li>
		<li>Zapisz stos jako pojedynczy obraz .tif lub serię .tif obrazów. 
		UWAGA: Krytyczne etapy tomografii matrycowej są pokazane w Rysunek 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+%28SEM%29+and+focused+ion+beam+%28FIB%29%2FSEM+in+biology%3A+Fixed+coordinates%2C+flat+embedding%2C+absolute+references%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transaction+of+Royal+Society+of+London+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+electron+microscopy+volume+of+the+brain+of+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster.</a> Cell. 174 (3), 730-743 (2018).</li>
<li>Mulcahy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+volume+electron+microscopy+of+the+caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 94(2018).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+molecules+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of molecules and cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).</li>
<li>Hoog, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li>
<li>Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+studies+of+eukaryotic+cells+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography.</a> Cells. 8 (1), 57(2019).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+%28S3EM%29+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS One. 7 (4), 35172(2012).</li>
<li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper%3A+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 68(2014).</li>
<li>Kubota, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carbon+nanotube+tape+for+serial-section+electron+microscopy+of+brain+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure.</a> Nature Communication. 9 (1), 437(2018).</li>
<li>Wacker, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+Hierarchical+Imaging+of+Serial+Sections+for+Finding+Specific+Cellular+Targets+within+Large+Volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57059(2018).</li>
<li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li>
<li>Templier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MagC%2C+magnetic+collection+of+ultrathin+sections+for+volumetric+correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy.</a> Elife. 8, 45696(2019).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li>
<li>Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+EM-based+reconstruction+of+the+interglomerular+projectome+in+the+zebrafish+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).</li>
<li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology%3A+Applications+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB-SEM+tomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">FIB-SEM tomography in biology.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).</li>
<li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, 25916(2017).</li>
<li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+cluster+ion+beam+SEM+for+imaging+of+large+tissue+samples+with+10+nm+isotropic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution.</a> Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).</li>
<li>Maco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+in+vivo+2+photon+and+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons.</a> PLoS One. 8 (2), 57405(2013).</li>
<li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li>
<li>Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+microscopes%3A+3D+correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+of+complex+biological+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures.</a> Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).</li>
<li>Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+scanning+electron+microscopy+for+observing+the+three-dimensional+ultrastructure+of+membranous+cell+organelles+in+relation+to+their+molecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).</li>
<li>Peddie, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+and+integrated+light+and+electron+microscopy+of+in-resin+GFP+fluorescence%2C+used+to+localise+diacylglycerol+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).</li>
<li>Markert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+subcellular+localization+with+superresolution+array+tomography+on+ultrathin+sections+of+various+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species.</a> Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).</li>
<li>Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+precise+and+rapid+mapping+protocol+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+small+invertebrate+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms.</a> Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).</li>
<li>Kolotuev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+correlative+anatomy+of+invertebrate+model+organisms+increases+efficiency+of+TEM+data+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).</li>
<li>Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+acetylcholine+signaling+through+a+muscarinic+receptor+regulates+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118(2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li>
<li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+asymmetric+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of asymmetric stem cell division.</a> Cell. 132 (4), 583-597 (2008).</li>
<li>Daniel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+septate+junctions+assembly+and+completion+of+cytokinesis+in+proliferative+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues.</a> Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).</li>
<li>Pasquettaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peculiar+protrusions+along+tanycyte+processes+face+diverse+neural+and+non-neural+cell+types+in+the+hypothalamic+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2020).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), 38011(2012).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+image+browser%3A+A+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1002340(2016).</li>
</ol>

Autor, Tilman Franke, jest pracownikiem firmy Thermo Fisher, która produkuje mikroskopy elektronowe i programy pilotażowe, które są wykorzystywane w artykule.

