Name: Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 4 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy. Ta technika umożliwia uzyskanie czystych kultur RPE do badań nad chorobami siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (C.S.S.), NIH Grant F31EY035156 (A.H.) oraz P30 EY011373. Organizacja finansująca nie odgrywała żadnej roli w projektowaniu ani prowadzeniu tych badań.

Wykorzystanie zwierząt w tym badaniu zostało zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Case Western Reserve.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę buforową do mycia, uzupełniając zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej z 10 mM roztworem buforowym HEPES. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę RPE, uzupełniając Zmodyfikowaną Pożywkę Orła firmy Dulbecco o 4,5 g/l glukozy, 1,25x suplement GlutaMAX (stężenie podstawowe 100x lub 200 mM; końcowe stężenie 2,5 mM L-glutaminy), z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną/streptomycyną i 1x roztworem aminokwasów endogennych MEM (100x). Przed użyciem podgrzej podłoże do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja oka myszy
<ol>
	<li>Eutanazja myszy, najlepiej w wieku od 3 do 14 tygodni, przy użyciu zatwierdzonej przez IACUC metody eutanazji (zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu przy użyciu koktajlu ketamina/ksylazyna w dawce 0,1 ml na 20 g myszy [87,5 mg/kg ketaminy i 12,5 mg/kg ksylazyny] było metodą zastosowaną w tym badaniu). 
	UWAGA: Oczy pobrane od młodszych myszy ułatwią z czasem zwiększenie wydajności komórek nabłonka barwnikowego siatkówki i wydłużą zdolność do kolejnych pasaży.</li>
	<li>Połóż mysz płasko na boku z okiem skierowanym do góry.</li>
	<li>Umieść palec wskazujący i kciuk odpowiednio powyżej i poniżej oka. Delikatnie uciskaj strukturę kostną otaczającą oko, aby wywołać wysunięcie gałki ocznej.</li>
	<li>Włóż końcówkę lekko otwartych nożyczek pod oko i delikatnie obróć nadgarstek od oka o 90°, aż oko odczepi się od oczodołu. 
	UWAGA: Nie zamykaj nożyczek, aby przeciąć oko lub nerw wzrokowy, ponieważ utrudni to rozcięcie muszli ocznej.</li>
	<li>Natychmiast umieścić oko w 70% etanolu i przetoczyć je nie dłużej niż 5 sekund przed przeniesieniem go do bufora płuczącego przechowywanego na lodzie.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przenoś jedno oko po oku na szalkę Petriego wypełnioną buforem do płukania i paskami namoczonej gazy.</li>
	<li>Ustabilizuj oko, przytrzymując nerw wzrokowy pęsetą. Delikatnie wykonaj nacięcie na poziomie ora serrata za pomocą noża chirurgicznego 3,00 mm 45° lub żyletki 0,009".</li>
	<li>Za pomocą nożyczek Vannas delikatnie włóż nożyczki do nacięcia i tnij na obwodzie ora serrata, aż przedni odcinek i ciało szkliste będzie można usunąć i wyrzucić.</li>
	<li>Delikatnie oderwij siatkówkę od muszli ocznej za pomocą kleszczy na uwięzi, uważając, aby nie naruszyć warstwy RPE. 
	UWAGA: Aby ułatwić usunięcie siatkówki, napełnij pipetę transferową pożywką buforową do płukania i ostrożnie nałóż ją na krawędzie muszli ocznej, aby delikatnie unieść siatkówkę.</li>
	<li>Na koniec usuń nerw wzrokowy i nadmiar tkanki łącznej z muszli ocznej za pomocą nożyczek. Uważaj, aby nie przebić muszli ocznej.</li>
</ol>
3. Izolacja pierwotnego RPE
<ol>
	<li>Przenieść muszlę oczną do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 0,25% trypsyny + 0,02% EDTA. 
	UWAGA: Do jednej porcji trypsyny-EDTA można dodać dwie muszle oczne, aby zwiększyć wydajność uprawywalnego RPE.</li>
	<li>Przenieść probówki do mikrowirówek do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut. Co 2 minuty wyjmuj rurki z łaźni wodnej i mocno postukaj dnem rurki 40 razy o blat.</li>
	<li>Po 10 minutach delikatnie rozbić muszlę oczną mechanicznie za pomocą pipety serologicznej P1000 lub pipety serologicznej o pojemności 2 ml, pipetując w górę i w dół nie więcej niż 3 razy. 
	UWAGA: Rozdrobnienie arkuszy RPE jest niezbędne, ponieważ duże arkusze nie będą prawidłowo przylegać.</li>
	<li>Natychmiast zneutralizuj trypsynę, nakładając oderwane arkusze RPE, ale nie muszlę oczną, na 0,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Następnie rozcieńczyć trypsynę, nakładając kroplami 3 ml pożywki RPE na warstwy arkuszy FBS i RPE.</li>
	<li>Odwirować RPE przy 340 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki RPE na płytkę 24-dołkową (1,9 cm2 dołek) lub 48-dołkową (0,75 cm2 dołek). 
	UWAGA: RPE można posiewać na płytkach dołkowych pokrytych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, w szczególności lamininą, kolagenem IV lub fibronektyną, w celu zwiększenia adherencji11. RPE można również ponownie zawiesić w 1 ml pożywki RPE i nałożyć warstwami na gradient separacji o gęstości 40% w celu dalszej izolacji czystych komórek RPE. Dodatkowo, obracanie płytki z prędkością 340 x g przez 3-5 minut może zwiększyć adhezję komórek13.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Hodowla RPE
<ol>
	<li>Nie należy zakłócać pracy odizolowanego RPE przez co najmniej 3 dni. Po 72 godzinach delikatnie usuń starą pożywkę i zastąp ją świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 48 godzin po pierwszych 3 dniach.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną konfluencję, przepuść komórki za pomocą 0,25% trypsyny + 0,02% EDTA i zredukuj FBS w pożywce RPE do 2%, 
	UWAGA: Wcześniej informowano, że pierwotne RPE zaczynają się deróżnicować po 5-7 przejściach i zaczną tracić swój sześciokątny kształt i pigmentację14.</li>
</ol>

