Name: Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Analiza ilościowa rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy rozmieszczenia konidiów Aspergillus fumigatus w optycznie oczyszczonych płucach myszy. Technika ta umożliwia badanie dystrybucji cząstek w drogach oddechowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Prof. Svenowi Krappmannowi (Szpital Uniwersytecki w Erlangen i FUA Erlangen-Nürnberg, Niemcy) za dostarczenie szczepu konidiów Aspergillus fumigatus AfS150. Autorzy dziękują Biuru Prasowemu MIPT. V.B. dziękuje Ministerstwu Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej (#075-00337-20-03, projekt FSMG-2020-0003). Prace nad obrazowaniem i kwantyfikacją konidiów A. fumigatus były wspierane przez RSF nr 19-75-00082. Prace dotyczące obrazowania dróg oddechowych były wspierane przez RFBR nr 20-04-60311.

Wszystkie opisane tutaj metody dotyczące zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Instytucie Chemii Bioorganicznej im. Szemiakina i Owczinnikowa Rosyjskiej Akademii Nauk (numer protokołu 226/2017).
1. Aplikacja konidiaów A. fumigatus
<ol>
	<li>Aby otrzymać znakowane fluorescencyjnie konidia A. fumigatus, utrwal 5 × 108 konidiów, dodając 1 ml 3% paraformaldehydu do granulki konidiów. Inkubować w probówce o pojemności 50 ml przez 2 godziny na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć konidia 20 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS): odwirować przy 1 000 x g przez 15 minut, delikatnie usunąć supernatant i dodać świeży PBS w objętości 20 ml. Powtórzyć.</li>
	<li>Rozpuścić konidia w 900 μl 0,1 M NaHCO3.</li>
	<li>Rozpuścić ester sukcynimidylowy barwnika fluorescencyjnego o długości fali 594 nm w 100 μl dimetylosulfotlenku i dodać do konidiów.</li>
	<li>Inkubować konidia z barwnikiem przez 1 godzinę na wytrząsarce z prędkością 150 obr./min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć konidia dwukrotnie 20 ml PBS w wirówce przy 1 000 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć konidia do stężenia 1 × 10-8 konidii/ml w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Znieczulij mysz 0,5-3% parą izofluranu. Połóż mysz na uchwycie, przymocuj język gładkimi kleszczami i przytrzymaj nozdrza. Weź pipetę jednokanałową i nałóż 50 μl zawiesiny konidiów na gardło myszy. Poczekać, aż zawiesina zostanie wdychana.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml i napełnij ją 15 ml świeżego 2% paraformaldehydu. Umieść narzędzia medyczne (15 cm kleszczy preparacyjne zębate, 8 cm kleszcze z cienką końcówką i 10 cm nożyczki z końcami) w 70% roztworze etanolu.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji zgodnie z protokołem IACUC. Następnie umieść mysz w pozycji grzbietowej i przymocuj łapki myszy za pomocą igieł. 
	UWAGA: W przypadku stosowania zwichnięcia szyjki macicy do eutanazji należy upewnić się, że tchawica jest integralna.
	<ol>
		<li>Potraktuj mysz 70% etanolem za pomocą opryskiwacza.</li>
		<li>Wykonaj środkowe podłużne cięcie w brzusznej skórze od tylnych łap do przednich łap i podbródka.</li>
		<li>Oddziel skórę od tkanki podskórnej za pomocą ząbkowanych kleszczy i zamkniętych nożyczek. Przymocuj górne końce skóry za pomocą igieł.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie w ścianie brzucha i oddziel wątrobę od przepony. Ostrożnie podnieś membranę zamkniętymi nożyczkami, a następnie przetnij membranę.</li>
		<li>Wykonaj przyśrodkowe cięcie tkanki łącznej klatki piersiowej i szyi, aż tchawica będzie widoczna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź jedwabną nić pod tchawicą i wykonaj węzeł chirurgiczny za pomocą dwóch kleszczy. 
	UWAGA: Alternatywnie użyj nici dentystycznej zamiast nici jedwabnej.
	<ol>
		<li>Ostrożnie pociągnij nić i odetnij nożyczkami płuca od tkanki łącznej. Trzymaj nożyczki prostopadle do stołu.</li>
		<li>Umieść płuca w probówce o pojemności 50 ml z 2% paraformaldehydem. Pozostaw końce nici na zewnątrz rurki, szczelnie załóż osłonę i odwróć rurkę, aby pokryć płuca paraformaldehydem. Utrzymać płuca przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj płaty płuc od serca i siebie nawzajem za pomocą skalpela.
	<ol>
		<li>Umieść płaty płuc w 24-dołkowej płytce, tak aby każdy płat znajdował się w osobnym dołku. Przemyć płaty płuc w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) o pH 7,4, 5 razy po 1 godzinę na wytrząsarce z prędkością 150 obr./min.</li>
		<li>Zastąp 1 ml TBS 1 ml buforu blokującego (1% Triton X 100, 5% mleka w proszku w TBS) i pozostaw próbkę na noc w temperaturze pokojowej na shakerze.</li>
		<li>Zastąp bufor blokujący 1 ml koniugatu fluorchromu streptawidyny-488 nm rozcieńczonego w stosunku 1:30 w TBS. Pozostaw próbkę na co najmniej 72 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce (150 obr./min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyć próbkę 5 razy przez 1 godzinę w 1 ml TBS w temperaturze pokojowej na wytrząsarce (150 obr./min). Przenieść próbkę do nowych studzienek i przykryć ją 2% paraformaldehydem przez noc w temperaturze 4 °C w celu późniejszego utrwalenia.</li>
</ol>
3. Optyczne oczyszczanie płata płuc myszy
<ol>
	<li>Umieścić próbkę w szklanej butelce o pojemności 5 ml wypełnionej 3 ml 50% roztworu metanolu i wody i umieścić ją w mieszalniku próbek w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.</li>
	<li>Zastąp 3 ml 50% metanolu 3 ml 100% metanolu i umieść w mieszalniku próbek na 2 godziny. Przygotuj mieszaninę alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (BABB) w proporcji 1:2 v/v w łącznej objętości 1 ml.</li>
