Name: Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Naucz się oceny patologii nabłonka barwnikowego siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. Wykorzystaj mikroskopię świetlną, elektronową i konfokalną do ilościowej analizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Satoshi Kinoshita i University of Wisconsin (UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory (TRIP) za przygotowanie naszych tkanek do mikroskopii świetlnej. Ten rdzeń jest wspierany przez Wydział Patologii i Medycyny Laboratoryjnej UW, University of Wisconsin Carbone Cancer Center (P30 CA014520) oraz Biuro Dyrektora NIH (S10OD023526). Mikroskopię konfokalną wykonano w Zespole Biochemii UW Optical Core, który powstał przy wsparciu Zakładu Biochemii UW. Prace te były również wspierane przez granty z National Eye Institute (R01EY022086 dla A. Ikedy; R01EY031748 C. Bowesowi Rickmanowi; P30EY016665 do Zakładu Okulistyki i Nauk Wizualnych UW; P30EY005722 do Duke Eye Center; NIH T32EY027721 do M. Landowskiego; F32EY032766 do M. Landowskiego), Timothy William Trout Chairmanship (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); oraz nieograniczony grant z Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

<ol><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).</li>
<li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+age-related+macular+degeneration+%28AMD%29%3A+relationships+between+the+photoreceptor%2Fretinal+pigment+epithelium%2FBruch%27s+membrane%2Fchoriocapillaris+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progess+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).</li>
<li>Bharti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+to+study+retinal+pigment+epithelium-related+pathogenesis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration.</a> Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).</li>
<li>Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+models+and+therapies+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Cellular models and therapies for age-related macular degeneration.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).</li>
<li>Landowski, M., Bowes Rickman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lipid+metabolism+for+the+treatment+of+age-related+macular+degeneration%3A+Insights+from+preclinical+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).</li>
<li>Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models of age related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).</li>
<li>Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+retinal+diseases+and+their+applicability+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperreflective+foci%2C+optical+coherence+tomography+progression+indicators+in+age-related+macular+degeneration%2C+include+transdifferentiated+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34(2021).</li>
<li>Ding, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+complement+factor+H+prevents+age-related+macular+degeneration-like+retina+damage+and+kidney+abnormalities+in+aged+Cfh+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice.</a> The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).</li>
<li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+project+MACULA+retinal+pigment+epithelium+grading+system+for+histology+and+optical+coherence+tomography+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).</li>
<li>Ding, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-amyloid+therapy+protects+against+retinal+pigmented+epithelium+damage+and+vision+loss+in+a+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histologic+findings+in+age-related+macular+degeneration+with+RPE+flatmount+images%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images.</a> Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).</li>
<li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+A+comparison+to+unaffected+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).</li>
<li>Gambril, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+retinal+pigment+epithelium+dysmorphia+and+loss+of+histologic+autofluorescence+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).</li>
<li>Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+atrophy%3A+a+histopathological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Geographic atrophy: a histopathological assessment.</a> JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).</li>
<li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+retinal+pigment+epithelium+phenotypes+in+the+transition+to+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Retina. 36, 12-25 (2016).</li>
<li>Sura, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+contributions+of+basal+laminar+deposit+and+Bruch%27s+membrane+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19(2020).</li>
<li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160(2018).</li>
<li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+morphology+of+human+macular+and+peripheral+Bruch%27s+membrane+in+older+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes.</a> Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).</li>
<li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy%3A+a+clinicopathological+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).</li>
<li>Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biometrics%2C+impact%2C+and+significance+of+basal+linear+deposit+and+subretinal+drusenoid+deposit+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33(2021).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).</li>
<li>Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial-section+electron+microscopy+using+automated+tape-collecting+ultramicrotome+%28ATUM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM).</a> Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).</li>
<li>Yamaguchi, M., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+of+microorganisms+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56235(2018).</li>
<li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+4%3A+improvements+in+speed%2C+utility+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).</li>
<li>Landowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Tmem135+leads+to+retinal+pigmented+epithelium+pathologies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16(2020).</li>
<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+age-related+changes+to+the+elastic+lamina+of+Bruch%27s+membrane+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelial+cell+multinucleation+in+the+aging+eye+-+a+mechanism+to+repair+damage+and+maintain+homoeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis.</a> Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).</li>
<li>Ortín-Martínez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-topographic+maps+for+regionally+enhanced+analysis+of+visual+space+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).</li>
<li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119(2022).</li>
<li>Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+Potential+targets+for+protection+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).</li>
<li>Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+fundus+and+retinal+studies+with+SD-OCT%3A+a+comparison+of+five+mouse+inbred+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains.</a> Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).</li>
<li>Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+correlation+of+mouse+photoreceptor-RPE+thickness+between+SD-OCT+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).</li>
<li>Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structural+assessments+of+ocular+disease+in+rodent+models+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61588(2020).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li>
</ol>

