Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek
7 grudnia 2021
Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.
Zademonstrowane tutaj dwie techniki peelingu izolują poszczególne przedziały subkomórkowe pręcików i mogą pomóc w ujawnieniu ważnych procesów fizjologicznych zachodzących w każdym wyspecjalizowanym przedziale u zdrowych i chorych pręcików. Izolowanie różnych przedziałów komórek pręcikowych od siatkówki myszy może być trudne. Te proste techniki wykorzystują niedrogie i powszechne materiały laboratoryjne do niezawodnego izolowania subkomórkowych przedziałów pręcików do analizy białek.
Na początek umieść kawałek bibuły filtracyjnej na szalce Petriego wypełnionej buforem Ames HEPES z bąbelkami 100% tlenu. Następnie, za pomocą pipety transferowej o szerokim otworze, przenieś jeden prostokąt siatkówki wycięty z dwu- lub trzymiesięcznej myszy C57 Black 6J. Ustaw podzieloną siatkówkę wklęsłą do góry i upewnij się, że fotoreceptory są skierowane w dół w kierunku dna naczynia.
Następnie za pomocą pęsety lekko chwyć boki przepołowionej siatkówki i przesuń ją na wierzch bibuły filtracyjnej. Gdy siatkówka zostanie wyśrodkowana, przesuń bibułę filtracyjną w górę, tak aby przepołowiona siatkówka dotykała bibuły filtracyjnej, tworząc zewnętrzny segment pręta lub ROS, aby przyczepność bibuły filtracyjnej. Ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z dołączoną siatkówką z bufora Ames HEPES.
Umieść dolną stronę bibuły filtracyjnej na ręczniku papierowym i przetrzyj dwa do trzech razy do wyschnięcia. Dodaj kroplę Ames HEPES na bok bibuły filtracyjnej z siatkówką i ponownie umieść bibułę filtracyjną na ręczniku papierowym do wyschnięcia. Następnie umieść bibułę filtracyjną z siatkówką z powrotem na szalce Petriego i za pomocą pęsety delikatnie popchnij wszystkie krawędzie przepołowionej siatkówki do góry i odsuń ją od bibuły filtracyjnej ze wszystkich stron.
Delikatnie oderwij siatkówkę od bibuły filtracyjnej, dotykając tylko skrajnego obwodu siatkówki, aby zachować jej integralność strukturalną. Następnie wyjmij bibułę filtracyjną z szalki Petriego i usuń nadmiar płynu na ręczniku papierowym, upewniając się, że strona stykająca się z siatkówką nie styka się z ręcznikiem papierowym. Umieść bibułę filtracyjną z częściową warstwą ROS w oznakowanej probówce na lodzie i utrzymuj obraną siatkówkę zanurzoną w buforze Ames HEPES.
Powtórz proces złuszczania dla tej przepołowionej siatkówki około siedem do ośmiu razy, aby usunąć całą warstwę ROS. Po każdym peelingu umieść bibułę filtracyjną w tej samej probówce, aby połączyć wszystkie ROS wyizolowane z jednej przepołowionej siatkówki. Probówkę zawierającą wszystkie skórki bibuły filtracyjnej izolowanego ROS należy przechowywać na lodzie do natychmiastowego użycia.
Za pomocą pęsety przenieś resztki obrany siatkówki do odpowiednio oznakowanej rurki i trzymaj probówkę na lodzie do natychmiastowego użycia. Aby przygotować próbkę siatkówki do liofilizacji, umieść kawałek bibuły filtracyjnej i przenieś przepołowioną siatkówkę na szalkę Petriego wypełnioną zimnym buforem Ringera. Następnie za pomocą pęsety ostrożnie odwróć siatkówkę tak, aby była zorientowana wklęsła do góry i przesuń ją tak, aby spoczęła na bibule filtracyjnej.
Podnieś bibułę filtracyjną za krawędzie do góry, tak aby przepołowiony kawałek siatkówki dotykał bibuły filtracyjnej. Kontynuuj wyjmowanie bibuły filtracyjnej z roztworu Ringera. Następnie połóż dolną stronę bibuły filtracyjnej na ręczniku papierowym i ostrożnie przetrzyj dwa do trzech razy, aby usunąć nadmiar płynu.
Następnie podnieś bibułę filtracyjną pęsetą i dodaj kroplę zimnego Ringera na bok bibuły filtracyjnej z siatkówką. Ponownie połóż bibułę filtracyjną na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Każdą przylegającą próbkę siatkówki i bibuły filtracyjnej należy przechowywać na szalce Petriego wypełnionej zimnym filtrem Ringera, aż będzie gotowa do zamrożenia wszystkich próbek.
Następnie, za pomocą pęsety, wyjmij każdą próbkę z zimnego bufora Ringera, upewniając się, że pęseta styka się tylko z krawędziami bibuły filtracyjnej, unikając przepołowienia siatkówki. Umieść dolną stronę każdej bibuły filtracyjnej na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Następnie dodaj kroplę zimnego PBS na stronę bibuły filtracyjnej, do której przylega siatkówka i ponownie przetrzyj bibułę filtracyjną na ręczniku papierowym.
