Name: Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj zminiaturyzowaną metodę przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej bez użycia papierowego blotowania. Technika ta umożliwia analizę lizatów pojedynczych komórek w badaniach proteomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować warsztatom Biozentrum Uniwersytetu w Bazylei za wsparcie, S. A. Müllerowi za krytyczne dyskusje i uważne przeczytanie manuskryptu, A. Fecteau-LeFebvre za pomoc techniczną z EM, Ricardo Adaixo, Frankowi Lehmannowi za próbki do badań białek błonowych (wszystkie z C-CINA, Biozentrum, Uniwersytetu w Bazylei) i A. Engelowi, emerytowany Uniwersytet w Bazylei za inspirujące rozmowy. Próbki do badań zostały dostarczone przez mgr P. Ringlera. Mahi i T. Schwede (Biozentrum, Uniwersytet w Bazylei), P. Leiman (Laboratorium Biologii Strukturalnej i Biofizyki, EPFL) i R. Diaz-Avalos (New York Structural Biology Center, USA). Projekt był wspierany przez Szwajcarski Instytut Nanonauki (SNI, projekt P1401, projekt ARGOVIA MiPIS) oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNF, projekt 200021_162521).

<ol><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%3A+The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li>
<li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3043536">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).</li>
<li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li>
<li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1683435">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li>
<li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0968432894900264">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li>
<li>Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li>
<li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li>
<li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li>
<li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Cryo-EM+movie+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+cryo-EM+become%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li>
<li>Engel, A. in . <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642025969">Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology</a>. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).</li>
<li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094535">Connecting µ-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li>
<li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li>
<li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((openBEB%3A+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84(2014).</li>
<li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+interactome%3A+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li>
</ol>

Autorzy, Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg i Thomas Braun, deklarują następujące konkurencyjne interesy finansowe: Koncepcja cryoWriter jest częścią wniosku patentowego PCT/ EP2015/065398 i EP16194230.

Przedstawiono przyrząd "cryoWriter" oraz protokoły wymagane do przygotowania siatek próbek dla NS i cryo-EM z całkowitej objętości próbki o rozmiarach nL i całkowitego uniknięcia klasycznego etapu blottingu. Jest to możliwe dzięki połączeniu zasad mikroprzepływowości i systemu mikromechanicznego w cryoWriterze.
Z naszego doświadczenia wynika, że w przypadku zastosowania zminiaturyzowanych metod przedstawionych w tym manuskrypcie, przestrzeń parametrów do przygotowania siatki EM-grid jest większa niż w przypadku metod klasycznych i znajduje się pod ściślejszą kontrolą użytkownika. Co ważne, osiągnięta zwiększona odtwarzalność umożliwia wstępne badanie przesiewowe za pomocą systemu buforowego próbki, uzupełnionego łatwo dostępnym białkiem testowym, w celu określenia optymalnych parametrów przed przeprowadzeniem właściwego eksperymentu. Ogranicza to konsumpcję interesującej nas próbki do absolutnego minimum i jest wysoce zalecane. Krytycznymi etapami przygotowania sieci zarówno NS, jak i cryo-EM są: (i) Zalewanie systemu pompy; W przypadku dozowania objętości poniżej nanolitrów ciecz systemowa (woda) musi być odgazowana i pozbawiona pęcherzyków. (ii) Precyzyjna kontrola etapu wyładowania jarzeniowego lub czyszczenia plazmowego; charakterystyka powierzchni siatki EM ma kluczowe znaczenie dla powtarzalnych wyników. (iii) kondycjonowanie próbki; czas potrzebny do kondycjonowania, np. za pomocą NS, zależy od rodzaju buforu, zawartości soli i stężenia (rysunek 3), a także od geometrii dyszy mikrokapilary24. (iv) szybkości parowania preparatów NS-EM dla ilościowych EM; efekt pierścienia kawy może uniemożliwić analizę ilościową preparatów NS-EM i musi być stłumiony przez powolne tempo parowania kontrolowane przez stopień DP.
Różne aspekty prezentowanych metod przygotowania siatek można dowolnie łączyć, co pozwala na opracowanie wszechstronnych protokołów dla konkretnych próbek. Typowymi przykładami mogą być usunięcie substancji, która zapobiega powstawaniu elektromagnetyczu o wysokiej rozdzielczości, np. glicerolu, poprzez etap kondycjonowania przed przygotowaniem siatki do krio-emu; wprowadzenie cząsteczek mediatorowych, takich jak ligandy, poprzez kondycjonowanie przed przygotowaniem siatek; lub badanie lizatu jednokomórkowego za pomocą NS- lub cryo-EM (ryc. 6).
