Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Zademonstrowane tutaj dwie techniki peelingu izolują poszczególne przedziały subkomórkowe pręcików i mogą pomóc w ujawnieniu ważnych procesów fizjologicznych zachodzących w każdym wyspecjalizowanym przedziale u zdrowych i chorych pręcików. Izolowanie różnych przedziałów komórek pręcikowych od siatkówki myszy może być trudne. Te proste techniki wykorzystują niedrogie i powszechne materiały laboratoryjne do niezawodnego izolowania subkomórkowych przedziałów pręcików do analizy białek.

Na początek umieść kawałek bibuły filtracyjnej na szalce Petriego wypełnionej buforem Ames HEPES z bąbelkami 100% tlenu. Następnie, za pomocą pipety transferowej o szerokim otworze, przenieś jeden prostokąt siatkówki wycięty z dwu- lub trzymiesięcznej myszy C57 Black 6J. Ustaw podzieloną siatkówkę wklęsłą do góry i upewnij się, że fotoreceptory są skierowane w dół w kierunku dna naczynia.

Następnie za pomocą pęsety lekko chwyć boki przepołowionej siatkówki i przesuń ją na wierzch bibuły filtracyjnej. Gdy siatkówka zostanie wyśrodkowana, przesuń bibułę filtracyjną w górę, tak aby przepołowiona siatkówka dotykała bibuły filtracyjnej, tworząc zewnętrzny segment pręta lub ROS, aby przyczepność bibuły filtracyjnej. Ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z dołączoną siatkówką z bufora Ames HEPES.

Umieść dolną stronę bibuły filtracyjnej na ręczniku papierowym i przetrzyj dwa do trzech razy do wyschnięcia. Dodaj kroplę Ames HEPES na bok bibuły filtracyjnej z siatkówką i ponownie umieść bibułę filtracyjną na ręczniku papierowym do wyschnięcia. Następnie umieść bibułę filtracyjną z siatkówką z powrotem na szalce Petriego i za pomocą pęsety delikatnie popchnij wszystkie krawędzie przepołowionej siatkówki do góry i odsuń ją od bibuły filtracyjnej ze wszystkich stron.

Delikatnie oderwij siatkówkę od bibuły filtracyjnej, dotykając tylko skrajnego obwodu siatkówki, aby zachować jej integralność strukturalną. Następnie wyjmij bibułę filtracyjną z szalki Petriego i usuń nadmiar płynu na ręczniku papierowym, upewniając się, że strona stykająca się z siatkówką nie styka się z ręcznikiem papierowym. Umieść bibułę filtracyjną z częściową warstwą ROS w oznakowanej probówce na lodzie i utrzymuj obraną siatkówkę zanurzoną w buforze Ames HEPES.

Powtórz proces złuszczania dla tej przepołowionej siatkówki około siedem do ośmiu razy, aby usunąć całą warstwę ROS. Po każdym peelingu umieść bibułę filtracyjną w tej samej probówce, aby połączyć wszystkie ROS wyizolowane z jednej przepołowionej siatkówki. Probówkę zawierającą wszystkie skórki bibuły filtracyjnej izolowanego ROS należy przechowywać na lodzie do natychmiastowego użycia.

Za pomocą pęsety przenieś resztki obrany siatkówki do odpowiednio oznakowanej rurki i trzymaj probówkę na lodzie do natychmiastowego użycia. Aby przygotować próbkę siatkówki do liofilizacji, umieść kawałek bibuły filtracyjnej i przenieś przepołowioną siatkówkę na szalkę Petriego wypełnioną zimnym buforem Ringera. Następnie za pomocą pęsety ostrożnie odwróć siatkówkę tak, aby była zorientowana wklęsła do góry i przesuń ją tak, aby spoczęła na bibule filtracyjnej.

Podnieś bibułę filtracyjną za krawędzie do góry, tak aby przepołowiony kawałek siatkówki dotykał bibuły filtracyjnej. Kontynuuj wyjmowanie bibuły filtracyjnej z roztworu Ringera. Następnie połóż dolną stronę bibuły filtracyjnej na ręczniku papierowym i ostrożnie przetrzyj dwa do trzech razy, aby usunąć nadmiar płynu.

Następnie podnieś bibułę filtracyjną pęsetą i dodaj kroplę zimnego Ringera na bok bibuły filtracyjnej z siatkówką. Ponownie połóż bibułę filtracyjną na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Każdą przylegającą próbkę siatkówki i bibuły filtracyjnej należy przechowywać na szalce Petriego wypełnionej zimnym filtrem Ringera, aż będzie gotowa do zamrożenia wszystkich próbek.

Następnie, za pomocą pęsety, wyjmij każdą próbkę z zimnego bufora Ringera, upewniając się, że pęseta styka się tylko z krawędziami bibuły filtracyjnej, unikając przepołowienia siatkówki. Umieść dolną stronę każdej bibuły filtracyjnej na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Następnie dodaj kroplę zimnego PBS na stronę bibuły filtracyjnej, do której przylega siatkówka i ponownie przetrzyj bibułę filtracyjną na ręczniku papierowym.