	<li>Przenieść próbkę do płytki 24-dołkowej i zalać 1 ml mieszaniny BABB na co najmniej 30 minut. Nie zostawiaj próbki w BABB przez długi czas; BABB może uszkodzić plastikową płytkę i sprawić, że próbka będzie zbyt sztywna.</li>
	<li>Umieścić próbkę w komorze obrazowania komórkowego z dnem szklanym pokrywowym. Próbka jest gotowa do obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie płata płuc myszy za pomocą CLSM
<ol>
	<li>Włącz system mikroskopu. Otwórz oprogramowanie mikroskopu. Włącz lampkę transmisji na karcie Lokalizacja. Wybierz obiektyw 10x. 
	UWAGA: Aby uzyskać bardziej szczegółową analizę, użyj obiektywu 20x, ale wydłuża to czas eksperymentu i rozmiar pliku obrazu.</li>
	<li>Umieść komorę z próbką w uchwycie szkiełka pokrywy. Umieść uchwyt na stoliku XY nad obiektywem. Wyśrodkuj próbkę za pomocą elementów sterujących XY stolika na górze obiektywu. Użyj światła transmisyjnego i okularu, aby ręcznie znaleźć płaszczyznę Z próbki.</li>
	<li>Przełącz oprogramowanie na zakładkę Akwizycja. Wybierz tryb λ CLSM. Włącz lasery 488 nm i 561 nm. Wybierz lustro dichroiczne 488/561 nm. Zmień zakres widmowy detektora na 490-695 nm. Dostosuj moc lasera do odpowiedniego zakresu (10-50 μW). Dostosuj wzmocnienie detektora w zakresie 750-900. 
	UWAGA: Wyższe ustawienia wzmocnienia są niepożądane ze względu na szumy.</li>
	<li>Zawęź otwór do 1 jednostki Airy, klikając przycisk 1 AU. Ustaw rozdzielczość pikseli na 512 × 512 pikseli.</li>
	<li>Włącz tryb Z-stack. Rozpocznij obrazowanie na żywo. Wybierz płaszczyznę ogniskowej, w której widoczne są oba barwniki. 
	UWAGA: W razie potrzeby wyreguluj moc lasera, aby znormalizować jasność dwóch barwników fluorescencyjnych. Użyj trybu Galeria i Jednokanałowy, aby uniknąć przycinania i precyzyjnie dopasować intensywność fluorescencji.</li>
	<li>Rozwiń wyświetlony panel stosu Z. Użyj pokrętła ostrości i znajdź najniższą płaszczyznę próbki. Użyj pierwszego przycisku w okienku Z-stack. Przesuń płaszczyznę ogniskowej w górę, aby znaleźć górną granicę próbki i zapisać pozycję za pomocą przycisku Ostatni. Sprawdź reprezentację głębokości próbki w panelu Z-stack. 
	UWAGA: Reprezentacja głębokości próbki pojawi się w panelu Z-stack po wybraniu pierwszej i ostatniej pozycji.</li>
	<li>Ustaw obiektyw za pomocą pokrętła ostrości w pobliżu dolnej części preparatu, patrząc na panel Z-stack. Jest to około 20 μm od dna próbki.</li>
	<li>Wyłącz tryb Z-stack i włącz tryb Tile Scan (Skanowanie kafelków). Zdobądź obraz z odpowiednią liczbą płytek do wielkości próbki. 5 × 5 płytek to dobry punkt wyjścia.</li>
	<li>Dostosuj liczbę kafelków i pozycję XY próbki, aż całe płuco zmieści się w obrazie wyłożonym kafelkami. Ponownie sprawdź poprawność pozycji stosu Z z nowo uzyskaną pozycją XY środka próbki.</li>
	<li>Włącz zarówno tryby Z-stack, jak i Tile Scan. Ustaw krok Z (w panelu stosu Z) na 5 μm. Ustaw szybkość skanowania na 6. Włącz funkcję automatycznego zapisywania. Włącz opcję Zapisywanie oddzielnych kafelków. Nazwij plik. Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment.</li>
	<li>Sprawdź, czy eksperyment nie przekracza czasu wyznaczonego na mikroskopie; jeśli tak - dostosuj prędkość. 
	UWAGA: Przybliżony rozmiar pliku to ponad 10 GB; Upewnij się, że na dysku twardym jest wystarczająca ilość miejsca.</li>
</ol>
5. Widmowe mieszanie i zszywanie
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania do wstępnego przetwarzania obrazu. Aby uzyskać rozmieszanie spektralne, wybierz opcję Unmixing. Wybierz dwa regiony odpowiadające streptawidynie/drogom oddechowym i konidiom, aby uzyskać widma z obrazu. Kliknij Rozpocznij rozmieszanie. 
	UWAGA: Alternatywnie można użyć istniejących widm dla fluorochromów 488 i 594 nm.</li>
	<li>Otwórz plik do przetwarzania obrazu i wybierz kartę Przetwarzanie. W sekcji Metody wybierz opcję Geometryczne i Zszywanie. W sekcji Parametr wybierz Nowe wyjście i zaznacz opcję Kafelki bezpiecznika. Użyj trybu referencyjnego z wybranym kanałem odpowiadającym fluorescencji dróg oddechowych. Zastosuj zszywanie, klikając przycisk Zastosuj.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazu: renderowanie powierzchni
<ol>
	<li>Otwórz obraz jako widok Surpass 3D. Utwórz powierzchnię dróg oddechowych, korzystając z opcji Powierzchnia dla kanału, który został użyty do wizualizacji dróg oddechowych. Wybierz parametr Wygładzanie 10 μm. 
	UWAGA: Wybierz również automatyczną wartość progową.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo powierzchnię. Wybierz progi, aby zredukować sygnał odstający. Usuń powierzchnie opłucnej i naczyń.</li>
	<li>Utwórz maskę dla powierzchni dróg oddechowych, korzystając z opcji Edytuj i Zamaskuj wszystko. Wybierz kanał dróg oddechowych i ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na 0,001.</li>
	<li>Zapisz plik z maską dróg oddechowych jako serię TIFF w folderze. Zapisz plik z kanałem conidia jako serię TIFF w osobnym folderze.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie obrazu: korekta maski
<ol>
	<li>Otwórz plik z maską dróg oddechowych na platformie open source do analizy obrazu biologicznego17 jako obraz 8-bitowy. Utwórz obraz w formacie binarnym, klikając przycisk Proces | Binarny | Utwórz plik binarny. 
	UWAGA: W razie potrzeby popraw maskę: usuń nadmiarowe powierzchnie za pomocą zakładki Wybór wielokąta i Usuń. Alternatywnie można użyć narzędzia Flood Fill Tool (Wypełnianie powodziowe).</li>