Zastosowanie mikrofluidyki i minimalnych ilości próbek w prezentowanych metodach całkowicie eliminuje konieczność wykonywania etapów bibuły. Jest to ogromna zaleta, ponieważ bibuła jest surowym traktowaniem białek, potencjalnie zanieczyszczając próbkę niechcianymi jonami i z natury prowadząc do masowej utraty próbki. Z drugiej strony, nie można uniknąć efektów, które mogą być spowodowane przez granicę faz powietrze-woda cienkiej warstwy próbki utworzonej, gdy próbki cryo-EM są przygotowywane w klasyczny sposób, gdy używany jest cryoWriter. Siatki odpowiednie do krio-EM można przygotować z czasem oczekiwania krótszym niż 0,2 s między nałożeniem próbki a witryfikacją (dane nie pokazane). Ponieważ jednak białka przemieszczają się przez dyfuzję o długości kilku dziesiątych nanometra w ciągu kilku nanosekund, wciąż jest wystarczająco dużo czasu, aby kilkakrotnie zderzyć się z powierzchnią międzyfazową powietrze-woda warstwy próbki o grubości 100 nm. Jednak ilość białek przylegających do granicy faz powietrze-woda może być znacznie zmniejszona przez te krótkie przerwy czasowe i może zapobiec denaturacji białek lub ograniczonej orientacji cząstek. Innym obiecującym podejściem, które może chronić wrażliwe białka przed granicą faz powietrze-woda, jest pokrycie błony próbki substancjami powierzchniowo czynnymi o niskiej masie cząsteczkowej. Związki te mogą być szybko wprowadzone przez etap kondycjonowania w cryoWriter przed przygotowaniem siatki. Wysoki stosunek powierzchni do objętości układów mikroprzepływowych jest kolejnym ograniczeniem cryoWriter, ponieważ próbka może zostać potencjalnie utracona przez niespecyficzną adsorpcję na powierzchni mikrokapilary i zakłócić analizę ilościową podczas zliczania cząstek. Problem ten można rozwiązać na dwa sposoby: po pierwsze, próbka nie pokonuje dużych odległości w obrębie mikrokapilary. Rzeczywiście, objętość próbki w nanolitrach pozostaje na końcówce kapilary przez cały czas przetwarzania. Po drugie, stosunek powierzchni do objętości jest dodatkowo zmniejszony dzięki zastosowaniu mikrokapilar o stosunkowo dużych średnicach wewnętrznych, np. 180 μm. Po trzecie, powierzchnie mikrokapilar można w razie potrzeby łatwo pasywować, np. poprzez obróbkę ich dostępnymi w handlu glikolami polilizynowo-etanolowymi (PLL-PEG).
Analiza białek w wysokiej rozdzielczości metodą pojedynczych cząstek stosowana w EM wymaga jedynie od 100 000 do kilku milionów obrazów pojedynczych cząstek białka. Oznacza to, że techniki mikroprzepływowe mogą dostarczyć wystarczającą ilość kompleksów białkowych do badania strukturalnego. Zminiaturyzowana metoda immunoprecypitacji do szybkiej izolacji kompleksów białkowych (około 1 godziny) od minimalnej ilości komórek (ok. 40 000 komórek) została opracowana wcześniej28. Metoda ta będzie teraz bezpośrednio powiązana ze zminiaturyzowanym etapem przygotowania próbki w cryoWriterze. Ostatecznym celem jest opracowanie zintegrowanego rurociągu mikroprzepływowego do ultraszybkiej izolacji białek i przygotowania siatki kriogenicznej, co zajmuje w sumie mniej niż dwie godziny. Ponadto, jak pokazano na rysunku 6, niewielka ilość i objętość materiału potrzebnego do przygotowania próbki oraz prawie bezstratna procedura kondycjonowania i przygotowania siatki osiągnięta za pomocą cryoWriter umożliwiają badanie kompleksów białkowych poszczególnych komórek. Zminiaturyzowana metoda immunoprecypitacji i cryoWriter stanowią podstawę nowej metody proteomicznej zwanej "proteomiką wizualną pojedynczej komórki", co niedawno wykazaliśmy w eksperymentach z szokiem cieplnym24. Obecnie testowane są algorytmy analizy danych ukierunkowane na analizę obrazów "proteomiki wizualnej".

Sprzęt i oprogramowanie do analizy strukturalnej kompleksów białkowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) znacznie rozwinęły się w ostatnich latach. Wprowadzone ulepszenia utorowały drogę do „rewolucji rozdzielczości”1,2 i zasadniczo zmieniły badania strukturalne. Rewolucja ta rozpoczęła się wraz z pojawieniem się kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM)3,4, która umożliwiła przygotowanie próbek biologicznych w warunkach bliskich fizjologicznym, jednocześnie zmniejszając wrażliwość na promieniowanie i zapobiegając odparowywaniu próbek w wysokiej próżni mikroskopu transmisyjnego5. W kolejnych latach stopniowy postęp technologiczny sukcesywnie zwiększał osiągalną rozdzielczość. Wśród tych innowacji znalazło się zastosowanie działek z emisją polową6,7, a w późniejszym czasie udoskonalone algorytmy analizy danych, takie jak metody maksymalnej wiarygodności8,9. Kamery z bezpośrednimi detektorami elektronów10,1,12,13, obrazowanie w trybie filmowym oraz towarzyszący im rozwój oprogramowania14,15,16,17 zapewniły ostateczny przełom niezbędny do osiągnięcia rozdzielczości atomowej dla próbek biologicznych za pomocą analizy pojedynczych cząsteczek (przegląd dostępny w pracy Cheng, Grigorieff, et al.18). Znaczenie cryo-EM zostało niedawno uznane poprzez przyznanie Nagrody Nobla w dziedzinie chemii trojgu pionierom tej metody.
Aby obrazować próbkę biologiczną za pomocą TEM, metoda ładowania siatki EM próbką (dalej określana jako „przygotowanie siatki”) musi zapewniać, aby powstała warstwa próbki (i) była wystarczająco cienka (&lt;10 nm), aby uniknąć znacznego szumu wywołanego przez elektrony rozproszone nieelastycznie lub wielokrotnie, (ii) wytrzymywała wysoką próżnię mikroskopu elektronowego oraz (iii) chroniła biomolekuły przed uszkodzeniami radiacyjnymi. Do spełnienia tych wymagań stosuje się dwie główne metody: procedury barwienia negatywowego (NS)19,20 (Rysunek 1A) polegają na adsorpcji próbki na cienkiej błonie węglowej, zanurzeniu biomolekuł w amorficznym ciężkim metalu, a następnie wysuszeniu zespołu na powietrzu. Jest to metoda prosta i szybka, a załadowane siatki EM (dalej określane jako „siatki z próbką”) są łatwe w przechowywaniu i mogą być zachowane przez długi czas (zazwyczaj lata). W TEM preparaty te wykazują wysoki kontrast dzięki NS i tolerują wyższe dawki elektronów niż preparaty kriogeniczne, jednak rozdzielczość jest ograniczona do około 20 Å. Procedury Cryo-EM (Rysunek 1B) wykorzystują perforowane podłoża węglowe. Cienka warstwa roztworu próbki jest rozciągnięta nad otworami, a siatka EM jest zanurzana w kriogenie, zazwyczaj w upłynnionym etanie, aby szybko schłodzić ją poniżej -150°C. Wynikiem jest amorficzna, witryfikowana warstwa roztworu o grubości od 50 do 10 nm w otworach podłoża. Ta cienka, amorficzna warstwa wytrzymuje wysoką próżnię w mikroskopie elektronowym i w idealnym przypadku zachowuje struktury biologiczne w ich stanie natywnym. Procedura ta pozwala na obrazowanie próbek biologicznych z wysoką rozdzielczością. Jednak siatka z próbką musi być przez cały czas przechowywana w temperaturach poniżej -150 °C, aby uniknąć dewitryfikacji. Można ją obrazować przy użyciu stosunkowo wysokich dawek elektronów ze względu na niską temperaturę, niemniej jednak kontrast i stosunek sygnału do szumu są niskie. Dlatego stosuje się techniki uśredniania w celu zwiększenia kontrastu i, pod warunkiem obrazowania próbki pod różnymi kątami, można zrekonstruować trójwymiarową (3D) mapę o wysokiej rozdzielczości. Obecnie najczęściej stosowaną i niezwykle skuteczną metodą rekonstrukcji 3D jest podejście pojedynczych cząsteczek (single particle approach). Nowoczesny przegląd literatury przedstawiono w pracy Cheng i wsp.18.
