Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii struktury, takie jak przygotowanie wrażliwych białek, w przypadku których dostępna jest ograniczona ilość białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że w porównaniu ze standardowymi metodami przygotowania próbek, wymagane są tylko niewielkie ilości próbki i nie jest wymagany żaden ostry etap blottingu papieru. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku analizy pojedynczej komórki za pomocą proteomiki wizualnej lub diagnozy chorób związanych z białkami.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy dysponowaliśmy technologią pozwalającą na rozwiązywanie struktur o wysokiej rozdzielczości za pomocą zaledwie około 100 000 pojedynczych cząstek. Aby rozpocząć, przygotuj próbkę zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie zmontuj kubek na etan, uchwyt na krioskrzynkę i pająka.

I napełnij pojemnik kriogeniczny po brzegi ciekłym azotem. Po kilku minutach kubek będzie chłodny i wolny od ciekłego azotu. Następnie otwórz butlę z etanem i powoli pozwól, aby gaz wpłynął do kubka na etan.

Pozwól kubkowi napełnić się ciekłym etanem, aż poziom znajdzie się dwa do trzech milimetrów poniżej góry. Zajmie to kilka minut i wymaga około pięciu mililitrów ciekłego etanu. Usuń pająka, umieść pokrywkę z polistyrenu na górze i umieść pojemnik kriogeniczny na uchwycie w pisarce kriologicznej.

Chwyć rozładowaną jarzeniem siatkę EM za pomocą pęsety kriopisarki, zawiąż pęsetę na elektromagnesie i przykręć mikromanipulator, aby wyrównać siatkę płasko na scenie, stroną z folią węglową do góry. Wróć do oprogramowania i kliknij dwukrotnie grid_save. Następnie wyreguluj położenie mikrokapilarnej, tak aby końcówka znajdowała się około 10 mikrometrów nad powierzchnią siatki.

Upewnij się, że mikrokapilara może swobodnie poruszać się po siatce, nie dotykając jej w żadnym miejscu. A jeśli to konieczne, wycofaj mikrokapilę o kilka mikrometrów. Następnie ustaw go z powrotem na środku siatki i zapisz nową pozycję jako siatkę.

Przesuń mikrokapilę z powrotem do pozycji wyjściowej. Następnie przepłucz mikrokapilę kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego i użyj niestrzępiącej się tkanki, aby usunąć wszelkie krople z mikrokapilary. Gdy wszystko jest już przygotowane, uruchom skrypt makra.

Makro najpierw przesuwa się na miejsce i dozuje pięć nanolitrów płynu systemowego w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków powietrza na końcówce, a następnie przechodzi do pozycji próbek. Następnie zasysa 65 nanolitrów próbki, a następnie wprowadza pięć nanolitrów z powrotem do probówki z próbką. Uwzględnia to luz systemu i pozwala na zsynchronizowany zapis.

Po przesunięciu się do pozycji siatki inicjuje wzór pisania, który spowoduje, że mikrokapila przesunie się po siatce i jednocześnie dozuje 45 nanolitrów próbki. Następnie przesuwa mikrokapilę z powrotem do środka siatki, obniża ją o kolejne 10 mikrometrów i pobiera nadmiar cieczy próbki. Na koniec makro wycofuje mikrokapilę i wyłącza elektromagnes, który inicjuje mechanizm zamrażania wgłębnego.

Po zwolnieniu z magnesu ostrożnie zwolnij adapter magnetyczny z tłoka i szybko przenieś siatkę z kubka na etan do pojemnika kriogenicznego, zawierającego pudełko kriogeniczne, umieszczając siatkę w wolnym gnieździe. Na początek należy przygotować komórki zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym i zamontować szkiełko z tlenku indu i cyny na wkładzie mikroskopu. Użyj dwóch, aby przymocować suwak do aluminiowej wkładki i zapewnić kontakt elektryczny między powłoką z tlenku indu cyny prowadnicy a elektrycznie uziemioną aluminiową ramą.

Następnie wyjmij pożywkę do hodowli komórkowej ze studzienki i umyj komórki dwukrotnie 300 mikrolitrami buforu do elektroporacji. Po ostatnim płukaniu utrzymuj ogniwa w buforze do elektroporacji. Następnie umieść aluminiową wkładkę, która przytrzymuje szkiełko z tlenku indu i cyny w inkubatorze z żywymi komórkami, na ustawieniu.

