Name: Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metody wytwarzania i utrzymywania ludzkich organoidów jelitowych oraz okrężnicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Protokoły te poprawiają powtarzalność i skalowalność badań nad organoidami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium Múnera jest finansowane przez NIH/NCI 5U54CA210962-02 South Carolina Cancer Disparities Research Center (SC CADRE), NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE in Digestive and Liver Disease oraz NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Digestive Disease Research Core Center.

1. Wytwarzanie organoidów jelitowych i okrężnicy człowieka
<ol>
	<li>Przygotowanie płyt pokrytych ECM<ol>
		<li>Dodaj 50 ml zimnego podłoża DMEM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wyjąć podwielokrotność 4 ECM z kwalifikacją hESC (patrz tabela materiałów) z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić na lodzie. UWAGA: Zapoznaj się z certyfikatem analizy produktu, aby określić objętość ECM z kwalifikacją ESC wymaganą do przygotowania 4x zapasu.</li>
		<li>Jeśli ECM z kwalifikacją hESC nie jest w pełni rozmrożony, należy pobrać 750 μl DMEM z probówki stożkowej o pojemności 50 ml i wymieszać go z ECM.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę ECM z kwalifikacją DMEM/hESC do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z DMEM i dobrze wymieszać. Dodaj 0,5 ml na studzienkę do każdej z 4 x 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Potrząśnij płytkami, aby równomiernie rozprowadzić ECM w całej studzience, aby upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta. Za pomocą parafilmu uszczelnić płytki pokryte ECM i pozostawić je w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 1 godzinę. Płytki z powłoką ECM należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni lub do momentu, gdy będą potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewanie pojedynczych komórek hPSC<ol>
		<li>Umieścić 24-dołkową płytkę pokrytą ECM w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut, aby mogła osiągnąć temperaturę pokojową.</li>
		<li>Umieść mTeSR1 complete medium, roztwór do oddzielania komórek i zaawansowany DMEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i pozwól im się rozgrzać przez 30 minut.</li>
		<li>Sprawdź, czy hPSC są zlewające się w co najmniej 85% z minimalnym zróżnicowaniem. W razie potrzeby usuń wszystkie zróżnicowane komórki.</li>
		<li>Przygotować pożywkę galwaniczną w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w następujący sposób: 13 ml mTeSR1 i 13 μl 10 mM inhibitora kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK). UWAGA: Y-27632 hamuje anoikis i zwiększa przeżywalność pojedynczych komórek.</li>
		<li>Aby zebrać komórki z płytki 6-dołkowej, odessać pożywkę z 3 do 4 dołków i przemyć raz 2 ml zaawansowanego DMEM na studzienkę.</li>
		<li>Odessać zaawansowany DMEM i dozować 1 ml roztworu do dysocjacji komórek do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 5-7 minut w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są w zawiesinie.</li>
		<li>Oddziel wszelkie pozostałe grudki komórek, pipetując w górę i w dół 4-5 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Dodaj 2 ml zaawansowanego DMEM do każdej studzienki, delikatnie pipetuj w górę i w dół 4-5 razy i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki na 300 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać pożywkę z probówki bez zasysania osadu komórkowego i dodać 6 ml przygotowanej pożywki mTeSR1 plus inhibitor ROCK. Delikatnie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 3-4 razy, a następnie przenieść zawiesinę do reszty pożywki inhibitora mTeSR1/ROCK wewnątrz probówki o pojemności 50 ml. Zawiesić energicznie 4-5 razy i policzyć komórki za pomocą hemekytometru.</li>
		<li>Odessać ECM z płytki 24-dołkowej tuż przed posianiem komórek. Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 2-3 razy i dozować 0,5 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki. UWAGA: Optymalna gęstość posiewu musi zostać określona przez eksperymentatora. Tutaj optymalna liczba komórek wynosi 80 000-200 000 komórek na studzienkę.</li>
		<li>Delikatnie kołysz płytką 3 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara, 3 razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, 3 razy do przodu i do tyłu oraz 3 razy na boki, aby równomiernie rozproszyć komórki.</li>
		<li>Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować przez 24 godziny. UWAGA: Nie należy naruszać płytki przez pierwsze kilka godzin, aby zapewnić prawidłowe rozproszenie komórek w studzienkach.</li>
		<li>Po 24 godzinach (Rysunek 2A) odessać zużytą pożywkę, dodać 0,5 ml mTeSR1 na studzienkę, ponownie inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny (Rysunek 2B), a następnie przejść do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie ostatecznej endodermy (DE) od hPSC<ol>
		<li>W stożkowej probówce o pojemności 15 ml dodaj 13 ml pożywki Activin Day 1 (patrz tabela materiałów), 13 μl 100 μg/ml aktywiny A i 1,95 μl 100 μg/ml BMP4. Ogrzać podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odessać pożywkę mTeSR1 z płytki 24-dołkowej i dodać 0,5 ml pożywki Activin Day 1 do dołka. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować przez 24 godziny. Sprawdź ogniwa po 24 godzinach. UWAGA: Rozległa śmierć komórki powinna być widoczna, jak pokazano na rysunku 2C. Chociaż monowarstwa będzie wydawać się rzadka, kolonie komórek rozszerzą się.</li>
		<li>Przygotuj kompletną pożywkę Activin Day 2, dodając 12,5 μl 100 μg/ml Activiny A do 12,5 ml pożywki Activin Day 2 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wyjąć 24-dołkową płytkę różnicującą z inkubatora CO2 i usunąć zużyte podłoże. Dozować 0,5 ml podgrzanej pożywki Activin Day 2 do dołka i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze CO2 na 24 godziny. UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas dozowania pożywki. Nie dozuj pożywki bezpośrednio na środku studzienki, ponieważ spowoduje to oderwanie komórek w monowarstwie. Ostrożnie dozuj pożywkę po ścianie studzienki. Następnego dnia tworzy się monowarstwa komórek przy znikomej śmierci komórki. Komórki powinny teraz zlewać się w ~90 do 95% (rysunek 2D).</li>
		<li>Przygotuj kompletną pożywkę Activin Day 3, dodając 12,5 μl 100 μg/ml Activin A do 12,5 ml pożywki Activin Day 3 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usuń zużytą pożywkę i dozuj 0,5 ml pożywki Activin Day 3 do dołka. UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas dozowania pożywki. Nie dozuj pożywki bezpośrednio na środku studzienki, ponieważ spowoduje to oderwanie komórek w monowarstwie. Ostrożnie dozuj pożywkę po ścianie studzienki. Następnego dnia monowarstwa powinna osiągnąć pełną konfluencję z niewielką lub żadną śmiercią komórki na tym etapie. Nie próbuj generować sferoid środkowego odcinka jelita grubego, jeśli monowarstwa nie zlewa się 24 godziny po dodaniu pożywki Activin Day 3. Patrz rysunek 2E , aby zapoznać się z idealną morfologią monowarstwy DE przed przystąpieniem do generowania sferoid środkowego jelita tylnego.</li>
		<li>Przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne (IF) monowarstwy w celu ekspresji białka A2 w pudełku widłowym (FOXA2) i czynnika transkrypcyjnego 17 w regionie determinującym płeć (SRY) podczas optymalizacji różnicowania DE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie DE na sferoidy środkowego jelita tylnego<ol>
		<li>Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 25 ml pożywki indukcyjnej dla jelita środkowego z FGF4 (bez CHIR99021) i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut.</li>