TEM z barwieniem negatywowym (NS-EM) jest istotny w procesach przesiewania i kontroli jakości, gdy wymagany jest wysoki kontrast lub gdy dysponujemy ograniczoną ilością próbki (adsorpcja do błony węglowej zazwyczaj zagęszcza próbkę). Kriomikroskopia elektronowa pojedynczych cząsteczek (single particle cryo-EM) jest złotym standardem, jeśli celem jest uzyskanie wysokorozdzielczych rekonstrukcji 3D struktury białka.
<img alt="Procesy nanotechnologiczne: schemat manipulacji kroplami, etapy mikrofabricatedacji, układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Zasady przygotowania siatki do TEM oraz porównanie metody klasycznej (panel A, B) i podejścia mikrofluidycznego (panel C, D). A) Klasyczne przygotowanie siatek do NS-EM: Opis 3 µL próbkę pipetuje się ręcznie na siatkę do EM pokrytą ciągłą warstwą węgla (w dalszej części określaną jako „siatka NS-EM”) (i). Po inkubacji przez ok. 10 s nadmiar cieczy odsącza się z boku za pomocą papieru filtracyjnego (ii), pozostawiając zaadsorbowane biomolekuły w cienkiej warstwie wody. Następnie białko inkubuje się w roztworze soli ciężkiego metalu, np., 2% octanu uranylu przez 20 s (iii), a następnie ponownie usuwa się ciecz, osuszając brzeg papierem filtracyjnym (iv). Na koniec siatkę do EM pozostawia się do wyschnięcia na powietrzu. B) Klasyczne przygotowanie siatek do kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM): Opis 3 µL próbki przenosi się pipetą na błonę z dziurawego węgla. Aby utworzyć cienką warstwę próbki, nadmiar cieczy usuwa się poprzez osuszanie papierem filtrującym z jednej lub obu stron (ii). Na koniec siatkę szybko zanurza się w ciekłym etanie w celu witryfikacji (iii). C) Przygotowanie siatek do NS-EM przy użyciu zestawu cryoWriter: za pomocą mikrokapilary (i) aspiruje się 5 nL objętości z zapasu próbki. W celu kondycjonowania próbki końcówka mikrokapilary zostaje zanurzona w roztworze kondycjonującym, np., 2% octanu amonu. Jony i małe cząsteczki są wymieniane drogą dyfuzji (ii). Należy zauważyć, że wymiary mikrokapilary zapewniają, iż cały proces jest napędzany przez dyfuzję. Białka mają znacznie niższe stałe dyfuzji niż jony soli i nie ulegają w znacznym stopniu stracie24Na koniec próbkę nanosi się na siatkę i pozostawia do wyschnięcia (iii). D) Zasady przygotowywania siertek do krio-EM z wykorzystaniem metody opartej na urządzeniu cryoWriter: Siertekę EM pokrytą dziurkowaną błoną węglową umieszcza się na powierzchni platformy z kontrolowaną temperaturą i przytrzymuje pęsetą. Temperatura platformy jest regulowana z zachowaniem określonej różnicy względem temperatury punktu rosy w otoczeniu siertek. Sierteka jest przesuwana względem mikrokapilary zawierającej próbkę, a następnie mikrokapilara jest obniżana aż do momentu, gdy znajdzie się kilka mikrometrów nad sierteką. Następnie nanosi się z niej kilka nanolitrów próbki, podczas gdy stolik porusza się po trajektorii spiralnej; nadmiar cieczy jest ponownie zasysany (i). Po przygotowaniu siertek EM mikrokapilara jest wycofana, a sierteka pozostaje na platformie z kontrolowaną temperaturą (zwanej dalej stolikiem punktu rosy (DP)) przez krótki czas, aby umożliwić odparowanie kontrolowanej ilości próbki. W celu mrożenia szokowego sierteka jest szybko zdejmowana ze stolika za pomocą pęsety (ii), a następnie odwracana przez 90° do pozycji pionowej, a następnie zanurzono w kąpieli kriogenicznej (iii) (dalej określany jako mechanizm „pick-and-plunge”). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Niestety metody przygotowywania siatek stosowane w NS i cryo-EM nie uległy znaczącej poprawie od czasu ich opracowania. Obecnymi wadami są wysokie zużycie próbki (ok. 3 µL o stężeniu 1 mg/ml białka) oraz dużą ilość (&gt; 9%) próbki utracono (Rycina 1A,B). Ponadto klasyczna metoda stosowana do przygotowania siatek do kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) jest procedurą drastyczną dla białek: po pierwsze, obejmuje ona etap intensywnego osuszania za pomocą papieru filtracyjnego (blottingu) z przodu (Rycina 1B, ii), a po drugie, białko jest wystawione na działanie granicy faz powietrze-woda przez znaczny czas21W niniejszej pracy przedstawiono alternatywną metodę przygotowania próbek, przygotowania siatek obiektowych oraz post-processingu (suszenia lub witryfikacji siatek) dla NS-EM (Rycina 1C) lub krio-EM (Rysunek 1D) zostaje przedstawiony. Opracowany wewnętrznie układ, nazwany „cryoWriter”, wykorzystuje zminiaturyzowaną technologię obsługi próbek oraz zasady mikroprzepływowe do aspiracji, kondycjonowania i dozowania próbki, co pozwala całkowicie uniknąć stosowania papierowych pasków do odsączania i zapewnia alternatywne metody rozcieńczania próbek do krio-EM. Rozwiązanie to znacząco zmniejsza zużycie próbek i zwiększa kontrolę użytkownika nad całym procesem ich przygotowania. Co więcej, metoda ta umożliwia nowe zastosowania eksperymentalne, takie jak przygotowanie wyizolowanych komponentów biologicznych pojedynczych komórek w podejściu zwanym „wizualną proteomiką pojedynczych komórek”.22,23,24,25.

<table><tbody><tr><td><mocny>Obsługa cieczy</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówka mikrokapilarna</td><td>Nowy obiektyw</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>KrzemionkaKońcówki 30 i mikro; m ID końcówki, 100 i mikro; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>KrzemionkaKońcówki 30 & mikro; m ID końcówki, 150 i mikro; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td>Tuleja przewodząca</td><td>Nowy obiektyw</td><td>CONGAS-1&nbsp;</td><td>Elastomer przewodzący do styku WN, długość 12"</td></tr><tr><td>Rurki z topionej krzemionki</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Standardowe rurki FS, 150 i mikro; m ID, 363 &mikro; m OD, 5 metrów</td></tr><tr><td>Złącze PressFit</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. Łącznik PressFit 0,25 do 0,25 mm średnica wewnętrzna, ok. 25&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka 10 i mikro; l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Końcówka Luer (igła nie jest dołączona)&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterownik pompy strzykawkowej</td><td>Sterownik Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>neMESYS</td></tr><tr><td>Jednostka dozująca pompę strzykawkową</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>jednostka dozująca neMESYS</td></tr> <tr><td>Kontrola temperatury</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czujnik punktu rosy</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>, obliczanie punktu rosy, USB i wbudowana biblioteka DLL</td></tr><tr><td>Temperatura czujnik</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>Czujnik temperatury do montażu powierzchniowego Pt1000</td></tr><tr><td>Sterownik Peltiera</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp;</td><td>Regulator temperatury PID do aktywacji układów napędzanych Peltierem z wyjściem stałonapięciowym</td></tr><tr><td>Element Peltiera</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>Blok chłodzący wodę</td> <td>-</td><td></td> <td>Blok chłodzenia wodą do elementu Peltiera 40x40 mm, podstawa miedziana</td></tr><tr><td>Pompa wodna</td><td>Digitec.ch</td><td>294877</td><td>XSPC X20 750 Podwójna pompa zbiornikowa 5.25 blok</td></tr><tr><td>wodnego wymiennika ciepła</td> <td>-</td><td></td> <td>Blok wodnego wymiennika ciepła z 2 wentylatorami do schładzania wody krążącej</td></tr><tr><td>Małe chłodnice wodne</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ram copper edition 2 szt</td></tr>. <tr><td>Małe elementy ogniwa petiera</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3,4 A 8,1 W 3,8 V 74 &deg; C, 2 szt</td></tr><tr><td><mocny>Mechanika</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stolik liniowy oś z</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>Precyzyjny stolik translacyjny o dużym obciążeniu, zakres przesuwu 50 mm, silnik prądu stałego</td></tr><tr><td>Sterownik stopnia</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Sterownik serwomechanizmu Mercury Stopień</td></tr> osi <tr><td>xy</td> mikroskopu <td>Wcześniejszy</td><td>H117EIL5</td> naukowy <td>Stopień zmotoryzowany do Zeiss Axiovert 200 mikroskop odwrócony</td></tr><tr><td>Małe magnesy trwałe</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Magnes prętowy & Oslash; 5 mm, wysokość 8,47 mm, neodymowy, N45, niklowany, pk. 10</td></tr><tr><td>Mały elektromagnes</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Elektromagnes 