Kwantyfikacja gęstości komórkowych i właściwości antygenowych za pomocą lewitacji magnetycznej
17 maja 2021
Ten artykuł opisuje metodę opartą na lewitacji magnetycznej, która może specyficznie wykrywać obecność antygenów, zarówno rozpuszczalnych, jak i związanych z błoną, poprzez ilościowe określanie zmian wysokości lewitacji koralików wychwytujących o stałej gęstości.
Technika ta pozwala na separację różnych typów komórek i komórek poddawanych różnym procesom wyłącznie w oparciu o gęstość, przy niewielkiej lub zerowej manipulacji w krótkim czasie. Głównymi zaletami tej metody jest to, że jest mało inwazyjna, wymaga małych objętości, zapewnia szybkie rezultaty, nie zależy od klasycznych odczytów i nie jest wymagany wyspecjalizowany personel. Technika ta może być stosowana do wykrywania wielu chorób, na przykład niedokrwistości i sepsy.
Aby rozpocząć, użyj nakłuwacza jednym kliknięciem, aby nakłuć palec dawcy krwi z dodatnim czynnikiem Rh i pobrać 10 mikrolitrów krwi w jednym mililitrze DPBS. Dodaj jeden mikrolitr barwnika fluorescencyjnego w jednym mililitrowym zawiesinie komórek dodatnich czynnika Rh do fluorescencyjnie wybarwionej błony plazmatycznej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Osadzaj komórki, wirując z prędkością 5 600 razy G przez 15 sekund i umyj granulkę trzy razy za pomocą jednego mililitra DPBS.
Zawiesić osad w jednym mililitrze HBSS z wapniem i magnezem. Za pomocą nakłuwacza jednym kliknięciem nakłuj palec dawcy krwi z ujemnym czynnikiem Rh i pobierz dwa mikrolitry krwi. Aby przygotować probówkę eksperymentalną zawierającą tylko kulki, dodaj 174 mikrolitry HBSS z wapniem i magnezem, jeden mikrolitr kulek kontrolnych IgG, jeden mikrolitr ciężkich kulek o gęstości 1,2 grama na mililitr i 24 mikrolitry 500 milimolowego gadolinu.
Aby przygotować eksperymentalną probówkę kontrolną zawierającą IgG, dodaj 172 mikrolitry HBSS z wapniem i magnezem, jeden mikrolitr kulek kontrolnych IgG, jeden mikrolitr ciężkich kulek, jeden mikrolitr krwi ujemnej względem czynnika rezus, jeden mikrolitr barwionej zawiesiny krwi dodatniej pod względem czynnika Rh i 24 mikrolitry 500 milimolowego gadolinu. Aby przygotować probówkę eksperymentalną próbki, dodaj 172 mikrolitry HBSS z wapniem i magnezem, jeden mikrolitr kulek powlekanych anty-RhD, jeden mikrolitr ciężkich kulek, jeden mikrolitr krwi ujemnej względem czynnika Rh, jeden mikrolitr barwionej zawiesiny krwi dodatniej pod względem czynnika Rh i 24 mikrolitry 500 milimolowego gadolinu. Skonfiguruj urządzenie lewitacji magnetycznej.
I załaduj 50 mikrolitrów próbki do rurki kapilarnej, aż probówka zostanie napełniona. Uszczelnij końce rurki kapilarnej szczeliwem kapilarnym, upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Umieść rurkę kapilarną w uchwycie kapilary między górnym i dolnym magnesem, wyreguluj stage i skup się, aby uzyskać optymalne viewing.
Odczekaj około pięciu do 20 minut, aż komórki i kulki osiądą w pozycji równowagi magnetycznej. Korzystając z tego protokołu, komórki krwi zostały oddzielone w zależności od wysokości lewitacji za pomocą urządzenia do lewitacji magnetycznej. Koraliki o niskiej i wysokiej gęstości zostały użyte do zapewnienia wysokości lewitacji gęstości i odniesienia rozmiaru.
Komórki wielojądrzaste lewitowały nad czerwonymi krwinkami przy stężeniu 21 milimolowych jonów gadolinu. Stare krwinki lewitowały przy stężeniu jonów gadolinu 60 milimolowym. Czerwone krwinki, komórki wielojądrzaste i limfocyty oddzielono przy 40-milimolowym stężeniu jonów gadolinu w oparciu o ich wewnętrzną gęstość.
