Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Badanie produkcji synapsy immunologicznej zostało ograniczone głównie do metod mikroskopowych. BSLB poszerzyły nasz repertuar narzędzi, które można wykorzystać do badania wyników synaps odpornościowych limfocytów T, w tym cytometrii przepływowej, mikroskopii, proteomiki i technologii sekwencjonowania RNA. W związku z tym BSLB mogą być stosowane w wielu różnych kwestiach immunologicznych oraz w identyfikacji składu i biochemicznej regulacji wyjścia limfocytów T.

Obejmuje to na przykład badania chimerycznych receptorów antygenowych, leków hamujących określone szlaki sygnałowe lub genetycznej ablacji genów będących przedmiotem zainteresowania. Jednym z najbardziej krytycznych aspektów tego protokołu jest optymalizacja kalibracji białek i wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej wymaganego do śledzenia interesującej nas cząstki transsynaptycznej. Wymaga to systematycznej iteracji stężeń białek, stężeń przeciwciał i ustawień instrumentów.

Zacznij od rozcieńczenia jednego mikrolitra roztworu kulek 1 000 mikrolitrów PBS. Policz koraliki za pomocą komory hemocytometru i oblicz ich stężenie na mililitr. Następnie oblicz objętość kulek krzemionki potrzebną do uzyskania 500 000 końcowych BSLB na punkt miareczkowania.

Przenieś wymaganą objętość kulek krzemionkowych do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Umyj kulki krzemionki trzykrotnie jednym mililitrem sterylnego PBS i odwiruj kulki. Przygotuj trzy objętości głównej mieszanki liposomów zawierającej końcowe 12,5 procent molowych fosfolipidów zawierających nikiel.

Użyj głównej mieszanki liposomów, aby ponownie zawiesić umyte kulki krzemionki. Następnie delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół połowę całkowitej objętości. Stosując sterylną technikę, dodaj do probówki argon lub azot, aby wyprzeć powietrze i chronić lipidy przed utlenianiem podczas mieszania.

Dodaj argon do 0,4-milimolowych zapasów lipidów. Przechowuj wywar i manipuluj przy użyciu sterylnej techniki. Przenieś BSLB do miksera pionowego i mieszaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, używając mieszania orbitalnego z prędkością 10 obr./min.

Następnie odwiruj kulki, wirując przez 15 sekund w temperaturze pokojowej na miniwirówce stołowej. Zablokuj utworzone BSLB, dodając jeden mililitr 5% BSA zawierającego 100-mikromolowy siarczan niklu, aby nasycić miejsca NTA na BSLB. Przemyć trzykrotnie za pomocą buforu HBS-HSA, aby usunąć nadmiar roztworu blokującego.

Weź nową 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U lub z dnem w kształcie litery V i przygotuj dwukrotne seryjne rozcieńczenia białek. Ponownie zawiesić przygotowane BSLB w objętości tak, aby 100 mikrolitrów buforu HBS-HSA zawierało 500 000 BSLB. Następnie weź kolejną 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U lub z dnem w kształcie litery V i przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny BSLB do studzienek w taki sposób, aby każda studzienka otrzymała 500 000 BSBL.

Odwirowywać drugą płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty w temperaturze 300x G. Odrzucić supernatant i przenieść objętość 100 mikrolitrów z płytki do miareczkowania białek na płytkę zawierającą osadzone BSLB. Mieszać delikatnie, unikając nadmiernego wytwarzania pęcherzyków podczas pipetowania. Użyj folii aluminiowej, aby chronić go przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 1 000 obr./min.

Następnie umyj płytkę trzykrotnie, dodając do niej bufor HBS-HSA i wiruj ją w temperaturze pokojowej przez dwie minuty przy 300x G. Policz komórki po umyciu. Następnie rozcieńczyć je do końcowego stężenia 2,5 miliona na mililitr za pomocą pożywki do testów transferu synaptycznego. Po załadowaniu BSLB mieszanką białkową należy dwukrotnie przepłukać BSLB buforem HBS-HSA, aby usunąć nadmiar niezwiązanych białek.

Zawiesić 500 000 BSLB na studzienkę w 200 mikrolitrach buforu HBS-HSA. Przenieś 100 mikrolitrów BSLB na studzienkę na nową 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U, aby utworzyć duplikat, tak aby ostateczna ilość BSLB na studzienkę wynosiła 250 000. Wiruj BSLB przy 300x G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić BSLB przy użyciu 100 mikrolitrów zawiesiny limfocytów T. Delikatnie wymieszaj, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Inkubuj kokultury przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Chroń komórki przed światłem i schładzaj kokultury, najpierw inkubując je w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut. Odwirować kokultury w temperaturze pokojowej przez pięć minut przy 500x G. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kokultury w wolnym od jonów wapnia i magnezu 2% BSA PBS w temperaturze pokojowej w celu zablokowania. Umieść komórki na lodzie na 45 minut i chroń je przed światłem.

Przygotować główną mieszankę przeciwciał, używając lodowatego filtra 0,22 mikrometra, 2% BSA i PBS jako buforu barwiącego. Ta główna mieszanka zapewni dodatkowe blokowanie. Wiruj kokultury w temperaturze 500x G przez pięć minut i cztery stopnie Celsjusza.

Odrzucić supernatanty, a następnie użyć pipety wielokanałowej do ponownego zawieszenia komórek w mieszance wzorcowej barwienia zawierającej zoptymalizowane stężenia przeciwciał. Uwzględnij komórki znakowane izotypem i BSLB, fluorescencyjne i niefluorescencyjne BSLB oraz komórki i BSLB barwione samodzielnie. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół połowę objętości.

Inkubuj przez 30 minut na lodzie i chroń je przed światłem. Umyj ogniwa i BSLB dwukrotnie za pomocą lodowatego 2% BSA PBS. Obracaj je w temperaturze 500x G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Po odwirowaniu sprawdź kokulturę osadzoną na dnie studzienek. Następnie ponownie zawieś umyte kokultury w 100 mikrolitrach PBS i natychmiast uzyskaj. Aktywuj skalę logarytmiczną dla światła rozproszonego bocznego i parametr czasu przelotu dla świateł rozpraszanych bocznie i do przodu.

Zdobądź standardy MESF, zapewniając, że zarówno populacje o słabym wzroście, jak i najjaśniejsze mieszczą się w liniowym zakresie instrumentu. Następnie pobierz próbki kompensacji, oblicz kompensację i zastosuj macierz kompensacji do eksperymentu. Zdobądź i zapisz co najmniej 20 000 całkowitych standardów MESF dla każdego kanału kwantyfikacji.

Unikaj używania płynu osłonowego FACS lub podobnego produktu do ponownego zawieszania kulek MESF, ponieważ zawierają one sole i alkohole, które niszczą fluorochromy, prowadząc do szerszych pików fluorescencji i wysokiego błędu. W przypadku akwizycji za pomocą próbników o wysokiej przepustowości należy ustawić akwizycję przyrządu na Standardową, ustawić akwizycję próbki na 80 mikrolitrów. Natężenie przepływu próbki od dwóch do trzech mikrolitrów na sekundę, objętość mieszania próbki przy 50 mikrolitrach, mieszanie próbki 150 mikrolitrów na sekundę i mieszanie na studzienkę od trzech do pięciu.

Zdobądź co najmniej 10 000 pojedynczych BSLB na próbkę. Na koniec wyeksportuj pliki FCS. Przykład pomiarów ilościowej cytometrii przepływowej ICAM-1 na powierzchni komórek B migdałków i limfocytów T pomocniczych przedstawiono tutaj.

Reprezentatywne obrazy opisują strategię bramkowania do analizy pojedynczych limfocytów B CXCR5 i pęcherzyków limfocytów T pomocniczych wyizolowanych z ludzkich migdałków podniebiennych. Ta strategia bramkowania sekwencyjnego identyfikuje pojedyncze zdarzenia na żywo w oknie ciągłego pozyskiwania. Poniżej przedstawiono dublety, ekspresję ICAM-1 na powierzchni komórki w porównaniu z kontrolami FMO i kontrolami FMO znakowanymi odpowiednimi izotypami populacji.

Bramkowanie i pomiar MIF z różnych standardowych populacji MESF na nałożonych histogramach populacji MESF przedstawiono tutaj. Wartości reprezentują MIF dla każdej z pięciu populacji MESF. Przedstawiono tutaj regresję liniową MESF nad cMFI dla populacji MESF.

Nachylenie ekstrahuje MESF związany z komórkami z danych FCM ICAM-1 na powierzchni komórek B migdałków w TFH. Konwersja do bezwzględnych gęstości molekularnych odbywa się zgodnie z tymi prostymi operacjami matematycznymi. Reprezentatywne obrazy pokazują analizę cytometrii przepływowej BSLB odtworzonych ze zwiększoną gęstością rekombinowanych monomerycznych histydyn ICAM-1 12.

Przedstawiono tutaj analizy regresji stężenia referencyjnego ICAM-1 w stosunku do zmierzonej gęstości. Nachylenie służy do obliczania docelowych stężeń białka w celu uzyskania gęstości komórek. Diagramy przepływu pokazują krytyczne etapy kohodowli limfocytów T z BSLB, odtwarzając błony modelowe w późniejszym pomiarze transferu cząstek za pomocą cytometrii przepływowej.

Strategia bramkowania w celu identyfikacji pojedynczych BSLB i komórek w oknie ciągłego pozyskiwania jest pokazana tutaj. Jednym z najważniejszych aspektów tego protokołu jest to, że aby zachować powtarzalność wyników, za każdym razem, gdy zmieniasz zapasy białek lub lipidów, musisz przeprowadzić nową analizę kalibracyjną. Aby odkryć nowe skuteczne cząsteczki wydzielane przez różne podzbiory limfocytów T, BSLB można dalej izolować przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, poddając je analizie transkryptomicznej i proteomicznej.

Nasi koledzy z Uniwersytetu Oksfordzkiego wykorzystali tę technologię do zbadania i zademonstrowania nowych interakcji receptor-ligand, a także do zbadania wpływu ablacji genetycznych na wyjście synapsy immunologicznej limfocytów T.