Umieść wszystkie kawałki bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i za pomocą niestrzępiącej się bibułki usuń nadmiar płynu otaczającego bibułę filtracyjną. Następnie szczelnie owiń całe naczynie folią aluminiową i upewnij się, że krawędzie folii aluminiowej są zabezpieczone i płynnie wciśnięte w dno szalki Petriego. Przebij garść otworów o średnicy od 0,1 do 0,2 milimetra w pokrywie z folii aluminiowej.
Następnie za pomocą metalowych szczypiec stopniowo zanurzaj pokrytą folią aluminiową szalkę Petriego do ciekłego azotu. Próbki należy przechowywać w ciekłym azocie do czasu, aż będą gotowe do liofilizacji. W celu liofilizacji umieść pokrytą folią aluminiową szalkę Petriego w kolbie do liofilizacji i przymocuj ją do liofilizatora zgodnie z protokołem producenta.
Liofilizuj siatkówki przez 30 minut. Po liofilizacji zbierz zewnętrzny i wewnętrzny segment pręcika, ostrożnie kładąc mały kawałek taśmy na wierzchu liofilizowanej siatkówki i lekko dociskając pęsetą, aby upewnić się, że wiąże się z warstwą fotoreceptora. Powoli odklej taśmę i upewnij się, że zarówno ROS, jak i RIS przylegają do taśmy.
Na pękniętej powierzchni będzie obecny cienki, biały film. To jest RIS. Aby oddzielić ten RIS, umieść kolejny kawałek taśmy i dociśnij taśmę do pękniętej powierzchni.
Następnie umieść kawałek taśmy z tylko pomarańczowo-różową warstwą w probówce mikrowirówki oznaczonej jako ROS, a kawałki taśmy z cienką, białą warstwą w innej probówce oznaczonej RIS. Następnie za pomocą taśmy należy zebrać pozostałą tkankę siatkówki znajdującą się na bibule filtracyjnej, odklejając grubą, białą warstwę. Następnie umieść ten izolat w probówce oznaczonej jako OIS.
W przypadku stosowania tego samego dnia należy przechowywać izolowane warstwy z liofilizowanych siatkówek w temperaturze pokojowej. U zwierząt przystosowanych do ciemności dystrybucja GNAT1 i ARR1 ściśle odpowiadała ich znanym rozkładom stanu ciemnego, gdzie sygnał GNAT1 był wyraźnie najsilniejszy w izolacji ROS, a sygnał ARR1 był bardziej solidny w izolacji ROS. Kwantyfikacja sygnałów GNAT1 i ARR1 wykazała znaczące różnice między warunkami ciemnego światła dla GNAT1 i ARR1 w próbkach ROS i ROS.
Zarówno w ciemnych, jak i jasnych próbkach, sygnały G beat 5S, cytochromu C i aktyny są wykluczone z próbek ROS, co świadczy o braku zanieczyszczenia z innych warstw komórkowych. Dodatkowo sygnał G beta 5L był wyraźnie widoczny w próbkach ROS. Skaningowa mikroskopia elektronowa powierzchni nienaruszonych i złuszczonych liofilizowanych siatkówk wykazała, że przed złuszczeniem taśmą klejącą powierzchnia nienaruszonej liofilizowanej siatkówki ściśle odpowiadała charakterystycznemu cylindrycznemu ROS.
Po początkowym odklejeniu taśmy, ROS i RIS wydawały się być całkowicie usunięte, o czym świadczy jednolita warstwa jądrowa obecna na powierzchni resztkowej, złuszczanej, liofilizowanej siatkówki. Kolejne odklejenia taśmy usuwały RIS z wolnej powierzchni złuszczonej warstwy. Technika ta wykazała również, że immunoreaktywność GRK1 była najbardziej intensywna w próbkach ROS w siatkówkach wystawionych na działanie światła i nieobecna w próbkach OIS.
I odwrotnie, próbki ROS i RIS wykazywały słaby sygnał dla PKC alfa, który zwykle nie jest wykrywany w ROS lub RIS przez barwienie immunofluorescencyjne. Wreszcie, nieoptymalne złuszczanie taśmy może spowodować powstanie lekko zanieczyszczonych próbek. Próbka RIS została zanieczyszczona pewną próbką OIS, wytwarzającą zarówno pasma G beta 5L, jak i G beta 5S, a także wyższy sygnał PKC alfa.
