Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej
July 27th, 2018
Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii struktury, takie jak przygotowanie wrażliwych białek, w przypadku których dostępna jest ograniczona ilość białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że w porównaniu ze standardowymi metodami przygotowania próbek, wymagane są tylko niewielkie ilości próbki i nie jest wymagany żaden ostry etap blottingu papieru. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku analizy pojedynczej komórki za pomocą proteomiki wizualnej lub diagnozy chorób związanych z białkami.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy dysponowaliśmy technologią pozwalającą na rozwiązywanie struktur o wysokiej rozdzielczości za pomocą zaledwie około 100 000 pojedynczych cząstek. Aby rozpocząć, przygotuj próbkę zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie zmontuj kubek na etan, uchwyt na krioskrzynkę i pająka.
I napełnij pojemnik kriogeniczny po brzegi ciekłym azotem. Po kilku minutach kubek będzie chłodny i wolny od ciekłego azotu. Następnie otwórz butlę z etanem i powoli pozwól, aby gaz wpłynął do kubka na etan.
Pozwól kubkowi napełnić się ciekłym etanem, aż poziom znajdzie się dwa do trzech milimetrów poniżej góry. Zajmie to kilka minut i wymaga około pięciu mililitrów ciekłego etanu. Usuń pająka, umieść pokrywkę z polistyrenu na górze i umieść pojemnik kriogeniczny na uchwycie w pisarce kriologicznej.
Chwyć rozładowaną jarzeniem siatkę EM za pomocą pęsety kriopisarki, zawiąż pęsetę na elektromagnesie i przykręć mikromanipulator, aby wyrównać siatkę płasko na scenie, stroną z folią węglową do góry. Wróć do oprogramowania i kliknij dwukrotnie grid_save. Następnie wyreguluj położenie mikrokapilarnej, tak aby końcówka znajdowała się około 10 mikrometrów nad powierzchnią siatki.
Upewnij się, że mikrokapilara może swobodnie poruszać się po siatce, nie dotykając jej w żadnym miejscu. A jeśli to konieczne, wycofaj mikrokapilę o kilka mikrometrów. Następnie ustaw go z powrotem na środku siatki i zapisz nową pozycję jako siatkę.
Przesuń mikrokapilę z powrotem do pozycji wyjściowej. Następnie przepłucz mikrokapilę kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego i użyj niestrzępiącej się tkanki, aby usunąć wszelkie krople z mikrokapilary. Gdy wszystko jest już przygotowane, uruchom skrypt makra.
Makro najpierw przesuwa się na miejsce i dozuje pięć nanolitrów płynu systemowego w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków powietrza na końcówce, a następnie przechodzi do pozycji próbek. Następnie zasysa 65 nanolitrów próbki, a następnie wprowadza pięć nanolitrów z powrotem do probówki z próbką. Uwzględnia to luz systemu i pozwala na zsynchronizowany zapis.
Po przesunięciu się do pozycji siatki inicjuje wzór pisania, który spowoduje, że mikrokapila przesunie się po siatce i jednocześnie dozuje 45 nanolitrów próbki. Następnie przesuwa mikrokapilę z powrotem do środka siatki, obniża ją o kolejne 10 mikrometrów i pobiera nadmiar cieczy próbki. Na koniec makro wycofuje mikrokapilę i wyłącza elektromagnes, który inicjuje mechanizm zamrażania wgłębnego.
Po zwolnieniu z magnesu ostrożnie zwolnij adapter magnetyczny z tłoka i szybko przenieś siatkę z kubka na etan do pojemnika kriogenicznego, zawierającego pudełko kriogeniczne, umieszczając siatkę w wolnym gnieździe. Na początek należy przygotować komórki zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym i zamontować szkiełko z tlenku indu i cyny na wkładzie mikroskopu. Użyj dwóch, aby przymocować suwak do aluminiowej wkładki i zapewnić kontakt elektryczny między powłoką z tlenku indu cyny prowadnicy a elektrycznie uziemioną aluminiową ramą.
Następnie wyjmij pożywkę do hodowli komórkowej ze studzienki i umyj komórki dwukrotnie 300 mikrolitrami buforu do elektroporacji. Po ostatnim płukaniu utrzymuj ogniwa w buforze do elektroporacji. Następnie umieść aluminiową wkładkę, która przytrzymuje szkiełko z tlenku indu i cyny w inkubatorze z żywymi komórkami, na ustawieniu.