Mikroskopia elektronowa daje wgląd w ultrastrukturę komórek i organizmów, dla których często pożądane jest obrazowanie interesujących struktur w ich trójwymiarowym kontekście. Pomimo licznych taktyk EM do analizy ultrastrukturalnej, nadal nie ma rozwiązania "złotego standardu". Głównym powodem jest duża różnorodność próbek, wiele kwestii biologicznych, które często wymagają indywidualnego podejścia. Proponowany przepływ pracy AT został zaprojektowany tak, aby zminimalizować czas niezbędny do przetwarzania, pozyskiwania, oceny i przechowywania próbek. Co więcej, zmodyfikowany nóż stanowi pomocne narzędzie upraszczające akwizycję tablicy. Kompaktowy układ sekcji na płytkach jest wygodny, zarówno do obserwacji, jak i późniejszego przechowywania próbek. Taki układ umożliwia "boczne przesiewanie" próbek poprzez poziome przesuwanie się od taśmy do taśmy i skanowanie tylko jednej sekcji na każdej z nich, co znacznie skraca czas potrzebny na zlokalizowanie zwrotu z inwestycji. Proponowane scenariusze pozyskiwania danych ułatwiają ukierunkowanie na małe i losowo rozmieszczone obszary. Po znalezieniu, AT/SEM ogranicza obrazowanie w wysokiej rozdzielczości precyzyjnie do interesującej go wielkości, niezależnie od tego, czy jest wykonywane ręcznie, czy za pomocą funkcji automatycznej. AT dla ograniczonych objętości można wykonać ręcznie, a operator porusza się po próbce i definiuje obszary obrazowania jeden po drugim. Zautomatyzowany moduł oprogramowania zapewnia elastyczną strategię akwizycji obrazu do obrazowania małych obszarów na dużych odcinkach. Automatyzacja w tym oprogramowaniu pozwala na nagrywanie dużych obrazów o wysokiej rozdzielczości na setkach sekcji, osiągając podobne objętości jak SBFI. Rejestrowanie obrazów przeglądowych wszystkich przekrojów upraszcza lokalizację zwrotu z inwestycji i skraca czas spędzony przy mikroskopie. Ponieważ sekcje nie są uszkadzane podczas nagrywania przeglądów i podglądów o wyższej rozdzielczości, AT/SEM zezwala na ponowne wykorzystanie próbki do zbierania dalszych danych o innych ROI lub w wyższej rozdzielczości.
Czas akwizycji obrazu jest jednym z najważniejszych (i najdroższych) aspektów 3D EM i dlatego powinien być brany pod uwagę w projekcie eksperymentu. Chociaż nie jest zaskakujące, że obrazowanie dużych obszarów trwa dłużej niż obrazowanie małych obszarów, łatwo jest nie docenić wpływu: w zależności od wybranych parametrów obrazowania, czas akwizycji na każdej sekcji może wahać się od sekund do godzin. Krytyczne parametry obrazowania obejmują rozmiar pola widzenia, rozdzielczość i czas przebywania. Zakładając docelową rozdzielczość 10 nm na piksel i czas przebywania 1 μs, obrazowanie pola o wymiarach 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm lub 500 μm x500 μm zajmuje 4 sekundy, 100 sekund lub 2,500 s. Możemy pomnożyć te czasy obrazowania dla każdego odcinka przez liczbę sekcji, aby oszacować czas potrzebny na pełne zadanie obrazowania. Długie czasy obrazowania dla każdej sekcji mogą być akceptowalne, jeśli liczba sekcji jest mała lub jeśli czas pracy mikroskopu nie ma znaczenia.
Jednak w większości przypadków konieczne jest ograniczenie czasu nagrywania do pracy w nocy lub w weekendy. Równie krytycznym aspektem 3D EM, który należy wziąć pod uwagę, jest ilość i struktura wynikowych danych obrazu. Zapis w/w pól obrazowania w 100 sekcjach generuje odpowiednio 400 mb, 10 gb lub 250 gb danych obrazu; Obrazy o wymiarach 500 μm x 500 μm stanowią dodatkowy problem polegający na tym, że każdy z nich jest większy niż 2 GB. Wiele programów używanych do oceny danych nie może otwierać obrazów o takim rozmiarze.
Aby skrócić czas obrazowania, ważne jest, aby wybrać czas przebywania pikseli, aby spełnić wymagania dotyczące stosunku sygnału do szumu dla późniejszej oceny danych (np. rekonstrukcji, śledzenia) i ograniczyć nagrania do zdefiniowanych ROI. Rozszerzenie AT oprogramowania ułatwia akwizycję obrazu w małych obszarach w odcinkach szeregowych. Oprogramowanie obsługuje ręczne i automatyczne przepływy pracy oraz wiele wariantów półautomatycznych: obszary obrazowania mogą być ręcznie pozycjonowane i skupiane na każdej sekcji lub użytkownik może korzystać z funkcji automatycznego wyszukiwania sekcji i wyrównywania pozycji. W zależności od wybranego i wspieranego przez typ próbki poziom automatyzacji lub cele obrazowania, czas potrzebny na skonfigurowanie akwizycji obrazu w setkach sekcji może zająć cały dzień roboczy (wykonywany ręcznie) lub tylko kilka minut. Zasadniczo tomografia matrycowa sprawia, że uzyskanie małych zwrotów z inwestycji jest trudniejsze niż inne metody 3D EM; Nieprecyzyjne rozmieszczenie regionów na kolejnych odcinkach musi być kompensowane poprzez pozyskiwanie większych obszarów. Na przykład, jeśli ROI ma rozmiar 20 μm x 20 μm, a zmienność położenia pól obrazowania między sekcjami wynosi 10 μm, należy uzyskać obrazy 40 μm x 40 μm, aby mieć pewność, że ROI jest w pełni uchwycony na każdym obrazie, na każdym przekroju. Rzeczywista zmienność pozycji obrazu waha się od 100 μm do <10 μm, w zależności od dostępności lub jakości funkcji oprogramowania do wyrównywania pozycji lub cierpliwości użytkownika. Dzięki temu oprogramowaniu można osiągnąć 10 μm bez zbytniej ręcznej interwencji w większości próbek.