Characterization and Morphological Dynamics of Cultured Primary Murine RPE

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakkaraju%2C+A+%22Prog+Retin+Eye+Res%22">Prog Retin Eye Res</a>. 100846, (2020).</li>
<li>Lambros, M. L., Plafker, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+the+Nrf2+anti-oxidant+transcription+factor+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration.</a> Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).</li>
<li>Ferrari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+genes+and+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li>
<li>Xia, T., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetic+retinopathy+on+the+barrier+functions+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium.</a> Vision Res. 139, 72-81 (2017).</li>
<li>Edwards, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+rat+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Culture of rat retinal pigment epithelium.</a> In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).</li>
<li>Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+rat+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).</li>
<li>Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+pigment+epithelial+cells+from+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina.</a> Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).</li>
<li>Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).</li>
<li>Sakagami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+rat+eyeballs%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs.</a> Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).</li>
<li>Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+culture+of+adult+rat+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+cells+to+study+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).</li>
<li>Shen, J., He, J., Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+cells+with+Rho-Kinase+and+TGFbetaR-1%2FALK5+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor.</a> Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).</li>
<li>Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+cryosectioning+of+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+on+transwell+cell+culture+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).</li>
<li>Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+Junctions+of+the+outer+blood+retina+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight Junctions of the outer blood retina barrier.</a> Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).</li>
<li>Ban, B., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Mol Vis. 3, 18(1997).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+diseases+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Functions and diseases of the retinal pigment epithelium.</a> Front Pharmacol. 12, 727870(2021).</li>
</ol>

Nie ujawnia się żadnych istotnych informacji finansowych ani niefinansowych.

W tym artykule przedstawiliśmy uproszczony protokół izolacji i hodowli nabłonka barwnikowego mysiej siatkówki. Komórki RPE wyizolowane z oczu dorosłych myszy wykazywały ekspresję markera specyficznego dla RPE, RPE65, i markera połączenia międzykomórkowego, ZO-1. Dodatkowo wyhodowane komórki rozwinęły się w kulturze w pigmentowane, sześciokątne arkusze.
Wcześniej opublikowano kilka metod izolacji RPE u gryzoni: 6,7,8,9,10,11,12. Wiele protokołów odrywa warstwy RPE od błony Brucha, co wymaga umiejętności technicznych i zwiększa ryzyko uszkodzenia RPE lub śmierci komórki 6,7,9,11,12,16. W związku z tym protokół ten wykorzystuje enzymatyczne odrywanie warstwy RPE, a nie dysocjację mechaniczną, w celu promowania przetrwania i utrzymania integralności arkuszy RPE w hodowli. Ta metoda daje mysie RPE w hodowli, która utrzymuje morfologię RPE z wysoce pigmentowanymi i sześciokątnymi komórkami, które zachowują ekspresję białek ścisłego połączenia. Ponadto w protokole tym brakuje użycia złożonych odczynników lub materiałów stosowanych w innych protokołach, takich jak przepuszczalne wkładki błonowe, dodatkowe białka powlekające macierz zewnątrzkomórkową lub specjalistyczne odczynniki dysocjacji tkanek. Zamiast tego protokół ten wykorzystuje proste trawienie enzymatyczne przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA w połączeniu z mieszaniem tkanek w celu dysocjacji warstwy RPE od błony Brucha. Protokół ten został z powodzeniem przeprowadzony na myszach w wieku od 3 do 14 tygodni; Jednak może być potrzebnych więcej oczu, aby pomyślnie uzyskać zlewającą się kulturę u młodych myszy.
Podczas wykonywania tego protokołu może pojawić się kilka wyzwań. Wymagane są umiejętności techniczne, aby precyzyjnie przeciąć okolicę ora serrata i ostrożnie usunąć siatkówkę bez naruszania warstwy RPE. Siatkówka może zostać zaburzona podczas przecinania obwodu twardówki, co może zmienić żywotność RPE. Udoskonalenie tej techniki można osiągnąć tylko poprzez powtarzalną, ciągłą praktykę. Dodatkowo arkusze RPE mogą pozostać przyczepione do warstwy siatkówki po usunięciu. Aby uniknąć nadmiernej utraty RPE, należy stymulować odwarstwienie siatkówki za pomocą strzykawki lub pipety transferowej wypełnionej pożywką buforową do płukania, aby delikatnie oderwać krawędzie siatkówki od muszli ocznej. Inkubacja hialuronidazy może również ułatwić oderwanie16. W przypadku, gdy RPE nie odłączają się prawidłowo od błony i naczyniówki Brucha, należy wydłużyć czas inkubacji z trypsyną w kąpieli wodnej. Dodatkowo należy zamrozić porcje świeżej trypsyny w temperaturze -20 °C i rozmrozić bezpośrednio przed użyciem, aby utrzymać optymalną aktywność enzymatyczną. Niepowodzenie RPE w przyczepieniu się do płytki studzienkowej po izolacji może wystąpić, jeśli komórki zostaną wysiane przy zbyt niskiej gęstości lub jeśli RPE zostały uszkodzone podczas procesu izolacji. Ponadto nasz protokół nie wymaga powlekania białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do hodowli. Wykazano jednak, że białka ECM, takie jak fibronektyna, kolagen IV, laminina lub kolagen I, zwiększają przyczepienie komórek i powinny być brane pod uwagę, jeśli przestrzeganie zaleceń jest słabe11.
Aby zwiększyć wydajność monowarstw hodowanych w RPE, zbierz co najmniej 2-3 oczy myszy w tym samym wieku o tym samym tle genetycznym; Komórki mogą z czasem stracić swój sześciokątny kształt i pigment, jeśli nie zostaną zasiane w wystarczająco dużej gęstości. W przypadku myszy w wieku powyżej 8 tygodni 2 oczy na 24-dołkową płytkę powinny wystarczyć dla optymalnego zbiegu. Jeśli myszy są w wieku poniżej 8 tygodni, 3-4 oczy spowodują lepsze przyleganie i zbieżność. Z biegiem czasu komórki mogą być podatne na przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) z utratą pigmentacji i uzyskaniem wydłużonego kształtu. Dodanie inhibitorów kinazy Rho i TGFβR-1 / ALK5, takich jak odpowiednio Y27632 i Repsox, może zapobiec EMT hodowanych komórek RPE12. Podczas gdy protokół izolacji jest krótki i wymaga tylko 1 godziny na izolację 2-4 oczu, hodowla pierwotna może potrzebować do 7-10 dni, aby osiągnąć pełne zlanie. Ponadto pasażowanie RPE jest ograniczone, ze zwiększonym ryzykiem EMT przy każdym kolejnym przejściu.
Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki są komórkami krytycznymi dla utrzymania homeostazy oka. RPE działają jak fagocyty, pomagając w utrzymaniu fotoreceptorów, zapobiegając uszkodzeniom warstw nerwowych przez światło i działają jako szczelna bariera nabłonkowa regulująca transport17. Choroby bezpośrednio wpływające na RPE, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i retinopatia cukrzycowa, mogą zaostrzać stan zapalny, zwiększać apoptozę i zakłócać połączenia komórkowe, prowadząc do zwiększonego prawdopodobieństwa zwyrodnienia siatkówki i ślepoty17. Uprawa pierwotnego RPE ułatwia badanie patogenezy chorób oczu wpływających na RPE. Podsumowując, nasz protokół skraca czas trwania izolacji i upraszcza niezbędne techniki i odczynniki przy jednoczesnym zachowaniu hodowli komórek o wysokiej czystości.