Należy zachować ostrożność podczas liofilizacji siatkówki. Jeśli zostanie zastosowana niewłaściwa technika liofilizacji, siatkówka może się stopić, co uniemożliwi wyizolowanie różnych warstw subkomórkowych pręcików za pomocą taśmy. Zastosowanie tej metody peelingu taśmowego w połączeniu z qRT-PCR pozwoliło na oddzielenie transkryptów fotoreceptorów od reszty siatkówki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia dwie techniki izolacji podkomórkowych przedziałów fotoreceptorów pręcików u myszy, koncentrując się na zrozumieniu procesów fizjologicznych zarówno w stanie zdrowia, jak i choroby. Protokoły wykorzystują żywe siatkówki i liofilizowane próbki, stosując powszechne materiały laboratoryjne do skutecznej izolacji na potrzeby analizy białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia fotoreceptorów
- Analiza białek
Tło
- Izolacja podkomórkowych przedziałów pręcików jest kluczowa dla badania fizjologii fotoreceptorów.
- Istnieją wyzwania w utrzymaniu integralności struktur siatkówki podczas procesów izolacji.
- Powszechne techniki często wymagają zaawansowanych lub drogich narzędzi; to badanie oferuje prostsze alternatywy.
Cel badania
- Opisanie protokołów do izolacji zewnętrznych i wewnętrznych segmentów pręcików z siatkówek mysich.
- Ułatwienie analizy białek izolowanych przedziałów.
- Wsparcie przyszłych badań dotyczących fizjologicznych zmian w fotoreceptorach.
Stosowane metody
- Izolacja żywej siatkówki za pomocą filtru celulozowego i bufru Ames HEPES.
- Proces liofilizacji dla izolacji zewnętrznych i wewnętrznych segmentów.
- Zastosowanie taśmy klejącej do usuwania warstw z liofilizowanej siatkówki.
- Wielokrotne iteracje łuskania dla zapewnienia kompleksowej izolacji warstw.
Główne wyniki
- Opisane metody pozwalają na niezawodne oddzielenie zewnętrznych segmentów pręcików (ROS) i wewnętrznych segmentów pręcików (RIS).
- Testy potwierdziły odrębne sygnały białkowe w ROS i RIS w różnych warunkach świetlnych.
- Badanie wskazuje na znaczne różnice molekularne między izolowanymi przedziałami.
Wnioski
- To dzieło umożliwia lepsze zrozumienie funkcjonalności fotoreceptorów pręcikowych poprzez szczegółową analizę przedziałów.
- Techniki izolacji mogą być szeroko stosowane w badaniach nad biologią fotoreceptorów.
- Wyniki mogą wpłynąć na przyszłe badania nad chorobami siatkówki i patofizjologią fotoreceptorów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating subcellular compartments of rod photoreceptors enables precise measurement of protein distribution, supporting target validation in retinal disease research. These peeling methods provide enriched, compartment-specific fractions for quantitative western blot analysis, improving mechanistic de-risking of photoreceptor targets. The techniques are adaptable to healthy and degenerating retinae, offering translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating rod outer segment (ROS) and inner segment (RIS) for protein-specific analysis.
- Operational Value: Uses inexpensive, common lab materials (filter paper, tweezers, tape) to isolate subcellular compartments without specialized equipment.
- Predictive Value: Facilitates quantitative measurement of photoreceptor protein redistribution under dark- and light-adapted conditions, supporting functional target assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers enriched subcellular fractions (ROS, RIS, OIS) that reduce contamination from other retinal layers, improving assay specificity.
- Operational Value: Simple peeling workflow allows rapid preparation of samples for downstream protein analysis, increasing throughput in early screening.
- Predictive Value: Enables reliable detection of compartment-specific proteins (e.g., GNAT1 in ROS, ARR1 in ROS) under defined physiological conditions, supporting biomarker-aligned assay design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by allowing isolation of compartments from both healthy and degenerating retinae.
- Operational Value: Lyophilization and tape-based peeling preserve structural integrity, enabling consistent sample preparation across experimental conditions.
- Predictive Value: Demonstrates absence of contamination (e.g., exclusion of G beta 5S, cytochrome C, actin from ROS) confirming layer-specific protein signals for reliable translational readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven isolation of photoreceptor compartments prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating ROS and RIS to study protein localization and redistribution.
- Screening: Generates quantitative, compartment-specific protein outputs suitable for assay standardization and reproducibility testing.
- Analytics: Provides measurable readouts (e.g., GNAT1, ARR1, GRK1 signals) that allow comparison across light/dark conditions and disease states.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by enabling protein analysis in disease models of retinal degeneration.
- Enterprise Reuse: Protocol uses standardized, low-cost materials, supporting adaptation across labs and model systems as a reusable isolation capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through compartment-specific protein resolution.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via simple, repeatable peeling steps using accessible lab supplies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of target engagement and subcellular specificity, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on target distribution in photoreceptor compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection and handling of delicate neural tissue under sterile or controlled conditions.
- Dependent on standard lab equipment: Petri dishes, filter paper, tweezers, tape, lyophilizer, and buffers (Ames HEPES, Ringer's, PBS).
- Necessitates cross-team standardization of peeling technique and lyophilization timing to ensure sample integrity and reproducibility.
- Must account for adaptation across model systems, as retinal curvature and layer thickness may vary between species or disease states.
- Practical limitation: suboptimal tape peeling or improper lyophilization can yield contaminated samples, requiring careful technique execution.