Jak każda technika, AT ma kilka słabych punktów, które mogą wpływać na pomyślne pozyskiwanie danych, a wiele z nich jest podobnych do innych metod opartych na sekcjach. Brak jednorodnego rozkładu pustej żywicy w stosunku do tkanki może skutkować zakrzywionymi lub uszkodzonymi układami. W skrajnych przypadkach sekcje mogą odczepić się od podpory (Rysunek 6A). Zmienna kompresja lub rozciąganie podczas procesu cięcia może powodować powstawanie fałd, które mogą zakłócać próbkę w zmiennych obszarach na kolejnych odcinkach (rysunek 6B). Na powierzchni pobranych skrawków mogą pojawić się ślady noża po użyciu uszkodzonego noża (Rysunek 6C). Różnice w warunkach przekroju mogą powodować sporadyczne różnice w ściskaniu i grubości przekroju. Cząsteczki kurzu lub brudu mogą wylądować na sekcji i częściowo zasłaniać obszar zainteresowania (rysunek 6D). Akwizycja obrazu może się nie powieść z powodu niedoskonałych funkcji automatycznego kontrastu, automatycznego ustawiania ostrości i autostygmatora. Położenie automatycznie utworzonych obszarów obrazowania może być zmienne i może nie uchwycić zwrotu z inwestycji we wszystkich sekcjach.
Na etapie szycia i wyrównywania może pojawić się kilka problemów. Automatyczne zszywanie płytek mozaikowych może się nie powieść, na przykład z powodu dużej pustej przestrzeni wewnątrz próbki. Ze względu na drastyczną zmianę kształtu w 3D rejestrowanie stosów obrazów może być trudne. Specjalnie opracowane programy (np. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB lub MAPS-AT) mogą ułatwić półautomatyczne wyrównywanie 32,38,39,40. Trudniejsze sekcje można ręcznie wyrównać za pomocą oprogramowania do edycji zdjęć. Niestety, niektóre zestawy danych mogą być niemożliwe do prawidłowego wyrównania.
Duże próbki stanowią wyzwanie dla sekcji szeregowych TEM pasujących do siatek; z drugiej strony, wiele projektów nie uzasadnia długiego automatycznego pozyskiwania za pomocą FIB/SEM lub SBF-SEM. AT jest prostą alternatywą dla żmudnego TEM sekcji szeregowej, w którym zbieranie i manipulowanie sekcjami szeregowymi na płytce jest prostsze niż w przypadku siatek szczelinowych. Opracowano kilka strategii, aby ułatwić zbieranie tablic, a my udostępniamy naszą metodę rozszerzania istniejącego zestawu narzędzi. W przypadkach, w których identyfikacja zwrotu z inwestycji jest trudna, AT-SEM zapewnia fundamentalną przewagę, dzięki skutecznemu badaniu przesiewowemu próbek, w których wymagana jest rozdzielczość w skali organelli w 50 do 500 sekcjach. W przypadku większych ilości strategie automatycznego odbioru AT mogą być efektywnie zbierane, jeśli wymagane jest więcej sekcji. Próbki AT mogą być wielokrotnie obrazowane, co ułatwia celowe obrazowanie obszarów o wysokiej rozdzielczości na podstawie wcześniej uzyskanych obrazów przeglądowych. Uważamy, że proponowana tutaj ukierunkowana analiza i zmniejszone nadpróbkowanie przez AT/SEM zmniejsza wymagania dotyczące pracy i przechowywania danych. Ostatecznie biblioteki sekcji mogą być gromadzone i utrzymywane w celu późniejszego ponownego wykorzystania i konsultacji. W przypadku pozyskiwania objętości podejścia FIB lub SBF-SEM stanowią doskonałe rozwiązanie, gdy zwrot z inwestycji jest łatwy do zidentyfikowania na powierzchni bloku lub gdy do analizy potrzebne są duże objętości 3D. Jednak FIB/SBF-SEM są mniej wydajne, gdy obraz stosu o wysokiej rozdzielczości musi być zbierany ze zdefiniowanego zwrotu z inwestycji w ukierunkowany sposób. Podsumowując, zaproponowane metody badań przesiewowych próbek AT oraz wykorzystanie obrazów przeglądowych o średniej rozdzielczości pozwalają na ograniczenie akwizycji obrazu do odpowiednich części matrycy sekcji. Precyzyjne celowanie w obszary obrazowania skraca czas uzyskiwania danych i upraszcza ich analizę.