	<li>Narysuj brakujące powierzchnie, kilkakrotnie rozszerzając (3D): kliknij Wtyczki | Proces | Rozszerzanie (3D). Wypełnij otwory, klikając przycisk Process | Binarny | Wypełnianie otworów. Użyj interpolacji wyboru i menedżera ROI, aby ręcznie wypełnić pozostałe otwory w masce. Zastosuj kilka opcji erozji (3D) (Wtyczki | Proces | Erodowanie (3D)), aby ponownie próbkować grubość maski. 
	UWAGA: Tworzenie makr za pomocą wtyczek | Opcje makr dla wielu powtórzeń rozszerzania (3D) i erozji (3D). 
	Upewnij się, że liczba aplikacji Erode (3D) jest równa liczbie aplikacji Dilate (3D).</li>
	<li>Zapisz maskę w nowym folderze jako serię TIFF.</li>
</ol>
8. Analiza ilościowa konidiów
<ol>
	<li>Otwórz aplikację na platformie programowania i obliczeń numerycznych: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Dodaj pliki. Wybierz folder maski dróg oddechowych i folder konidia.</li>
	<li>Ustaw niestandardowy próg z zakresu od 0 do 1. Naciśnij przycisk OK.</li>
	<li>Zapisz tabelę wyjściową w niestandardowym pliku .xls</li>.
	<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>O'Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+Aspergillus+fumigatus+conidia%3A+A+risk+factor+for+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis.</a> Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).</li>
<li>Hyde, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma%3A+A+comparison+of+animal+models+using+stereological+methods%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Review%22%5BJournal%5D)">Asthma: A comparison of animal models using stereological methods.</a> European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).</li>
<li>Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+nested+developmental+waves+demarcate+a+compartment+boundary+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+drug-aerosol+delivery+in+the+human+respiratory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).</li>
<li>Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cilia and mucociliary clearance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).</li>
<li>Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+assessment+of+inhaled+nanoparticles%3A+Role+of+in+vivo%2C+ex+vivo%2C+in+vitro%2C+and+in+Silico+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).</li>
<li>Patel, V. I., Metcalf, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+macrophage+and+dendritic+cell+subsets+in+the+resting+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung.</a> Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).</li>
<li>Bogorodskiy, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+intraepithelial+dendritic+cells+interact+with+phagocytic+cells+during+Aspergillus+fumigatus-Induced+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, (2020).</li>
<li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus-what+makes+the+species+a+ubiquitous+fuman+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen.</a> PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).</li>
<li>Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenetics+of+chronic+and+allergic+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics+of+Fungal+Diseases%22%5BJournal%5D)">Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis.</a> Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).</li>
<li>Thiesse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+structure+phenotype+variation+in+inbred+mouse+strains+revealed+through+in+vivo+micro-CT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging.</a> Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).</li>
<li>Tochigi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+implications+of+Aspergillus+infection+in+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Histopathological implications of Aspergillus infection in lung.</a> Mediators of Inflammation. 2013, (2013).</li>
<li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+extracellular+traps+against+aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+rodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).</li>
<li>Shevchenko, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+infection-induced+neutrophil+recruitment+and+location+in+the+conducting+airway+of+immunocompetent%2C+neutropenic%2C+and+immunosuppressed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice.</a> Journal of Immunology Research. 2018, 5379085(2018).</li>
<li>Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+optical+clearing%2C+three-dimensional+imaging%2C+and+computer+morphometry+in+whole+mouse+lungs+and+human+airways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).</li>
<li>Amich, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+light+sheet+fluorescence+microscopy+of+lungs+to+dissect+local+host+immune-aspergillus+fumigatus+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions.</a> mBio. 11 (1), (2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+cell-level+analysis+of+tissues+with+Ce3D+multiplex+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).</li>
<li>Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> J Vis Exp. (89), e51382(2014).</li>
<li>Kuhn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin+stores+in+rodent+lungs%3A+Localization+to+Clara+and+type+II+alveolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells.</a> Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów w tej pracy.

