Kwantyfikacja gęstości komórkowych i właściwości antygenowych za pomocą lewitacji magnetycznej

Technika ta pozwala na separację różnych typów komórek i komórek poddawanych różnym procesom wyłącznie w oparciu o gęstość, przy niewielkiej lub zerowej manipulacji w krótkim czasie. Głównymi zaletami tej metody jest to, że jest mało inwazyjna, wymaga małych objętości, zapewnia szybkie rezultaty, nie zależy od klasycznych odczytów i nie jest wymagany wyspecjalizowany personel. Technika ta może być stosowana do wykrywania wielu chorób, na przykład niedokrwistości i sepsy.

Aby rozpocząć, użyj nakłuwacza jednym kliknięciem, aby nakłuć palec dawcy krwi z dodatnim czynnikiem Rh i pobrać 10 mikrolitrów krwi w jednym mililitrze DPBS. Dodaj jeden mikrolitr barwnika fluorescencyjnego w jednym mililitrowym zawiesinie komórek dodatnich czynnika Rh do fluorescencyjnie wybarwionej błony plazmatycznej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Osadzaj komórki, wirując z prędkością 5 600 razy G przez 15 sekund i umyj granulkę trzy razy za pomocą jednego mililitra DPBS.

Zawiesić osad w jednym mililitrze HBSS z wapniem i magnezem. Za pomocą nakłuwacza jednym kliknięciem nakłuj palec dawcy krwi z ujemnym czynnikiem Rh i pobierz dwa mikrolitry krwi. Aby przygotować probówkę eksperymentalną zawierającą tylko kulki, dodaj 174 mikrolitry HBSS z wapniem i magnezem, jeden mikrolitr kulek kontrolnych IgG, jeden mikrolitr ciężkich kulek o gęstości 1,2 grama na mililitr i 24 mikrolitry 500 milimolowego gadolinu.

Aby przygotować eksperymentalną probówkę kontrolną zawierającą IgG, dodaj 172 mikrolitry HBSS z wapniem i magnezem, jeden mikrolitr kulek kontrolnych IgG, jeden mikrolitr ciężkich kulek, jeden mikrolitr krwi ujemnej względem czynnika rezus, jeden mikrolitr barwionej zawiesiny krwi dodatniej pod względem czynnika Rh i 24 mikrolitry 500 milimolowego gadolinu. Aby przygotować probówkę eksperymentalną próbki, dodaj 172 mikrolitry HBSS z wapniem i magnezem, jeden mikrolitr kulek powlekanych anty-RhD, jeden mikrolitr ciężkich kulek, jeden mikrolitr krwi ujemnej względem czynnika Rh, jeden mikrolitr barwionej zawiesiny krwi dodatniej pod względem czynnika Rh i 24 mikrolitry 500 milimolowego gadolinu. Skonfiguruj urządzenie lewitacji magnetycznej.

I załaduj 50 mikrolitrów próbki do rurki kapilarnej, aż probówka zostanie napełniona. Uszczelnij końce rurki kapilarnej szczeliwem kapilarnym, upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Umieść rurkę kapilarną w uchwycie kapilary między górnym i dolnym magnesem, wyreguluj stage i skup się, aby uzyskać optymalne viewing.

Odczekaj około pięciu do 20 minut, aż komórki i kulki osiądą w pozycji równowagi magnetycznej. Korzystając z tego protokołu, komórki krwi zostały oddzielone w zależności od wysokości lewitacji za pomocą urządzenia do lewitacji magnetycznej. Koraliki o niskiej i wysokiej gęstości zostały użyte do zapewnienia wysokości lewitacji gęstości i odniesienia rozmiaru.

Komórki wielojądrzaste lewitowały nad czerwonymi krwinkami przy stężeniu 21 milimolowych jonów gadolinu. Stare krwinki lewitowały przy stężeniu jonów gadolinu 60 milimolowym. Czerwone krwinki, komórki wielojądrzaste i limfocyty oddzielono przy 40-milimolowym stężeniu jonów gadolinu w oparciu o ich wewnętrzną gęstość.

Antygen czynnika Rh wykryto na krwinkach czerwonych za pomocą kulek pokrytych przeciwciałami IgG i anty-RhD. Kompleksy krwinek czerwonych nie zostały wygenerowane w próbce kontrolnej IgG, ale wykryto fluorescencyjnie zabarwione krwinki czerwone wychwycone przez kulki dodatnie czynnika Rh. Wiązanie anty-RhB z komórkami dodatnimi czynnika Rh utworzyło kompleks komórek koralików w środku przy przerywanej gęstości niezwiązanych kulek i ujemnych czerwonych krwinek.

Co więcej, tworzenie się kompleksu zostało potwierdzone obserwacją emitowanej fluorescencji. Kompleksy kulek B utworzone między kulkami o wysokiej i niskiej gęstości pokrytymi przeciwciałami dla CR1 i CD47 wskazują na obecność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z czerwonych krwinek. Zamknięcie kapilary bez wprowadzania pęcherzyków jest najtrudniejszym krokiem i wymaga praktyki.

Metoda ta może dostarczyć informacji dla hematologii, szczególnie skoncentrowanej na chorobach czerwonych krwinek.