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Sterownik elektromagnesu</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Płytka PCB sterująca elektromagnesem</td></tr><tr><td>Piasta</td> <td>elektromagnetycznaDistrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini pęseta</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Type 5 mini, super cienkie końcówki</td></tr><tr><td>Różne części optomechaniczne</td><td>Thorlabs</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>różne części mechaniczne</td><td>Warsztat Biozentrum, Uniwersytet w Bazylei</td> <td>-</td> <td>Specjalnie zaprojektowane płyty adaptera, uchwyty itp. zobacz załączone pliki CAD</td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm moduł diody laserowej 2,5 mW</td></tr><tr><td>Fotodetektor</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si Przełączany detektor wzmocnienia, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mmSiatki 2</td></tr><tr><td>EM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td></td> <td>emsdiasum.comDTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&trade; membrany z azotku krzemu do TEM, opakowanie 5 sztuk</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers / Neg. stain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp; SIGMA</td><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td>NanoW</td>2%nanoprobes.com <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Ujemna plama na bazie wolframu</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td> Framework openBEB <td></td><td></td><td>2 jest dostępny na żądanie, wersja 3 będzie dostępna do pobrania</td></tr><tr><td>Kontrola CryoWriter oprogramowanie (wtyczka openBEB)</td><td></td><td>Dostępne na żądanie, mogą obowiązywać dodatkowe opłaty za oprogramowanie sterownika innych firm.</td><td></td></tr></tbody></table>

zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Ze względu na niedawny postęp technologiczny, mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) szybko staje się standardową metodą analizy strukturalnej kompleksów białkowych do rozdzielczości atomowej. Wąskim gardłem pozostają jednak techniki izolacji białek i metody przygotowania próbek do EM. Stosunkowo niewielka liczba (od 100 000 do kilku milionów) pojedynczych cząstek białka musi zostać zobrazowana w celu analizy białek w wysokiej rozdzielczości metodą EM pojedynczej cząstki, co umożliwia zastosowanie zminiaturyzowanych technik obsługi próbek i zasad mikroprzepływowych.
Przedstawiono zminiaturyzowaną, wolną od bibuły metodę przygotowania siatki EM do wstępnego kondycjonowania próbki, gruntowania siatki EM i obróbki końcowej, która zużywa tylko nanolitrowe objętości próbki. Metoda wykorzystuje system dozowania z precyzją sub-nanolitrów do kontrolowania wchłaniania cieczy i zalewania siatki EM, platformę do kontrolowania temperatury siatki, określając w ten sposób wilgotność względną nad siatką EM, oraz mechanizm podnoszenia i zanurzania do witryfikacji próbki. W przypadku cryo-EM siatkę EM umieszcza się na stoliku o kontrolowanej temperaturze, a próbkę zasysa się do kapilary. Końcówka kapilarny jest umieszczana w pobliżu powierzchni siatki, siatka jest ładowana próbką, a nadmiar jest ponownie zasysany do mikrokapilary. Następnie folia próbki jest stabilizowana i nieznacznie rozcieńczana przez kontrolowane parowanie wody regulowane przesunięciem temperatury platformy w stosunku do punktu rosy. W pewnym momencie uruchamiany jest mechanizm podnoszenia i zanurzania, który szybko przenosi zalaną siatkę EM do ciekłego etanu w celu zeszklenia próbki. Alternatywnie dostępne są metody kondycjonowania próbki w celu przygotowania objętości próbki o wielkości nanolitrów do barwienia ujemnego (NS) EM.
Metodologie znacznie zmniejszają zużycie próbek i unikają podejść potencjalnie szkodliwych dla białek, takich jak bibuła filtracyjna stosowana w konwencjonalnych metodach. Co więcej, niewielka ilość wymaganej próbki pozwala na nowatorskie strategie eksperymentalne, takie jak szybkie kondycjonowanie próbek, połączenie z lizą pojedynczych komórek w celu "wizualnej proteomiki" lub "bezstratne" przygotowanie całkowitej próbki do analizy ilościowej złożonych próbek.

