Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poniższy protokół opisuje wytwarzanie ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ta technika pozwoli użytkownikowi na zbadanie ścieżek zaangażowanych w wzorce jelitowe. Technika ta pozwala użytkownikowi na generowanie organoidów specyficznych dla regionu, które są izogeniczne. Protokół ten może dostarczyć informacji na temat czynników, które regulują tworzenie i utrzymywanie wzorca jelitowego.

[Narrator] Rozpocznij od umieszczenia macierzy zewnątrzkomórkowej lub 24-dołkowej płytki pokrytej ECM w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut, aby umożliwić jej osiągnięcie temperatury pokojowej. Umieść mTeSR1 kompletny roztwór do odrywania średnich komórek i zaawansowany DMEM w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól im się rozgrzać przez 30 minut. Przygotować pożywkę galwaniczną w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, dodając 13 mililitrów mTeSR1 i 13 mikrolitrów 10-milimolowej kinazy białkowej Y-27632 związanej z Rho lub inhibitora ROCK. Aby zebrać komórki z płytki sześciodołkowej, odessać pożywkę z trzech do czterech dołków i przemyć raz dwoma mililitrami zaawansowanego DMEM na studzienkę. Zassać zaawansowany DMEM i dozować jeden mililitr roztworu dysocjacji komórek do każdej studzienki. Inkubuj płytkę przez pięć do siedmiu minut w inkubatorze o temperaturze 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oddziel wszelkie grudki komórek, pipetując w górę iw dół cztery do pięciu razy za pomocą pięciomililitrowej pipety w celu przygotowania zawiesiny komórek. Dodaj dwa mililitry zaawansowanego DMEM do każdej studzienki. Delikatnie pipetuj w górę i w dół cztery do pięciu razy i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wirować komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę z probówki bez zasysania osadu komórkowego. I dodać sześć mililitrów przygotowanego podłoża mTeSR1 plus inhibitor ROCK. Delikatnie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół trzy do czterech razy. Następnie przenieś zawiesinę do reszty mTeSR1 i pożywki inhibitora ROCK wewnątrz 50-mililitrowej probówki. Ponownie energicznie zawiesić cztery do pięciu razy i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odessać ECM z płytki 24-dołkowej tuż przed posianiem komórek. Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę iw dół dwa do trzech razy, a następnie dozować 0,5 mililitra zawiesiny komórek do każdej studzienki. Delikatnie kołysz płytką trzy razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara, trzy razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, trzy razy do przodu i do tyłu oraz trzy razy na boki, aby równomiernie rozproszyć komórki. Przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i inkubuj przez 24 godziny. Po 24 godzinach odessać zużyte podłoże. Dodać 0,5 mililitra na studzienkę mTeSR1 i ponownie inkubować przez 24 godziny w tych samych warunkach. Przygotuj kompletną pożywkę Activin pierwszego dnia, rozcieńczając 100 mikrogramów na mililitr roztworu podstawowego Activin A i 100 mikrogramów na mililitr BMP4 w pożywce Activin day one w stożkowej probówce. Podgrzej podłoże w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę mTeSR1 z płytki 24-dołkowej i dodać 0,5 mililitra Activin dziennie po jednym podłożu na dołek. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i inkubuj przez 24 godziny. Sprawdź komórki po 24 godzinach. Przygotować kompletną pożywkę Activin dnia drugiego, rozcieńczając 100 mikrogramów na mililitr roztworu podstawowego Activin A w pożywce Activin dnia drugiego w stożkowej probówce i umieścić probówkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjąć 24-dołkową płytkę różnicującą z inkubatora dwutlenku węgla i usunąć zużyte podłoże. Dozować 0,5 mililitra podgrzanego podłoża Activin day two do dołka i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla na 24 godziny. Przygotować kompletną pożywkę Activin dnia trzeciego, rozcieńczając 100 mikrogramów na mililitr roztworu podstawowego Activin A w pożywce Activin dnia trzeciego w stożkowej probówce i umieścić probówkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń zużytą pożywkę i dozuj 0,5 mililitra pożywki Activin dzień trzeci na dołek. Aby rozpocząć od różnicowania ostatecznej endodermy na sferoidy środkowego jelita tylnego, dodaj 25 mililitrów pożywki indukcyjnej środkowego jelita tylnego z FGF4 w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i umieść ją w kąpieli kulkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Aby przygotować kompletną pożywkę indukcyjną dla środkowego odcinka jelita grubego, dodaj 7,5 mikrolitra CHIR99021 po podgrzaniu pożywki. Usuń zużytą pożywkę, dozuj 0,5 mililitra pożywki indukcyjnej środkowego jelita grubego na dołek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Po tym, jak następnego dnia nastąpiła kondensacja komórek w monowarstwie, zastąp zużytą pożywkę świeżą pożywką indukcyjną dla środkowego jelita grubego i umieść płytkę z powrotem do inkubacji na 24 godziny. Aby uniknąć wyrzucenia pływających sferoid podczas zmiany pożywki, przenieś starą pożywkę do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 300 G przez jedną minutę. Ponownie zawiesić sferoidy w 12,5 mililitrach świeżej pożywki indukcyjnej dla jelita tylnego, dodać 0,5 mililitra na studzienkę do tej samej 24-dołkowej płytki i inkubować przez 24 godziny w inkubatorze. W czwartym dniu indukcji jelita tylnego należy zebrać pływające sferoidy z dołków płytkowych, zbierając pożywkę do 15-mililitrowej probówki, a następnie odwirować przy 300 G przez jedną minutę. Skuteczność ostatecznej indukcji endodermy oceniano, wykonując barwienie immunofluorescencyjne dla FOXA2 i SOX17. Stwierdzono, że ekspresja mRNA przedniego czynnika HOXD3 HOXD3 jest najwyższa w ludzkich organoidach jelitowych lub HIO traktowanych Noggin, mniejsza w nabłonkowym czynniku wzrostu lub EGF i najniższa w ludzkich organoidach okrężnicy lub HCO traktowanych BMP. I odwrotnie, stwierdzono, że ekspresje mRNA HOXA13 i HOXD13 są niskie w HIO i wysokie w HCO. Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono dla SATB2, CDX2 i CDH1 w celu określenia, czy nabłonek HCO był prawidłowo wzorzec.