Za pomocą mikroskopu zlokalizuj kulturę komórkową i wybierz obszar, w którym nie ma komórek. Podejdź do końcówki mikrokapilarnej na powierzchni szkiełka i delikatnie jej dotknij. Następnie wycofaj końcówkę za 100 mikrometrów i zapisz pozycję jako komórki.
Teraz szybko opuść hodowlę komórkową i przepłucz końcówkę mikrokapilarną kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego, a następnie ponownie włóż ją do hodowli komórkowej. Dozuj kilka nanolitrów podczas zanurzenia do studni PDMS, aby upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione na końcówce. Kliknij dwukrotnie w pozycji ogniwa i delikatnie zbliż się do powierzchni szkiełka z tlenku indu i cyny, a po kontakcie cofnij końcówkę o 10 mikrometrów.
W tym momencie wybierz pobliską komórkę do lizy. i umieść końcówkę mikrokapilary nad docelową komórką. Następnie uruchom skrypt makr do lizy pojedynczych komórek.
Po uruchomieniu skrypt poprosi o pozycję, do której należy przesunąć mikrokapilę po pomyślnej lizie komórki. Wprowadź żądaną pozycję, na przykład siatkę, dla siatki EM. Makro będzie następnie postępować bez interwencji użytkownika i rozpocznie się od przesunięcia stolika mikroskopu w hodowli komórkowej o 100 mikrometrów w lewo, gdzie wykona migawkę docelowej komórki.
Następnie z rurki mikrokapilarnej dozuje się 15 nanolitrów podwójnie destylowanej wody, wypierając i rozcieńczając bufor o wysokiej zawartości soli, wywierając ciśnienie osmotyczne na komórkę. Następnie etap cofa się, aby ponownie umieścić końcówkę nad komórką docelową. Tam stosowany jest predefiniowany impuls napięcia, a po 500 milisekundach system pompy zaczyna zasysać trzy nanolitry próbki z natężeniem przepływu dwóch mikrolitrów na minutę.
Na koniec stolik ponownie przesuwa się w lewo, co pozwala na sprawdzenie komórki. Pojawi się okno z prośbą o wprowadzenie danych przez użytkownika. Jeśli komórka zakończyła się pomyślnie, wprowadź yes, aby wykonać migawkę lizowanej komórki.
Następnie mikrokapilara przemieszcza się do miejsca endodontycznego, zanurzona w cieczy zbiornikowej. Pozostaw mikrokapilę zanurzoną na osiem do 12 minut, w zależności od geometrii dyszy. Następnie dozuj pięć nanolitrów kondycjonowanego lizatu komórkowego na siatkę.
Wycofać mikrokapilę i pozostawić kondycjonowaną próbkę do powolnego wyschnięcia na stoliku z punktem rosy. Na koniec zdejmij siatkę ze sceny i przechowuj ją w temperaturze pokojowej w pudełku z siatką. Pokazano tutaj typowe obrazy kriogeniczne zamrożonych próbek przy użyciu opisanej konfiguracji CryoWriter.
W przeglądzie siatki wyraźnie widać obrzeża szklistego lodu. Po bliższym zbadaniu szczeliny siatki z dziurawą warstwą węglową zawierającą szklisty lód, można znaleźć białe, co wskazuje, że nie wszystkie otwory zostały wypełnione buforem próbki. W jednej z próbek zawierających węglowe ogon bakteriofaga jest wyraźnie widoczny ze szczegółami.
Korzystając z zestawu CryoWriter do wykonywania proteomiki wizualnej pojedynczej komórki, można zobaczyć takie rzeczy, jak pojedyncze białka, na przykład nitkowate aktyny i łaty błonowe z przyłączonymi białkami. Obraz, który można zobaczyć w panelu 6b, jest barwiony ujemnie 2%barwnikiem negatywowym, opartym na związku organoorganicznym. Panel c przedstawia lizat jednokomórkowy przygotowany do kriozadruku EM. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować siatki EM z barwienia ujemnego lub kriogenicznego, z nanolitrowych całkowitych objętości próbek białek lub ekstraktów jednokomórkowych.
Nie zapominaj, że praca z ciekłym etanem i azotem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nową metodę przygotowywania nanolitrowych objętości próbek do mikroskopii elektronowej transmisyjnej bez konieczności kroków wyssania na papierze. Ta technika znacznie zmniejsza utratę próbki i umożliwia analizę lizatów pojedynczych komórek dla proteomiki wizualnej.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Proteomika
- Analiza pojedynczych komórek
Tło
- Tradycyjne metody przygotowywania próbek często wymagają dużych ilości próbki.
- Wyssanie na papierze może niekorzystnie wpływać na wrażliwe białka.
- Ta metoda pozwala na analizę ograniczonych ilości białek.
- Wysokiej rozdzielczości struktury można uzyskać przy minimalnej próbce.
Cel badania
- Opracować technikę, która minimalizuje utratę próbki podczas przygotowywania.
- Ułatwić analizę lizatów pojedynczych komórek.
- Poprawić diagnozę chorób związanych z białkami poprzez proteomikę wizualną.
Stosowane metody
- Przygotowywanie próbek w pojemniku kriogenicznym.
- Użycie mikrokapilary do precyzyjnego dozowania próbek.
- Zastosowanie makroskryptu do zautomatyzowanej obsługi próbek.
- Zastosowanie ciśnienia osmotycznego do lizy komórek.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie przygotowuje objętości nanolitrów bez utraty próbki.
- Lizaty pojedynczych komórek można analizować skutecznie.
- Możliwe jest uzyskanie wysokiej rozdzielczości obrazowania białek.
- Technika pokazuje obiecujące wyniki w diagnostyce chorób związanych z białkami.
Wnioski
- Ta innowacyjna metoda poprawia badania wrażliwych białek.
- Otwiera nowe szanse dla analizy pojedynczych komórek w proteomiki.
- Brak wyssania na papierze poprawia integralność próbki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in structural biology by enabling high-resolution protein analysis from nanoliter sample volumes, directly supporting target validation when protein availability is limited. By eliminating paper blotting and reducing sample loss, it enhances sample integrity and reproducibility—key factors for reliable assay development and mechanistic de-risking in early discovery. The capability to integrate with single-cell lysis opens pathways for visual proteomics, expanding the utility of cryo-EM in phenotypic screening and biomarker discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural characterization of low-abundance or sensitive protein targets that are difficult to isolate in sufficient quantities using conventional methods.
- Operational Value: Reduces sample consumption from microgram to nanogram scales, conserving precious material for downstream assays and minimizing waste in precious target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports confident target de-risking by providing high-fidelity structural data from minimal input, improving go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces vitrified samples suitable for single-particle cryo-EM, enabling quantitative structural readouts that can inform binding affinity and conformational dynamics in assay development.
- Operational Value: Uses a dispensing system with sub-nanoliter precision, ensuring reproducible sample deposition across grids and supporting assay standardization.
- Scalability: The macro-driven automation allows consistent processing of multiple samples, facilitating medium-throughput screening campaigns when integrated with robotic sample handling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables structural follow-up of biomarkers identified in phenotypic screens, linking target engagement to atomic-level mechanism.
- Mechanistic De-risking: Facilitates visualization of protein complexes, post-translational modifications, or mutation effects in disease-relevant systems without requiring large-scale protein production.
- Quantitative Readiness: The method’s ability to prepare “lossless” total sample supports accurate quantification of complex mixtures, aiding in biomarker validation and pharmacokinetic studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural insight and enabling progression to lead identification by reducing biological uncertainty in protein targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing high-resolution structural data on protein targets, clarifying binding sites and mechanistic function from limited samples.
- Screening: Delivers assay-ready grids with standardized sample thickness and ice quality, improving reliability in downstream screening and hit validation.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs such as particle distribution, ice thickness, and molecular occupancy, enabling objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing structural analysis of disease variants or biomarker candidates derived from patient samples or single-cell lysates.
- Enterprise Reuse: The automated macro script and temperature-controlled platform create a reusable infrastructure for structural proteomics across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target structure and function, reducing ambiguity in mechanistic interpretation.
- Operational Value: Eliminates variability introduced by manual blotting, improving reproducibility and throughput in grid preparation.
- Strategic Value: Lowers the barrier to studying challenging targets, enabling broader exploration of the proteome and reducing reliance on overexpression systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing structural evidence early in the discovery pipeline, de-risking investment in high-value targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM sample preparation, microfluidic handling, and macro-based automation systems.
- Dependent on specialized instrumentation including a cryogen container, ethane plunge system, temperature-controlled stage, and precision microcapillary dispenser.
- Necessitates standardization of environmental controls (humidity, temperature) to ensure consistent sample vitrification across runs.
- Adaptation to different sample types (e.g., membrane proteins, complexes) may require optimization of buffer conditions and blotting alternatives.
- Practical limitations include the need for hazardous material handling (liquid ethane, nitrogen) and initial setup complexity, though operational simplicity improves post-training.