Podsumowując, chociaż koncepcja AT/SEM nie jest nowa, jej zastosowanie nadal nie jest tak powszechne, jak sugerowałyby jej zalety. Ogólnie rzecz biorąc, stanowi ona procedurę uzupełniającą w stosunku do innych istniejących metod EM. AT/SEM jest kompatybilny z najszerszym zakresem protokołów przygotowania próbek i procesów obrazowania i może być wykonywany na dowolnym mikroskopie FIB/SEM lub SBF-SEM jako technika towarzysząca. W tym artykule skoncentrowaliśmy się na AT do rejestrowania danych ultrastrukturalnych z próbek, które mają mniejsze szanse na pomyślne rozwiązanie za pomocą innych metod. Mamy nadzieję, że opisana procedura wygodnego zbierania sekcji i znacznie zautomatyzowanych strategii pozyskiwania pomoże w pierwszych próbach tym, którzy nigdy nie zetknęli się z tą metodą i pomoże ją udoskonalić tym, którzy mają już pewne doświadczenie.

Pomimo znaczenia technik związanych z EM, wysiłek wymagany do ich opanowania sprawia, że cała dziedzina jest ograniczona do niewielkiej liczby specjalistów. Jedną z istotnych trudności jest identyfikacja i odnalezienie obszaru zainteresowania (ROI) w próbkach zachowanych dla EM. Wygląd tej samej próbki znacznie się różni, gdy jest analizowany za pomocą mikroskopii optycznej i po przetworzeniu do obserwacji EM. Zmiany dla próbek przygotowanych chemicznie obejmują kurczenie się próbki anizotropowej po etapach odwadniania (~10% w każdym wymiarze) oraz utratę fluorescencji przy użyciu osmu w protokole utrwalania i barwienia (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A). W przypadku ultracienkiego przekroju próbki są zatapiane w żywicach epoksydowych lub akrylowych przy użyciu różnych strategii (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Aby uzyskać pomyślne wyniki tego przygotowania, cała próbka musi zostać pofrakcjonowana na kawałki, które nie przekraczają 1 mm x 1 mm. Aby spełnić wymagania standardowych warunków obserwacji za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), ta niewielka część próbki jest dalej cięta na warstwy o grubości 50-150 nm. Uzyskane obrazy w skali szarości pokazują organizację tkanek i strukturę organelli niewielkiej części całej próbki z większą szczegółowością niż jakakolwiek inna technika mikroskopowa (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Typowy zestaw danych TEM dostarcza informacji 2D, teoretycznie ekstrapolowanych w celu zrozumienia procesów naturalnie zachodzących w przestrzeni 3D w komórkach i tkankach. Rysunek 1D przedstawia wyzwanie związane z pozyskiwaniem objętości ultrastrukturalnych: jeśli sześcian o boku 1000 μm jest podzielony na grubość 50 nm, potrzeba będzie 20 000 sekcji, aby pokryć całą objętość; W przypadku sześcianu bocznego o grubości 500 μm będzie to 10 000 sekcji. Aby pokryć objętość 50 μm x 50 μm x 50 μm, może być konieczne 1000 sekcji "tylko". Ręczne uzyskanie tej objętości jest praktycznie niemożliwe i niezwykle trudne do wykonania za pomocą automatyzacji. Jeżeli, oprócz głębokości próbki, musimy pokryć całą powierzchnię takich hipotetycznych sześcianów, pokrycie powierzchni 1μm2 w rozsądnej rozdzielczości staje się poważnym problemem logistycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Podczas gdy w przypadku nadzwyczajnych projektów na dużą skalę, takich jak podejścia konektomiczne, duża liczba sekcji jest kluczowa, dla większości "przyziemnych" projektów EM generowanie większej liczby sekcji wymaganych do obserwacji stanowi istotną wadę.