Autorzy tego protokołu nie ujawniają informacji i nie pozostają w konflikcie interesów.

W tym artykule przedstawiliśmy protokół fenotypowania do oceny strukturalnych patologii RPE w modelach mysich. Opisaliśmy etapy wymagane do przetwarzania oczu dla różnych technik obrazowania, w tym mikroskopii świetlnej, elektronów transmisyjnych i konfokalnej, a także ilościowe określenie typowych patologii obserwowanych za pomocą tych metod obrazowania. Udowodniliśmy skuteczność naszego protokołu fenotypowania RPE, badając Tmem135 TG i 24-miesięczne myszy WT, ponieważ myszy te wykazują patologie RPE 3...

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest powszechną chorobą powodującą ślepotę, która dotyka populacje powyżej 55 roku życia1. Wielu badaczy uważa, że dysfunkcja w obrębie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) jest wczesnym i kluczowym zdarzeniem patobiologicznym w AMD2. RPE to monowarstwa spolaryzowanych komórek, której zadaniem jest utrzymanie homeostazy sąsiadujących fotoreceptorów i naczyniówek krwionośnych3. Istnieje wiele modeli do badania mechanizmów związanych z chorobą w RPE, w tym modele hodowli komórkowych4,5 i myszy6,7,8. Niedawny raport opisał ustandaryzowane protokoły i kryteria kontroli jakości dla modeli hodowli komórkowych RPE4, ale żaden raport nie próbował ustandaryzować fenotypowania RPE w modelach mysich. W rzeczywistości w wielu publikacjach na temat mysich modeli AMD brakuje pełnego opisu RPE lub ilościowego określenia patologii RPE w nich. Ogólnym celem tego protokołu jest przedstawienie standardowych metod fenotypowania RPE wraz z bezstronnymi ocenami ilościowymi dla naukowców korzystających z mysich modeli AMD.
Poprzednie publikacje odnotowały obecność kilku patologii RPE u myszy za pomocą trzech technik obrazowania. Na przykład mikroskopia świetlna pozwala naukowcom zobaczyć ogólną morfologię mysiej siatkówki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) i wykryć patologie RPE, takie jak przerzedzenie RPE, wakuolizacja i migracja. Przykładem przerzedzania RPE w modelu myszy AMD jest odchylenie wysokości RPE od odpowiednich kontrolek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Wakuolizację RPE można podzielić na dwie oddzielne kategorie: mikrowakuolizację (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C) i makrowakuolizację (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Mikrowakuolizację RPE podsumowuje się obecnością wakuoli w RPE, które nie wpływają na jego całkowitą wysokość, podczas gdy makrowakuolizacja jest wskazywana przez obecność wakuoli, które wystają do zewnętrznych segmentów fotoreceptorów. Migrację RPE wyróżnia się ogniskowym agregatem pigmentu nad monowarstwą RPE w przekroju siatkówki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E). Należy zauważyć, że migrujące komórki RPE w oczach dawcy AMD wykazują immunoreaktywność na markery komórek odpornościowych, takie jak klaster różnicowania 68 (CD68)9, i mogą reprezentować komórki odpornościowe pochłaniające szczątki RPE lub RPE ulegające transdyferencjacji9. Inna technika obrazowania, zwana transmisyjną mikroskopią elektronową, może pozwolić naukowcom na wizualizację ultrastruktury RPE i jego błony podstawnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Ta technika może zidentyfikować dominujący depozyt sub-RPE u myszy, znany jako podstawowy depozyt laminarny (BLamD) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B)10. Wreszcie, mikroskopia konfokalna może ujawnić strukturę komórek RPE poprzez obrazowanie płaskich mocowań RPE (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). Ta metoda może wykryć dysmorfię RPE, odchylenie RPE od klasycznego kształtu plastra miodu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Może również wykrywać wielojądrowość RPE, obecność trzech lub więcej jąder w komórce RPE (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C). Aby zapoznać się z podsumowaniem typów patologii RPE obecnych w obecnych modelach myszy AMD, odsyłamy badaczy do tych przeglądów z literatury6,7.
Badacze badający AMD powinni być świadomi zalet i wad używania myszy do badania patologii RPE przed protokołem fenotypowania. Myszy są korzystne ze względu na ich stosunkowo krótką żywotność i opłacalność, a także możliwość manipulacji genetycznej i farmakologicznej. Myszy wykazują również zmiany zwyrodnieniowe RPE, w tym migrację RPE, dysmorfię i wielojądrowość, które obserwuje się w oczach dawcy AMD11,12,13,14,15,16,17; sugeruje to, że podobne mechanizmy mogą leżeć u podstaw rozwoju tych patologii RPE u myszy i ludzi. Istnieją jednak kluczowe różnice, które ograniczają przekładalność badań na myszach na ludzkie AMD. Po pierwsze, myszy nie mają plamki żółtej, anatomicznie odrębnego obszaru ludzkiej siatkówki niezbędnego do ostrości wzroku, który jest preferencyjnie dotknięty w AMD. Po drugie, niektóre patologie RPE u myszy, takie jak ścieńczenie RPE i wakuolizacja, zwykle nie są obserwowane w oczach dawcy AMD18. Po trzecie, u myszy nie rozwijają druzy, co jest cechą charakterystyczną patologii AMD19. Druzy to złogi zawierające lipidy i białka z bardzo małą ilością białek błony podstawnej, które tworzą się między blaszką podstawną RPE a wewnętrzną warstwą kolagenową błony Brucha (BrM)19. Druzy różnią się od BLamD, powszechnego depozytu sub-RPE u myszy, zarówno pod względem składu, jak i lokalizacji anatomicznej. BLamD to zależne od wieku i stresu nieprawidłowości wzbogacone w macierz zewnątrzkomórkową, które tworzą się między blaszką podstawną RPE BrM a podstawnymi fałdami klasy RPE<sup="xref">20. Co ciekawe, BLamD mają podobny skład białkowy i wygląd zarówno u myszy, jak i u ludzi6,10,21. Ostatnie prace sugerują, że BLamD mogą działać w patobiologii AMD, wpływając na progresję AMD do późniejszych stadiów18,22; w związku z tym złogi te mogą reprezentować chory RPE w siatkówce myszy. Wiedza na temat tych korzyści i ograniczeń ma kluczowe znaczenie dla naukowców zainteresowanych przełożeniem wyników badań na myszach na AMD.
W tym protokole omawiamy metody przygotowania oczu do światła, transmisji elektronów i mikroskopii konfokalnej w celu wizualizacji patologii RPE. Opisujemy również, jak w sposób bezstronny określić ilościowo patologie RPE do badań statystycznych. Jako dowód słuszności koncepcji wykorzystujemy protokół fenotypowania RPE do zbadania strukturalnych patologii RPE obserwowanych u myszy z nadekspresją białka transbłonowego 135- (Tmem135) i starzejących się myszy C57BL / 6J typu dzikiego (WT). Podsumowując, naszym celem jest opisanie metodologii fenotypowania w celu scharakteryzowania RPE w modelach myszy AMD, ponieważ obecnie nie ma dostępnych standardowych protokołów. Naukowcy zainteresowani badaniem i ilościowym określaniem patologii fotoreceptorów lub naczyniówki, które są również dotknięte w mysich modelach AMD, mogą nie uznać tego protokołu za przydatny w swoich badaniach.