Umieść wszystkie kawałki bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i za pomocą niestrzępiącej się bibułki usuń nadmiar płynu otaczającego bibułę filtracyjną. Następnie szczelnie owiń całe naczynie folią aluminiową i upewnij się, że krawędzie folii aluminiowej są zabezpieczone i płynnie wciśnięte w dno szalki Petriego. Przebij garść otworów o średnicy od 0,1 do 0,2 milimetra w pokrywie z folii aluminiowej.

Następnie za pomocą metalowych szczypiec stopniowo zanurzaj pokrytą folią aluminiową szalkę Petriego do ciekłego azotu. Próbki należy przechowywać w ciekłym azocie do czasu, aż będą gotowe do liofilizacji. W celu liofilizacji umieść pokrytą folią aluminiową szalkę Petriego w kolbie do liofilizacji i przymocuj ją do liofilizatora zgodnie z protokołem producenta.

Liofilizuj siatkówki przez 30 minut. Po liofilizacji zbierz zewnętrzny i wewnętrzny segment pręcika, ostrożnie kładąc mały kawałek taśmy na wierzchu liofilizowanej siatkówki i lekko dociskając pęsetą, aby upewnić się, że wiąże się z warstwą fotoreceptora. Powoli odklej taśmę i upewnij się, że zarówno ROS, jak i RIS przylegają do taśmy.

Na pękniętej powierzchni będzie obecny cienki, biały film. To jest RIS. Aby oddzielić ten RIS, umieść kolejny kawałek taśmy i dociśnij taśmę do pękniętej powierzchni.

Następnie umieść kawałek taśmy z tylko pomarańczowo-różową warstwą w probówce mikrowirówki oznaczonej jako ROS, a kawałki taśmy z cienką, białą warstwą w innej probówce oznaczonej RIS. Następnie za pomocą taśmy należy zebrać pozostałą tkankę siatkówki znajdującą się na bibule filtracyjnej, odklejając grubą, białą warstwę. Następnie umieść ten izolat w probówce oznaczonej jako OIS.

W przypadku stosowania tego samego dnia należy przechowywać izolowane warstwy z liofilizowanych siatkówek w temperaturze pokojowej. U zwierząt przystosowanych do ciemności dystrybucja GNAT1 i ARR1 ściśle odpowiadała ich znanym rozkładom stanu ciemnego, gdzie sygnał GNAT1 był wyraźnie najsilniejszy w izolacji ROS, a sygnał ARR1 był bardziej solidny w izolacji ROS. Kwantyfikacja sygnałów GNAT1 i ARR1 wykazała znaczące różnice między warunkami ciemnego światła dla GNAT1 i ARR1 w próbkach ROS i ROS.

Zarówno w ciemnych, jak i jasnych próbkach, sygnały G beat 5S, cytochromu C i aktyny są wykluczone z próbek ROS, co świadczy o braku zanieczyszczenia z innych warstw komórkowych. Dodatkowo sygnał G beta 5L był wyraźnie widoczny w próbkach ROS. Skaningowa mikroskopia elektronowa powierzchni nienaruszonych i złuszczonych liofilizowanych siatkówk wykazała, że przed złuszczeniem taśmą klejącą powierzchnia nienaruszonej liofilizowanej siatkówki ściśle odpowiadała charakterystycznemu cylindrycznemu ROS.

Po początkowym odklejeniu taśmy, ROS i RIS wydawały się być całkowicie usunięte, o czym świadczy jednolita warstwa jądrowa obecna na powierzchni resztkowej, złuszczanej, liofilizowanej siatkówki. Kolejne odklejenia taśmy usuwały RIS z wolnej powierzchni złuszczonej warstwy. Technika ta wykazała również, że immunoreaktywność GRK1 była najbardziej intensywna w próbkach ROS w siatkówkach wystawionych na działanie światła i nieobecna w próbkach OIS.

I odwrotnie, próbki ROS i RIS wykazywały słaby sygnał dla PKC alfa, który zwykle nie jest wykrywany w ROS lub RIS przez barwienie immunofluorescencyjne. Wreszcie, nieoptymalne złuszczanie taśmy może spowodować powstanie lekko zanieczyszczonych próbek. Próbka RIS została zanieczyszczona pewną próbką OIS, wytwarzającą zarówno pasma G beta 5L, jak i G beta 5S, a także wyższy sygnał PKC alfa.

Należy zachować ostrożność podczas liofilizacji siatkówki. Jeśli zostanie zastosowana niewłaściwa technika liofilizacji, siatkówka może się stopić, co uniemożliwi wyizolowanie różnych warstw subkomórkowych pręcików za pomocą taśmy. Zastosowanie tej metody peelingu taśmowego w połączeniu z qRT-PCR pozwoliło na oddzielenie transkryptów fotoreceptorów od reszty siatkówki.