Istnieje kilka metod pozyskiwania informacji ultrastrukturalnych 3D: transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), tomografia TEM, tomografia matrycowa (AT), skaningowa mikroskopia elektronowa z blokiem szeregowym (SBF-SEM) oraz skaningowa mikroskopia elektronowa z ogniskowaną wiązką jonów (FIB-SEM). Główne różnice między tymi metodami to strategia podziału na sekcje oraz to, czy akwizycja obrazu jest sprzężona z generowaniem sekcji1. W przypadku TEM z podziałem szeregowym sekwencyjne sekcje są zbierane na siatkach szczelin, obrazy TEM są generowane z tych sekwencji i aligned2,3,4,5. W tomografii TEM serie pochyleń od 150-300 nm na siatce, a w połączeniu z sekcjami szeregowymi, zapewniają bardzo wysoką rozdzielczość, choć stosunkowo małe objętości6,7,8. Podejście AT wykorzystuje fizyczne cięcie z różnymi ręcznymi i półautomatycznymi sposobami zbierania przekrojów na stosunkowo dużym podłożu, takim jak szklane szkiełko nakrywkowe, płytki silikonowe lub specjalna taśma. W przypadku akwizycji obrazu wsparcie jest analizowane w SEM, z dostępnymi różnymi strategiami pozyskiwania obrazów9,10,11,12,13,14,15 . W przypadku SBF-SEM fizyczne cięcie odbywa się za pomocą mini-mikrotomu z diamentowym nożem umieszczonym bezpośrednio w komorze SEM, z obrazem SEM generowanym z powierzchni bloku żywicy16,17,18,19. W przypadku FIB-SEM źródło jonów usuwa cienkie warstwy próbki, a następnie następuje automatyczne obrazowanie odsłoniętej powierzchni za pomocą SEM20,21. Tomografia TEM i AT generują fizyczne przekroje, które w razie potrzeby można ponownie zobrazować, podczas gdy FSBF-SEM i FIB-SEM eliminują przekrój po obrazowaniu. Niedawna kombinacja fizycznych przekrojów zobrazowanych przez wielowiązkowy SEM zapewnia kombinację metod, która rozwiązuje problem "wąskiego gardła" szybkości akwizycji obrazu22. Każda z tych technik zrewolucjonizowała sposób pozyskiwania i analizowania danych EM, a każde podejście ma swoje praktyczne oddziaływania związane z danym zagadnieniem badawczym.
Biorąc pod uwagę charakter przygotowania i skalę wymiarów ultrastrukturalnych, nie jest łatwo przewidzieć, gdzie w bloku próbki znajduje się konkretna struktura docelowa (<silna klasa="xfig">Rysunek1D,E). Jednym z rozwiązań dla lokalizacji ROI jest nagrywanie obrazów z całego bloku w żądanej rozdzielczości od samego początku. Interesujące nas struktury mogą znajdować się w pozyskanej objętości danych, gdy znajdują się z dala od mikroskopu. Czas akwizycji i obsługa danych związane z tą strategią są problematyczne. Pożądane jest zmniejszenie ilości rejestrowanych danych, zwłaszcza jeśli ROI są znacznie mniejsze niż blok tkankowy, tj. jeśli obiektami zainteresowania są określone typy komórek (nie całe narządy). Różne techniki korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) mogą być skuteczne, gdy fluorescencja jest zachowana i zlokalizowana przed lub po przygotowaniu w tej samej próbce23,24,25,26,27,28,29. Niemniej jednak wiele struktur komórkowych jest rozpoznawalnych nawet bez korelacji fluorescencyjnej, tylko na podstawie znanej ultrastruktury. W takich przypadkach uważamy, że boczna tomografia matrycowa zapewnia równowagę między wysiłkiem włożonym w lokalizację ROI a ultrastrukturalną jakością informacji. Korzystając z tej strategii, podzbiór sekcji na płytce jest badany w regularnych odstępach czasu, które można ustalić na podstawie wielkości i charakteru zwrotu z inwestycji. Po znalezieniu zwrotów z inwestycji akwizycja danych jest konfigurowana w ciągłej serii sekcji, zaczynając przed i kończąc po sekcji zakotwiczenia, zbierając odpowiednie informacje w ukierunkowany sposób.
Prezentujemy protokoły dla AT, które upraszczają i przyspieszają pozyskiwanie interesujących regionów lub wydarzeń w licznych sekcjach i dają lepiej dopasowane objętości obrazów. Boczne przesiewanie i wieloetapowa akwizycja generują dane o bardzo wysokiej rozdzielczości w precyzyjnie docelowych regionach. Opisana przez nas procedura rozwiązuje kilka wyzwań związanych z pozyskiwaniem danych 3D EM, ponieważ zapewnia: kompatybilność z szeroką gamą próbek bez zasadniczej zmiany procesu przygotowywania próbek; ukierunkowana lokalizacja dla sekcji i przejęć SEM; skrócony czas i wysiłek podczas konfiguracji; obrazowanie regionów w wielu sekcjach z lepszym wyrównaniem wynikowych objętości; oraz płynna procedura zszywania i wyrównywania w celu skompilowania różnych obrazów w zszyty obraz mozaiki. Zdecydowaliśmy się zademonstrować siłę naszej metody na kilku próbkach z opublikowanych i trwających projektów. Uważamy, że takie podejście może znacznie ułatwić generowanie i pozyskiwanie ukierunkowanych danych EM, nawet dla badaczy z ograniczonym doświadczeniem w EM.