Antygen czynnika Rh wykryto na krwinkach czerwonych za pomocą kulek pokrytych przeciwciałami IgG i anty-RhD. Kompleksy krwinek czerwonych nie zostały wygenerowane w próbce kontrolnej IgG, ale wykryto fluorescencyjnie zabarwione krwinki czerwone wychwycone przez kulki dodatnie czynnika Rh. Wiązanie anty-RhB z komórkami dodatnimi czynnika Rh utworzyło kompleks komórek koralików w środku przy przerywanej gęstości niezwiązanych kulek i ujemnych czerwonych krwinek.
Co więcej, tworzenie się kompleksu zostało potwierdzone obserwacją emitowanej fluorescencji. Kompleksy kulek B utworzone między kulkami o wysokiej i niskiej gęstości pokrytymi przeciwciałami dla CR1 i CD47 wskazują na obecność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z czerwonych krwinek. Zamknięcie kapilary bez wprowadzania pęcherzyków jest najtrudniejszym krokiem i wymaga praktyki.
Metoda ta może dostarczyć informacji dla hematologii, szczególnie skoncentrowanej na chorobach czerwonych krwinek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia technikę opartą na lewitacji magnetycznej do specyficznego wykrywania antygenów we krwi, koncentrując się na ich właściwościach gęstościowych. Metoda wykazuje efektywność w separacji różnych typów komórek i identyfikacji czynnika Rh w czerwonych krwinkach przy minimalnej inwazyjności i krótkim czasie realizacji.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Techniki diagnostyczne w hematologii
- Separacja typów komórek na podstawie ich właściwości fizycznych
- Wykrywanie antygenów krwi do identyfikacji chorób
Tło
- Znaczenie gęstości komórek we krwi dla analizy
- Wyzwania w tradycyjnej obróbce próbek krwi
- Zastosowania w wykrywaniu stanów takich jak niedokrwistość i sepsa
Stosowane metody
- Lewitacja magnetyczna do wykrywania antygenów
- Próbki krwi od darczyńców z pozytywnym i negatywnym czynnikiem Rh
- Barwienie fluorescencyjne i testy oparte na kulkach
Główne wyniki
- Udana separacja krwinek na podstawie ich gęstości za pomocą lewitacji magnetycznej
- Wykrywanie antygenów czynnika Rh poprzez kompleksy kulek
- Wyraźna różnica między polimorfonuklearnymi, limfocytami i czerwonymi krwinkami
Wnioski
- Metoda poprawia zdolność analizy próbek krwi przy zmniejszonym nacisku
- Dostarcza nową drogę badań w dziedzinie stanów hematologicznych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Magnetic levitation enables rapid, label-free separation of cells based on intrinsic density, supporting early discovery workflows where target validation and phenotypic screening require minimal manipulation. The method provides quantitative readouts of antigen presence through bead-bead complex formation, offering a scalable approach for assay development in hematology-focused discovery programs. Its compatibility with standard imaging reduces dependency on specialized instrumentation, enhancing accessibility for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by separating cell subtypes based on density-linked metabolic and activation states.
- Operational Value: Supports functional target validation with minimal sample processing, reducing variability from manipulation steps.
- Predictive Value: Facilitates biomarker-aligned stratification of cell populations for de-risking target engagement hypotheses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative antigen measurements via bead-bead complex levitation height, enabling dose-response analysis.
- Reproducibility: Provides standardized separation based on physical properties, minimizing batch-to-batch variability in cell-based assays.
- Platform Scalability: Compatible with smartphone or tablet imaging, supporting decentralized screening and point-of-need applications.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to hematological disease models, including anemia and sickle cell disease, through density-based cell separation.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving native cell states during separation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of circulating tumor cells and extracellular vesicles, supporting go/no-go decisions in oncology pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay-ready systems for downstream screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating cell subpopulations with distinct density profiles linked to differentiation status.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts for compound effect evaluation without reliance on fluorescent or enzymatic reporters.
- Analytics: Provides levitation height as a measurable output for comparing conditions and assessing target modulation.
- Translational Research: Maintains phenotypic integrity of separated cells, supporting continuity into functional validation assays.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable separation platform applicable across multiple target classes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in cell-based assays through label-free separation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput via standardized magnetic equilibrium positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent dependency and specialized training needs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through early detection of rare cell populations and antigen levels.
Implementation Considerations
- Requires expertise in magnetic levitation setup and capillary handling to avoid bubble formation.
- Depends on access to tunable magnetic fields and density-calibrated bead systems.
- Necessitates standardization of bead-antigen coupling protocols for reproducible quantitative outputs.
- Adaptation to non-hematological systems may require optimization of bead density and magnetic parameters.
- Practical limitations include sensitivity to capillary sealing quality and equilibration time variability.