		<li>Aby przygotować kompletną pożywkę indukcyjną dla środkowego odcinka jelita grubego, dodaj 7,5 μl CHIR99021 po ogrzaniu pożywki.</li>
		<li>Usunąć zużytą pożywkę, dozować 0,5 ml pożywki indukcyjnej dla środkowego jelita grubego na dołek i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
		<li>Po tym, jak następnego dnia nastąpiła kondensacja komórek w monowarstwie (ryc. 3A), zastąp zużytą pożywkę świeżą pożywką indukcyjną dla środkowego odcinka jelita grubego i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 24 godziny. UWAGA: Struktury rurkowe będą zauważalne po 48 godzinach indukcji jelita środkowego tylnego, jak pokazano na rysunku 3B. Sferoidy środkowego odcinka jelita tylnego zaczną pączkować z monowarstwy w 3 dniu, jak pokazano na rysunku 3C.</li>
		<li>Aby uniknąć wyrzucenia pływających sferoid podczas zmiany pożywki, przenieś starą pożywkę do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 300 × g przez 1 minutę. Ponownie zawiesić sferoidy w 12,5 ml świeżej pożywki indukcyjnej dla środkowego jelita grubego, dodać 0,5 ml na studzienkę do tej samej 24-dołkowej płytki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
		<li>W 4 dniu indukcji jelita grubego (ryc. 3D) należy zebrać pływające sferoidy z dołków płytkowych, zbierając pożywkę do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwirować w temperaturze 300 × g przez 1 minutę. Przejdź do następnego kroku, aby osadzić sferoidy środkowego jelita tylnego w ECM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poszycie i wzór sferoid jelita środkowego/tylnego w ECM<ol>
		<li>Rozmrozić matrycę membrany podstawnej ECM w temperaturze 4 °C przez noc przed osadzeniem. UWAGA: Ten moduł ECM różni się od ECM z kwalifikacją hESC. Moduł ECM należy umieścić na lodzie, a odpowiednią objętość ECM można podzielić na wstępnie schłodzone probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml na lodzie. Tabela 1 zawiera informacje na temat objętości ECM. Upewnij się, że objętość ECM wynosi co najmniej 75% w kropli, w której zostaną osadzone sferoidy.</li>
		<li>Rozgrzać 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zebrać pływające sferoidy ze wszystkich 24 dołków za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wiruj sferoidy z prędkością 300 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Odessać większość pożywki, ale pozostawić objętość wymaganą do posiewu (Tabela 1).</li>
		<li>Przygotuj końcówki do pipet o pojemności 1000 μl i 200 μl, odcinając ich końce. Wyjmij podgrzaną płytkę 24-dołkową.</li>
		<li>Wymieszać pływające sferoidy, przenieść odpowiednią objętość do rurki ECM umieszczonej na lodzie, a następnie ponownie zawiesić sferoidy i ECM przez pipetowanie, aby dobrze je wymieszać.</li>
		<li>Weź 65 μl mieszaniny sferoid i ECM z naciętymi końcówkami do pipet o pojemności 200 μl i załaduj do środka każdej studzienki na płytce 24-dołkowej. Aby upewnić się, że tworzy się dobra kropla ECM, należy delikatnie i powoli podnosić pipetę podczas dozowania mieszaniny. UWAGA: Płytka 30-100 sferoid na studzienkę.</li>
		<li>Delikatnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Odwróć płytkę do góry nogami i inkubuj przez 15-25 minut, co pomoże kropelkom ECM utrzymać strukturę przypominającą kopułę.</li>
		<li>Podczas inkubacji przygotuj wymagane podłoże i rozgrzej je. Po zestaleniu ECM dodać 0,5 ml pożywki wzorcowej HIO lub HCO do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Rysunek 3E przedstawia obraz sferoid w ECM.</li>
		<li>Hoduj sferoidy w pożywce modelowej przez 3 dni.</li>
		<li>Po 3 dniach zmienić pożywkę wzorcową HIO lub HCO na normalną pożywkę wzrostową i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . UWAGA: Organoidy w tym punkcie czasowym (dzień 10) są organoidami we wczesnym stadium. W oparciu o cel projektu, niektóre organoidy we wczesnym stadium rozwoju mogą być wykorzystane do wczesnej analizy wzorców, jak szczegółowo opisano w sekcji 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przerost i pasażowanie ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy<ol>
		<li>Po 10 dniach zmieniaj podłoże co 3 dni. UWAGA: W zależności od gęstości posiewu i wzrostu organoidów mogą być wymagane częstsze zmiany pożywki. Zmiany podłoża należy wykonać, zanim czerwień fenolowa (wskaźnik pH) w pożywce zmieni kolor na żółty.</li>
		<li>Inkubować organoidy do dnia 21 (ryc. 3F). UWAGA: Leczenie BMP2 spowoduje zmniejszenie liczby organoidów (~ 3 razy mniej niż HIO), które wyrastają ze sferoidów. W związku z tym do wytworzenia HCO konieczne jest pokrycie większej liczby sferoid.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podział organoidów w dniu 21<ol>
		<li>Zbadaj organoidy. UWAGA: Organoidy muszą zostać podzielone w dniu 21, ponieważ ECM jest prawie zdegradowany do dnia 21 z powodu wzrostu i ekspansji organoidów.</li>
		<li>Przygotuj końcówki do pipet o pojemności 1000 μl i 200 μl, odcinając ich końce.</li>
		<li>Rozgrzać 24-dołkową płytkę Nunc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umieścić odpowiednią objętość ECM w wstępnie schłodzonych probówkach o pojemności 1,5 ml (tabela 1).</li>
		<li>Delikatnie zeskrobać kropelkę ECM z organoidami za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 μl i kilkakrotnie odpipetować mieszaninę w górę i w dół, aby rozbić ECM.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę na szalkę Petriego o średnicy 60 mm i sprawdzić organoidy pod mikroskopem. W razie potrzeby oddzielić organoidy od siebie za pomocą sterylnych kleszczy. Upewnij się, że oddzielenie nie uszkodzi nabłonka organoidów.</li>
		<li>Przenieść organoidy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 × g przez 30 s. Odessać supernatant i pozostawić ~1 ml pożywki w probówce. UWAGA: Objętość podłoża można zmieniać w zależności od celu eksperymentu. Jeśli wymagana jest większa liczba organoidów na kroplę ECM, objętość podłoża można zmniejszyć. Jeśli jednak wymagana jest mniejsza liczba organoidów, objętość podłoża można zwiększyć.</li>
		<li>Dobrze wymieszać organoidy, przenieść odpowiednią objętość do probówki ECM umieszczonej na lodzie, a następnie ponownie zawiesić organoidy i ECM przez pipetowanie, aby dobrze je wymieszać.</li>
		<li>Dodać 65 μl mieszaniny sferoid i ECM do środka każdego dołka płytki 24-dołkowej, używając naciętych końcówek pipet o pojemności 200 μl. UWAGA: Bardzo ważne jest, aby podczas pipetowania najpierw pobrać organoidy, a następnie ECM. Tak więc, podczas dozowania mieszaniny, organoidy znajdują się w górnej części kropli ECM.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 5 minut.</li>
		<li>Odwróć płytkę do góry nogami na kolejne 15-25 minut, aby kropelki ECM utrzymały strukturę przypominającą kopułę.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml pożywki HIO/HCO do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . UWAGA: Pożywka wzrostowa jest taka sama zarówno dla HIO, jak i HCO po utworzeniu wzoru.</li>
		<li>Zmieniaj podłoże co 2-3 dni aż do 35 dnia (ryc. 3G).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Weryfikacja wzorca organoidów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)
<ol>
	<li>Przed pobraniem RNA należy przygotować 1x bufor do lizy RNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyrzuć zużytą pożywkę i dodaj 350 μl buforu do lizy do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Poddać organoidy lizie, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Aby uzyskać lepszą lizę, wiruj krótko z maksymalną prędkością przez 5 s.</li>