Za pomocą mikroskopu zlokalizuj kulturę komórkową i wybierz obszar, w którym nie ma komórek. Podejdź do końcówki mikrokapilarnej na powierzchni szkiełka i delikatnie jej dotknij. Następnie wycofaj końcówkę za 100 mikrometrów i zapisz pozycję jako komórki.

Teraz szybko opuść hodowlę komórkową i przepłucz końcówkę mikrokapilarną kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego, a następnie ponownie włóż ją do hodowli komórkowej. Dozuj kilka nanolitrów podczas zanurzenia do studni PDMS, aby upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione na końcówce. Kliknij dwukrotnie w pozycji ogniwa i delikatnie zbliż się do powierzchni szkiełka z tlenku indu i cyny, a po kontakcie cofnij końcówkę o 10 mikrometrów.

W tym momencie wybierz pobliską komórkę do lizy. i umieść końcówkę mikrokapilary nad docelową komórką. Następnie uruchom skrypt makr do lizy pojedynczych komórek.

Po uruchomieniu skrypt poprosi o pozycję, do której należy przesunąć mikrokapilę po pomyślnej lizie komórki. Wprowadź żądaną pozycję, na przykład siatkę, dla siatki EM. Makro będzie następnie postępować bez interwencji użytkownika i rozpocznie się od przesunięcia stolika mikroskopu w hodowli komórkowej o 100 mikrometrów w lewo, gdzie wykona migawkę docelowej komórki.

Następnie z rurki mikrokapilarnej dozuje się 15 nanolitrów podwójnie destylowanej wody, wypierając i rozcieńczając bufor o wysokiej zawartości soli, wywierając ciśnienie osmotyczne na komórkę. Następnie etap cofa się, aby ponownie umieścić końcówkę nad komórką docelową. Tam stosowany jest predefiniowany impuls napięcia, a po 500 milisekundach system pompy zaczyna zasysać trzy nanolitry próbki z natężeniem przepływu dwóch mikrolitrów na minutę.

Na koniec stolik ponownie przesuwa się w lewo, co pozwala na sprawdzenie komórki. Pojawi się okno z prośbą o wprowadzenie danych przez użytkownika. Jeśli komórka zakończyła się pomyślnie, wprowadź yes, aby wykonać migawkę lizowanej komórki.

Następnie mikrokapilara przemieszcza się do miejsca endodontycznego, zanurzona w cieczy zbiornikowej. Pozostaw mikrokapilę zanurzoną na osiem do 12 minut, w zależności od geometrii dyszy. Następnie dozuj pięć nanolitrów kondycjonowanego lizatu komórkowego na siatkę.

Wycofać mikrokapilę i pozostawić kondycjonowaną próbkę do powolnego wyschnięcia na stoliku z punktem rosy. Na koniec zdejmij siatkę ze sceny i przechowuj ją w temperaturze pokojowej w pudełku z siatką. Pokazano tutaj typowe obrazy kriogeniczne zamrożonych próbek przy użyciu opisanej konfiguracji CryoWriter.

W przeglądzie siatki wyraźnie widać obrzeża szklistego lodu. Po bliższym zbadaniu szczeliny siatki z dziurawą warstwą węglową zawierającą szklisty lód, można znaleźć białe, co wskazuje, że nie wszystkie otwory zostały wypełnione buforem próbki. W jednej z próbek zawierających węglowe ogon bakteriofaga jest wyraźnie widoczny ze szczegółami.

Korzystając z zestawu CryoWriter do wykonywania proteomiki wizualnej pojedynczej komórki, można zobaczyć takie rzeczy, jak pojedyncze białka, na przykład nitkowate aktyny i łaty błonowe z przyłączonymi białkami. Obraz, który można zobaczyć w panelu 6b, jest barwiony ujemnie 2%barwnikiem negatywowym, opartym na związku organoorganicznym. Panel c przedstawia lizat jednokomórkowy przygotowany do kriozadruku EM. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować siatki EM z barwienia ujemnego lub kriogenicznego, z nanolitrowych całkowitych objętości próbek białek lub ekstraktów jednokomórkowych.

Nie zapominaj, że praca z ciekłym etanem i azotem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego.