Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Analiza ilościowa rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy
September 18th, 2021
Opisujemy metodę analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów Aspergillus fumigatus (o wielkości 3 μm) w drogach oddechowych myszy. Metoda może być również stosowana do analizy rozkładu mikrocząstek i aglomeratów nanocząstek w drogach oddechowych w różnych modelach stanów patologicznych.
Nasze podejście pozwala nam przeprowadzić analizę ilościową rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całym optycznie oczyszczonym płucu myszy. Aspergillus fumigatus Conidia może przenikać do dróg oddechowych i powodować choroby zagrażające życiu u pacjentów z obniżoną odpornością. Drogi oddechowe ssaków to układ dróg oddechowych różnych pokoleń.
Każde pokolenie charakteryzuje się inną strukturą ścian dróg oddechowych i populacjami komórek odpornościowych. W gałęziach oskrzeli Aspergillus fumigatus Conidia są eliminowane przez klirens śluzowo-rzęskowy. Jednak w dostępnej przestrzeni klirens śluzowo-rzęskowy nie działa i konidia muszą zostać usunięte przez komórki odpornościowe, takie jak makrofagi pęcherzykowe i neutrofile.
Podobnie jak przestrzenne, czasowe aspekty rozmieszczenia konidiów w drogach oddechowych są ważne. Jednak nie jest to właściwie zbadane pytanie w zrozumieniu mechanizmów choroby. W tym miejscu przedstawiamy zestaw eksperymentalny do analizy ilościowej rozmieszczenia Aspergillus fumigatus Conidia w drogach oddechowych zakażonych myszy.
Na mysz nakładam 50 mikrolitrów oznakowanego Aspergillus fumigatus Conidia. Sześć godzin później zbierz płuca. Utrwalić przez noc w 2% formaldehydzie i zabarwić znakowanym koniugatem streptawidyny.
Następnie poddaj próbkę czyszczeniu optycznemu. Umieścić próbkę w szklanej butelce wypełnionej 50% roztworem metanolu i umieścić ją w mieszalniku próbek w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Zamień 50% metanol na 100% metanol i umieść go pod mieszalnikiem próbek na dwie godziny.
Przygotować mieszaninę składającą się z jednej części alkoholu benzylowego i dwóch części benzoesanu benzylu. Przenieść próbkę na płytkę 24-dołkową i przykryć ją mieszaniną benzoesanu benzylu na co najmniej 30 minut. Próbka jest gotowa do obrazowania.
Umieścić próbkę na uchwycie próbki. I umieść uchwyt w mikroskopie. Po włączeniu systemu mikroskopowego i otwarciu oprogramowania, włącz lampę transmisyjną i wybierz obiektyw X.
Wizualnie zlokalizuj próbkę w świetle transmisyjnym i przejdź do zakładki akwizycji. Wybierz tryb konfokalnej mikroskopii laserowej Lambda. Włącz odpowiednie lasery.
Ustaw zakres widmowy detektora i wybierz zwierciadło dichroiczne. Dostosuj wzmocnienie detektora i zawęź otwór do jednej jednostki obszaru. Ustaw rozdzielczość pikseli na 512 na 512.
Włącz tryb zed-stack i rozpocznij obrazowanie na żywo. Znajdź płaszczyznę ogniskową, w której widoczne są obie kostki. Rozwiń panel zed-stack.
Za pomocą pokrętła ostrości znajdź i wybierz najniższą i najwyższą płaszczyznę próbki. Umieść płaszczyznę ogniskową obok dolnej części próbki. Wyłącz tryb zed-stack i włącz tryb skanowania za pomocą wybierania.
W razie potrzeby dostosuj położenie X, Y i liczbę płytek. Włącz tryby zed-stack i dial scan. Ustaw krok przekroju zed na pięć mikronów.
Ustaw szybkość skanowania. Rozpocznij eksperyment. Obrazowanie trwa zazwyczaj kilka godzin, w zależności od wielkości terenu i prędkości skanowania.
Uzyskany obraz jest następnie spektralnie niezmieszany. Do rozmieszania spektralnego użyj opcji rozmieszania liniowego. Wybierz regiony odpowiadające obszarom lądowym oznaczonym streptawidyną i konidią.
Zacznij rozmieszawać. Po rozmieszaniu zapisz niewymieszany plik. Aby zszyć kafelki z uzyskanego obrazu, otwórz obraz.
Wybierz metody, ściegi geometryczne. Zaznacz obraz w oknie wprowadzania. W opcjach łączenia wybierz opcję nowe płytki wyjściowe i bezpiecznikowe.
