Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy
May 24th, 2024
Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.
Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE znajdują się między fotoreceptorami a naczyniówką. Dysfunkcja RPE jest ważna w patogenezie chorób, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, retinopatia cukrzycowa i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki. Zastosowanie pierwotnego RPE ma kluczowe znaczenie dla badań mających na celu lepsze zrozumienie, w jaki sposób rozwija się choroba.
Podczas gdy różne gatunki były wykorzystywane jako źródło pierwotnego RPE, myszy mają tę przewagę, że pozwalają na wykorzystanie manipulacji genetycznej, aby pomóc zrozumieć, jak rozwija się retinopatia. Wcześniejsze metody izolacji pierwotnego RPE od gryzoni wymagają wykorzystania noworodków, są długotrwałe, wymagają specjalistycznej wiedzy technicznej lub nie nadają się do hodowli komórkowej. Opisujemy prostą i szybką metodę izolowania pierwotnego RPE od dorosłych myszy, która daje wysoce czyste kultury komórek.
Aby rozpocząć, przygotuj bufor do płukania, uzupełniając równoważny roztwór soli Hanka 10-milimolowym buforem w hałdach. Przechowuj bufor w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Przygotuj nabłonek barwnikowy siatkówki lub podłoże RPE w DMEM i rozgrzej do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.
Połóż uśpioną mysz płasko na boku z okiem skierowanym do góry. Umieść palec wskazujący nad okiem, a kciuk pod nim. Delikatnie uciskaj strukturę kości wokół oka, aby spowodować wysunięcie gałki ocznej.
Włóż końcówkę lekko otwartych nożyczek pod oko i delikatnie obróć nadgarstek od oka o 90 stopni, aż oko odczepi się od oczodołu. Natychmiast umieść i przetacz oko w 70% etanolu przez pięć sekund. Następnie przenieść oko do buforu do przemywania trzymanego na lodzie.
Pod mikroskopem preparacyjnym umieścić oko na szalce Petriego wypełnionej buforem do płukania i paskami nasączonej gazy. Ustabilizuj oko, przytrzymując nerw wzrokowy pęsetą i za pomocą noża chirurgicznego delikatnie wykonaj nacięcie na poziomie ora serrata. Włóż nożyczki Venice do nacięcia i tnij na obwodzie ora serrata, aż przedni odcinek i ciało szkliste zostaną usunięte.
Delikatnie oderwij siatkówkę od muszli ocznej za pomocą kleszczy na uwięzi, nie naruszając warstwy RPE. Za pomocą nożyczek usuń nerw wzrokowy i nadmiar tkanki łącznej z muszli ocznej bez nakłuwania muszli ocznej. Przenieś muszlę oczną do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA.
Inkubuj muszlę oczną w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Co dwie minuty wyjmij rurkę i mocno uderz dnem 40 razy w blat. Po inkubacji, za pomocą pipety AP 1000, delikatnie wymieszaj trzy razy w górę i w dół, aby przerwać muszlę oczną.
Aby zneutralizować trypsynę, natychmiast ułóż oderwane arkusze RPE, wyłączając muszlę oczną, na 0,5 mililitra FBS w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów. Następnie kroplami dodaj pożywkę RPE na warstwy arkuszy FBS i RPE, aby rozcieńczyć trypsynę. Odwirować RPE przy stężeniu 340 G przez trzy minuty.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki RPE na płytkę 24-dołkową. Inkubuj RPE w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy dni. 24 godziny po izolacji RPE jądrzaste komórki barwnikowe zaczynają osiadać bez pełnego przylegania.
W ciągu 48 do 72 godzin komórki te przyczepiają się i rozprzestrzeniają, zachowując ciemną pigmentację w przezroczystym jądrze. Po pięciu dniach komórki RPE wykazują zwiększoną konfluencję i zaczynają tworzyć kontakty międzykomórkowe, tworząc spolaryzowaną monowarstwę o sześciokątnych strukturach. Wyizolowany RPE wykazał czystość, o czym świadczy marker specyficzny dla RPE i ścisła integralność połączenia po sześciu dniach w hodowli.
Przegląd
Badanie przedstawia prosty i skuteczny protokół do izolacji i hodowli dorosłych komórek pigmentowych nabłonka siatkówki myszy (RPE). RPE służy jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, odgrywając kluczową rolę w zdrowiu komórek siatkówki, szczególnie fotoreceptorów.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Zdrowie siatkówki
Tło
- RPE jest niezbędne dla utrzymania funkcji komórek siatkówki.
- Dysfunkcja RPE jest zaangażowana w choroby takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem.
- Myszy zapewniają model do manipulacji genetycznych w celu badania retinopatii.
- Obecne metody izolacji RPE są często długotrwałe i wymagają specjalistycznej wiedzy technicznej.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego i prostego protokołu do izolacji pierwotnego RPE od dorosłych myszy.
- Umożliwienie wysokiego wydajności i czystości hodowli RPE dla zastosowań badawczych.
- Dostarczenie podstawy do badania rozwoju chorób w siatkówce.
Stosowane metody
- Główna metoda polega na izolowaniu RPE od dorosłych myszy poprzez sekcje.
- Zastosowano podejście chirurgiczne do usunięcia oka, poprzedzone trawieniem enzymatycznym.
- RPE jest hodowane w specyficznym medium w celu obserwacji i analizy po izolacji.
- Krytyczne kroki obejmują sekcje oka, inkubację trypsyną i wirowanie.
- Wygląd komórek i ich przyczepność są monitorowane przez kilka dni po hodowli.
Główne wyniki
- Protokół daje wysoce czyste hodowle RPE nadające się do długotrwałych badań.
- Komórki RPE wykazują wyraźne zmiany morfologiczne i wzrost konfluencji w czasie.
- Komórki wykazują charakterystyczne pigmentowanie i tworzą spolaryzowane monowarstwy.
- Wyniki potwierdzają integralność hodowanej RPE, wspierając ich zastosowanie w dalszych badaniach.
Wnioski
- Badanie dostarcza dostępnej metody do izolowania dorosłego RPE mysiego, ułatwiając badania nad chorobami siatkówki.
- Protokół poprawia zrozumienie mechanizmów komórkowych związanych ze zdrowiem i chorobą RPE.
- Potencjalne zastosowania obejmują badania nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem i innymi patologiami siatkówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and culture of adult murine retinal pigment epithelial (RPE) cells enables disease-relevant model development for retinal pathologies. This streamlined protocol supports early discovery and mechanistic de-risking by providing high-purity primary RPE for functional studies. The method enhances predictive confidence in target validation and translational research for retinal disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RPE-specific disease mechanisms in genetically tractable mouse models.
- Supports functional validation of retinal disease targets using primary adult RPE.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing physiologically relevant cell systems.
- Improves predictive confidence for early-stage retinal therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of primary RPE for assay standardization.
- Enables development of quantitative, disease-relevant readouts in cell-based assays.
- Supports scalability and platform reuse for compound screening in retinal research.
- Improves reliability of compound evaluation by using high-purity, adult-derived RPE.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro RPE models with disease-relevant phenotypes for translational continuity.
- Facilitates biomarker discovery and validation in primary RPE systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by bridging discovery and preclinical validation.
- Enables mechanistic studies that inform preclinical model selection and design.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions primary RPE isolation at the interface of early discovery and preclinical research, supporting workflows from target validation to lead identification in retinal disease programs.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification in RPE-driven diseases.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible primary cells for quantitative evaluation of candidate compounds.
- Analytics: Enables measurement of morphological, molecular, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for RPE isolation across research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal disease research.
- Operational Value: Simplifies workflows, enhances reproducibility, and supports scalable RPE culture.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early-stage retinal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of retinal disease assets.
Implementation Considerations
- Requires basic dissection skills and standard cell culture infrastructure.
- Utilizes commonly available reagents and equipment for enzymatic dissociation and culture.
- Standardization across teams is facilitated by protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptation to other rodent strains or species may require protocol optimization.
- Cell quality may be affected by donor age or disease state, impacting downstream applications.