<table><tbody><tr><td>Cutting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AT nóż do cięcia</td><td>Diatome</td><td>DUATS3530</td><td>Diatome Nóż Jumbo</td></tr><tr><td>Diamentowy nóż do przycinania 90&deg;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td>Przycinanie diatomu 20&deg; Nóż do szkła</td></tr><tr><td>Klej kontaktowy Pattex</td><td>Pattex</td><td>PCL3C</td><td></td></tr><tr><td>Wafel silikonowy</td><td>Ted Pella</td><td>16015</td><td>Rezystancja: 1-30 Ohm Typ P: (bor) (1 pierwotny płaski) Chropowatość: 2 nm Brak powłoki wierzchniej SiO2 TTV: = < 20 &mikro; m Wafel jest jednostronnie polerowany</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica UC6</td><td>Alternatywa: Leica UC7</td><td></td></tr> - <tr><td>Zestaw do cięcia płytek półprzewodnikowych</td><td>EMS</td><td>7642</td><td>- EMF - Tasak do małych próbek, nr kat. 7652</td></tr><tr><td>Akwizycja obrazu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FESEM</td><td>Thermo Fischer Helios</td><td>1072419</td><td>Alternatywy: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN</td></tr><tr><td>Mapy 3 dla SEM z korelacyjnym przepływem pracy & Tomografia macierzowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1135932</td><td>Maps zapewnia automatyzację procesów obrazowania SEM i umożliwia importowanie danych innych firm dla CLEM i nawigacji.</td></tr><tr><td>Image analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira x.y</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1131599</td><td>Amira to oprogramowanie do wizualizacji i analizy danych 3D z kilkoma praktycznymi funkcjami do rekonstrukcji danych tomografii matrycowej.</td></tr><tr><td>Przetwarzanie obrazu</td><td>Open source</td><td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td><td>IMOD, MIB (Zobacz tekst, aby uzyskać referencje)</td></tr></tbody></table>

tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Mikroskopia elektronowa jest stosowana w biologii i medycynie do obrazowania szczegółów komórkowych i strukturalnych w rozdzielczości nanometrów. Historycznie rzecz biorąc, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) zapewniała wgląd w ultrastrukturę komórek, ale w ostatniej dekadzie rozwój nowoczesnych skaningowych mikroskopów elektronowych (SEM) zmienił sposób patrzenia do wnętrza komórek. Mimo że rozdzielczość TEM jest lepsza, gdy potrzebne są szczegóły strukturalne na poziomie białka, rozdzielczość SEM jest wystarczająca dla większości pytań związanych z biologią komórki na poziomie organelli. Postęp technologiczny umożliwił automatyczne pozyskiwanie rozwiązań, takich jak obrazowanie szeregowe blokowe (SBF-SEM) i skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM). Niemniej jednak do dziś metody te pozostają nieskuteczne, gdy kluczowa jest identyfikacja i nawigacja do obszarów zainteresowania. Bez środków do precyzyjnej lokalizacji obszarów docelowych przed obrazowaniem, operatorzy muszą pozyskiwać znacznie więcej danych niż potrzebują (w SBF-SEM), lub, co gorsza, przygotowywać wiele siatek i obrazować je wszystkie (w TEM). Proponujemy strategię "bocznego badania przesiewowego" z wykorzystaniem tomografii matrycowej w SEM, która ułatwia lokalizację obszarów zainteresowania, a następnie zautomatyzowane obrazowanie odpowiedniej frakcji całkowitej objętości próbki. Próbki tomografii matrycowej są konserwowane podczas obrazowania i można je układać w biblioteki sekcji gotowe do wielokrotnego obrazowania. Przedstawiono kilka przykładów, w których przesiewanie boczne umożliwia nam analizę szczegółów strukturalnych, do których dostęp jest niezwykle trudny przy użyciu jakiejkolwiek innej metody.

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Analiza mikroskopii elektronowej jest często złożona. Wierzymy, że nasz protokół ułatwia przetwarzanie i pozyskiwanie danych EM z dużej powierzchni próbki i objętości pośredniej. Nasz protokół pomaga znaleźć docelowe struktury w sekcjach szeregowych.Rejestrowanie danych jest ograniczone do tego, co jest niezbędne. W porównaniu z akwizycją danych w blokach całych tkanek czas rejestracji jest skrócony, a analiza danych łatwiejsza. Biorąc pod uwagę ogólną łatwość tego podejścia, uważamy, że można je wykorzystać nie tylko do rozwiązywania problemów naukowych, ale także jako narzędzie diagnostyczne.Aby wygenerować matrycę do analizy, najpierw zaciśnij próbkę na uchwycie ultramikrotomu i użyj żyletki, aby z grubsza przyciąć żywicę wokół próbki. Użyj diamentowego narzędzia do przycinania, aby dokładnie przyciąć próbkę i użyj noży do przycinania o nachyleniu 20 lub 90 stopni, aby upewnić się, że górna i dolna powierzchnia bloku są równoległe do krawędzi tnącej noża. Wymieszaj ksylen i klej w proporcji 3:1 i za pomocą rzęsy dołączonej do wykałaczki nałóż mieszankę na górną i dolną krawędź przyciętego bloku.Podczas suszenia mieszaniny użyj narzędzia do rozłupywania wafli, aby przyciąć kawałek płytki do odpowiedniego rozmiaru do analizy. Wyczyść wafel w wodzie destylowanej, aby spłukać wszelkie zanieczyszczenia i oczyść powierzchnię plazmą po wyschnięciu wafla. Aby przygotować nóż do tomografii matrycowej, użyj piankowej taśmy klejącej, aby przymocować igłę do dna noża histo jumbo i umieść nóż w uchwycie ultra mikrotomowym pod zerem stopni.Wyreguluj krawędź noża równolegle do powierzchni bloku i przyłóż przycięty klocek do krawędzi noża w pozycji gotowej do cięcia. Umieść czystą wafel w misce na nóż i napełnij miskę wodą do tego samego poziomu co krawędź noża, a następnie pozwól diamentowej krawędzi noża odpowiednio nawilżyć, używając dołączonej strzykawki do dodawania lub odjmowania wody w razie potrzeby. W przypadku cięcia matrycowego ustaw mikrotom na zakres cięcia od 50 do 100 nanometrów i prędkość cięcia od 6 do 1 milimetra na sekundę, a następnie rozpocznij cięcie, aby uzyskać wstęgę wystarczająco długą, aby pokryć docelową objętość Z.W zależności od rozmiaru bloku, jednorodności tkanki i rodzaju żywicy, wstążka będzie w przybliżeniu prosta. Użyj czystej, nieklejącej się końcówki rzęsy, aby odczepić wstążki od krawędzi noża. Użyj rzęsy, aby delikatnie przesunąć wstążkę do środka podłoża podporowego.W razie potrzeby do rozciągnięcia odcinka można użyć chloroformu lub pisaka grzewczego. Po rozciągnięciu należy schować strzykawkę, aby rozpocząć spuszczanie wody. W przypadku delikatniejszych wstążek lub wolniejszego cofania wody, odłącz strzykawkę od węża, aby woda mogła spłynąć.Gdy poziom wody osiągnie poziom wafla, delikatnie popchnij wstążkę do środka miski i kontynuuj opróżnianie, aż cała pozostała woda zostanie całkowicie usunięta z miski. Pozostaw wafel do wyschnięcia w czystym środowisku. Suszenie trwa około 30 minut.Gdy próbka jest całkowicie wysuszona, przenieś matrycę do szczelnie zamkniętego pudełka, aby chronić ją przed zanieczyszczeniem brudem. I umieść pudełko w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut. Aby uzyskać mapę poglądową obrazów SEM, która ujawnia lokalizacje sekcji na płytce, użyj wbudowanej kamery optycznej w celu uzyskania obrazu SEM, który obejmuje wstęgę sekcji.Aby utworzyć mozaikę, kliknij i przeciągnij obraz z kamery próbki i rozpocznij automatyczną akwizycję. Uzyskuj przeglądy w wyższej rozdzielczości, aby znaleźć docelowe struktury. Jeśli konieczne jest zobrazowanie tylko kilku sekcji, użyj przeglądarki z możliwością powiększania, aby wyświetlić uzyskane obrazy w ich oryginalnych lokalizacjach.Po zidentyfikowaniu sekcji, która powinna zostać zobrazowana w wysokiej rozdzielczości, kliknij i przeciągnij, aby utworzyć region obrazowania, a następnie wybierz opcję Ustawienia obrazowania w wysokiej rozdzielczości i zapisz ustawienia w szablonie Aby znaleźć szczególnie małe lub trudne do wykrycia rzadkie zdarzenia, użyj ustawień obrazowania o wysokiej rozdzielczości w co 10. sekcji lub w jednej sekcji na wstążce, aby ręcznie utworzyć region obrazowania i uzyskać obrazy. Następnie przejrzyj obrazy i zaznacz sekcje, które zawierają obszar zainteresowania. Aby uzyskać więcej niż 10 kolejnych sekcji, użyj wyszukiwarki sekcji, aby automatycznie zlokalizować wszystkie sekcje.Jeśli obrazy przeglądowe nie pokazują wyraźnych obszarów zainteresowania, uzyskaj obrazy sekcji w wyższej rozdzielczości i użyj funkcji podglądu przekroju, aby automatycznie utworzyć i pobrać obrazy. Aby określić optymalne ustawienia obrazowania, aktywuj obrazowanie na żywo w oprogramowaniu sterującym mikroskopem i przejdź do jednego obszaru zainteresowania, a następnie dostosuj ustawienia obrazowania, aż obrazy pokażą wyraźne obszary zainteresowania, ale bez nadmiernie długiego pozyskiwania obrazu, zgodnie z wytycznymi producenta. Aby zoptymalizować położenie obszarów obrazowania na kolejnych sekcjach, powiększ obraz zainteresowania i kliknij przycisk Rozpocznij zawężenie pozycji, aby zwiększyć precyzję rejestrowanych lokalizacji sekcji.Aby zdefiniować region obrazowania, kliknij i przeciągnij dowolną sekcję, przytrzymując Alt, a następnie wybierz opcję Utwórz zestaw kafelków z wyskakującego menu kontekstowego. Oprogramowanie utworzy obszary obrazowania w tym samym względnym położeniu we wszystkich sekcjach, które zostały znalezione lub wcześniej oznaczone. Następnie w razie potrzeby skonfiguruj liczbę pikseli, rozmiar pikseli, układ kafelków i czas przebywania pikseli w każdej serii obrazów.Aby skonfigurować funkcję auto, należy utworzyć osobną serię obrazów dla funkcji automatycznych, jak pokazano, i przenieść serię obrazów do pozycji w sekcji, która zawiera struktury o wysokim kontraście. Ustaw serię obrazów na 1024 x 884 pikseli i wybierz rozmiar piksela odpowiadający najwyższej rozdzielczości użytej w serii obrazów. Na liście funkcji automatycznych zaznacz Autofokus i Autostygmat.Wybierz opcję Bisection (Przekrój) w kontrolkach sekwencji akwizycji i upewnij się, że obraz funkcji automatycznej jest pierwszym elementem na liście, a następnie kliknij przycisk Acquire All (Uzyskaj wszystko), aby rozpocząć pobieranie obrazu. Po utworzeniu i skonfigurowaniu wszystkich serii obrazowania zostaną one wyświetlone w kolejce zadań. Akwizycja w niskiej rozdzielczości może być wykonywana ręcznie lub automatycznie bezpośrednio na wybranych częściach sekcji lub całej sekcji za pomocą obrazowania pojedynczego lub mozaikowego, a następnie zszywania.Obrazy z wybranego obszaru można następnie uzyskać przy użyciu parametrów o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji mitochondriów, jąder i mikrokosmków, na przykład Po wybraniu automatycznego pozyskiwania map mozaiki w rozdzielczości można wyciąć kilka obszarów zainteresowania lub użyć ich do zdefiniowania dodatkowych lokalnych obszarów obrazowania w regionach. Chociaż różne wyspecjalizowane typy komórek w jelicie Drosophila są rozmieszczone losowo, można je wizualnie odróżnić po przesiewaniu obrazów przy użyciu parametrów o wysokiej rozdzielczości, albo z pojedynczych sekcji, albo jako zbiór obrazów seryjnych. Po wyrównaniu stosy mogą być renderowane przy użyciu różnych rozwiązań programowych.Analiza tomografii matrycowej pozwala na wygenerowanie wielu sekwencyjnych sekcji na pojedynczej płytce i ich przesiewanie przy użyciu parametrów o niskiej rozdzielczości w celu zlokalizowania ogólnych obszarów zainteresowania. Obszary te mogą być ukierunkowane na dalszą analizę przy użyciu zaawansowanych parametrów akwizycji. Na przykład podziały mitotyczne w notum nie są łatwe do zlokalizowania na poziomie ultrastrukturalnym, ponieważ komórki są stosunkowo duże w porównaniu ze strefą odcięcia.Jednak przy użyciu tej metody można wykorzystać automatyczne obrazy przeglądowe o średniej rozdzielczości skoków od 20 do 40 sekcji do lokalizacji dzielących się komórek. Procedura tomografii matrycowej zapewnia prostszą analizę danych z mikroskopii elektronowej. Zachęcamy widzów do zainwestowania w opanowanie regeneracji i zapoznania się z pracą związaną z mapami Z naszego doświadczenia wynika, że niewiele tematów badawczych wymaga ultrastrukturalnej analizy całych zwierząt lub całych narządów.Nasza metoda pomaga w szybkiej lokalizacji komórek i ich partnerów interakcji w tkankach.

array-tomography-workflow-for-targeted-acquisition-volume-information

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego łączenia mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką bloków szeregowych i skupionej wiązki jonów, aby dotrzeć do interesującego obszaru. Pozwala to na sprawne wyszukiwanie, w trzech wymiarach i lokalizowanie rzadkich zdarzeń w dużym polu widzenia.

Ukierunkowane badania z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej z blokiem szeregowym i mikroskopią elektronową ze zogniskowaną wiązką jonów

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Fenestrowana komórka śródbłonka wątroby sinusoidalnej jest biologicznie ważnym systemem filtrów, na który duży wpływ mają różne choroby, toksyny i stany fizjologiczne. Zmiany te mają znaczący wpływ na pracę wątroby. Opisano metody standaryzacji pomiaru wielkości i liczby okien w tych komórkach.

Znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Poznaj protokół tomografii matrycowej do ukierunkowanego pozyskiwania danych objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Ta metoda skraca czas rejestracji i ułatwia analizę struktur komórkowych.

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów