Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Protokół ten jest pierwszym, który opisuje, w jaki sposób przetwarzać i oceniać rozmiar myszy pod kątem patologii RP przy użyciu transmisji światła, mikroskopii elektronowej i konfokalnej. Główną zaletą tego protokołu jest włączenie ilościowych ocen patologii RP, wykorzystujących te trzy techniki obrazowania do porównań statystycznych. Techniki opisane w tym protokole mogą również pomóc w poszerzeniu naszej wiedzy na temat szlaków molekularnych ważnych dla zdrowia RPE.

Osoby, które wcześniej nie analizowały rozmiaru myszy, mogą mieć problemy z tym protokołem. Sugerujemy, aby osoby te ćwiczyły z niektórymi myszami, aby opanować techniki opisane w tym protokole. Na początek przygotuj grawitacyjny system perfuzyjny na chłonnym podkładzie do perfuzji serca w dygestorium.

Wlać 40 mililitrów świeżo przygotowanego buforu utrwalającego do cylindra strzykawki systemu perfuzyjnego. Obróć zawór równolegle do przewodu rurowego, aby umożliwić przepływ bufora przez przewód rurowy. Przepłucz linię, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte z linii.

Następnie obróć zawór prostopadle do przewodu rurowego, aby zapobiec przepływowi bufora do przewodu rurowego. Aby wykonać perfuzję serca, przenieś uśpioną mysz na płytką tacę w pobliżu systemu perfuzyjnego. Z brzuchem skierowanym do góry.

Spryskaj brzuch 70% etanolem, a następnie wykonaj pięciocentymetrowe dolne cięcie za pomocą zakrzywionych nożyczek i kleszczy przez skórę i ścianę brzucha po lewej stronie myszy poniżej klatki piersiowej. Przystąp do wykonania trzycentymetrowego cięcia przyśrodkowego przez skórę i ścianę brzucha w górnej części dolnego cięcia. Wykonaj kolejne pięciocentymetrowe dolne cięcie na końcu przyśrodkowego cięcia przez skórę i ścianę brzucha po najdalszej prawej stronie myszy poniżej klatki piersiowej.

Wykonaj kolejne trzycentymetrowe nacięcie przyśrodkowe, aby usunąć płat skóry brzucha za pomocą zakrzywionych kleszczy. Następnie przetnij przeponę i mostek, aby odsłonić serce. Włóż igłę miernika do lewej komory serca i przekręć zawór.

Przetnij prawy przedsionek zakrzywionymi nożyczkami, aby umożliwić wydostanie się krwi i utrwalacza z serca. Pozwól, aby 10 mililitrów buforu utrwalającego przenikało mysz przez jedną do dwóch minut lub do momentu, gdy wątroba stanie się blada i krew nie będzie wypływać z prawego przedsionka. Po zakończeniu perfuzji przekręć zawór prostopadle do przewodu rurowego, aby zatrzymać przepływ bufora.

Aby zanużować oczy, wyjmij mysz z płytkiej tacki i umieść ją na chłonnym podkładzie w dygestorium. Następnie ustaw głowę myszy tak, aby lewe oko było skierowane w stronę eksperymentatora, a prawe oko było poza zasięgiem wzroku. Opisz górną stronę oka za pomocą barwnika do znakowania tkanek.

Delikatnie popchnij kciukiem i palcem wskazującym w okolice oczodołu, aby wysunąć oko z oczodołu. Następnie za pomocą zakrzywionych nożyczek przytrzymaj oko ostrzem pod kątem 30 stopni od oczodołu i przetnij wokół oka. Zdejmij gałkę oczną z głowy za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieść ją na chłonnym podkładzie.

Naciąć rogówkę ostrzem skalpela numer 11 i umieścić oko zakrzywionymi kleszczami w dwumililitrowej mikroprobówce zawierającej dwa mililitry buforu utrwalającego. Po zarodkowaniu obu oczu inkubuj je w buforze utrwalającym przez noc na wytrząsarce w pomieszczeniu o czterech stopniach z prędkością 75 obr./min. Następnego dnia zastąpić bufor utrwalający dwoma mililitrami PBS i inkubować przez 10 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej i 75 obr./min.

Następnie, aby wygenerować tylne segmenty, umieść oko na szalce Petriego wypełnionej PBS pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie podnieś tłuszcz i mięśnie z gałki ocznej za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Ostrożnie przytnij tłuszcz i mięśnie mikronożyczkami preparacyjnymi w kierunku równoległym do gałki ocznej, aż gałka oczna będzie miała jednolity niebieskawo-kolor Umieść kleszcze z cienką końcówką w miejscu nakłucia rogówki i przetnij na obwodzie rogówki, zaczynając od miejsca nakłucia, za pomocą mikronożyczek preparujących, aby usunąć rogówkę i tęczówkę z gałki ocznej.

Następnie za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie wyjmij soczewkę z gałki ocznej, aby uzyskać tylny segment. Umieść tylny segment w probówce zawierającej dwa mililitry PBS i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce do czasu użycia. Przenieść oko na szalkę Petriego zawierającą PBS i usunąć rogówkę i tęczówkę, jak pokazano.

Wyciągnij obiektyw za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Następnie za pomocą dwóch kleszczyków z cienką końcówką delikatnie oddziel siatkówkę nerwową od tylnego segmentu. Ostrożnie przeciąć siatkówkę nerwową w głowie nerwu wzrokowego w celu usunięcia z tylnej muszli ocznej.

Umieść muszlę oczną w dwumililitrowej mikroprobówce zawierającej pięć mikrolitrów PBS. Aby zamocować tylne muszle oczne, dodaj 500 mikrolitrów metanolu do tkanki i inkubuj na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez pięć minut. Powtórzyć utrwalanie metanolu trzy razy z końcową inkubacją przez dwie godziny.

Po utrwaleniu przemyj tkankę trzykrotnie PBS, a następnie przejdź do barwienia immunofluorescencyjnego i wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej. Czteromiesięczne myszy TMEM 135 TG wykazały znaczne zmniejszenie pigmentowanego nabłonka siatkówki lub grubości RPE w odległości 600 i 900 mikrometrów od nerwu wzrokowego, w porównaniu z myszami typu dzikiego w tym samym wieku. Obliczono przypadki patologii RPE, w tym mikrowascuolizację, makrowakuolizację i migrację 325-dniowych myszy WT i TMEM 135 TG.

Średnia częstość mikrowakuolizacji RPE była niższa u myszy dzikich w porównaniu z myszami TMEM 135 TG. Nie wykryto makrowakuolizacji i migracji RPE w typie dzikim w porównaniu ze średnimi wartościami obserwowanymi u myszy TMEM 135 TG. W transmisyjnej mikroskopii elektronowej w 24-miesięcznych siatkówkach zaobserwowano podstawowe złogi laminarne, których nie było w dwumiesięcznych siatkówkach.

Analiza skumulowanych częstości wysokości podstawowych osadów laminarnych wykazała przesunięcie na prawo linii u 24-miesięcznego dziecka w porównaniu z dwumiesięcznym, wykazując wzrost złogów u 24-miesięcznych myszy. Obserwacja ta została poparta większą średnią wysokością w 24-miesięcznych siatkówkach. RPE u czteromiesięcznych myszy TMEM 135 TG było dysmorficzne.

Siatkówki TMEM 135 TG są większe i mniej gęste niż siatkówki typu dzikiego w tym samym wieku. Zaobserwowano również więcej wielojądrowych komórek RPE w siatkówkach TG w porównaniu z grupą kontrolną. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogli ocenić określone szlaki za pomocą technik biologii molekularnej u myszy, co może przyczynić się do zrozumienia, w jaki sposób te patologie RP rozwijają się u myszy.

Protokół ten pomoże ustandaryzować fenotypowanie RP u myszy, co przełoży wyniki badań na myszach na inne modele AMD i pomoże w zrozumieniu patobiologii AMD.