	<li>Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do ekstrakcji RNA. Po przygotowaniu wyjmij próbki RNA z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrażaj je na lodzie przez 10 minut. Energicznie wirować probówki w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut, aby zapewnić całkowitą lizę próbek.</li>
	<li>Ponownie umieść próbki na lodzie i przystąp do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcją producenta. Przenieś próbki RNA do zamrażarki o temperaturze -80 °C, jeśli nie są gotowe do przejścia do następnego etapu.</li>
	<li>Wykonaj ekstrakcję RNA, leczenie DNAzy, syntezę cDNA i RT-qPCR przy użyciu standardowej metodologii. Zapoznaj się z tabelą 2 , aby uzyskać listę nazw i sekwencji starterów.</li>
</ol>
3. Weryfikacja wzorca organoidów za pomocą immunofluorescencji
<ol>
	<li>Pobieranie i utrwalanie organoidów<ol>
		<li>Odessać pożywkę HIO lub HCO z odpowiednich studzienek i dodać 1 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej studzienki. Oddzielić organoidy od ECM za pomocą naciętej końcówki pipety o pojemności 200 μl. Pipetować w górę i w dół, aby oddzielić duże kawałki ECM od organoidów.</li>
		<li>Przenieść organoidy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i napełnić resztę probówki lodowatym PBS i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Pozwól organoidom osiąść grawitacyjnie i zassać PBS. UWAGA: Jeśli organoidy nie osiądą grawitacyjnie, odwirować przy 300 × g przez 1 minutę.</li>
		<li>Odessać PBS i dodać 1 ml lodowatego roztworu rozkładającego ECM. Trzymaj rurkę na lodzie przez 10-15 minut na obrotowej platformie, delikatnie potrząsając. UWAGA: Przechyl probówkę pod kątem 45°, aby umożliwić prawidłowe wymieszanie organoidów i roztworu do odzyskiwania komórek. Po 10-15 minutach organoidy powinny osiąść na dnie probówki, wskazując na całkowite trawienie ECM.</li>
		<li>Dodaj zimny PBS do probówki do 15 ml; Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Gdy organoidy osiądą na dnie probówki, odessać PBS i dodać 1 ml wstępnie schłodzonego 4% paraformaldehydu, aby utrwalić organoidy. Inkubować organoidy z 4% paraformaldehydem na lodzie przez 1 godzinę.</li>
		<li>Napełnij pozostałą część probówki lodowatym PBS i umieść ją poziomo na platformie bujanej w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia wyrzucić paraformaldehyd/PBS do określonego pojemnika na odpady i przemyć raz 15 ml lodowatego PBS, jak opisano w kroku 3.1.2.</li>
		<li>Odessać PBS i napełnić probówkę 30% sacharozą w PBS. Umieść rurkę poziomo na platformie bujanej w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia należy osadzić organoidy w modelu podstawowym o wymiarach 7 mm x 7 mm x 5 mm z pożywką OCT i błyskawicznie zamrozić przy użyciu kąpieli suchego lodu/etanolu.</li>
		<li>Osusz bloki chusteczkami laboratoryjnymi, zawiń je w ręcznik papierowy i przechowuj przez noc w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Następnego dnia wytnij skrawki 5 μm na szkiełkach mikroskopowych za pomocą kriostatu. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne organoidów<ol>
		<li>Przetwarzaj szkiełka z zamrażarki w temperaturze -80 °C i wykonaj barwienie IF przy użyciu standardowych protokołów.</li>
		<li>Nałóż szkiełka nakrywkowe na szkiełka i wysusz je w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez co najmniej 2 godziny lub przez noc przed obrazowaniem.</li>
		<li>Zobrazuj szkiełka za pomocą obiektywu 25x mikroskopu konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+gastrointestinal+tract%3A+twenty+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress.</a> Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).</li>
<li>van Klinken, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+is+the+prominent+mucin+in+human+gallbladder+and+is+also+expressed+in+a+subset+of+colonic+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells.</a> American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).</li>
<li>Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Muc5b+mucin+gene%3A+cDNA+and+genomic+structures%2C+chromosomal+localization+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression.</a> Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).</li>
<li>Lau, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hedgehog+signaling+promotes+development+of+mouse+and+human+enteric+neural+crest+cells%2C+based+on+single-cell+transcriptome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses.</a> Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Munera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+colonic+organoids+via+transient+activation+of+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+fibroblasts+have+specialized%2C+diverse+transcriptional+phenotypes%3A+a+comprehensive+gene+expression+analysis+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).</li>
<li>Yahagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-specific+expression+of+Hox+genes+along+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies%22%5BJournal%5D)">Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract.</a> Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).</li>
<li>Sarvestani, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+organoids+derived+from+patients+with+ulcerative+colitis+recapitulate+colitic+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity.</a> Nature Communications. 12 (1), 262(2021).</li>
<li>Holloway, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+intestinal+organoids+with+endogenous+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Jaitner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+determines+miRNA+expression+and+long-term+memory+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system.</a> Elife. 5, 17361(2016).</li>
<li>Teo, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+and+BMP4+synergistically+promote+formation+of+definitive+endoderm+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).</li>
<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Tamminen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commitment+and+maturation+of+human+pluripotent+stem+cells+is+independent+of+exogenous+FGF4+and+R-spondin1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1.</a> PloS One. 10 (7), 0134551(2015).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+Salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Jung, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+induces+the+in+vitro+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids.</a> Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+a+Wnt-telomere+feedback+loop+restores+intestinal+stem+cell+function+in+a+human+organotypic+model+of+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+APC+mutagenesis+and+familial+adenomatous+polyposis+using+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells.</a> PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+couple+nutrient+sensing+to+nutrient+absorption+by+regulating+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport.</a> Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structure-function+study+of+neurogenin3+disease-causing+alleles+during+human+pancreas+and+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development.</a> Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Różnicowanie hPSC na HIO i HCO jest złożonym procesem wymagającym kontroli jakości na każdym etapie. Początkowe hPSC muszą mieć minimalne zróżnicowanie przed zainicjowaniem różnicowania w DE. Optymalizacja gęstości hPSC powlekanych w celu różnicowania DE ma kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu. Aby zapewnić jakość różnicowania DE, należy wykonać IF dla FOXA2 i SOX17 w celu określenia skuteczności różnicowania DE. Różnicowanie DE powinno spowodować, że ponad 80% leczonych komórek będzie miało dodatnie barwienie na ...