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wyspecjalizowana monowarstwa komórkowa wyściełająca błonę Brucha znajdująca się między fotoreceptorami a naczyniówką1. Komórki RPE odgrywają kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu siatkówki. Komórki RPE transportują glukozę i witaminę A do fotoreceptorów, promują widzenie poprzez ponowną izomeryzację siatkówki all-trans do siatkówki 11-cis i utrzymują zewnętrzne segmenty fotoreceptora poprzez fagocytozę zrzucanych segmentów zewnętrznych, usuwają wodę z przestrzeni podsiatkówkowej, tworzą zewnętrzną barierę krew-siatkówka poprzez obecność ścisłych połączeń i wydzielają neurotropowe czynniki wzrostu (takie jak czynnik pochodzący z nabłonka barwnikowego, i Podstawowy Czynnik Wzrostu Fibroblastów), które wspierają fotoreceptory2. Dysfunkcja komórek RPE bierze udział w patogenezie różnych retinopatii, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, barwnikowego zwyrodnienia siatkówki i retinopatii cukrzycowej3,4,5. Badania in vitro z wykorzystaniem komórek RPE mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy tych chorób. Pierwotne komórki RPE są znacznie preferowane w tych badaniach, ponieważ linie komórkowe RPE, choć łatwo dostępne, nie mają kluczowych cech pierwotnych komórek RPE.
Podczas gdy różne gatunki były wykorzystywane jako źródła pierwotnych komórek RPE, myszy mają tę przewagę, że korzystają z modyfikacji genetycznych, które pomagają zrozumieć patogenezę retinopatii. Poprzednio opisane protokoły izolacji komórek RPE od gryzoni albo wymagają użycia noworodków, są długotrwałe, wymagają umiejętności technicznych, albo nie nadają się do hodowli6,7,8,9,10,11,12. Opisujemy prostą i szybką metodę izolowania komórek RPE od dorosłych myszy, które dają wysoce czyste kultury tych komórek.

<table><tbody><tr><td>0,009 RD Ostrza jednoostrzowe</td><td>Personna</td><td>941202</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>z 4,5 g/l glukozy, L-glutaminą, pirogronianem sodu</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Corning</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100x</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nóż Micro-Unitome</td><td>BVI Beaver</td><td>377546</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytki polistyrenowe</td><td>Falcon</td><td>08-772-1</td><td>24-dołkowa lub 48-dołkowa</td></tr><tr><td>regularna płodowa surowica bydlęca</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>z czerwienią fenolową</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr></tbody></table>

uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) są kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania siatkówki. Dysfunkcja RPE bierze udział w patogenezie ważnych chorób siatkówki, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i retinopatia cukrzycowa. Przedstawiamy uproszczone podejście do izolacji RPE od mysich oczu dorosłych. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, podejście to umożliwia izolację i hodowlę wysoce czystych RPE od dorosłych myszy. Ta prosta i szybka metoda nie wymaga rozległych umiejętności technicznych i jest osiągalna przy użyciu podstawowych narzędzi naukowych i odczynników. Pierwotne RPE izoluje się od myszy tła C57BL/6 w wieku od 3 do 14 tygodni poprzez enukleację oka, a następnie usunięcie przedniego odcinka. Enzymatyczna trypsyna i wirowanie służą do dysocjacji i izolacji RPE od muszli ocznej. Podsumowując, podejście to oferuje szybki i skuteczny protokół wykorzystania RPE w badaniu funkcji i chorób siatkówki.

Opisany protokół został zastosowany u myszy w linii C57BL/6. Płeć nie wydaje się wpływać na możliwość hodowli RPE. Myszy poniżej 6. tygodnia życia dają ograniczone płaty RPE w porównaniu z myszami starszymi, przez co do osiągnięcia optymalnej konfluencji może być potrzebna większa liczba oczu. Po izolacji komórki RPE potrzebują około 3 dni na stabilizację i przytwierdzenie się do płytki hodowlanej. Około 24 h po izolacji okrągłe, pigmentowane komórki, które wydają się nie posiadać jądra, zaczynają osiadać, ale nie przylgnęły jeszcze w pełni do płytki (Rysunek 1A). W ciągu kolejnych 48–72 h komórki zaczynają przylegać i rozprzestrzeniać się, zachowując ciemną pigmentację i przezroczyste jądro (Rysunek 1B,C). Po 5 dniach konfluencja RPE wzrasta i zaczynają tworzyć się kontakty międzykomórkowe przypominające spolaryzowaną monowarstwę o kształcie heksagonalnym (Rysunek 1D).
Wyizolowane komórki RPE oceniano pod kątem czystości oraz integralności połączeń ścisłych po 6 dniach hodowli. W pierwszej kolejności sprawdzano obecność retinoidowej izomerohydrolazy, czyli białka nabłonka pigmentowego siatkówki 65 kDA (RPE65), będącego markerem specyficznym dla RPE (Rysunek 2, kolor zielony). Ponadto, aby RPE mogły utworzyć pojedynczą warstwę pigmentowanych komórek o kształcie sześciokątnym, połączenia międzykomórkowe muszą pozostać nienaruszone. Białko połączeń ścisłych 1 lub zonula occludens-1 (ZO-1) to białka rusztowaniowe niezbędne do utrzymania i zachowania integralności połączeń ścisłych między poszczególnymi komórkami RPE14. Konfluentne hodowle wyizolowanych komórek RPE zachowały białka połączeń międzykomórkowych, co potwierdzono barwieniem ZO-1 zlokalizowanym na obwodzie komórki (Rysunek 2, kolor czerwony). Po osiągnięciu konfluencji w postaci dużych płatów, komórki te utrzymują kontakty międzykomórkowe bez nadmiernego rozrostu przez okres do 2 tygodni. Wcześniejsze badania wykazały, że ZO-1 wykazuje wysoką ekspresję przez okres do 9 dni hodowli15. Dodatkowe markery stosowane w hodowlach pierwotnych komórek RPE obejmują Collagen IV, CRALBP oraz OTX211.
<img alt="Obraz mikroskopowy pokazujący analizę wzrostu kolonii bakterii na płytkach agarowych, zróżnicowane wzorce rozmieszczenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66921/66921fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Morfologia pierwotnych komórek RPE myszy hodowanych na standardowej polistyrenowej płytce 24-dołkowej. (A) Pierwotne komórki RPE wyizolowane z obu oczu myszy C57BL/6 i hodowane w pojedynczym dołku niepowlekanej polistyrenowej płytki 24-dołkowej do hodowli tkankowej bezpośrednio po izolacji. (B,C) Po 48 h i 72 h pierwotne komórki RPE zaczynają przylegać do płytki i tworzyć pigmentowane, dwojądrowe komórki. (D) Po 5 dniach mikroskopia w polu jasnym pokazuje hiperpigmentowane komórki o kształcie sześciokątnym, zwiększające stopień konfluencji i zaczynające tworzyć kontakty międzykomórkowe. Pasek skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66921/66921fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna RPE-65/ZO-1 w hodowlach komórkowych; kontrast fazowy a fluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66921/66921fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Marker specyficzny dla RPE, RPE-65, oraz marker połączeń międzykomórkowych, ZO-1, są zachowane w wyizolowanych pierwotnych komórkach RPE myszy. Pierwotne komórki nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) od trzech myszy C57BL/6 hodowano przez 6 dni przed utrwaleniem 4% paraformaldehydem. Komórki poddano permeabilizacji 0,1% Tritonem-X w PBS przez 5 min, zablokowano 5% normalną surowicą kozią, a następnie inkubowano z przeciwciałami przeciwko RPE-65 (zielone) lub ZO-1 (czerwone). Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66921/66921fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Kroki sekcji gałki ocznej i usuwania siatkówki, wirowanie, wysiew komórek na schemacie eksperymentu badawczego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66921/66921fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3Uproszczony schemat procedury izolacji nabłonka barwnikowego siatkówki. Po wyjęciu gałki ocznej myszy należy ją wysterylizować, zanurzając ją na krótko w 70% etanolu, a następnie przenieść do buforu płuczącego. W buforze płuczącym należy naciąć tkankę wzdłuż ora serrata i usunąć segment przedni. Po usunięciu siatkówki pozostałą część gałki ocznej należy umieścić w probówce z trypsyną/EDTA. Przez łącznie 10 minut należy delikatnie opukiwać probówkę o blat co 2 minuty, następnie przenieść nadsącz do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować osad RPE. Komórki należy resuspenderować i wysiać na płytkę 24- lub 48-dołkową. Grafiki przygotowano za pomocą BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66921/66921fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE znajdują się między fotoreceptorami a naczyniówką. Dysfunkcja RPE jest ważna w patogenezie chorób, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, retinopatia cukrzycowa i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki. Zastosowanie pierwotnego RPE ma kluczowe znaczenie dla badań mających na celu lepsze zrozumienie, w jaki sposób rozwija się choroba.Podczas gdy różne gatunki były wykorzystywane jako źródło pierwotnego RPE, myszy mają tę przewagę, że pozwalają na wykorzystanie manipulacji genetycznej, aby pomóc zrozumieć, jak rozwija się retinopatia. Wcześniejsze metody izolacji pierwotnego RPE od gryzoni wymagają wykorzystania noworodków, są długotrwałe, wymagają specjalistycznej wiedzy technicznej lub nie nadają się do hodowli komórkowej. Opisujemy prostą i szybką metodę izolowania pierwotnego RPE od dorosłych myszy, która daje wysoce czyste kultury komórek.Aby rozpocząć, przygotuj bufor do płukania, uzupełniając równoważny roztwór soli Hanka 10-milimolowym buforem w hałdach. Przechowuj bufor w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Przygotuj nabłonek barwnikowy siatkówki lub podłoże RPE w DMEM i rozgrzej do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.Połóż uśpioną mysz płasko na boku z okiem skierowanym do góry. Umieść palec wskazujący nad okiem, a kciuk pod nim. Delikatnie uciskaj strukturę kości wokół oka, aby spowodować wysunięcie gałki ocznej.Włóż końcówkę lekko otwartych nożyczek pod oko i delikatnie obróć nadgarstek od oka o 90 stopni, aż oko odczepi się od oczodołu. Natychmiast umieść i przetacz oko w 70% etanolu przez pięć sekund. Następnie przenieść oko do buforu do przemywania trzymanego na lodzie.Pod mikroskopem preparacyjnym umieścić oko na szalce Petriego wypełnionej buforem do płukania i paskami nasączonej gazy. Ustabilizuj oko, przytrzymując nerw wzrokowy pęsetą i za pomocą noża chirurgicznego delikatnie wykonaj nacięcie na poziomie ora serrata. Włóż nożyczki Venice do nacięcia i tnij na obwodzie ora serrata, aż przedni odcinek i ciało szkliste zostaną usunięte.Delikatnie oderwij siatkówkę od muszli ocznej za pomocą kleszczy na uwięzi, nie naruszając warstwy RPE. Za pomocą nożyczek usuń nerw wzrokowy i nadmiar tkanki łącznej z muszli ocznej bez nakłuwania muszli ocznej. Przenieś muszlę oczną do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA.Inkubuj muszlę oczną w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Co dwie minuty wyjmij rurkę i mocno uderz dnem 40 razy w blat. Po inkubacji, za pomocą pipety AP 1000, delikatnie wymieszaj trzy razy w górę i w dół, aby przerwać muszlę oczną.Aby zneutralizować trypsynę, natychmiast ułóż oderwane arkusze RPE, wyłączając muszlę oczną, na 0,5 mililitra FBS w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów. Następnie kroplami dodaj pożywkę RPE na warstwy arkuszy FBS i RPE, aby rozcieńczyć trypsynę. Odwirować RPE przy stężeniu 340 G przez trzy minuty.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki RPE na płytkę 24-dołkową. Inkubuj RPE w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy dni. 24 godziny po izolacji RPE jądrzaste komórki barwnikowe zaczynają osiadać bez pełnego przylegania.W ciągu 48 do 72 godzin komórki te przyczepiają się i rozprzestrzeniają, zachowując ciemną pigmentację w przezroczystym jądrze. Po pięciu dniach komórki RPE wykazują zwiększoną konfluencję i zaczynają tworzyć kontakty międzykomórkowe, tworząc spolaryzowaną monowarstwę o sześciokątnych strukturach. Wyizolowany RPE wykazał czystość, o czym świadczy marker specyficzny dla RPE i ścisła integralność połączenia po sześciu dniach w hodowli.

a-simplified-method-for-isolation-culture-retinal-pigment-epithelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wielofunkcyjny nabłonek oka. W tym miejscu przedstawiamy protokół ustanawiania pierwotnych kultur komórkowych pochodzących z mysiego RPE.

Pierwotne hodowle komórkowe z nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Protokół opisuje organotypowe eksplantaty myszy neuroretina, hodowana razem z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE), w pożywce zdefiniowanej przez R16, wolna od surowicy i antybiotyków. Metoda ta jest stosunkowo prosta do wykonania, tańsza i bardziej czasochłonna w porównaniu z eksperymentami in vivo i może być dostosowana do wielu zastosowań eksperymentalnych.

Długotrwała, pozbawiona surowicy hodowla organtypowych eksplantatów siatkówki myszy z nienaruszonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Opisujemy prostą i skuteczną metodę izolowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od oczu młodych pigmentowanych świnek morskich. Procedura ta pozwala na dalsze badania biologii molekularnej wyizolowanego RPE, w tym analizy ekspresji genów.

Izolacja komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z oczu świnki morskiej

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji pierwotnych komórek Müllera siatkówki od noworodków szczurów Sprague-Dawley (SD). Procedura obejmuje wyłuszczenie gałek ocznych, wypreparowanie tkanki siatkówki, ekstrakcję i identyfikację komórek oraz kluczowe kwestie dotyczące późniejszej hodowli komórek.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek Müllera siatkówki od szczurów Sprague-Dawley (SD)

Poznaj uproszczoną metodę izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy. Ta technika umożliwia uzyskanie czystych kultur RPE do badań nad chorobami siatkówki.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów