Name: Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj technikę rozdzielonej siatkówki w badaniach neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej u myszy. Ta metoda przyspiesza dyfuzję przeciwciał ponad dwudziestokrotnie i ułatwia dostęp do neuronów wewnętrznej siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez następujące granty NIH: grant NIH R01EY031596 (dla C.M.); NIH grant R01EY029985 (dla C.M.); P30EY010572 grantu NIH (dla C.M.); NIH grant R01EY032564 (na licencjat). Dziękujemy Tammie Haley za wsparcie techniczne przy przygotowaniu sekcji siatkówki oraz dr Charlesowi Allenowi za hojny wkład w badania sond mRNA FISH użytych w tej pracy.

Studying Bipolar and Horizontal Neuronal Cells in the Murine Split Retina

<ol><li>Morgans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+at+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina.</a> Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).</li>
<li>Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+bipolar+cells%3A+elementary+building+blocks+of+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).</li>
<li>Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Cell+Feedback+to+Cone+Photoreceptors+in+Mammalian+Retina%3A+Novel+Insights+From+the+GABA-pH+Hybrid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li>
<li>Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+remove+photoreceptors+from+whole+mount+retina+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).</li>
<li>Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+retinal+preservation+in+the+photoinducible+I307N+rhodopsin+mutant+mouse%2C+a+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).</li>
<li>Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+semaphorin+signaling+controls+laminar+stratification+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina.</a> Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).</li>
<li>Matsuoka, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance-Cue+Control+of+Horizontal+Cell+Morphology%2C+Lamination%2C+and+Synapse+Formation+in+the+Mammalian+Outer+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina.</a> Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).</li>
<li>Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+Contacts%2C+Mosaics%2C+and+Territories+of+Bipolar+Cells+in+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina.</a> Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).</li>
<li>Thoreson, W. B., Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Cell+Types%2C+Circuits%2C+and+Mechanisms+for+Color+Vision+in+the+Vertebrate+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).</li>
<li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li>
<li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28(2017).</li>
<li>Todorova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Layer+Separation+%28ReLayS%29+method+enables+the+molecular+analysis+of+photoreceptor+segments+and+cell+bodies%2C+as+well+as+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina.</a> Scientific Reports. 12 (1), 20195(2022).</li>
<li>Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+of+retinal+sublayers+from+the+entire+retina+with+special+reference+to+application+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).</li>
<li>Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transgenic+mouse+lines+expressing+Cre-recombinase+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina.</a> Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).</li>
<li>Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermolecular+Interaction+between+Anchoring+Subunits+Specify+Subcellular+Targeting+and+Function+of+RGS+Proteins+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).</li>
<li>Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+Receptor+GPR179+Forms+Macromolecular+Complexes+With+Components+of+Metabotropic+Signaling+Cascade+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).</li>
<li>Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Visualization+of+RNA+and+Protein+Expression+in+Tissue+Using+a+Combined+RNAscopeTM+In+Situ+Hybridization+and+Immunofluorescence+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 2148, Clifton, N.J. 301-312 (2020).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Morgans, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM1+is+required+for+the+depolarizing+light+response+in+retinal+ON-bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).</li>
<li>Alessio, E., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+whole-mount+retinas+with+the+CLARITY+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054(2020).</li>
<li>Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Thickness+Normative+Data+in+Wild-Type+Mice+Using+Customized+Miniature+SD-OCT%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67265(2013).</li>
<li>Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Protocol+for+Retinal+Wholemount+Preparation+for+Imaging+and+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018(2013).</li>
<li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Webvision%3A+The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters in the Retina.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center. (1995).</li>
<li>Chaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+functional+roles+of+horizontal+cells+in+the+retinal+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5540(2017).</li>
<li>Egger, V., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A17+Amacrine+Cells+and+Olfactory+Granule+Cells%3A+Parallel+Processors+of+Early+Sensory+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537(2020).</li>
<li>Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+amacrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic amacrine cell.</a> The Journal of Comparative Neurology. 301 (3), 461-489 (1990).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+analysis+reveals+an+interneuron+with+an+integral+role+in+the+retinal+circuit+for+night+vision%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision.</a> eLife. 9, 56077(2020).</li>
<li>Janssen-Bienhold, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin57+is+expressed+in+dendro-dendritic+and+axo-axonal+gap+junctions+of+mouse+horizontal+cells+and+its+distribution+is+modulated+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).</li>
<li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+excitation+and+inhibition+in+the+dendrites+of+mouse+direction-selective+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells.</a> eLife. 9, 52949(2020).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability%2C+affinity%2C+and+chromatic+variants+of+the+glutamate+sensor+iGluSnFR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR.</a> Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).</li>
<li>Strauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Center-surround+interactions+underlie+bipolar+cell+motion+sensitivity+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina.</a> Nature Communications. 13 (1), 5574(2022).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+for+in+vivo+imaging+of+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA.</a> Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).</li>
<li>Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+Proton-Mediated+Inhibitory+Feedback+at+the+Retinal+Horizontal+Cell-Cone+Synapse+with+Genetically-Encoded+pH+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Po tym, jak fotoreceptory przekształcają absorpcję fotonów w uwalnianie neuroprzekaźników, BC i HC są pierwszymi neuronami siatkówki, które przetwarzają sygnał wzrokowy23. Choć znaczenie tych neuronów jest dobrze doceniane, wiele ich funkcji jest niedo do końca poznanych lub w ogóle niezbadanych. Wiele badań fizjologii BC i HC prawdopodobnie skorzystałoby na przygotowaniu siatkówki na płasko-mocowanym, które poprawiłoby dostęp do neuronów INL, zachowując jednocześnie łączność boczną. Opracowanie metody rozdzielonej siatkówki to wysiłek mający na celu zapewnienie łatwego protokołu do pozyskiwania wysokiej jakości zapisów elektrofizjologicznych oraz danych mikroskopowych od BC i HC w orientacji flatmount. Opisane tutaj przygotowanie rozdzielonej siatkówki można wykonać w około 20 minut na mysz (10 minut na siatkówkę) po izolacji siatkówki, bez użycia specjalistycznego sprzętu. Metoda czerpie inspirację z istniejących procedur usuwania fotoreceptorów, ale oferuje znaczące ulepszenia w zakresie prostoty, szybkości i wszechstronności 4,10,11,12,13. W przeciwieństwie do wcześniejszych metod rozdzielania warstw siatkówki, rozszczepianie siatkówki nie wymaga zamrożenia, liofilizacji ani wielokrotnego nakładania klejów na siatkówkę. Dzięki praktyce niemal wszystkie fotoreceptory można usunąć jednym rozdarciem za pomocą błony nitrocelulozowej. Szybkość i łatwość tego podejścia pozwalają zminimalizować czas, jaki siatkówka spędza poza karbogenezowanym Amesem, co umożliwia wysoką żywotność komórek przez długi czas; rozszczepione siatkówki mogą być utrzymywane w karbogenezowanym medium Amesa przez kilka godzin po rozszczepieniu. Na dowód zdrowia neuronów INL w tym przygotowaniu, barwienie żywych/martwych komórek (Rysunek 4) oraz elektrofizjologia patch-clamp (Rysunek 6) potwierdzają żywotność czerwonych i HC po rozszczepie.
Usunięcie warstwy fotoreceptorowej w rozdzielonych siatkówkach daje znaczącą przewagę podczas immunoznakowania, drastycznie skracając czas dyfuzji przeciwciał do INL. Znakowanie przeciwciał pierwotnych i wtórnych można zakończyć w ciągu 2 godzin, co stanowi znaczną poprawę w porównaniu do konwencjonalnego barwienia płaskiego, które może trwać 72 godziny lub dłużej w zależności od celu: 5,6,7,7,8,20,22. W efekcie dane mikroskopowe mogą być pozyskiwane tego samego dnia co przygotowanie tkanek, co znacznie przyspiesza tempo eksperymentów immunofluorescencyjnych. Aby ułatwić wyżarzanie mRNA sondą, eksperymenty FISH zazwyczaj zalecają znacznie dłuższe czasy wiązania (~24 godziny) niż immunoznakowanie18. Jednak przedstawione tutaj eksperymenty pokazują, że utrwalanie trwające 2 godziny nadal powoduje wyjątkowe oznakowanie FISH (Rysunek 5). Pomimo wydłużenia czasu wiązania z 30 minut do 2 godzin, nie było konieczne wykonywanie etapów pobierania antygenów, aby uzyskać doskonałe znakowanie immunologiczne, ale może to się różnić w zależności od przeciwciała lub antygenu. Leczenie proteazą w protokole FISH może zakłócać znakowanie przeciwciał, prawdopodobnie z powodu zniszczenia celowych epitopów. Problem ten został rozwiązany dzięki zastosowaniu poliklonalnych przeciwciał celujących w wiele epitopów, co zmniejszało prawdopodobieństwo, że zniszczenie epitopów utrudnia immunoznakowanie. Dodatkowo zastosowano umiarkowane leczenie proteazą (proteaza ACD III), aby zapobiec nadmiernej zmianie epitopów, jednocześnie zapewniając wystarczającą penetrację tkanek.
Czasami siatkówka rozdziela się przez zewnętrzną warstwę jądrową (ONL), pozostawiając warstwy somów fotoreceptorowych bez widocznych komórek INL. Aby temu zapobiec, należy upewnić się, że siatkówka leży całkowicie płasko na szkle oraz że wszelkie pozostałości płynu wokół siatkówki zostały usunięte. Mocniejsze naciskanie pędzlem na nitrocelulozę może również pomóc zapobiec pęknięciu ONL. Jeśli błona stanie się zbyt wilgotna lub siatkówka zostanie zgięta na siebie, szanse na skuteczne rozszczepienie znacznie się zmniejszyją. Zastosowanie DAPI do barwienia jąder komórkowych jest przydatne do oceny jakości rozszczepu oraz do określenia pokrycia pozostałych fotoreceptorów. Jądra fotoreceptorów są mniejsze, jaśniejsze i bardziej powierzchowne (Ilustracja uzupełniająca 3A), podczas gdy jądra BC są większe, ciemniejsze i głębsze (Ilustracja uzupełniająca 3B). W niektórych przypadkach płaszczyzna rozdarcia nieznacznie zmienia się na części siatkówki, co skutkuje miejscami, w których ciała komórek fotoreceptorów nie zostały całkowicie usunięte (Rysunek uzupełniający 3C). W zastosowaniach w mikroskopii i elektrofizjologii nie przeszkadza to w zbieraniu wysokiej jakości danych z regionów, gdzie fotoreceptory zostały prawidłowo usunięte; Duże pola odsłoniętej wewnętrznej siatkówki można łatwo znaleźć podczas obrazowania lub nagrywania pipetą patch. Jeśli pożądane jest bardziej pełne usunięcie fotoreceptorów, można wykonać drugie zerwanie dodatkowym kawałkiem błony nitrocelulozowej, choć 100% usunięcie fotoreceptorów nie jest gwarantowane. Dlatego zaleca się ostrożność przy stosowaniu rozdzielonych siatkówek w badaniach ekspresji genów lub proteomiki, gdzie resztki materiału fotoreceptorowego mogą wpływać na wyniki. W przypadku zastosowań pojedynczych komórek takie obawy są nieuzasadnione, ponieważ dane z fotoreceptorów mogą zostać wykluczone z analizy.
Zalety przygotowania rozdzielonej siatkówki są być może najbardziej widoczne w elektrofizjologicznych zapisach szerokopolowych interneuronów. Podczas gdy tradycyjne pionowe cięcia przerywają rozległe procesy komórek szerokopolnych, przygotowanie rozdzielonej siatkówki pozostawia OPL i IPL nienaruszone, pozwalając na przechwytywanie danych z komórek szerokopolnych, takich jak HC24, A1725, TH AC26 i NOS-1 AC27 , które w przeciwnym razie byłyby pomijane w pionowych przekrojach. Dlatego interpretacja wyników i porównanie z wcześniejszymi danymi zebranymi z nacięć siatkówki wymaga starannego przemyślenia. Niemniej jednak, w eksperymentach z farmakologicznymi naśladowcami stymulacji światła wyniki te przypominają dane zarejestrowane z przekrojów siatkówki19. Ekspresując ChR2 pod promotorami specyficznymi dla komórek, można stymulować pożądaną populację komórek, jednocześnie rejestrując BC w INL, aby zbadać wpływ pożądanej komórki na pionową ścieżkę informacyjną. Bezpośrednie rejestrowanie z głębiej neuronów INL, takich jak komórki amakryny, jest również możliwe w rozdzielonej siatkówce. Chociaż w tym przypadku elektroda plastrowa musi najpierw przejść przez bardziej powierzchowne neurony INL, znacznie mniej tkanek blokuje jej drogę w porównaniu do tradycyjnego przygotowania pełnego montażu.
Oprócz pomiaru wpływu komórek szerokokątnego na inne neurony, metoda ta umożliwia bezpośrednie zaciskanie łatek pojedynczych komórek przez HC, których dendryty tworzą rozległą sieć sprzężoną szczelinowo-złączową w OPL28. Komórki poziome wysyłają krytyczne sprzężenie zwrotne do fotoreceptorów, które kształtują przekazywanie informacji pionowych przez siatkówkę. Jednakże, ponieważ pola dendrytyczne HC są odcięte w pionowych fragmentach, brakuje danych rejestrujących pojedynczą komórkę. Prace te przedstawiają anatomicznie i fizjologicznie nienaruszone HC, z których zarejestrowano prądy wywołane ChR2 w potrójnej linii myszy transgenicznej (Rysunek 6 C-E). Poza stymulacją ChR2, rozdzielona siatkówka może być wykorzystywana do badania endogennych prądów HC oraz sprzężenia szczelinowego28. Choć rozdzielona siatkówka stanowi wygodny model do badania łączności synaptycznej i aktywności neuronalnej wywołanej przez chemiczne działanie lub stymulację ChR2, brak fotoreceptorów uniemożliwia bezpośrednie badanie naturalnych odpowiedzi świetlnych lub mechanizmów adaptacji do światła.
Obrazowanie in situ siatkówki poczyniło w ostatnich latach godne podziwu postępy. Jednak większość badań obrazowych ogranicza się do warstwy komórek zwojowe w całych przygotowaniach siatkówki29. Autorzy przewidują, że brak fotoreceptorów w rozdzielonej siatkówce uczyni ją idealnym modelem do obrazowania wapnia na żywo w OPL i INL. Poza obrazowaniem wapnia, model ten ma duży potencjał do wykorzystania z genetycznie kodowanymi biosensorami, takimi jak iGluSnFR30,31, iGABASnFR32 i pHluorin33. W połączeniu z przygotowaniem rozdzielonej siatkówki, te potężne narzędzia mogą zaoferować efektywne podejście do badania interakcji synaptycznych oraz biofizycznych właściwości BC i HC, które przyczyniają się do przetwarzania światła w siatkówce.

Siatkówka to cienka tkanka nerwowa zlokalizowana w tylnej części oka, gdzie światło jest przechwytywane i przetwarzane na sygnał elektrochemiczny, który mózg może interpretować. Z tyłu siatkówki fotoreceptory pręcików i czopków są stymulowane przez światło, co zmniejsza tempo uwalniania toniku neuroprzekaźnika, glutaminianu1. Pierwszymi neuronami, które doświadczają i reagują na tę zmianę stężenia glutaminianu wywołaną światłem, są komórki dwubiegunowe (BC) oraz komórki poziome (HC), których soma znajdują się w najbardziej zewnętrznym obszarze wewnętrznej warstwy jądrowej (INL). Te neurony drugiego rzędu wykonują pierwszy etap przetwarzania sygnału w siatkówce i kształtują kluczowe cechy widzenia, takie jak adaptacja do światła, czułość na kontrast oraz przestrzenna/kolorowa opozycja2. Chociaż te funkcje przypisuje się BC i HC, obwody i mechanizmy biochemiczne leżące u ich podstaw nie są w pełni poznane3. Dlatego rozwój narzędzi i metod do badania fizjologii BC i HC ma kluczowe znaczenie.
Pionowe (poprzeczne) przekroje siatkówki od dawna okazują się najbardziej praktycznym modelem badania BC i HC; jednak niektóre aspekty fizjologii BC i HC są niedostępne dla eksperymentatora w tym modelu. Bezpośrednie zapisy z HC lub pośrednie pomiary ich wpływu na BC nie odzwierciedlają endogennej łączności siatkówki, ponieważ boczne procesy tych komórek są przerywane podczas cięcia. Preparaty całokształtnego zamontowania siatkówki omijają ten problem, zachowując te boczne wyrostki, ale otaczające warstwy siatkówki stanowią wyzwanie w dostępie do tych komórek4. Chociaż istnieje wiele przykładów immunobarwienia 5,6,7,8 oraz patch clamp9 z neuronów INL w całych siatkówkach, istnieje możliwość przyspieszenia i uproszczenia zbierania tych danych. Ograniczenia przekroju poprzecznego oraz wyzwania całego modelu montażowego zainspirowały więc rozwój alternatywnego przygotowania siatkówki na płasko.
Poniższe opracowanie opisuje protokół umożliwiający łatwe usuwanie warstwy fotoreceptorowej z żywych, płaskich siatkówek, aby poprawić dostęp do BC i HC dla uproszczonego patch clamping oraz szybszego, bardziej efektywnego immunoznakowania. Rozerwanie dwóch kawałków błony nitrocelulozowej przymocowanych po obu stronach izolowanej siatkówki rozrywa tkankę przez aksony fotoreceptorów, pozostawiając rozdzieloną siatkówkę, która zachowuje zewnętrzną warstwę pleksiformną (OPL) oraz wszystkie wewnętrzne warstwy siatkówki. Chociaż inni opisywali protokoły mechanicznego rozdzielania warstw siatkówki, metody te są albo słabo przystosowane do stosowania patch clamping i mikroskopii, albo wymagają żmudnej manipulacji tkanką. Kilka z tych metod wymaga mrożonej lub liofilizowanej tkanki do separacji warstw, co czyni je niekompatybilnymi z eksperymentami elektrofizjologii10, 11, 12. Inne są przeznaczone do żywej tkanki, ale wymagają 5-15 kolejnych peelingów z papierem filtracyjnym 4,11 lub leczenia trypsyną13 w celu usunięcia fotoreceptorów. Opisana tutaj technika udoskonala swoje poprzedniki, upraszczając procedurę usuwania fotoreceptorów i rozszerzając zakres dalszych zastosowań.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Szklane pokrywki</td><td>Fisherbrand</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>2 pary kleszczy Dumont #5</td><td>Ted Pella</td><td>38125</td><td></td></tr><tr><td>Igła 25 gauge</td><td>Becton Dickenson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>470 nm LED</td><td>THORLABS</td><td>M470L2</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki zakrzywione 5-306</td><td>Miltex</td><td>5-306</td><td></td></tr><tr><td>9" jednorazowe pipety pasteur&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td>do budowy niestandardowych pipet transferowych</td></tr><tr><td>Mysz Ai80d</td><td>Jackson Laboratories</td><td>25109</td><td>RRID: IMSR_JAX:025109</td></tr><tr><td>Ames Medium z L-glutaminianem</td><td>Biologia USA</td><td>A1372-25</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące wzmacniaczem</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Oprogramowanie Clampex 10.3</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwkalbątyny D28K</td><td>Invitrogen</td><td>PA-5 85669</td><td>RRID: AB_2792808, gatunek gospodarza = królik; Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>przeciwciało przeciw CtBP2</td><td>BD Biosciences</td><td>612044</td><td>RRID:&nbsp; AB_399431, gatunek gospodarza = mysz; Rozcieńczenie 1:5000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw GPR179</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dar od Kirilla Martemianova; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; gatunek gospodarza = owce; Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało alfa przeciw PKC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4334</td><td>RRID: AB_477345, gatunek gospodarza = królik; Rozcieńczenie 1:5000</td></tr><tr><td>Przeciwciało alfa przeciw PKC</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc8393 AF594</td><td>RRID: AB_628142, gatunek gospodarza = mysz; Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwciało przeciw PSD95</td><td>Laboratoria Transdukcji BD</td><td>610495</td><td>RRID:&nbsp; AB_397862, gatunek gospodarza = mysz; Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-RGS11</td><td>NA</td><td>NA</td><td>prezent od Teda Wensela; Baylor College of Medicine w Houston, TX; &nbsp; gatunek gospodarza = królik; rozcieńczenie między 1:1000 a 1:5000</td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwsynaptofizyna P38</td><td>Sigma</td><td>S-S5768</td><td>RRID: AB_477523, gatunek gospodarza = mysz; Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Nośniki montażowe Aquamount</td><td>Epredia</td><td>13800</td><td>Nośniki montażowe na suwakach</td></tr><tr><td>Mysz C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000664</td><td>RRID: IMSR_JAX:000664</td></tr><tr><td>Zbiornik węglowodynowy</td><td>Matheson</td><td>NA</td><td>95% O2 i 5% CO2</td></tr><tr><td>Niestandardowa pipeta transferowa</td><td>Budowa na zamówienie</td><td>NA</td><td>Instrukcje: użyj nożyczek, aby odciąć końcówkę pipety transferowej plastyki w miejscu, gdzie zaczyna się zwężać. Użyj szczypiec, aby bezpiecznie odłamać ostatnie 2-3 cale szklanej pipety pasteur. Włóż wąski koniec szklanej pipety pasteura do szerokiego końca plastikowej pipety transferowej. Owiń parafilm wokół połączenia obu elementów, aby wzmocnić uszczelnienie.</td></tr><tr><td>Cyfrowy miernik mocy optycznej</td><td>THORLABS</td><td>&nbsp; PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcjonujący</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz elektrofizjologii</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop elektrofizjologiczny</td><td>Olympus</td><td>OLIMP, BX50WI</td><td>Mikroskopia gradientowa z kontrastem Dodta</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 40x/1.3&nbsp;</td><td>Leica</td><td>506358</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 63x/1.40&nbsp;</td><td>Leica</td><td>15506350</td><td></td></tr><tr><td>Piec hybrydyzacyjny</td><td>Robbins Scientific</td><td>Model 1000</td><td>tylko dla protokołu RNAscope</td></tr><tr><td>Immedge hydrofobowe zagroda barierowe</td><td>Laboratoria Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Piramal Intensywna Opieka Krytyczna</td><td>66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe (delikatne wycieranie zadań)</td><td>Nauka Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 obiektyw immersyjny olejowy</td><td>Leica</td><td>506358</td><td></td></tr><tr><td>Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 obiektyw immersyjny olejowy</td><td>Leica</td><td>15506350</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Leica</td><td>Wycofane z produkcji</td><td></td></tr><tr><td>Średnia szalka Petriego 15 mm</td><td>Corning</td><td>25060-60</td><td>Oczy są tu przechowywane podczas sekcji siatkówki</td></tr><tr><td>Nożyczki stalowe Merit 97-275</td><td>Zasługi</td><td>97-275</td><td></td></tr><tr><td>Ciągarka mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sonda mRNA Mm-Gabrd-C2</td><td>ACD</td><td>459481-C2</td><td></td></tr><tr><td>Komora eutanazji myszy</td><td>NA</td><td>NA</td><td>budowa na zamówienie; szklana miska Petriego zakrywa mały szklany słoik.</td></tr><tr><td>Filtry membranowe z nitrocelulozą</td><td>GE Healthcare Life Sciences; Co, człowieku</td><td>7184-005</td><td>0,45 & mikro; Rozmiar porów m</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve Corporation</td><td>Picospritzer II&nbsp;</td><td>w tekście określana jako jednostka mikrokomórkowa do wtrysków</td></tr><tr><td>Pipety transferowe plastiku</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td>do budowy niestandardowych pipet transferowych</td></tr><tr><td>Plastikowe rurki</td><td>Tygon</td><td>R-603</td><td>Do podłączenia do zbiornika węglowodorowego</td></tr><tr><td>Platynowa harfa</td><td>Budowa na zamówienie</td><td>NA</td><td>do zakotwiczenia rozszczepionych siatkówek w komorze rejestrującej elektrofizjologii.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Pędzel w rozmiarze 0</td><td>Generyka</td><td>NA</td><td>do spłaszczania siatkówki podczas rozszczepiania.</td></tr><tr><td>Reagent antyfade SlowFade Gold</td><td>Sondy molekularne</td><td>S36937&nbsp;</td><td>w tekście określane jako nośnik anty-fade</td></tr><tr><td>Mała szalka Petriego o średnicy 10 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Oczy są tu umieszczane po enukleacji</td></tr><tr><td>Mała szyba (7,5 cm x 5 cm)</td><td>Generyka</td><td>NA</td><td>Fragmenty siatkówki izolatdyjskiej są umieszczane na nim podczas procesu rozszczepiania</td></tr><tr><td>Superfrost plus szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>Elektrostatycznie naładowane szkiełka mikroskopowe szklane</td></tr><tr><td>Grubościenne pipety borosilikatowe z włóknem i filamentem;</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10HP</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki Vannas; proste</td><td>Titan Medical</td><td>TMS121</td><td>nie specyficzne dla marki; Każde porównywalne nożyczki się sprawdzą</td></tr><tr><td>mysz vGATFLPo</td><td>Jackson Laboratories</td><td>29591</td><td>RRID: IMSR_JAX:029591</td></tr><tr><td>mysz vGlut2Cre</td><td>Jackson Laboratories</td><td>28863, 016963</td><td>RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963</td></tr><tr><td>Zestaw do naprawy zombie NIR</td><td>BioLegend</td><td>423105</td><td>w tekście określany jako MI-NIR</td></tr></tbody></table>

rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Komórki dwubiegunowe oraz poziome komórki siatkówki kręgowców są pierwszymi neuronami, które przetwarzają informacje wzrokowe po wykryciu fotonów przez fotoreceptory. Wykonują podstawowe operacje, takie jak adaptacja do światła, czułość na kontrast oraz przestrzenna i kolorowa przeciwstawność. Pełne zrozumienie precyzyjnych obwodów i mechanizmów biochemicznych rządzących ich zachowaniem przyczyni się do rozwoju badań w neurobiologii wzrokowej oraz medycyny okulistycznej. Jednak obecne przygotowania do badania komórek dwubiegunowych i poziomych (całość siatkówki i pionowe cięcia) są ograniczone pod względem zdolności do uchwycenia anatomii i fizjologii tych komórek. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę usuwania ciał komórek fotoreceptorowych z żywych, płaskich siatkówek myszy, zapewniając lepszy dostęp do komórek dwubiegunowych i poziomych dla efektywnego patch clampingu i szybkiego immunoznakowania. Rozdzielone siatkówki przygotowuje się przez umieszczenie odizolowanej siatkówki myszy między dwoma kawałkami nitrocelulozy, a następnie delikatne ich rozdzielanie. Rozdzielenie rozdziela siatkówkę tuż nad zewnętrzną warstwą pleksiformną, tworząc dwa fragmenty nitrocelulozy: jeden zawierający ciała komórek fotoreceptorowych, a drugi zawierający pozostałą wewnętrzną siatkówkę. W przeciwieństwie do pionowych przecinków siatkówki, rozszczepienie siatkówki nie przerywa wyrostków dendrytycznych neuronów wewnętrznych, umożliwiając rejestrację komórek dwubiegunowych i poziomych, które integrują wkład sieci sprzężonych z połączeniem szczelinowym oraz szerokopolnych komórek amakrynowych. Prace te pokazują wszechstronność tego przygotowania do badania komórek poziomych i dwubiegunowych w elektrofizjologii, immunohistochemii oraz eksperymentach hybrydyzacji in situ .

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by ...

Nasza grupa interesuje się obwodami neuronowymi oraz mechanizmami synaptycznymi leżącymi u podstaw przetwarzania wzrokowego w siatkówce. Laboratorium Morgansa bada molekularne mechanizmy adaptacji do światła w komórkach dwubiegunowych. Laboratorium Sivyera interesuje się tym, jak neurony wewnętrzne siatkówki wpływają na funkcjonowanie komórek zwojowych.Dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w całej siatkówce jest wyzwaniem zarówno dla badań anatomicznych, jak i fizjologicznych. Neurony wewnętrznej warstwy jądrowej są dostępne w pionowych przekrojach, ale w polu widzenia jest bardzo niewiele neuronów. Ponadto cięcie odciętych bocznych procesów i połączeń może wpływać na badania fizjologiczne.Usunięcie fotoreceptorów w technice rozdzielonej siatkówki znacząco poprawia dyfuzję przeciwciał do siatkówki wewnętrznej, co sprawia, że znakowanie immunologiczne celów wewnętrznych siatkówki jest ponad 20 razy szybsze w porównaniu do tradycyjnych całomontażowych siatkówek. Rozdzielona siatkówka znacznie poprawia także dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej podczas elektrofizjologii patch-clamp. Technika rozdzielonej siatkówki otworzy drzwi do nowych podejść i przyspieszy tempo naszych eksperymentów. Na przykład planujemy wykorzystać tę technikę do badania danych komórek dwubiegunowych do komórek zwojowe melanopsyny poprzez ekspresję kanałowej rodopsiny w komórkach dwubiegunowych.Przy szerokim przejściu pipetą przenieś jedno oko myszy na nową szalkę Petriego z lodowatym, świeżym medium Amesa. Używając kleszczy, przypięj nadmiar tkanki łącznej do dna naczynia, aby ustabilizować oko. Teraz przebij oko wzdłuż linii ora serrata igłą 25, aby stworzyć punkt wejścia do nożyczek vanna.Użyj nożyczek vannas, aby przeciąć ora serrata, aż rogówka się rozdzieli. Za pomocą kleszczy wyjmij soczewkę z oku, a następnie użyj szerokiej pipety transferowej, aby przenieść miskę do misy zawierającej dużą ilość aktywnie węglowodanego Amesa. Przelej jedną miseczkę do szalki Petriego wypełnioną świeżym roztworem węglowodanowego Amesa.Nożyczkami Vanny zrób małe nacięcie do wewnątrz od krawędzi twardówki. Za pomocą dwóch par kleszczy ostrożnie odklej twardówkę od siatkówki. Teraz przetnij nerw wzrokowy łączący twardówkę z siatkówką, a następnie użyj nożyczek, aby delikatnie oderwać siatkówkę od twardówki, aby ją izolować.Następnie skalpelem przetnij siatkówkę na pół lub ćwiartki. Używając pipety z szerokim ustkiem, umieść fragmenty siatkówki w dużej ilości nieprzerwanie karbogenizowanego medium Amesa. Powtórz sekcję siatkówki drugiego oka przed rozszczepieniem siatkówki.Zacznij od zastąpienia podłoża Amesa z szalki Petriego, która zawierała siatkówkę myszy, na świeżą dawkę węglowodanowego Amesa. Użyj pipety do transferu z szerokim pyskiem, aby umieścić fragment rozciętej siatkówki myszy na szklanym szkiełku, z komórką zwoju do góry. Usuń nadmiar płynu delikatną ściereczką, aby ją spłaszczyć.W razie potrzeby użyj cienkiego pędzla, aby delikatnie pociągnąć krawędzie siatkówki pod mikroskopem sekcyjnym. Użyj kleszczy, aby przyłożyć suchy kawałek błony nitrocelulozowej na siatkówkę, przyklejając go do strony komórek zwojowych. Odwróć siatkówkę, aby położyć nitrocelulozę na szklanym szkiełku i umieść kolejny suchy element błony po stronie fotoreceptora siatkówki.Teraz zwilż czubek pędzla mediem Ames. Delikatnie naciskaj w dół na górną błonę, aby zapewnić równomierne przyleganie. Następnie przypiń dolną błonę do szkła jedną parą kleszczy, a następnie ostrożnie użyj drugiej pary, aby powoli i równomiernie odklejać górną błonę.Pozbądź się górnej błony, która zawiera fotoreceptory. Na koniec należy zwrócić dolną błonę zawierającą wewnętrzną siatkówkę do karbogenezowanego ośrodka Amesa. Zacznij od zanurzenia rozszczepionej siatkówki myszy z przymocowanymi błonami nitrocelulozowymi w 4% paradehydu na lodzie przez 30 minut.Następnie zastąp paraformaldehyd pięciodo do dziesięciu mililitrów PBS w temperaturze pokojowej, aby przemyć rozszczepione siatkówki. Przed usunięciem rozszczepionej siatkówki z nitrocelulozy, użyj hydrofobowego pióra barierowego, aby przygotować okrągłe dołki na szkiełku mikroskopowym. Pozwól studniom wyschnąć na powietrzu przez pięć do dziesięciu minut. Następnie umieść rozszczepione siatkówki w przygotowanych dołkach i dodaj wystarczająco dużo PBS, by je zanurzył.Pod mikroskopem sekcyjnym delikatnie unieś krawędzie tkanki cienkim pędzlem i okrąż siatkówkę, aby oddzielić ją od błony. Użyj kleszczy i pędzla, aby usunąć błonę spod unoszącej się części siatkówki. Następnie ostrożnie zasysaj pozostałe PBS tak, aby tkanka siatkówki spoczywała na szkiełku mikroskopu, z komórką zwojową do dołu.Znakowanie immunofluorescencyjne synaptofizyny na górze rozdzielonej siatkówki wskazało, że zakończenia synaptyczne fotoreceptorów zostały zachowane. Jednak jądra fotoreceptorów były nieobecne, co potwierdza, że siatkówka rozdzieliła się przez aksony fotoreceptorów. Integralność synapcji oceniono poprzez znakowanie RGS11 w dendrytach nie-BC oraz CtBP2 w wstążkach synaptycznych fotoreceptorów.Rozszczepienie nie uszkodziło morfologii zakończeń fotoreceptorowych w zewnętrznej warstwie pleksiformnej. Żywotność RBC w rozdzielonej siatkówce oceniono za pomocą barwnika jądrowego w bliskiej podczerwieni. Regionalna zmienność żywotności komórek w tkankach została zaobserwowana przy wyższej śmierci komórek w niektórych obszarach, przy czym większość czerwonych krwinek pozostaje żywotna po rozszczepieniu.Znakowanie immunofluorescencyjne antykrwinek przeciwko komórkom alfa PKC oraz poziomym przeciwko kalbendynie-D wykazało szybką dyfuzję przeciwciał w rozdzielonej siatkówce po godzinnej inkubacji.

split-retina-as-an-improved-flatmount-preparation-for-studying-inner

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Tradycyjnie w pionie kawałek i cały montażu przygotowanie siatkówce były używane w badaniach funkcji siatkówki obwodów. Poniżej opiszemy powieści krojenia metody zachowania dendrytycznych morfologii neuronów siatkówki nienaruszone.

Poziome Przygotowanie Kromka Retina

Nieludzkie naczelne są istotnym gatunkiem translacyjnym dla naszego zrozumienia rozwoju i starzenia się. Organizacja anatomiczna siatkówki naczelnych może dostarczyć ważnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi.

Brama do mózgu: sekcja oka naczelnych

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Siatkówka gryzonia od dawna jest uznawana za dostępne okno do mózgu. W tym artykule technicznym przedstawiamy protokół, który wykorzystuje mysi model retinopatii indukowanej tlenem do badania mechanizmów, które prowadzą do niepowodzenia regeneracji naczyń w ośrodkowym układzie nerwowym po urazie niedokrwiennym. Opisany system można również wykorzystać do zbadania strategii wspomagających odrastanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie siatkówki i ośrodkowego układu nerwowego.

Ocena regeneracji naczyń w OUN za pomocą siatkówki myszy

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Obrazowanie tkanki siatkówki może dostarczyć informacji o pojedynczej komórce, której nie można uzyskać tradycyjnymi metodami biochemicznymi. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków siatkówki od danio pręgowanego do obrazowania konfokalnego. Fluorescencyjne czujniki kodowane genetycznie lub barwniki wskaźnikowe umożliwiają wizualizację wielu procesów biologicznych w różnych typach komórek siatkówki.

Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Poznaj technikę rozdzielonej siatkówki w badaniach neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej u myszy. Ta metoda przyspiesza dyfuzję przeciwciał ponad dwudziestokrotnie i ułatwia dostęp do neuronów wewnętrznej siatkówki.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej (Wideo) | JoVE Journal

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Przeglądaj więcej filmów