<table><tbody><tr><td>0,1 M Bufor kakodylowy pH7,2</td><td>PolyScientiifc R& D Company</td><td>S1619</td><td></td></tr><tr><td>100 Capacity Slide Box Do</td><td></td><td></td><td>tego protokołu potrzebne są dwa (jeden dla H& Prowadnice barwione elektrycznie i jedna do płaskich mocowań RPE.)</td></tr><tr><td>100% etanol&nbsp;</td><td>MDS Warehouse</td><td>2292-CASE</td><td>Może być używany do wytwarzania rozcieńczonych roztworów etanolu w tym protokole.</td></tr><tr><td>1-kierunkowy kran odcinający, 2 żeńskie zamki Luer</td><td>Qosina</td><td>11069</td><td></td></tr><tr><td>1x roztwór buforu fosforanowego (PBS)</td><td></td><td></td><td>W tym protokole można użyć wstępnie przygotowanego 1x PBS.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroprobówki 2,0 ml</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-283-LR</td><td></td></tr><tr><td>24 Kapsułka do osadzania wnęki Substytut formy</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70165</td><td></td></tr><tr><td>24-calowe rurki PVC z końcówkami Luer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1376778</td><td></td></tr><tr><td>400 Mesh Gilder Cienkie siatki z siatki kwadratowej</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>95% etanolu</td><td>MDS Magazyn</td><td>2293-CASE</td><td></td></tr><tr><td>Chłonne podkłady z wodoodporną barierą dla wilgoci (23 cale na 24 cale)</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr><tr><td>Regulowany 237 ml&nbsp; Butelka z rozpylaczem</td><td>VWR</td><td>23609-182</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 Sprzężony osioł anty-królik IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>BD Precyzyjny ślizg 19 Igła strzykawki</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z192546</tr><tr><td>Kleszcze paprociowe; Zakrzywiony; drobne ząbkowania krzyżowe; 4 "Długość, 1 mm Szerokość końcówki</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-5211</td><td>Znany w tym protokole jako zakrzywione kleszcze.</td></tr><tr><td>Szczotka do włosów wielbłąda</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>65575-02</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td><td></td>eutanazji dwutlenku węgla</tr><tr><td>Przepływomierz</td><td></td><td></td><td></td>dwutlenku</tr><tr><td>węgla Zbiornik</td><td></td><td></td><td></td>dwutlenku węgla</tr><tr><td>Zaciski przedłużające bolce Castaloy Fisher</td><td>Scientific&nbsp;</td><td>05-769-7Q</td><td></td></tr><tr><td>Żeliwny stojak nośny w kształcie litery L</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11-474-207</td><td></td></tr><tr>Program <td></td><td></td><td>proliferacji komórek</td><td>Dostępne do pobrania: https://cellprofiler.org/releases</td></tr><tr><td>Przezroczysty lakier do paznokci</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Colorfrost Lawenda</td><td>VWR</td><td>10118-956</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr>W protokole tym zastosowano <td>destylowaną wodę H20</td><td></td><td></td><td>z systemu oczyszczania Milli-Q.</td></tr><tr><td>Dumont Pęseta z cienką końcówką; Wzór #55</td><td>Instrument chirurgiczny Roboz</td><td>RS-4984</td><td>Znany w tym protokole jako kleszcze z cienką końcówką, a do tego protokołu potrzebne są 3 (dwa do sekcji i jeden do przetwarzania pod mikroskopem elektronowym).</td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa Uchwyt siatki</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71147-01</td><td></td></tr><tr><td>EPON 815 Żywiczna</td><td>mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>14910</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Mark-It Znakowanie tkanek Żółty barwnik</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22050460</td><td>Podczas korzystania z tego barwnika do znakowania tkanek należy postępować zgodnie z protokołem producenta.&nbsp;</td></tr><tr><td>Epredia Nośnik montażowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-110-610</td><td>Służy do montażu H& E slajdy.&nbsp;</td></tr><tr><td>Seria Fiber-Lite Mi-150 Illuminator, halogenowe źródło światła 150 w</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Mi-150</td><td>Źródło światła do mikroskopu preparacyjnego.</td></tr><tr>Program <td></td><td></td><td>Fiji ImageJ</td><td>dostępny do pobrania: https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Łącznik hakowy Flexaframe Castaloy</td><td>Thermo Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>14-666-18Q</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 2,5% w buforze fosforanowym, pH 7,4, 32%</td> <td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16537-05</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 Transmisyjny mikroskop elektronowy (JEOL) z kamerą</td><td></td><td></td><td></td>CCD ORIUS (1000)</tr><tr><td>Laboratoryjna wytrząsarka</td><td></td><td></td> <td>stołowaDo tych eksperymentów potrzebne są dwa. Jeden powinien mieć temperaturę pokojową, a drugi powinien znajdować się w chłodni o temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Laserowe etykiety tagów kriogenicznych</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>77564-05</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>cytrynianu ołowiu</td><td>Sciences 17800</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC7Ultramikrotom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Reichert Ultracut S Microtome</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LifterSlips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22X22I24788001LS</td><td>Szkiełka nakrywkowe należy stosować do płaskich mocowań RPE, ponieważ mają one podniesione krawędzie i są dostosowane do grubości RPE.