Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej
16 stycznia 2024
Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.
Nasza grupa interesuje się obwodami neuronowymi oraz mechanizmami synaptycznymi leżącymi u podstaw przetwarzania wzrokowego w siatkówce. Laboratorium Morgansa bada molekularne mechanizmy adaptacji do światła w komórkach dwubiegunowych. Laboratorium Sivyera interesuje się tym, jak neurony wewnętrzne siatkówki wpływają na funkcjonowanie komórek zwojowych.
Dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w całej siatkówce jest wyzwaniem zarówno dla badań anatomicznych, jak i fizjologicznych. Neurony wewnętrznej warstwy jądrowej są dostępne w pionowych przekrojach, ale w polu widzenia jest bardzo niewiele neuronów. Ponadto cięcie odciętych bocznych procesów i połączeń może wpływać na badania fizjologiczne.
Usunięcie fotoreceptorów w technice rozdzielonej siatkówki znacząco poprawia dyfuzję przeciwciał do siatkówki wewnętrznej, co sprawia, że znakowanie immunologiczne celów wewnętrznych siatkówki jest ponad 20 razy szybsze w porównaniu do tradycyjnych całomontażowych siatkówek. Rozdzielona siatkówka znacznie poprawia także dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej podczas elektrofizjologii patch-clamp. Technika rozdzielonej siatkówki otworzy drzwi do nowych podejść i przyspieszy tempo naszych eksperymentów. Na przykład planujemy wykorzystać tę technikę do badania danych komórek dwubiegunowych do komórek zwojowe melanopsyny poprzez ekspresję kanałowej rodopsiny w komórkach dwubiegunowych.
Przy szerokim przejściu pipetą przenieś jedno oko myszy na nową szalkę Petriego z lodowatym, świeżym medium Amesa. Używając kleszczy, przypięj nadmiar tkanki łącznej do dna naczynia, aby ustabilizować oko. Teraz przebij oko wzdłuż linii ora serrata igłą 25, aby stworzyć punkt wejścia do nożyczek vanna.
Użyj nożyczek vannas, aby przeciąć ora serrata, aż rogówka się rozdzieli. Za pomocą kleszczy wyjmij soczewkę z oku, a następnie użyj szerokiej pipety transferowej, aby przenieść miskę do misy zawierającej dużą ilość aktywnie węglowodanego Amesa. Przelej jedną miseczkę do szalki Petriego wypełnioną świeżym roztworem węglowodanowego Amesa.
Nożyczkami Vanny zrób małe nacięcie do wewnątrz od krawędzi twardówki. Za pomocą dwóch par kleszczy ostrożnie odklej twardówkę od siatkówki. Teraz przetnij nerw wzrokowy łączący twardówkę z siatkówką, a następnie użyj nożyczek, aby delikatnie oderwać siatkówkę od twardówki, aby ją izolować.
Następnie skalpelem przetnij siatkówkę na pół lub ćwiartki. Używając pipety z szerokim ustkiem, umieść fragmenty siatkówki w dużej ilości nieprzerwanie karbogenizowanego medium Amesa. Powtórz sekcję siatkówki drugiego oka przed rozszczepieniem siatkówki.
Zacznij od zastąpienia podłoża Amesa z szalki Petriego, która zawierała siatkówkę myszy, na świeżą dawkę węglowodanowego Amesa. Użyj pipety do transferu z szerokim pyskiem, aby umieścić fragment rozciętej siatkówki myszy na szklanym szkiełku, z komórką zwoju do góry. Usuń nadmiar płynu delikatną ściereczką, aby ją spłaszczyć.
W razie potrzeby użyj cienkiego pędzla, aby delikatnie pociągnąć krawędzie siatkówki pod mikroskopem sekcyjnym. Użyj kleszczy, aby przyłożyć suchy kawałek błony nitrocelulozowej na siatkówkę, przyklejając go do strony komórek zwojowych. Odwróć siatkówkę, aby położyć nitrocelulozę na szklanym szkiełku i umieść kolejny suchy element błony po stronie fotoreceptora siatkówki.
Teraz zwilż czubek pędzla mediem Ames. Delikatnie naciskaj w dół na górną błonę, aby zapewnić równomierne przyleganie. Następnie przypiń dolną błonę do szkła jedną parą kleszczy, a następnie ostrożnie użyj drugiej pary, aby powoli i równomiernie odklejać górną błonę.
Pozbądź się górnej błony, która zawiera fotoreceptory. Na koniec należy zwrócić dolną błonę zawierającą wewnętrzną siatkówkę do karbogenezowanego ośrodka Amesa. Zacznij od zanurzenia rozszczepionej siatkówki myszy z przymocowanymi błonami nitrocelulozowymi w 4% paradehydu na lodzie przez 30 minut.
Następnie zastąp paraformaldehyd pięciodo do dziesięciu mililitrów PBS w temperaturze pokojowej, aby przemyć rozszczepione siatkówki. Przed usunięciem rozszczepionej siatkówki z nitrocelulozy, użyj hydrofobowego pióra barierowego, aby przygotować okrągłe dołki na szkiełku mikroskopowym. Pozwól studniom wyschnąć na powietrzu przez pięć do dziesięciu minut. Następnie umieść rozszczepione siatkówki w przygotowanych dołkach i dodaj wystarczająco dużo PBS, by je zanurzył.
Pod mikroskopem sekcyjnym delikatnie unieś krawędzie tkanki cienkim pędzlem i okrąż siatkówkę, aby oddzielić ją od błony. Użyj kleszczy i pędzla, aby usunąć błonę spod unoszącej się części siatkówki. Następnie ostrożnie zasysaj pozostałe PBS tak, aby tkanka siatkówki spoczywała na szkiełku mikroskopu, z komórką zwojową do dołu.
Znakowanie immunofluorescencyjne synaptofizyny na górze rozdzielonej siatkówki wskazało, że zakończenia synaptyczne fotoreceptorów zostały zachowane. Jednak jądra fotoreceptorów były nieobecne, co potwierdza, że siatkówka rozdzieliła się przez aksony fotoreceptorów. Integralność synapcji oceniono poprzez znakowanie RGS11 w dendrytach nie-BC oraz CtBP2 w wstążkach synaptycznych fotoreceptorów.
Rozszczepienie nie uszkodziło morfologii zakończeń fotoreceptorowych w zewnętrznej warstwie pleksiformnej. Żywotność RBC w rozdzielonej siatkówce oceniono za pomocą barwnika jądrowego w bliskiej podczerwieni. Regionalna zmienność żywotności komórek w tkankach została zaobserwowana przy wyższej śmierci komórek w niektórych obszarach, przy czym większość czerwonych krwinek pozostaje żywotna po rozszczepieniu.
Znakowanie immunofluorescencyjne antykrwinek przeciwko komórkom alfa PKC oraz poziomym przeciwko kalbendynie-D wykazało szybką dyfuzję przeciwciał w rozdzielonej siatkówce po godzinnej inkubacji.
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę przygotowania siatkówki w preparacie płaskim, która poprawia dyfuzję przeciwciał i ułatwia lepszy dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy siatkówki. Technika znacząco poprawia wydajność eksperymentów immunohistochemicznych, hybrydyzacji in situ oraz elektrofizjologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia siatkówki
- Elektrofizjologia
Tło
- Laboratorium Morgans bada mechanizmy adaptacji świetlnej w komórkach dwubiegunowych.
- Laboratorium Sivyer koncentruje się na neuronach wewnętrznej warstwy siatkówki i ich roli w funkcjonowaniu komórek zwojowych.
- Tradycyjne techniki całkowitego montażu stanowią wyzwanie w badaniu neuronów warstwy jąder wewnętrznych.
- Usuwanie fotoreceptorów umożliwia lepszy dostęp i zmniejsza czas oznaczania przeciwciałami.
Cel badania
- Opracowanie metody, która umożliwia szybszy dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy siatkówki.
- Poprawa wydajności eksperymentów immunooznaczających i elektrofizjologicznych.
- Dalsze badania nad wejściami komórek dwubiegunowych do komórek zwojowych zawierających melanopsynę.
Stosowane metody
- Do przygotowania siatkówki w preparacie płaskim zastosowano technikę sekcji siatkówki ex vivo.
- Model biologiczny obejmował sekcję siatkówki z oczu myszy, umożliwiającą dostęp do neuronów warstwy jąder wewnętrznych.
- Do analizy zastosowano techniki immunofluorescencyjne i elektrofizjologiczne.
- Kluczowymi krokami były staranna sekcja, płukanie w PBS i przeniesienie do medium Ames z karbogenem.
- Dyfuzję przeciwciał oceniono po godzinie inkubacji.
Główne wyniki
- Nowa technika powoduje, że dyfuzja przeciwciał jest ponad 20 razy szybsza niż w konwencjonalnych metodach.
- Integralność synaps fotoreceptorów była zachowana podczas procesu przygotowania.
- Obserwowano zmienność regionalną w żywotności komórek po podzieleniu, przy czym większość komórek siatkówki pozostawała żywotna.
- Wyniki immunofluorescencji potwierdziły zachowanie terminali synaptycznych fotoreceptorów.
Wnioski
- Ta metoda umożliwia łatwiejszy dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy siatkówki dla różnych podejść eksperymentalnych.
- Poprawia szybkość i wydajność immunooznaczania oraz badań fizjologicznych.
- Wyniki mogą mieć zastosowanie w dalszych badaniach nad mechanizmami neuronowymi w siatkówce.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient access to inner nuclear layer neurons is critical for de-risking early-stage ophthalmology targets and validating mechanistic hypotheses in retinal drug discovery. The split retina flatmount preparation accelerates quantitative immunolabeling and electrophysiological interrogation, supporting predictive confidence in neuronal pathway analysis. This capability enhances portfolio triage and informs translational continuity for vision research programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of bipolar and horizontal cell circuitry for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by preserving lateral neuronal connections.
- Facilitates rapid hypothesis testing on synaptic mechanisms relevant to visual processing.
Screening & Assay Development
- Provides a validated biological system for high-throughput immunolabeling and patch-clamp assays.
- Improves assay reproducibility by maintaining synaptic integrity and cell viability.
- Delivers quantitative outputs for screening compound effects on inner retinal neurons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying retinal circuitry implicated in vision disorders.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multiple analytical modalities.
- Reduces risk of artifactual findings by preserving physiological connectivity in the tissue model.
Pipeline & Workflow Integration
This preparation bridges early discovery and preclinical research by enabling robust functional and molecular analyses of inner retinal neurons.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing on neuronal pathways and synaptic mechanisms.
- Screening: Supports rapid, reproducible immunolabeling and electrophysiological readouts.
- Analytics: Provides quantitative measurements of antibody diffusion and cell viability for comparative studies.
- Translational Research: Maintains disease-relevant circuitry for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse retinal research and screening applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal target validation.
- Operational Value: Standardizes preparation for reproducible, scalable workflows across teams.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient advancement of vision research assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of retinal targets and modalities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection and tissue handling for optimal results.
- Needs access to electrophysiology and immunofluorescence instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in multi-site studies.
- Adaptation may be needed for different species or disease models.
- Regional variability in cell viability should be monitored during implementation.