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii struktury, takie jak przygotowanie wrażliwych białek, w przypadku których dostępna jest ograniczona ilość białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że w porównaniu ze standardowymi metodami przygotowania próbek, wymagane są tylko niewielkie ilości próbki i nie jest wymagany żaden ostry etap blottingu papieru. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku analizy pojedynczej komórki za pomocą proteomiki wizualnej lub diagnozy chorób związanych z białkami.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy dysponowaliśmy technologią pozwalającą na rozwiązywanie struktur o wysokiej rozdzielczości za pomocą zaledwie około 100 000 pojedynczych cząstek. Aby rozpocząć, przygotuj próbkę zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie zmontuj kubek na etan, uchwyt na krioskrzynkę i pająka.I napełnij pojemnik kriogeniczny po brzegi ciekłym azotem. Po kilku minutach kubek będzie chłodny i wolny od ciekłego azotu. Następnie otwórz butlę z etanem i powoli pozwól, aby gaz wpłynął do kubka na etan.Pozwól kubkowi napełnić się ciekłym etanem, aż poziom znajdzie się dwa do trzech milimetrów poniżej góry. Zajmie to kilka minut i wymaga około pięciu mililitrów ciekłego etanu. Usuń pająka, umieść pokrywkę z polistyrenu na górze i umieść pojemnik kriogeniczny na uchwycie w pisarce kriologicznej.Chwyć rozładowaną jarzeniem siatkę EM za pomocą pęsety kriopisarki, zawiąż pęsetę na elektromagnesie i przykręć mikromanipulator, aby wyrównać siatkę płasko na scenie, stroną z folią węglową do góry. Wróć do oprogramowania i kliknij dwukrotnie grid_save. Następnie wyreguluj położenie mikrokapilarnej, tak aby końcówka znajdowała się około 10 mikrometrów nad powierzchnią siatki.Upewnij się, że mikrokapilara może swobodnie poruszać się po siatce, nie dotykając jej w żadnym miejscu. A jeśli to konieczne, wycofaj mikrokapilę o kilka mikrometrów. Następnie ustaw go z powrotem na środku siatki i zapisz nową pozycję jako siatkę.Przesuń mikrokapilę z powrotem do pozycji wyjściowej. Następnie przepłucz mikrokapilę kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego i użyj niestrzępiącej się tkanki, aby usunąć wszelkie krople z mikrokapilary. Gdy wszystko jest już przygotowane, uruchom skrypt makra.Makro najpierw przesuwa się na miejsce i dozuje pięć nanolitrów płynu systemowego w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków powietrza na końcówce, a następnie przechodzi do pozycji próbek. Następnie zasysa 65 nanolitrów próbki, a następnie wprowadza pięć nanolitrów z powrotem do probówki z próbką. Uwzględnia to luz systemu i pozwala na zsynchronizowany zapis.Po przesunięciu się do pozycji siatki inicjuje wzór pisania, który spowoduje, że mikrokapila przesunie się po siatce i jednocześnie dozuje 45 nanolitrów próbki. Następnie przesuwa mikrokapilę z powrotem do środka siatki, obniża ją o kolejne 10 mikrometrów i pobiera nadmiar cieczy próbki. Na koniec makro wycofuje mikrokapilę i wyłącza elektromagnes, który inicjuje mechanizm zamrażania wgłębnego.Po zwolnieniu z magnesu ostrożnie zwolnij adapter magnetyczny z tłoka i szybko przenieś siatkę z kubka na etan do pojemnika kriogenicznego, zawierającego pudełko kriogeniczne, umieszczając siatkę w wolnym gnieździe. Na początek należy przygotować komórki zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym i zamontować szkiełko z tlenku indu i cyny na wkładzie mikroskopu. Użyj dwóch, aby przymocować suwak do aluminiowej wkładki i zapewnić kontakt elektryczny między powłoką z tlenku indu cyny prowadnicy a elektrycznie uziemioną aluminiową ramą.Następnie wyjmij pożywkę do hodowli komórkowej ze studzienki i umyj komórki dwukrotnie 300 mikrolitrami buforu do elektroporacji. Po ostatnim płukaniu utrzymuj ogniwa w buforze do elektroporacji. Następnie umieść aluminiową wkładkę, która przytrzymuje szkiełko z tlenku indu i cyny w inkubatorze z żywymi komórkami, na ustawieniu.Za pomocą mikroskopu zlokalizuj kulturę komórkową i wybierz obszar, w którym nie ma komórek. Podejdź do końcówki mikrokapilarnej na powierzchni szkiełka i delikatnie jej dotknij. Następnie wycofaj końcówkę za 100 mikrometrów i zapisz pozycję jako komórki.Teraz szybko opuść hodowlę