</td></tr><tr><td>Mayer's Hematoxylin</td><td>VWR</td><td>100504-406</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Micro Nożyczki sprężynowe do preparowania</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-5600</td><td>Znany w protokole jako nożyczki do mikropreparacji.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>Myszy A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Każdy model myszy AMD i jej odpowiednie elementy sterujące mogą działać z tym protokołem.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikro preparacji; Wersja standardowa; Zakrzywiony; Ostre punkty; 24 mm Długość ostrza; 4,5-calowy</td><td>instrument chirurgiczny Roboz</td> o całkowitej długości <td>RS-5913</td><td>Znany w tym protokole jako zakrzywione nożyczki.</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojaki</td><td></td><td></td><td></td>na mikroprobówki</tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td></td><td></td><td></td>Nikon A1RS</tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>SouthernBiotech</td><td>0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Numer 11 Sterylne jednorazowe ostrza skalpela</td><td>VWR</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 32%</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Ołówek</td><td></td><td></td><td></td></tr> na <tr><td>szalkę Petriego</td><td>VWR&nbsp;</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet Pipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało anty-ZO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>tlenku propylenu</td> Sciences <td>20412</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>VWR</td><td>10040-386</td><td></td></tr><tr><td>Płytka taca do perfuzji</td><td></td><td></td><td></td>myszy</tr><tr><td>Shandon Eozyna Y Alkohol</td><td>VWR</td><td>89370-828</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie Ultra Fine Tip marker permanentny</td><td>Zszywki</td><td>642736</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na suwaki do barwienia</td><td>Grainger</td><td>49WF31</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowe szkiełka osłonowe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia z pokrywą</td><td>Grainger</td><td>49WF30</td><td>Potrzeba 15 do H& E procedura barwienia.</td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka Luer-Slip 50 ml Target, wykonana w całości z tworzywa sztucznego&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>S7510-50</td><td>Używać wyłącznie cylindra strzykawki.</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher</td><td>1464917</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Piec</td><td></td><td></td><td></td>próżniowy</tr><tr><td>Vectashield Montaż medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Służy do montażu płaskich mocowań RPE.&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>22050283</tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> świetlny Zeiss Axio Imager 2 <td>Ten mikroskop ma możliwość generowania zszytych obrazów 20x. Jeśli mikroskop świetlny nie ma takiej pojemności, zrób zdjęcia całej siatkówki, które nieznacznie zachodzą na siebie. Użyj programu Adobe Photoshop, aby połączyć te obrazy. Zapoznaj się z instrukcjami programu Adobe Photoshop, aby uzyskać informacje na temat zszywania obrazów.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000 Mikroskop preparacyjny</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>65575-02</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest wyniszczającym zaburzeniem siatkówki w starzejących się populacjach. Powszechnie uważa się, że dysfunkcja nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) jest kluczowym zdarzeniem patobiologicznym w AMD. Aby zrozumieć mechanizmy, które prowadzą do dysfunkcji RPE, naukowcy mogą wykorzystać modele mysie. Wcześniejsze badania wykazały, że u myszy mogą rozwijać się patologie RPE, z których niektóre obserwuje się w oczach osób, u których zdiagnozowano AMD. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu oceny patologii RPE u myszy. Protokół ten obejmuje przygotowanie i ocenę przekrojów siatkówki za pomocą mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a także płaskich mocowań RPE za pomocą mikroskopii konfokalnej. Szczegółowo opisujemy typowe typy mysich patologii RPE obserwowanych za pomocą tych technik oraz sposoby ich ilościowego określania za pomocą bezstronnych metod testów statystycznych. Jako dowód słuszności koncepcji używamy tego protokołu fenotypowania RPE do ilościowego określenia patologii RPE obserwowanych u myszy z nadekspresją białka transbłonowego 135 (Tmem135) i starzejących się myszy C57BL / 6J typu dzikiego. Głównym celem tego protokołu jest przedstawienie standardowych metod fenotypowania RPE wraz z bezstronnymi ocenami ilościowymi dla naukowców wykorzystujących mysie modele AMD.

Ukończenie opisanego w tym artykule protokołu fenotypowania RPE dostarcza ilościowej analizy nieprawidłowości strukturalnych RPE powszechnie obserwowanych w mysich modelach AMD. Aby potwierdzić skuteczność tego protokołu, użyliśmy go u myszy, o których wiadomo, że wykazują patologie RPE, w tym myszy transgenicznych, które wykazują nadekspresję WT Tmem135 napędzanej przez promotor beta-aktyny kurczaka (Tmem135 TG)30 i starszych myszy C57BL/6J31,<...

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Protokół ten jest pierwszym, który opisuje, w jaki sposób przetwarzać i oceniać rozmiar myszy pod kątem patologii RP przy użyciu transmisji światła, mikroskopii elektronowej i konfokalnej. Główną zaletą tego protokołu jest włączenie ilościowych ocen patologii RP, wykorzystujących te trzy techniki obrazowania do porównań statystycznych. Techniki opisane w tym protokole mogą również pomóc w poszerzeniu naszej wiedzy na temat szlaków molekularnych ważnych dla zdrowia RPE.Osoby, które wcześniej nie analizowały rozmiaru myszy, mogą mieć problemy z tym protokołem. Sugerujemy, aby osoby te ćwiczyły z niektórymi myszami, aby opanować techniki opisane w tym protokole. Na początek przygotuj grawitacyjny system perfuzyjny na chłonnym podkładzie do perfuzji serca w dygestorium.Wlać 40 mililitrów świeżo przygotowanego buforu utrwalającego do cylindra strzykawki systemu perfuzyjnego. Obróć zawór równolegle do przewodu rurowego, aby umożliwić przepływ bufora przez przewód rurowy. Przepłucz linię, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte z linii.Następnie obróć zawór prostopadle do przewodu rurowego, aby zapobiec przepływowi bufora do przewodu rurowego. Aby wykonać perfuzję serca, przenieś uśpioną mysz na płytką tacę w pobliżu systemu perfuzyjnego. Z brzuchem skierowanym do góry.Spryskaj brzuch 70% etanolem, a następnie wykonaj pięciocentymetrowe dolne cięcie za pomocą zakrzywionych nożyczek i kleszczy przez skórę i ścianę brzucha po lewej stronie myszy poniżej klatki piersiowej. Przystąp do wykonania trzycentymetrowego cięcia przyśrodkowego przez skórę i ścianę brzucha w górnej części dolnego cięcia. Wykonaj kolejne pięciocentymetrowe dolne cięcie na końcu przyśrodkowego cięcia przez skórę i ścianę brzucha po najdalszej prawej stronie myszy poniżej klatki piersiowej.Wykonaj kolejne trzycentymetrowe nacięcie przyśrodkowe, aby usunąć płat skóry brzucha za pomocą zakrzywionych kleszczy. Następnie przetnij przeponę i mostek, aby odsłonić serce. Włóż igłę miernika do lewej komory serca i przekręć zawór.Przetnij prawy przedsionek zakrzywionymi nożyczkami, aby umożliwić wydostanie się krwi i utrwalacza z serca. Pozwól, aby 10 mililitrów buforu utrwalającego przenikało mysz przez jedną do dwóch minut lub do momentu, gdy wątroba stanie się blada i krew nie będzie wypływać z prawego przedsionka. Po zakończeniu perfuzji przekręć zawór prostopadle do przewodu rurowego, aby zatrzymać przepływ bufora.Aby zanużować oczy, wyjmij mysz z płytkiej tacki i umieść ją na chłonnym podkładzie w dygestorium. Następnie ustaw głowę myszy tak, aby lewe oko było skierowane w stronę eksperymentatora, a prawe oko było poza zasięgiem wzroku. Opisz górną stronę oka za pomocą barwnika do znakowania tkanek.Delikatnie popchnij kciukiem i palcem wskazującym w okolice oczodołu, aby wysunąć oko z oczodołu. Następnie za pomocą zakrzywionych nożyczek przytrzymaj oko ostrzem pod kątem 30 stopni od oczodołu i przetnij wokół oka. Zdejmij gałkę oczną z głowy za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieść ją na chłonnym podkładzie.Naciąć rogówkę ostrzem skalpela numer 11 i umieścić oko zakrzywionymi kleszczami w dwumililitrowej mikroprobówce zawierającej dwa mililitry buforu utrwalającego. Po zarodkowaniu obu oczu inkubuj je w buforze utrwalającym przez noc na wytrząsarce w pomieszczeniu o czterech stopniach z prędkością 75 obr./min. Następnego dnia zastąpić bufor utrwalający dwoma mililitrami PBS i inkubować przez 10 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej i 75 obr./min.Następnie, aby wygenerować tylne segmenty, umieść oko na szalce Petriego wypełnionej PBS pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie podnieś tłuszcz i mięśnie z gałki ocznej za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Ostrożnie przytnij tłuszcz i mięśnie mikronożyczkami preparacyjnymi w kierunku równoległym do gałki ocznej, aż gałka oczna będzie miała jednolity niebieskawo-kolor Umieść kleszcze z cienką końcówką w miejscu nakłucia rogówki i przetnij na obwodzie rogówki, zaczynając od miejsca nakłucia, za pomocą mikronożyczek preparujących, aby usunąć rogówkę i tęczówkę z gałki ocznej.Następnie za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie wyjmij soczewkę z gałki ocznej, aby uzyskać tylny segment. Umieść tylny segment w probówce zawierającej dwa mililitry PBS i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce do czasu użycia. Przenieść oko na szalkę Petriego zawierającą PBS i usunąć rogówkę i tęczówkę, jak pokazano.Wyciągnij obiektyw za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Następnie za pomocą dwóch kleszczyków z cienką końcówką delikatnie oddziel siatkówkę nerwową od tylnego segmentu. Ostrożnie przeciąć siatkówkę nerwową w głowie nerwu wzrokowego w celu usunięcia z tylnej muszli ocznej.Umieść muszlę oczną w dwumililitrowej mikroprobówce zawierającej pięć mikrolitrów PBS. Aby zamocować tylne muszle oczne, dodaj 500 mikrolitrów metanolu do tkanki i inkubuj na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez pięć minut. Powtórzyć utrwalanie metanolu trzy razy z końcową inkubacją przez dwie godziny.Po utrwaleniu przemyj tkankę trzykrotnie PBS, a następnie przejdź do barwienia immunofluorescencyjnego i wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej. Czteromiesięczne myszy TMEM 135 TG wykazały znaczne zmniejszenie pigmentowanego nabłonka siatkówki lub grubości RPE w odległości 600 i 900 mikrometrów od nerwu wzrokowego, w porównaniu z myszami typu dzikiego w tym samym wieku. Obliczono przypadki patologii RPE, w tym mikrowascuolizację, makrowakuolizację i migrację 325-dniowych myszy WT i TMEM 135 TG.Średnia częstość mikrowakuolizacji RPE była niższa u myszy dzikich w porównaniu z myszami TMEM 135 TG. Nie wykryto makrowakuolizacji i migracji RPE w typie dzikim w porównaniu ze średnimi wartościami obserwowanymi u myszy TMEM 135 TG. W transmisyjnej mikroskopii elektronowej w 24-miesięcznych siatkówkach zaobserwowano podstawowe złogi laminarne, których nie było w dwumiesięcznych siatkówkach.Analiza skumulowanych częstości wysokości podstawowych osadów laminarnych wykazała przesunięcie na prawo linii u 24-miesięcznego dziecka w porównaniu z dwumiesięcznym, wykazując wzrost złogów u 24-miesięcznych myszy. Obserwacja ta została poparta większą średnią wysokością w 24-miesięcznych siatkówkach. RPE u czteromiesięcznych myszy TMEM 135 TG było dysmorficzne.Siatkówki TMEM 135 TG są większe i mniej gęste niż siatkówki typu dzikiego w tym samym wieku. Zaobserwowano również więcej wielojądrowych komórek RPE w siatkówkach TG w porównaniu z grupą kontrolną. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogli ocenić określone szlaki za pomocą technik biologii molekularnej u myszy, co może przyczynić się do zrozumienia, w jaki sposób te patologie RP rozwijają się u myszy.Protokół ten pomoże ustandaryzować fenotypowanie RP u myszy, co przełoży wyniki badań na myszach na inne modele AMD i pomoże w zrozumieniu patobiologii AMD.

a-protocol-to-evaluate-quantify-retinal-pigmented-epithelium

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Angiografia z zieleni indocyjaninowej (lub ICGA) wykonywana przez wstrzyknięcie żyły ogonowej dostarcza wysokiej jakości obrazów przebiegu czasu ICGA do scharakteryzowania nieprawidłowości w naczyniówce myszy.

Wykrywanie nieprawidłowości w unaczynieniu naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem za pomocą zielonej angiografii indocyjaniny w czasie

Tutaj prezentujemy metodę rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) u myszy za pomocą techniki znanej jako DC-ERG, po raz pierwszy opisanej przez Marmorsteina, Peacheya i współpracowników na początku 2000 roku.

Elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Zdarzenia splicingu tandemowego występują w miejscach oddalonych od siebie o mniej niż 12 nukleotydów. Kwantyfikacja proporcji takich wariantów splicingu jest możliwa przy użyciu bezwzględnego ilościowego podejścia PCR. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób można określić ilościowo warianty splicingu genu STAT3, w których dwa zdarzenia splicingu skutkują włączeniem/wykluczeniem Serine-701 i α/β C-końcami.

Łączenie bezwzględnych i względnych ilościowych danych PCR w celu ilościowego określenia transkryptów wariantu splicingu STAT3

Naucz się oceny patologii nabłonka barwnikowego siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. Wykorzystaj mikroskopię świetlną, elektronową i konfokalną do ilościowej analizy.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (Wideo) | JoVE Journal

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Przeglądaj więcej filmów