Badanie rozwoju jelita grubego u człowieka jest trudne ze względu na ograniczenia dotyczące stosowania ludzkich tkanek płodowych. Modele zwierzęce były nieocenione i historycznie wykorzystywane w podejściach genetycznych u myszy w celu badania rozwoju jelit. Jednak różnice między rozwojem jelit myszy i człowieka ograniczają możliwość zastosowania myszy jako systemu modelowego. Na przykład, chociaż tworzenie się krypt w jelicie cienkim i okrężnicy myszy następuje po urodzeniu, ludzie rodzą się z w pełni uformowanymi kryptami1. Ponadto ludzkie jelito cienkie i okrężnica zawierają typy komórek, które nie występują u myszy, w tym komórki enteroendokrynne wykazujące ekspresję motyliny (MLN) w jelicie cienkim2 i komórki kubkowe wykazujące ekspresję mucyny 5B (MUC5B) w okrężnicy 3,4. Z tego powodu ważne jest, aby mieć system hodowli komórkowych, który dokładnie modeluje dynamiczne zdarzenia molekularne, które definiują wczesne etapy rozwoju okrężnicy. W związku z tym skierowanie hPSC do generowania komórek o charakterystyce jelita grubego stanowi potężny model do badania rozwoju jelita grubego u człowieka. 
Protokoły zostały opracowane w celu ułatwienia powtarzalnego, synchronicznego i wydajnego tworzenia organoidów podobnych do jelita6 i okrężnicy7 z hPSC. Protokoły te wykorzystują krokową procedurę różnicowania, która naśladuje rozwój jelita płodowego i okrężnicy (ryc. 1). Po pierwsze, ostateczna endoderma jest generowana z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przez leczenie Activin A, mimetykiem węzłowym. Narażenie ostatecznej endodermy na wysokie poziomy WNT i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) indukuje morfogenezę do sferoidów rurki środkowej / tylnej CDX2 + . Sferoidy jelita środkowego / tylnego są następnie osadzane w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i przekształcane w HIO lub HCO poprzez przejściową manipulację sygnalizacją BMP. Hamowanie sygnalizacji BMP za pomocą NOGGIN lub dodanie samej pożywki wzrostowej powoduje powstawanie HIO, które przypominają ludzkie proksymalne jelito cienkie.
Poprzez aktywację sygnalizacji BMP za pomocą BMP2, sferoidy jelita środkowego / tylnego są modelowane w HCO, które zachowują wzór w nabłonku i mezenchymie7. HCO zawierają wzbogacone w okrężnicę, komórki kubkowe wykazujące ekspresję MUC5B i są zdolne do wytwarzania komórek enteroendokrynnych eksprymujących specyficzne dla jelita grubego komórki jelita grubego typu insulinopodobnego 5 (INSL5). Wyizolowana mezenchyma z HCO wyraża homeobox A13 (HOXA13) i HOXD13, które są również wyrażane w ludzkim pierwotnym mezenchymieokrężnicy 8. Ważne jest, aby pamiętać, że etap tworzenia wzorca występuje w dniach 7-10 protokołu różnicowania. Ten trzydniowy okres jest wystarczający do wywołania wzorca okrężnicy, który utrzymuje się po przedłużonej hodowli in vitro .
Opisane poniżej protokoły są przeznaczone dla badaczy, którzy są zaznajomieni z hodowlą hPSC bez karmienia. Dla badaczy, którzy nie są zaznajomieni z tym typem hodowli hPSC, zaleca się szkolenie na temat hPSC, takie jak te oferowane przez Stem Cell Technologies lub Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) w Cincinnati Children's Hospital. Jakość początkowych hPSC ma kluczowe znaczenie i może mieć wpływ na wszystkie dalsze etapy. Poniższy protokół rozpocznie się od hPSC, które były hodowane przez 4 dni i są gotowe do podziału.

<table><tbody><tr><td>1% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Probówka Corning 15 ml</td><td>Sokół</td><td>21008-918</td><td>N/A</td></tr><tr><td>30% sacharozy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wyprodukowano w PBS.</td></tr><tr><td>5% normalna surowica osła</td><td>Laboratorium Badawcze Jacksona ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>N/A</td></tr><tr><td>50 ml probówka Corning</td><td>Sokół</td><td>21008-951</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dokładności</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1110501</td><td>Roztwór do odłączania komórek; podamy 5 ml Accutase do 10 ml probówek zawierających łącznie 20 probówek i przechowujemy w temperaturze -20 stopni; C przez okres do 6 miesięcy. Miejsce na 4 & stopni; C na noc przed użyciem.</td></tr><tr><td>Aktywina A</td><td>Systemy prowadzenia komórek</td><td>GFH6-100x10</td><td>Rozpuść liofilizowany proszek w stężeniu 100 &mikro; g/ml w sterylnym PBS zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Porcja 38 &mikro; L aktywiny A do wstępnie schłodzonych probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 & deg; C (Probówki tracą ważność 12 miesięcy od daty otrzymania).</td></tr><tr><td>Activin Dzień 1 pożywka (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Używaj aminokwasów endogennych (NEAA, Corning 11140050) i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka podstawowa dnia 1: 500 ml RPMI 1640 i 500 ml NEAA. Przygotowując pożywkę Activin Day 1, dodaj 13 ml basic day 1 medium, 13 &micro; l Activiny A (100 &mikro; g/ml) oraz 2 &mikro; l BMP4 (100 &mikro; g/ml). Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.</td></tr><tr><td>Pożywka Activin Day 2 (RPMI 1640, 0,2% FBS obj. / obj.)</td><td>Klon</td><td>SH30070.03T</td><td>Używaj aminokwasów endogennych (Corning 11140050) i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka podstawowa dnia 2: 500 ml RPMI 1640, 500 ml NEAA i 1 ml 0,2% surowicy. Przygotowując pożywkę Activin Day 2, dodaj 12,5 ml podstawowej pożywki dnia 2 i 12,5 &mikro; L Activiny A (100 &mikro; g/ml). Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.</td></tr><tr><td>Activin Dzień 3 pożywka (RPMI 1640, 2% FBS obj./obj.)</td><td>Klon</td><td>SH30070.03T</td><td>Używaj aminokwasów endogennych (Corning 11140050) i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka podstawowa dnia 3: 500 ml RPMI 1640, 500 ml NEAA i 10 ml 2% surowicy. Przygotowując pożywkę Activin Day 3, dodaj 12,5 ml basic Day 3 oraz 12,5 &micro; L Activiny A (100 &mikro; g/ml). Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Osioł anty-Koza</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11055</td><td>Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało drugorzędowe)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Osioł anty-Królik</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nr kat. A21206</td><td>Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało drugorzędowe)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Osioł anty-Mysz</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10036</td><td>Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało drugorzędowe)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Osioł anty-Mysz</td><td>Thermo Scientific</td><td>A31571</td><td>Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało drugorzędowe)</td></tr><tr><td>Forma bazowa</td><td>Rybak</td><td>22-363-552</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Podstawowe podłoże jelitowe (zaawansowany DMEM)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>12491015</td><td>&nbsp; Przygotowując podstawowe podłoże jelitowe, dodaj 500 ml DMEM, 500 ml N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml witaminy B27 (Gibco), 500 ml L-glutaminy, aby uzyskać 2 mM L-glutaminy (Corning A2916801), 5 ml 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (Gibco 15-140-122) i 7,5 ml 1 M HEPES, aby uzyskać 15 mM HEPES.&nbsp; Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.</td></tr><tr><td>Biorad CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td>Można stosować inne systemy qRT-PCR.</td></tr><tr><td>Rozwiązanie do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Rozwiązanie degradujące ECM</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell (reprokomórka)</td><td>4000410</td><td>Rozpuścić przez dodanie 2,15 ml DMSO w stężeniu 10 mM. Przygotuj 50 &mikro; L porcji i przechowywać w temperaturze -20 & stopni C.&nbsp; Przechowywać proszek w temperaturze 4 stopni; C, chroniony przed światłem.</td></tr><tr><td>Wzorzec CTRL HIO średni</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zasadowe podłoże jelitowe i 100 ng/ml EGF.</td></tr><tr><td>DAPI (interfejs DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał D9542</td><td>Rozcieńczenie 1:100 (przeciwciało drugorzędowe)</td></tr><tr><td>Monowarstwa DE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Monowarstwa została wygenerowana w poprzednich krokach (sekcja 4.4).</td></tr><tr><td>Rozpuść</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>17105041</td><td>Zawiesić liofilizowany proszek w Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) do końcowego stężenia 1 mg / ml. Przefiltruj roztwór do sterylizacji, odkurzając go za pomocą rurki sterylizacyjnej z filtrem Millipore. Przygotować 10 ml porcji (1 mg/ml) i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C przez okres do 6 miesięcy. Miejsce na 4 & stopni; C na noc przed użyciem.</td></tr><tr><td>EFG (EFG)</td><td>Thermo Scientific</td><td>236-EG-01M</td><td>Przygotowując 100 ng/ml EGF rozpuścić 500 &mikro; g/ml w sterylnym PBS. Następnie dodać 2 ml sterylnego PBS do 1 mg EGF i zrobić 500 &mikro; g/ml roztworu EGF. Podwielokrotność 100 &mikro; L EGF w 20 probówkach.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 6 cm szalki Petriego z przezroczystą pokrywką</td><td>Rybak</td><td>FB0875713A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Podnośnik komórkowy Fisherbrand</td><td>Rybak</td><td>08-100-240</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fiolki z gwintem z przezroczystego szkła klasy B Fisherbrand z dołączonymi zamknięciami</td><td>Rybak</td><td>03-338 mld</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fisherbrand Jednorazowa pipeta Pasteura ze szkła borokrzemianowego</td><td>Rybak</td><td>Numer katalogowy: 13-678-2D0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fluoromount G Medium do montażu ślizgowego</td><td>Firma VWR</td><td>100241-874</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM Gibco</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>12-491-023</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kozia anty-E-Kadheryna</td><td>R& Systemy D</td><td>AF648 powiedział:</td><td>Rozcieńczenie 1:400 (przeciwciało pierwszorzędowe)</td></tr><tr><td>Kozioł anty-SOX17</td><td>R& Systemy D</td><td>AF1924 powiedział:</td><td>Rozcieńczenie 1:500 (przeciwciało pierwszorzędowe)</td></tr><tr><td>Medium do wzorzystków HCO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zasadowe podłoże jelitowe, 100 ng/ml EGF i 100 ng/ml BMP2. Podczas przygotowywania BMP2 dodać 1 ml sterylnego 4 mM HCl 0,1% BSA do fiolek BMP2 (100 &mikro; g). Podwielokrotność 25 &mikro; L roztworu BMP4 w 4 probówkach. Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC)</td><td>Zakład Pluripotencjalnych Komórek Macierzystych</td><td>N/A</td><td>Komórki wysiane na 24-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem (Thermo Scientific 73520-906).</td></tr><tr><td>Lodowaty 4% roztwór paraformaldehydu (PFA)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lodowata sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>pH musi wynosić 7,4.</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>101098-065</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC)</td><td>Pluripotencjalne Centrum Komórkowe Komórek Macierzystych (Centrum Medyczne Szpitala Dziecięcego w Cincinnati)</td><td>N/A</td><td>Można stosować inne linie hESC lub iPSC, ale protokół musi być zoptymalizowany dla każdej linii komórkowej.</td></tr><tr><td>Mikrotom Leica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Zobacz materiał LSM 880</td><td></td><td></td><td>mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>Matrigel Matryca membrany podstawnej</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Matrigel z kwalifikacją hESC Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Przygotować 4 porcje Matrigel, które odpowiadają objętościom wystarczającym do wytworzenia wystarczającej ilości rozcieńczonego Matrigelu na 4 x 6-dołkowe szalki.</td></tr><tr><td>Pożywka indukcyjna dla środkowego odcinka jelita grubego (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Aminokwasy endogenne (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 i mikro; M CHIR99021 i 500 ng/ml FGF4. Pożywka bazowa jest stabilna do 3 tygodni, ale powinna być stosowana natychmiast po dodaniu czynników wzrostu.</td></tr><tr><td>Sferoidy środkowego odcinka jelita grubego</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MilliporeSigma Steriflip Sterylne jednorazowe filtry próżniowe</td><td>MiliporeSigma</td><td>SCGP00525</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mysz anty-CDX2</td><td>Firma BioGenex</td><td>MU392-UC</td><td>Rozcieńczenie 1:300 (przeciwciało pierwszorzędowe)</td></tr><tr><td>Mysz anty-FOXA2</td><td>Abnova/Novus</td><td>H00003170-M01</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Kompletna pożywka wzrostowa mTeSR1</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>85870</td><td>Dodaj 100 ml suplementu mTeSR (85870) do jednego 400 ml pożywki mTeSR (85870) i podwielokrotność do probówek 50 ml, unikając zanieczyszczenia. Przechowywać w 4&deg; C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>Przezroczyste rozwiązanie Murraya (znane również jako BABB)</td><td>Murray'a</td><td>N/A</td><td>Benzoesan benzylu 1:2 i alkohol benzylowy.</td></tr><tr><td>Medium do wzorzysk NOG HIO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zasadowe podłoże jelitowe, 100 ng/ml EGF i 100 ng/ml NOGGIN (Dozowanie 25 &mikro; g NOGGIN w 250 &mikro; l sterylny PBS z 0,1% BSA).</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA</td><td>Takara</td><td>740955.25</td><td>Można stosować inne zestawy do izolacji RNA.</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowej powierzchni Nunclon delta 24-dołkowe (Nunc)</td><td>Thermo Scientific</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowej powierzchni Nunclon delta 24-dołkowe pokryte Matrigelem</td><td>Thermo Scientific</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowej powierzchni Nunclon delta 6-dołkowe (Nunc)</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowej powierzchni nunclon delta 6-dołkowe pokryte &nbsp; Matrigel.</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu dla HIO, CTRL HIO i HCO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zasadowe podłoże jelitowe i 100 ng/ml EGF (stężenie końcowe)</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna, 0,5% Triton X (PBS-T)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Podkłady</td><td>Zintegrowane technologie DNA, Inc. (IDT)</td><td>N/A</td><td>Startery są wymienione w tabeli 2 protokołu.</td></tr><tr><td>Królik anty-CDX2</td><td>Marka komórki</td><td>EPR22764Y</td><td>Rozcieńczenie 1:100 (przeciwciało pierwszorzędowe)</td></tr><tr><td>Królik anty-SATB2</td><td>Marka komórki</td><td>EP281 powiedział:</td><td>Rozcieńczenie 1:100 (przeciwciało pierwszorzędowe)</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko BMP-4</td><td>R& Systemy D</td><td>314-BP-010</td><td>Rozpuść liofilizowany proszek w stężeniu 100 &mikro; g/ml w sterylnym 4 mM HCl zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodaj 4,17 ml roztworu HCl do 45,83 ml wody cząsteczkowej, co daje w sumie 50 ml 1 M HCl. Następnie dodaj 200 &micro; L 1 M HCl do 49,8 ml wody molekularnej, co daje łącznie 50 ml 4 mM HCl. Następnie dodać 0,05 g BSA do 50 ml 4 mM HCl i przefiltrować, aby uzyskać sterylność. Podwielokrotność 4 mM HCl 0,1% BSA do 33 probówek mikrowirówek łącznie i przechowywać w temperaturze -20 °C. Dodać 100 &mikro; l sterylnego 4 mM HCl 0,1% BSA do fiolek BMP4 (10 &mikro; g) wykonanie roztworu BMP4 przy 100 &mikro; g/ml.</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko FGF-4</td><td>R& Systemy D</td><td>235-F4-01M</td><td>Rozpuść w 100 &mikro; g/ml w sterylnym PBS zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej. Dodać 0,05 g BSA do 50 ml PBS, aby uzyskać 0,1% BSA. Filtr 0,22 i mikro; M BSA do sterylizacji BSA. Podaniec 10 ml 0,1% BSA w 5 probówkach. Dodać 1 mg FGF-4 do 10 ml sterylnego 0,1% BSA. Porcja 250 &mikro; L do wstępnie schłodzonych 40 probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>ROCK inhibitor Y-27632</td><td>Tocris powiedział:</td><td>1254</td><td>Końcowe stężenie wynosi 10 mM (10 mmol/L). Zawiesić ponownie w DMSO przy 10 mM i wysterylizować filtrem. Dodać 3 ml sterylnego PBS do każdej fiolki. Aliqout 100 & mikro; L inhibitora ROCK w 30 probówkach i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA SuperScript VILO</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-754-250</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe SuperFrost Plus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Związek Tissue Tek OCT</td><td>Firma VWR</td><td>25608-930</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

Specyfikacja regionu jelitowego opisuje proces, w którym unikalna morfologia i funkcja są przekazywane określonym obszarom rozwijającego się przewodu pokarmowego (GI). Specyfikacja regionalna w jelicie jest napędzana przez wiele szlaków rozwojowych, w tym szlak białka morfogenetycznego kości (BMP). W oparciu o normalną specyfikację regionalną opracowano metodę generowania ludzkich organoidów okrężnicy (HCO) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), które obejmują ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hES) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Trzydniowa indukcja sygnalizacji BMP w wystarczającym stopniu kształtuje hodowle rurki środkowej / tylnej w specjalne HCO z białkiem wiążącym sekwencję AT (SATB2) eksprymującym białko 2 (AT), zawierające wszystkie główne typy komórek nabłonkowych obecnych w ludzkiej okrężnicy, a także współtworzące się komórki mezenchymalne. Pominięcie BMP (lub dodanie inhibitora BMP NOGGIN) w tym krytycznym okresie wzorcowania spowodowało powstanie ludzkich organoidów jelitowych (HIO). HIO i HCO morfologicznie i molekularnie przypominają odpowiednio ludzkie rozwijające się jelito cienkie i okrężnicę. Pomimo użyteczności HIO i HCO do badania rozwoju jelit człowieka, generowanie HIO i HCO jest wyzwaniem. W artykule przedstawiono metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania HIO i HCO. Ponadto przedstawiono krytyczne kroki w protokole i zalecenia dotyczące rozwiązywania problemów.

Pomyślna generacja sferoidów podczas etapu indukcji jelita środkowego/tylnego świadczy o prawidłowym wzorcowaniu. W celu potwierdzenia poprawności wzorcowania należy przeprowadzić barwienie IF na CDX2 w sferoidach pływających oraz w monowarstwie. Chociaż barwienie na etapie ostatecznej endodermy (DE) może wskazywać na skuteczność indukcji DE, generacja sferoidów nie jest możliwa bez efektywnej indukcji DE. Aby sprawdzić wydajność indukcji DE, należy przeprowadzić barwienie IF i/lub RT-qPCR dla FOXA2 oraz SOX17.
<p cl...

W tym miejscu opisano szczegółowe metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania ludzkich organoidów jelita cienkiego i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metody te mają na celu poprawę odtwarzalności, rozszerzenie skalowalności i skrócenie czasu pracy wymaganego do posiewu i pasażowania organoidów.

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

Poniższy protokół opisuje wytwarzanie ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ta technika pozwoli użytkownikowi na zbadanie ścieżek zaangażowanych w wzorce jelitowe. Technika ta pozwala użytkownikowi na generowanie organoidów specyficznych dla regionu, które są izogeniczne. Protokół ten może dostarczyć informacji na temat czynników, które regulują tworzenie i utrzymywanie wzorca jelitowego.[Narrator] Rozpocznij od umieszczenia macierzy zewnątrzkomórkowej lub 24-dołkowej płytki pokrytej ECM w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut, aby umożliwić jej osiągnięcie temperatury pokojowej. Umieść mTeSR1 kompletny roztwór do odrywania średnich komórek i zaawansowany DMEM w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól im się rozgrzać przez 30 minut. Przygotować pożywkę galwaniczną w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, dodając 13 mililitrów mTeSR1 i 13 mikrolitrów 10-milimolowej kinazy białkowej Y-27632 związanej z Rho lub inhibitora ROCK. Aby zebrać komórki z płytki sześciodołkowej, odessać pożywkę z trzech do czterech dołków i przemyć raz dwoma mililitrami zaawansowanego DMEM na studzienkę. Zassać zaawansowany DMEM i dozować jeden mililitr roztworu dysocjacji komórek do każdej studzienki. Inkubuj płytkę przez pięć do siedmiu minut w inkubatorze o temperaturze 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oddziel wszelkie grudki komórek, pipetując w górę iw dół cztery do pięciu razy za pomocą pięciomililitrowej pipety w celu przygotowania zawiesiny komórek. Dodaj dwa mililitry zaawansowanego DMEM do każdej studzienki. Delikatnie pipetuj w górę i w dół cztery do pięciu razy i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wirować komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę z probówki bez zasysania osadu komórkowego. I dodać sześć mililitrów przygotowanego podłoża mTeSR1 plus inhibitor ROCK. Delikatnie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół trzy do czterech razy. Następnie przenieś zawiesinę do reszty mTeSR1 i pożywki inhibitora ROCK wewnątrz 50-mililitrowej probówki. Ponownie energicznie zawiesić cztery do pięciu razy i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odessać ECM z płytki 24-dołkowej tuż przed posianiem komórek. Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę iw dół dwa do trzech razy, a następnie dozować 0,5 mililitra zawiesiny komórek do każdej studzienki. Delikatnie kołysz płytką trzy razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara, trzy razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, trzy razy do przodu i do tyłu oraz trzy razy na boki, aby równomiernie rozproszyć komórki. Przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i inkubuj przez 24 godziny. Po 24 godzinach odessać zużyte podłoże. Dodać 0,5 mililitra na studzienkę mTeSR1 i ponownie inkubować przez 24 godziny w tych samych warunkach. Przygotuj kompletną pożywkę Activin pierwszego dnia, rozcieńczając 100 mikrogramów na mililitr roztworu podstawowego Activin A i 100 mikrogramów na mililitr BMP4 w pożywce Activin day one w stożkowej probówce. Podgrzej podłoże w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę mTeSR1 z płytki 24-dołkowej i dodać 0,5 mililitra Activin dziennie po jednym podłożu na dołek. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i inkubuj przez 24 godziny. Sprawdź komórki po 24 godzinach. Przygotować kompletną pożywkę Activin dnia drugiego, rozcieńczając 100 mikrogramów na mililitr roztworu podstawowego Activin A w pożywce Activin dnia drugiego w stożkowej probówce i umieścić probówkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjąć 24-dołkową płytkę różnicującą z inkubatora dwutlenku węgla i usunąć zużyte podłoże. Dozować 0,5 mililitra podgrzanego podłoża Activin day two do dołka i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla na 24 godziny. Przygotować kompletną pożywkę Activin dnia trzeciego, rozcieńczając 100 mikrogramów na mililitr roztworu podstawowego Activin A w pożywce Activin dnia trzeciego w stożkowej probówce i umieścić probówkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń zużytą pożywkę i dozuj 0,5 mililitra pożywki Activin dzień trzeci na dołek. Aby rozpocząć od różnicowania ostatecznej endodermy na sferoidy środkowego jelita tylnego, dodaj 25 mililitrów pożywki indukcyjnej środkowego jelita tylnego z FGF4 w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i umieść ją w kąpieli kulkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Aby przygotować kompletną pożywkę indukcyjną dla środkowego odcinka jelita grubego, dodaj 7,5 mikrolitra CHIR99021 po podgrzaniu pożywki. Usuń zużytą pożywkę, dozuj 0,5 mililitra pożywki indukcyjnej środkowego jelita grubego na dołek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Po tym, jak następnego dnia nastąpiła kondensacja komórek w monowarstwie, zastąp zużytą pożywkę świeżą pożywką indukcyjną dla środkowego jelita grubego i umieść płytkę z powrotem do inkubacji na 24 godziny. Aby uniknąć wyrzucenia pływających sferoid podczas zmiany pożywki, przenieś starą pożywkę do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 300 G przez jedną minutę. Ponownie zawiesić sferoidy w 12,5 mililitrach świeżej pożywki indukcyjnej dla jelita tylnego, dodać 0,5 mililitra na studzienkę do tej samej 24-dołkowej płytki i inkubować przez 24 godziny w inkubatorze. W czwartym dniu indukcji jelita tylnego należy zebrać pływające sferoidy z dołków płytkowych, zbierając pożywkę do 15-mililitrowej probówki, a następnie odwirować przy 300 G przez jedną minutę. Skuteczność ostatecznej indukcji endodermy oceniano, wykonując barwienie immunofluorescencyjne dla FOXA2 i SOX17. Stwierdzono, że ekspresja mRNA przedniego czynnika HOXD3 HOXD3 jest najwyższa w ludzkich organoidach jelitowych lub HIO traktowanych Noggin, mniejsza w nabłonkowym czynniku wzrostu lub EGF i najniższa w ludzkich organoidach okrężnicy lub HCO traktowanych BMP. I odwrotnie, stwierdzono, że ekspresje mRNA HOXA13 i HOXD13 są niskie w HIO i wysokie w HCO. Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono dla SATB2, CDX2 i CDH1 w celu określenia, czy nabłonek HCO był prawidłowo wzorzec.

generation-maintenance-characterization-human-pluripotent-stem-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Organoidy stały się cennymi narzędziami do modelowania chorób. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) kieruje losem komórki podczas generowania organoidów, a użycie systemu, który przypomina tkankę natywną, może poprawić dokładność modelu. W badaniu tym porównano wytwarzanie indukowanych organoidów jelitowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w hydrożelach ECM pochodzenia zwierzęcego i bezksenowęglowych.

Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

Organoidy jelitowe człowieka muszą być unerwione, aby lepiej oddać strukturę i funkcję rodzimego ludzkiego jelita. W tym miejscu przedstawiamy jedną z metod włączania jelitowego układu nerwowego do tych konstruktów.

unerwienie ludzkich organoidów jelitowych

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów wierzchołkowych z jelit ze standardowych kultur organoidów osadzonych w matrycy. Przedstawiono również późniejsze włączenie EdU do aktywnie proliferujących komórek i półautomatyczną kwantyfikację komórek EdU-dodatnich.

Wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania EdU

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Poznaj metody wytwarzania i utrzymywania ludzkich organoidów jelitowych oraz okrężnicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Protokoły te poprawiają powtarzalność i skalowalność badań nad organoidami.

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów