Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE znajdują się między fotoreceptorami a naczyniówką. Dysfunkcja RPE jest ważna w patogenezie chorób, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, retinopatia cukrzycowa i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki. Zastosowanie pierwotnego RPE ma kluczowe znaczenie dla badań mających na celu lepsze zrozumienie, w jaki sposób rozwija się choroba.

Podczas gdy różne gatunki były wykorzystywane jako źródło pierwotnego RPE, myszy mają tę przewagę, że pozwalają na wykorzystanie manipulacji genetycznej, aby pomóc zrozumieć, jak rozwija się retinopatia. Wcześniejsze metody izolacji pierwotnego RPE od gryzoni wymagają wykorzystania noworodków, są długotrwałe, wymagają specjalistycznej wiedzy technicznej lub nie nadają się do hodowli komórkowej. Opisujemy prostą i szybką metodę izolowania pierwotnego RPE od dorosłych myszy, która daje wysoce czyste kultury komórek.

Aby rozpocząć, przygotuj bufor do płukania, uzupełniając równoważny roztwór soli Hanka 10-milimolowym buforem w hałdach. Przechowuj bufor w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Przygotuj nabłonek barwnikowy siatkówki lub podłoże RPE w DMEM i rozgrzej do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.

Połóż uśpioną mysz płasko na boku z okiem skierowanym do góry. Umieść palec wskazujący nad okiem, a kciuk pod nim. Delikatnie uciskaj strukturę kości wokół oka, aby spowodować wysunięcie gałki ocznej.

Włóż końcówkę lekko otwartych nożyczek pod oko i delikatnie obróć nadgarstek od oka o 90 stopni, aż oko odczepi się od oczodołu. Natychmiast umieść i przetacz oko w 70% etanolu przez pięć sekund. Następnie przenieść oko do buforu do przemywania trzymanego na lodzie.

Pod mikroskopem preparacyjnym umieścić oko na szalce Petriego wypełnionej buforem do płukania i paskami nasączonej gazy. Ustabilizuj oko, przytrzymując nerw wzrokowy pęsetą i za pomocą noża chirurgicznego delikatnie wykonaj nacięcie na poziomie ora serrata. Włóż nożyczki Venice do nacięcia i tnij na obwodzie ora serrata, aż przedni odcinek i ciało szkliste zostaną usunięte.

Delikatnie oderwij siatkówkę od muszli ocznej za pomocą kleszczy na uwięzi, nie naruszając warstwy RPE. Za pomocą nożyczek usuń nerw wzrokowy i nadmiar tkanki łącznej z muszli ocznej bez nakłuwania muszli ocznej. Przenieś muszlę oczną do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA.

Inkubuj muszlę oczną w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Co dwie minuty wyjmij rurkę i mocno uderz dnem 40 razy w blat. Po inkubacji, za pomocą pipety AP 1000, delikatnie wymieszaj trzy razy w górę i w dół, aby przerwać muszlę oczną.

Aby zneutralizować trypsynę, natychmiast ułóż oderwane arkusze RPE, wyłączając muszlę oczną, na 0,5 mililitra FBS w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów. Następnie kroplami dodaj pożywkę RPE na warstwy arkuszy FBS i RPE, aby rozcieńczyć trypsynę. Odwirować RPE przy stężeniu 340 G przez trzy minuty.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki RPE na płytkę 24-dołkową. Inkubuj RPE w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy dni. 24 godziny po izolacji RPE jądrzaste komórki barwnikowe zaczynają osiadać bez pełnego przylegania.

W ciągu 48 do 72 godzin komórki te przyczepiają się i rozprzestrzeniają, zachowując ciemną pigmentację w przezroczystym jądrze. Po pięciu dniach komórki RPE wykazują zwiększoną konfluencję i zaczynają tworzyć kontakty międzykomórkowe, tworząc spolaryzowaną monowarstwę o sześciokątnych strukturach. Wyizolowany RPE wykazał czystość, o czym świadczy marker specyficzny dla RPE i ścisła integralność połączenia po sześciu dniach w hodowli.