Obrazowanie 3D całego narządu pozwala na uzyskanie danych bez preparacji próbki, co ma ogromne znaczenie dla badania przestrzennych aspektów anatomicznego rozmieszczenia patogenu w organizmie. Istnieje kilka technik i modyfikacji optycznego oczyszczania tkanek, które pomagają przezwyciężyć rozpraszanie światła laserowego i umożliwiają obrazowanie całego narządu 15,16,18,19. Jedno z niestandardo...

Codziennie ludzie wdychają patogeny unoszące się w powietrzu, w tym zarodniki oportunistycznych grzybów Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), które mogą przenikać do dróg oddechowych1. Drogi oddechowe ssaków to system dróg oddechowych różnych pokoleń, które charakteryzują się odmienną budową ścian dróg oddechowych2,3,4. Ściany tchawicy i oskrzeli składają się z kilku typów komórek, wśród których znajdują się komórki rzęskowe, które zapewniają klirens śluzowo-rzęskowy5. W pęcherzykach płucnych nie ma komórek rzęskowych, a patogeny penetrujące przestrzeń pęcherzykową nie mogą zostać wyeliminowane przez klirens śluzowo-rzęskowy6. Co więcej, każde pokolenie dróg oddechowych jest niszą dla wielu populacji komórek odpornościowych, a podzbiory tych populacji są unikalne dla niektórych przedziałów dróg oddechowych. Tak więc makrofagi pęcherzykowe znajdują się w przedziałach pęcherzykowych, podczas gdy zarówno tchawica, jak i przewodzące drogi oddechowe są wyłożone śródnabłonkowymi komórkami dendrytycznymi7,8.
Przybliżony rozmiar konidiów A. fumigatus to 2-3,5 μm9. Ponieważ średnica małych dróg oddechowych u ludzi, a nawet u myszy, przekracza 3,5 μm, zasugerowano, że konidia mogą przenikać przez przestrzeń pęcherzykową2,10,11. W rzeczywistości badanie histologiczne wykazało wzrost grzybów w pęcherzykach płucnych u pacjentów cierpiących na aspergilozę12. Konidia wykryto również w pęcherzykach płucnych zakażonych myszy za pomocą obrazowania na żywo grubych plastrów płuc13. Jednocześnie wykryto konidia po stronie światła nabłonka oskrzeli u myszy14.
Trójwymiarowe (3D) obrazowanie optycznie oczyszczonych płuc myszy pozwala na analizę morfometryczną dróg oddechowych15. W szczególności przeprowadzono analizę ilościową rozmieszczenia nerwów opłucnowych trzewnych przy użyciu optycznie oczyszczonych próbek płuc myszy15. Niedawno, Amich i wsp.16 badali wzrost grzybów po donosowym podaniu konidiów myszom z obniżoną odpornością, używając mikroskopii fluorescencyjnej z lekkim arkuszem optycznie oczyszczonych próbek płuc myszy. Dokładna lokalizacja spoczynkowych konidiów w drogach oddechowych w różnych punktach czasowych po infekcji jest ważna dla identyfikacji populacji komórek, które mogą zapewnić wystarczającą obronę przeciwgrzybiczą w określonych fazach zapalenia. Jednak ze względu na stosunkowo niewielkie rozmiary, czasoprzestrzenne aspekty rozmieszczenia konidiów A. fumigatus w drogach oddechowych są słabo scharakteryzowane.
Tutaj prezentujemy eksperymentalny zestaw do analizy ilościowej rozmieszczenia A. fumigatus conidia w drogach oddechowych zakażonych myszy. Za pomocą fluorescencyjnej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) optycznie oczyszczonych płuc myszy, którym podano do jamy ustnej i gardła znakowaną fluorescencyjnie A. fumigatus conidia, uzyskujemy obrazy 3D i przeprowadzamy przetwarzanie obrazu. Korzystając z obrazowania 3D całego płata płuca, wcześniej pokazaliśmy rozmieszczenie konidiów A. fumigatus w przewodzących drogach oddechowych myszy 72 godziny po aplikacji konidiów8.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 NHS Ester</td><td>ThermoFisher</td><td>A20004</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus konidia</td><td>ATCC</td><td>46645</td><td>Szczep AfS150, pochodna ATCC 46645</td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Panreac</td><td>141081.1611</td><td>98,0-100 %</td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Acros</td><td>AC10586-0010</td><td>99+%</td></tr><tr><td>C57Bl/6 myszy</td><td>Pushchino Animal Centrum Hodowlane (Rosja)</td><td></td><td>Samiec. 12 - 30 tygodni.</td></tr><tr><td>Cewnik</td><td>Venisystems</td><td>G715-A01</td><td>18G</td></tr><tr><td>Obrazowanie komórek komora ze szklanym dnem</td><td>Eppendorf</td><td>30742028</td><td>4 lub 8-dołkowa komora ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Można użyć dowolnej wirówki 1000 g</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>ZEISS</td><td>ZEISS LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>&ge; 99,9%</td></tr><tr><td>Pakiet do przetwarzania obrazu FIDŻI</td><td>Darmowe oprogramowanie</td><td>FIJI</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>B. Braun Aesculap</td><td>BD557R</td><td>Kleszcz zębaty</td></tr><tr><td></td><td>B. Braun Aesculap</td><td>BD321R</td><td>Kleszcz z cienką końcówką</td></tr><tr><td></td><td>Bochem</td><td>1727</td><td>Gładki</td></tr><tr><td>Butelka szklana</td><td>DURAN</td><td>242101304</td><td>Z mieloną pokrywką</td></tr><tr><td>Edytor graficzny Photoshop</td><td>Adobe Inc</td><td></td><td>Adobe Photoshop CS</td></tr><tr><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Prism 8</td></tr><tr><td>Imaris Microscopy Imaging Software</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Dostępna jest bezpłatna wersja próbna https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Karizoo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Panreac</td><td>141638</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>ZEISS</td><td>420640-9800-000</td><td>&nbsp; Plan-apochromatyczny, 10 i razy; (NA = 0,3)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Paneco</td><td>P060&Pi;</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>ProLine</td><td>722020</td><td>od 5 do 50 sztuk L</td></tr><tr><td>Mleko w proszku</td><td>Roth</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik próbek</td><td>Dynal</td><td>MXIC1</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>B. Braun</td><td>BC257R</td><td>Blunt</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Apexlab</td><td>GS-20</td><td>50-300 obr./min</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Bochem</td><td>12646</td><td></td></tr><tr><td>Nić jedwabna</td><td>B. Braun</td><td></td><td>3 USP</td></tr><tr><td>Streptawidyna, Alexa Fluor 488 koniugat</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Probówka</td><td>SPL Lifesciences</td><td>50050</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Tris (hydroksymetyloaminometan)</td><td>Helikon</td><td>H-1702-0,5</td><td>&nbsp; Pan 121.14; Numer CAS: 77-86-1</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Amresco Am-O694-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopu</td><td>ZEN ZEISS</td><td>ZEN2012 SP5</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html</td></tr></tbody></table>

konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa analiza ilościowa rozmieszczenia konidów aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia to patogeny przenoszone drogą powietrzną, które mogą przenikać do ludzkich dróg oddechowych. Osoby immunokompetentne bez alergii wykazują odporność i tolerancję immunologiczną, natomiast u pacjentów z obniżoną odpornością konidia mogą kolonizować drogi oddechowe i powodować ciężkie inwazyjne choroby układu oddechowego. Różne komórki w różnych przedziałach dróg oddechowych biorą udział w odpowiedzi immunologicznej, która zapobiega inwazji grzybów; Jednak czasoprzestrzenne aspekty eliminacji patogenów nadal nie są w pełni zrozumiałe. Trójwymiarowe (3D) obrazowanie optycznie oczyszczonych całych narządów, w szczególności płuc myszy eksperymentalnych, umożliwia wykrywanie fluorescencyjnie znakowanych patogenów w drogach oddechowych w różnych punktach czasowych po zakażeniu. W niniejszym badaniu opisano układ eksperymentalny do przeprowadzenia analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów A. fumigatus w drogach oddechowych. Za pomocą fluorescencyjnej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) prześledziliśmy lokalizację fluorescencyjnie znakowanych konidiów w gałęziach oskrzeli i przedziale pęcherzykowym 6 godzin po zastosowaniu jamy ustnej i gardła myszom. Opisane tutaj podejście było wcześniej stosowane do wykrywania dokładnej lokalizacji patogenu i identyfikacji komórek oddziałujących z patogenem w różnych fazach odpowiedzi immunologicznej. Układ doświadczalny można wykorzystać do oszacowania kinetyki eliminacji patogenu w różnych warunkach patologicznych.

Zgodnie z powyższym protokołem uzyskano obraz 3D przedstawiający drogi oddechowe i konidia A. fumigatus w płacie płuca myszy (Rycina 1A). Streptawidyna (użyta do wizualizacji dróg oddechowych) oznakowała oskrzela i oskrzeliki15. Dodatkowo w kanale dróg oddechowych widoczne są duże naczynia, które można łatwo odróżnić od dróg oddechowych po ich morfologii, oraz opłucna (Rycina 1A-C). Utworzenie powierzchni i maski...

Opisujemy metodę analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów Aspergillus fumigatus (o wielkości 3 μm) w drogach oddechowych myszy. Metoda może być również stosowana do analizy rozkładu mikrocząstek i aglomeratów nanocząstek w drogach oddechowych w różnych modelach stanów patologicznych.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Analiza ilościowa rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

Nasze podejście pozwala nam przeprowadzić analizę ilościową rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całym optycznie oczyszczonym płucu myszy. Aspergillus fumigatus Conidia może przenikać do dróg oddechowych i powodować choroby zagrażające życiu u pacjentów z obniżoną odpornością. Drogi oddechowe ssaków to układ dróg oddechowych różnych pokoleń.Każde pokolenie charakteryzuje się inną strukturą ścian dróg oddechowych i populacjami komórek odpornościowych. W gałęziach oskrzeli Aspergillus fumigatus Conidia są eliminowane przez klirens śluzowo-rzęskowy. Jednak w dostępnej przestrzeni klirens śluzowo-rzęskowy nie działa i konidia muszą zostać usunięte przez komórki odpornościowe, takie jak makrofagi pęcherzykowe i neutrofile.Podobnie jak przestrzenne, czasowe aspekty rozmieszczenia konidiów w drogach oddechowych są ważne. Jednak nie jest to właściwie zbadane pytanie w zrozumieniu mechanizmów choroby. W tym miejscu przedstawiamy zestaw eksperymentalny do analizy ilościowej rozmieszczenia Aspergillus fumigatus Conidia w drogach oddechowych zakażonych myszy.Na mysz nakładam 50 mikrolitrów oznakowanego Aspergillus fumigatus Conidia. Sześć godzin później zbierz płuca. Utrwalić przez noc w 2% formaldehydzie i zabarwić znakowanym koniugatem streptawidyny.Następnie poddaj próbkę czyszczeniu optycznemu. Umieścić próbkę w szklanej butelce wypełnionej 50% roztworem metanolu i umieścić ją w mieszalniku próbek w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Zamień 50% metanol na 100% metanol i umieść go pod mieszalnikiem próbek na dwie godziny.Przygotować mieszaninę składającą się z jednej części alkoholu benzylowego i dwóch części benzoesanu benzylu. Przenieść próbkę na płytkę 24-dołkową i przykryć ją mieszaniną benzoesanu benzylu na co najmniej 30 minut. Próbka jest gotowa do obrazowania.Umieścić próbkę na uchwycie próbki. I umieść uchwyt w mikroskopie. Po włączeniu systemu mikroskopowego i otwarciu oprogramowania, włącz lampę transmisyjną i wybierz obiektyw X.Wizualnie zlokalizuj próbkę w świetle transmisyjnym i przejdź do zakładki akwizycji. Wybierz tryb konfokalnej mikroskopii laserowej Lambda. Włącz odpowiednie lasery.Ustaw zakres widmowy detektora i wybierz zwierciadło dichroiczne. Dostosuj wzmocnienie detektora i zawęź otwór do jednej jednostki obszaru. Ustaw rozdzielczość pikseli na 512 na 512.Włącz tryb zed-stack i rozpocznij obrazowanie na żywo. Znajdź płaszczyznę ogniskową, w której widoczne są obie kostki. Rozwiń panel zed-stack.Za pomocą pokrętła ostrości znajdź i wybierz najniższą i najwyższą płaszczyznę próbki. Umieść płaszczyznę ogniskową obok dolnej części próbki. Wyłącz tryb zed-stack i włącz tryb skanowania za pomocą wybierania.W razie potrzeby dostosuj położenie X, Y i liczbę płytek. Włącz tryby zed-stack i dial scan. Ustaw krok przekroju zed na pięć mikronów.Ustaw szybkość skanowania. Rozpocznij eksperyment. Obrazowanie trwa zazwyczaj kilka godzin, w zależności od wielkości terenu i prędkości skanowania.Uzyskany obraz jest następnie spektralnie niezmieszany. Do rozmieszania spektralnego użyj opcji rozmieszania liniowego. Wybierz regiony odpowiadające obszarom lądowym oznaczonym streptawidyną i konidią.Zacznij rozmieszawać. Po rozmieszaniu zapisz niewymieszany plik. Aby zszyć kafelki z uzyskanego obrazu, otwórz obraz.Wybierz metody, ściegi geometryczne. Zaznacz obraz w oknie wprowadzania. W opcjach łączenia wybierz opcję nowe płytki wyjściowe i bezpiecznikowe.Użyj trybu referencyjnego z wybranym kanałem odpowiadającym fluorescencji dróg oddechowych. Otwórz obraz w nadmiarowym widoku 3D. W razie potrzeby zmień kolory używane w ich prezentacji.Tutaj pokazujemy kanał oddechowy w odcieniach szarości i kanał Conidia w kolorze fioletowym. Aby utworzyć maskę dróg oddechowych, użyj narzędzia Dodaj nową powierzchnię. Wybierz kanał dróg oddechowych i wybierz parametr wygładzania 10 mikronów.Do wykluczenia sygnału z dróg oddechowych można użyć różnych filtrów. Najpierw sprawdź wzrokowo powierzchnię i ustaw próg intensywności. Dodatkowe filtry, takie jak powierzchnia, mogą być również stosowane wyłącznie do wybranych dróg oddechowych, ale nie do opłucnej lub naczyń krwionośnych.Następnie należy ręcznie usunąć wybrany fragment powierzchni, który nie należy do dróg oddechowych. Teraz możesz obserwować utworzoną powierzchnię i badać brakujące części, aby je później poprawić. Utwórz maskę dla powierzchni dróg oddechowych, korzystając z opcji edycji i maskowania wszystkiego.Wybierz kanał dróg oddechowych i ustaw komórki robocze na zewnątrz powierzchni na wartość 0,001. Tutaj pokazaliśmy powstałą maskę w kolorze pomarańczowym. Zapisz kanał Conidia i maskę dróg oddechowych w dwóch oddzielnych folderach, jako seria T lub F.Otwórz plik z obrazem maski dróg oddechowych. Ustaw obraz jako binarny. Postępuj zgodnie z binarnym procesem, utwórz binarny.Aby upodobnić grubość maski, zastosuj kilka funkcji rozszerzania 3D. Podążaj za wtyczkami, przetwarzaj, rozszerzaj 3D. W tym celu można również użyć funkcji makr.Po kilku cyklach procesu rozszerzania użyj funkcji wypełniania otworów. Postępuj zgodnie z procesem, binarnym, wypełnij otwory. Aby ręcznie wypełnić pozostałe otwory w masce, otwórz menedżera obszaru zainteresowania.postępuj zgodnie z analizą, narzędziami, menedżerem ROI. Za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów wybierz obszar, który ma zostać wypełniony w jednym konkretnym rzucie. Zrób to kilka razy dla kilku projekcji w zed-stack, aby móc interpolować kształty interesujących regionów.Aby interpolować wybrane kształty, zaznacz je wszystkie i naciśnij więcej, aby interpolować ROI. Następnie wypełnij wszystkie ROI kolorem białym. Ponownie skorzystaj z procedury wypełniania otworów.Aby ponownie złożyć grubość maski po wypełnieniu otworów, zastosuj funkcję erodowania 3D. Podążaj za wtyczkami, przetwarzaj, eroduj 3D. Możesz również użyć do tego mikrosów.Liczba iteracji w erodach 3D i LA 3D powinna być równa. Uruchom aplikację do liczenia konidia. Naciśnij przycisk dodaj pliki i wybierz foldery z plikami DIFF z przygotowaną maską dróg oddechowych i obrazami fluorescencji Conidia.Ustaw niestandardowy próg z zakresu od zera do jednego. Naciśnij OK i zobacz wyniki. Stosując to podejście, przeprowadzamy analizę ilościową konidiów wewnątrz i na zewnątrz drzewa oskrzelowego myszy sześć godzin po zastosowaniu konidiów.Dane sugerują, że po naszym pierwotnym zastosowaniu większość konidiów przenika do przestrzeni pęcherzyków płucnych i przydziela się tam na początku zapalnej odpowiedzi immunologicznej. Trójwymiarowe obrazowanie płuc myszy za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej umożliwia identyfikację Aspergillus fumigatus Conidia w drogach oddechowych. Przetwarzanie obrazów trójwymiarowych z wykorzystaniem tego protokołu pozwala na przeprowadzenie analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów wewnątrz i na zewnątrz gałęzi oskrzeli.Nasze podejście można również wykorzystać do oszacowania kinetyki eliminacji konidiów z dala od myszy oraz do porównania anatomicznego rozkładu konidiów u myszy immunokompetentnych i z obniżoną odpornością. Dodatkowo, korzystając z tego podejścia, można przeanalizować rozmieszczenie mikrocząstek lub nanocząstek aglomeratów w drogach oddechowych.

confocal-laser-scanning-microscopy-based-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy sposób wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do obserwacji dynamiki granulocytów neutrofilnych w zainfekowanych płucach podczas fagocytowania patogenów lub wytwarzania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs).

Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Ta technika opisuje efektywny proces przesiewowy do oceny specyficznych dla bakterii środków obrazowania optycznego w tkance płuc ex vivo ludzkiej, za pomocą światłowodowej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w celu szybkiej identyfikacji kandydatów na sondy chemiczne o małym potencjale translacyjnym.

Optyczne badania przesiewowe nowych sond specyficznych dla bakterii na ludzkiej tkance płucnej ex vivo za pomocą konfokalnej endomikroskopii laserowej

Tutaj opisujemy protokół do określania obciążenia grzybami płuc u myszy z inwazyjną aspergilozą poprzez ilościowe zabarwienie srebrem zmodyfikowanej metanaminy Gomoriego w przekrojach histologicznych. Zastosowanie tej metody przyniosło porównywalne wyniki przy mniejszej liczbie zwierząt w porównaniu z oceną obciążenia grzybami za pomocą ilościowej reakcji PCR DNA grzyba płuc.

Kwantyfikacja histologiczna w celu określenia obciążenia grzybicą płuc w eksperymentalnej aspergilozie

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Prezentujemy protokół obrazowania na żywo bez znaczników, wykorzystujący techniki mikroskopii światła przechodzącego do przechwytywania obrazów, analizy i ilościowego określania kinetyki wzrostu nitkowatego grzyba A. nidulans zarówno w kulturach zanurzonych, jak i w podłożach stałych. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną.

Analiza ilościowa tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source

Prezentujemy metodę modelu patogenezy grzybów, która zachowuje naturalne położenie zarodników grzybów w drogach oddechowych płuc do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych

Poznaj metodę ilościowej analizy rozmieszczenia konidiów Aspergillus fumigatus w optycznie oczyszczonych płucach myszy. Technika ta umożliwia badanie dystrybucji cząstek w drogach oddechowych.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Analiza ilościowa rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy (Wideo) | JoVE Journal

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Analiza ilościowa rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy

Przeglądaj więcej filmów