komórkową i przepłucz końcówkę mikrokapilarną kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego, a następnie ponownie włóż ją do hodowli komórkowej. Dozuj kilka nanolitrów podczas zanurzenia do studni PDMS, aby upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione na końcówce. Kliknij dwukrotnie w pozycji ogniwa i delikatnie zbliż się do powierzchni szkiełka z tlenku indu i cyny, a po kontakcie cofnij końcówkę o 10 mikrometrów.W tym momencie wybierz pobliską komórkę do lizy. i umieść końcówkę mikrokapilary nad docelową komórką. Następnie uruchom skrypt makr do lizy pojedynczych komórek.Po uruchomieniu skrypt poprosi o pozycję, do której należy przesunąć mikrokapilę po pomyślnej lizie komórki. Wprowadź żądaną pozycję, na przykład siatkę, dla siatki EM. Makro będzie następnie postępować bez interwencji użytkownika i rozpocznie się od przesunięcia stolika mikroskopu w hodowli komórkowej o 100 mikrometrów w lewo, gdzie wykona migawkę docelowej komórki.Następnie z rurki mikrokapilarnej dozuje się 15 nanolitrów podwójnie destylowanej wody, wypierając i rozcieńczając bufor o wysokiej zawartości soli, wywierając ciśnienie osmotyczne na komórkę. Następnie etap cofa się, aby ponownie umieścić końcówkę nad komórką docelową. Tam stosowany jest predefiniowany impuls napięcia, a po 500 milisekundach system pompy zaczyna zasysać trzy nanolitry próbki z natężeniem przepływu dwóch mikrolitrów na minutę.Na koniec stolik ponownie przesuwa się w lewo, co pozwala na sprawdzenie komórki. Pojawi się okno z prośbą o wprowadzenie danych przez użytkownika. Jeśli komórka zakończyła się pomyślnie, wprowadź yes, aby wykonać migawkę lizowanej komórki.Następnie mikrokapilara przemieszcza się do miejsca endodontycznego, zanurzona w cieczy zbiornikowej. Pozostaw mikrokapilę zanurzoną na osiem do 12 minut, w zależności od geometrii dyszy. Następnie dozuj pięć nanolitrów kondycjonowanego lizatu komórkowego na siatkę.Wycofać mikrokapilę i pozostawić kondycjonowaną próbkę do powolnego wyschnięcia na stoliku z punktem rosy. Na koniec zdejmij siatkę ze sceny i przechowuj ją w temperaturze pokojowej w pudełku z siatką. Pokazano tutaj typowe obrazy kriogeniczne zamrożonych próbek przy użyciu opisanej konfiguracji CryoWriter.W przeglądzie siatki wyraźnie widać obrzeża szklistego lodu. Po bliższym zbadaniu szczeliny siatki z dziurawą warstwą węglową zawierającą szklisty lód, można znaleźć białe, co wskazuje, że nie wszystkie otwory zostały wypełnione buforem próbki. W jednej z próbek zawierających węglowe ogon bakteriofaga jest wyraźnie widoczny ze szczegółami.Korzystając z zestawu CryoWriter do wykonywania proteomiki wizualnej pojedynczej komórki, można zobaczyć takie rzeczy, jak pojedyncze białka, na przykład nitkowate aktyny i łaty błonowe z przyłączonymi białkami. Obraz, który można zobaczyć w panelu 6b, jest barwiony ujemnie 2%barwnikiem negatywowym, opartym na związku organoorganicznym. Panel c przedstawia lizat jednokomórkowy przygotowany do kriozadruku EM. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować siatki EM z barwienia ujemnego lub kriogenicznego, z nanolitrowych całkowitych objętości próbek białek lub ekstraktów jednokomórkowych.Nie zapominaj, że praca z ciekłym etanem i azotem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego.

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek o niskiej liczbie komórek do analizy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy TEM

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

To badanie przedstawia niezawodne i łatwe procedury uzyskiwania seryjnych ultracienkich odcinków mikroorganizmu bez drogiego sprzętu w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje różne techniki niezbędne do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w tym barwienie ujemne, ultracienkie sekcje dla szczegółowej struktury i znakowanie immuno-złote w celu określenia pozycji określonych białek w egzosomach.

Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Poznaj zminiaturyzowaną metodę przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej bez użycia papierowego blotowania. Technika ta umożliwia analizę lizatów pojedynczych komórek w badaniach proteomicznych.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów