Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Z biegiem lat monowarstwy lipidowe były stosowane jako warstwa nośna wspomagająca krystalizację 2D białek błony obwodowej, a także białek rozpuszczalnych. Metoda ta może być również stosowana do krystalizacji 2D, jako niektórych integralnych białek błonowych. Wymaga jednak bardziej rozległych badań empirycznych w celu określenia warunków detergentu i dializy, które sprzyjają podziałowi na monowarstwę lipidową.

Na granicy faz powietrze-woda tworzy się monowarstwa lipidowa, tak że polarne grupy główne lipidu pozostają uwodnione w fazie wodnej. I niepolarne ogony acylowe przegrody lipidowej do granicy faz powietrze-woda, które łamią napięcie powierzchniowe i spłaszczają powierzchnię wody. Charakter ładunku, charakterystyczne ugrupowania chemiczne grup głów lipidowych, zapewniają powinowactwo do białek w roztworze.

Promowanie wiązania, a w zasadzie tworzenia tablic 2D. Wszelkie kryształy 2D utworzone na monowarstwie lipidowej można łatwo przenieść do mikroskopu elektronowego na pokrytej węglem siatce EM, która służy do podnoszenia i podtrzymywania krystalicznej matrycy na warstwie lipidowej. Opisaliśmy w tym manuskrypcie metodologię monowarstwowej warstwy lipidowej do obrazowania w kriogenicznej mikroskopii elektronowej.

Preparat jednowarstwowy lipidów. Preparat podstawowy lipidów, przygotować mieszaninę lipidów w proporcji 0,01 mg na ml w stosunku 9:1 objętościowo do objętości chloroformu, metanolu. Używając 8,91 ml chloroformu i 0,99 ml metanolu oraz 0,1 ml 10 mg na ml roztworu lipidów.

Przygotowanie płytki teflonowej. Sonikować płytkę teflonową w kąpieli metanolowej przez pięć minut. Myć gorącą wodą przez 15 minut, a następnie spłukać wodą destylowaną.

Wysuszyć płytkę teflonową w wysuszonym miejscu przez 30 minut i przechowywać ją w próżni do momentu użycia. Tworzenie monowarstwy lipidowej na zbiorniku buforowym. Szacowany czas pracy wyniesie półtorej godziny.

Umieść bibułę filtracyjną typu pierwszego na szalce Petriego i ułóż blok teflonu na bibule filtracyjnej. Napełnij studzienki płyty teflonowej 60 mikrolitrami buforu. Ostrożnie dodawaj płynną mieszaninę na wierzch powierzchni bufora kropla po kropli.

Najlepiej jeden mikrolitr na kroplę za pomocą strzykawki Hamiltona. Zwilż bibułę filtracyjną wodą destylowaną i utrzymuj wilgotność na szalce Petriego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut, chloroform powinien odparować i powinna powstać monowarstwa lipidu na powierzchni.

Zastosowanie siatki EM na monowarstwie lipidowej. Szacowany czas pracy to półtorej godziny. Delikatnie umieść siatkę EM pokrytą węglem bez żarzenia, wyładowując węgiel stroną do dołu na powierzchnię każdego zbiornika buforowego.

Ostrożnie wstrzyknąć białka do dołka iniekcji bocznej, użyć końcowych stężeń białka w studzience wokół jednego mikromola. Inkubować 60 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wstrzyknąć około 20 do 30 mikrolitrów buforu do portu iniekcyjnego w miejscu, aby podnieść siatkę ponad powierzchnię bloku teflonowego.

Pozwala to podnieść siatkę za pomocą pęsety i podnieść ją pionowo z kropli. Reprezentatywne wyniki. Monowarstwę lipidową osadzoną na siatce EM można uwidocznić pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym bez barwienia kontrastowego.

Obecność monowarstwy można rozpoznać po różnicy kontrastu w stosunku do obszaru, w którym nie ma żadnej próbki na tej ścieżce wiązki. Obszary, które mają pokrycie monowarstwą lipidową, mają niższy kontrast niż te bez pokrycia. Ponieważ wiązka elektronów przez puste otwory nie ulega rozproszeniu, pokazuje jaśniejsze oświetlenie.

Podsumowując, metoda monowarstwy lipidowej daje możliwość badania struktur białkowych ze względu na swoją prostotę. Może stanowić alternatywne podejście ułatwiające proces krystalizacji 2D.