Użyj trybu referencyjnego z wybranym kanałem odpowiadającym fluorescencji dróg oddechowych. Otwórz obraz w nadmiarowym widoku 3D. W razie potrzeby zmień kolory używane w ich prezentacji.
Tutaj pokazujemy kanał oddechowy w odcieniach szarości i kanał Conidia w kolorze fioletowym. Aby utworzyć maskę dróg oddechowych, użyj narzędzia Dodaj nową powierzchnię. Wybierz kanał dróg oddechowych i wybierz parametr wygładzania 10 mikronów.
Do wykluczenia sygnału z dróg oddechowych można użyć różnych filtrów. Najpierw sprawdź wzrokowo powierzchnię i ustaw próg intensywności. Dodatkowe filtry, takie jak powierzchnia, mogą być również stosowane wyłącznie do wybranych dróg oddechowych, ale nie do opłucnej lub naczyń krwionośnych.
Następnie należy ręcznie usunąć wybrany fragment powierzchni, który nie należy do dróg oddechowych. Teraz możesz obserwować utworzoną powierzchnię i badać brakujące części, aby je później poprawić. Utwórz maskę dla powierzchni dróg oddechowych, korzystając z opcji edycji i maskowania wszystkiego.
Wybierz kanał dróg oddechowych i ustaw komórki robocze na zewnątrz powierzchni na wartość 0,001. Tutaj pokazaliśmy powstałą maskę w kolorze pomarańczowym. Zapisz kanał Conidia i maskę dróg oddechowych w dwóch oddzielnych folderach, jako seria T lub F.
Otwórz plik z obrazem maski dróg oddechowych. Ustaw obraz jako binarny. Postępuj zgodnie z binarnym procesem, utwórz binarny.
Aby upodobnić grubość maski, zastosuj kilka funkcji rozszerzania 3D. Podążaj za wtyczkami, przetwarzaj, rozszerzaj 3D. W tym celu można również użyć funkcji makr.
Po kilku cyklach procesu rozszerzania użyj funkcji wypełniania otworów. Postępuj zgodnie z procesem, binarnym, wypełnij otwory. Aby ręcznie wypełnić pozostałe otwory w masce, otwórz menedżera obszaru zainteresowania.
postępuj zgodnie z analizą, narzędziami, menedżerem ROI. Za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów wybierz obszar, który ma zostać wypełniony w jednym konkretnym rzucie. Zrób to kilka razy dla kilku projekcji w zed-stack, aby móc interpolować kształty interesujących regionów.
Aby interpolować wybrane kształty, zaznacz je wszystkie i naciśnij więcej, aby interpolować ROI. Następnie wypełnij wszystkie ROI kolorem białym. Ponownie skorzystaj z procedury wypełniania otworów.
Aby ponownie złożyć grubość maski po wypełnieniu otworów, zastosuj funkcję erodowania 3D. Podążaj za wtyczkami, przetwarzaj, eroduj 3D. Możesz również użyć do tego mikrosów.
Liczba iteracji w erodach 3D i LA 3D powinna być równa. Uruchom aplikację do liczenia konidia. Naciśnij przycisk dodaj pliki i wybierz foldery z plikami DIFF z przygotowaną maską dróg oddechowych i obrazami fluorescencji Conidia.
Ustaw niestandardowy próg z zakresu od zera do jednego. Naciśnij OK i zobacz wyniki. Stosując to podejście, przeprowadzamy analizę ilościową konidiów wewnątrz i na zewnątrz drzewa oskrzelowego myszy sześć godzin po zastosowaniu konidiów.
Dane sugerują, że po naszym pierwotnym zastosowaniu większość konidiów przenika do przestrzeni pęcherzyków płucnych i przydziela się tam na początku zapalnej odpowiedzi immunologicznej. Trójwymiarowe obrazowanie płuc myszy za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej umożliwia identyfikację Aspergillus fumigatus Conidia w drogach oddechowych. Przetwarzanie obrazów trójwymiarowych z wykorzystaniem tego protokołu pozwala na przeprowadzenie analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów wewnątrz i na zewnątrz gałęzi oskrzeli.
Nasze podejście można również wykorzystać do oszacowania kinetyki eliminacji konidiów z dala od myszy oraz do porównania anatomicznego rozkładu konidiów u myszy immunokompetentnych i z obniżoną odpornością. Dodatkowo, korzystając z tego podejścia, można przeanalizować rozmieszczenie mikrocząstek lub nanocząstek aglomeratów w drogach oddechowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę ilościowej analizy rozkładu zarodników Aspergillus fumigatus w drogach oddechowych myszy. Technika ta może być również zastosowana do analizy rozkładu mikro- i nanocząstek w różnych warunkach patologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Mikrobiologia
- Immunologia
Tło
- Aspergillus fumigatus może powodować ciężkie choroby układu oddechowego, szczególnie u osób z osłabioną odpornością.
- Układ oddechowy składa się z dróg oddechowych o różnorodnych strukturach i populacjach komórek układu odpornościowego.
- Oczyszczanie rzęskowe jest głównym mechanizmem obrony przed zarodnikami wdychanymi.
- W niektórych regionach komórki odpornościowe, takie jak makrofagi pęcherzykowe i neutrofile, odgrywają kluczową rolę w usuwaniu zarodników.
Cel badania
- Opracowanie metody ilościowej analizy rozkładu zarodników Aspergillus fumigatus w płucach myszy.
- Zgłębienie zrozumienia zachowania zarodników w układzie oddechowym.
- Dostarczenie wglądu w odpowiedź immunologiczną na wdychane patogeny.
Zastosowane metody
- Optyczne przejrzystość całego narządu płuc myszy.
- Ilościowa analiza rozkładu zarodników.
- Ocena struktur dróg oddechowych i interakcji z komórkami układu odpornościowego.
- Zastosowanie metody do mikro- i nanocząstek.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie wizualizuje i ilościowo ocena rozkładu zarodników w drogach oddechowych.
- Wyniki podkreślają rolę komórek odpornościowych w usuwaniu zarodników z układu oddechowego.
- Technika ta może być dostosowana do badania innych cząstek w modelach patologicznych.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia dynamiki infekcji układu oddechowego.
Wnioski
- Opracowany metoda jest cennym narzędziem do badania infekcji grzybiczych w układzie oddechowym.
- Uzyskane wglądy mogą pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych dla populacji zagrożonych.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć tę metodologię na szersze zastosowania w zdrowiu układu oddechowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative spatial analysis of pathogen distribution in whole-mount cleared tissues, supporting mechanistic de-risking in antifungal target validation. By providing 3D localization and kinetic data on conidia clearance, it informs predictive confidence in preclinical models of immunocompromised host defense. The approach enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation of host-directed or pathogen-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying conidia localization in bronchial versus alveolar compartments.
- Scientific Value: Supports functional target validation by identifying spatial patterns of immune cell-pathogen interaction.
- Operational Value: Provides reproducible 3D imaging workflow for de-risking mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of conidia burden inside and outside bronchial trees for assay standardization.
- Operational Value: Enables scalable, multiplex-compatible imaging of fluorescently labeled pathogens in cleared whole organs.
- Operational Value: Facilitates assay reproducibility through standardized optical clearing, staining, and spectral unmixing steps.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links early immune response dynamics to pathogen elimination kinetics in immunocompetent versus immunocompromised models.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by correlating spatial conidia distribution with immune cell recruitment.
- Operational Value: Permits longitudinal tracking of conidia clearance to inform risk-adjusted advancement decisions in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling spatial hypothesis testing and pathway clarification in pulmonary infection models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune evasion mechanisms through quantitative 3D mapping of conidia distribution.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissue preparations with quantitative fluorescence readouts for compound or genotype screening.
- Analytics: Provides z-sectioned, spectrally unmixed 3D datasets enabling statistical comparison of conidia burden across experimental groups.
- Translational Research: Connects early innate immune responses to preclinical outcomes via spatial-temporal pathogen tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for analyzing particulate distribution (e.g., microparticles, nanoparticles) in respiratory disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in antifungal target validation through direct visualization of pathogen-immune interactions.
- Operational Value: Standardizes whole-mount lung processing for reproducible, high-content 3D imaging across sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved efficacy data in immunocompromised host models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutics based on anatomical compartment-specific pathogen clearance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, optical clearing, and 3D image analysis workflows.
- Dependent on laser scanning microscopy with spectral unmixing and tiling capabilities for whole-lung imaging.
- Necessitates cross-team standardization of staining, clearing, and masking protocols for reproducible quantification.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of clearing duration and refractive index matching.
- Practical limitations include imaging time scaling with lung size and scanning speed, as noted in the source.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:03
Aspergillus fumigatus Conidia Application & Specimen Preparation
1:22
Mouse Lung Lobe Optical Clearing
2:23
Mouse Lung Lobe Imaging with CLSM
6:50
Image Processing: Surface Rendering
9:23
Image Processing: Mask Correction
12:54
Conidia Quantitative Analysis
13:41
Representative Results
14:07
Conclusions
