Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy
24 maja 2024
Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.
Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE znajdują się między fotoreceptorami a naczyniówką. Dysfunkcja RPE jest ważna w patogenezie chorób, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, retinopatia cukrzycowa i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki. Zastosowanie pierwotnego RPE ma kluczowe znaczenie dla badań mających na celu lepsze zrozumienie, w jaki sposób rozwija się choroba.
Podczas gdy różne gatunki były wykorzystywane jako źródło pierwotnego RPE, myszy mają tę przewagę, że pozwalają na wykorzystanie manipulacji genetycznej, aby pomóc zrozumieć, jak rozwija się retinopatia. Wcześniejsze metody izolacji pierwotnego RPE od gryzoni wymagają wykorzystania noworodków, są długotrwałe, wymagają specjalistycznej wiedzy technicznej lub nie nadają się do hodowli komórkowej. Opisujemy prostą i szybką metodę izolowania pierwotnego RPE od dorosłych myszy, która daje wysoce czyste kultury komórek.
Aby rozpocząć, przygotuj bufor do płukania, uzupełniając równoważny roztwór soli Hanka 10-milimolowym buforem w hałdach. Przechowuj bufor w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Przygotuj nabłonek barwnikowy siatkówki lub podłoże RPE w DMEM i rozgrzej do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.
Połóż uśpioną mysz płasko na boku z okiem skierowanym do góry. Umieść palec wskazujący nad okiem, a kciuk pod nim. Delikatnie uciskaj strukturę kości wokół oka, aby spowodować wysunięcie gałki ocznej.
Włóż końcówkę lekko otwartych nożyczek pod oko i delikatnie obróć nadgarstek od oka o 90 stopni, aż oko odczepi się od oczodołu. Natychmiast umieść i przetacz oko w 70% etanolu przez pięć sekund. Następnie przenieść oko do buforu do przemywania trzymanego na lodzie.
Pod mikroskopem preparacyjnym umieścić oko na szalce Petriego wypełnionej buforem do płukania i paskami nasączonej gazy. Ustabilizuj oko, przytrzymując nerw wzrokowy pęsetą i za pomocą noża chirurgicznego delikatnie wykonaj nacięcie na poziomie ora serrata. Włóż nożyczki Venice do nacięcia i tnij na obwodzie ora serrata, aż przedni odcinek i ciało szkliste zostaną usunięte.
Delikatnie oderwij siatkówkę od muszli ocznej za pomocą kleszczy na uwięzi, nie naruszając warstwy RPE. Za pomocą nożyczek usuń nerw wzrokowy i nadmiar tkanki łącznej z muszli ocznej bez nakłuwania muszli ocznej. Przenieś muszlę oczną do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA.
Inkubuj muszlę oczną w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Co dwie minuty wyjmij rurkę i mocno uderz dnem 40 razy w blat. Po inkubacji, za pomocą pipety AP 1000, delikatnie wymieszaj trzy razy w górę i w dół, aby przerwać muszlę oczną.
Aby zneutralizować trypsynę, natychmiast ułóż oderwane arkusze RPE, wyłączając muszlę oczną, na 0,5 mililitra FBS w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów. Następnie kroplami dodaj pożywkę RPE na warstwy arkuszy FBS i RPE, aby rozcieńczyć trypsynę. Odwirować RPE przy stężeniu 340 G przez trzy minuty.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki RPE na płytkę 24-dołkową. Inkubuj RPE w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy dni. 24 godziny po izolacji RPE jądrzaste komórki barwnikowe zaczynają osiadać bez pełnego przylegania.
W ciągu 48 do 72 godzin komórki te przyczepiają się i rozprzestrzeniają, zachowując ciemną pigmentację w przezroczystym jądrze. Po pięciu dniach komórki RPE wykazują zwiększoną konfluencję i zaczynają tworzyć kontakty międzykomórkowe, tworząc spolaryzowaną monowarstwę o sześciokątnych strukturach. Wyizolowany RPE wykazał czystość, o czym świadczy marker specyficzny dla RPE i ścisła integralność połączenia po sześciu dniach w hodowli.
Przegląd
Badanie przedstawia prosty i skuteczny protokół izolacji oraz hodowli dojrzałego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) myszy. RPE stanowi kluczową barierę między naczyniówką a siatkówką, odgrywając istotną rolę w utrzymaniu zdrowia komórek siatkówki, a w szczególności fotoreceptorów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Zdrowie siatkówki
Wprowadzenie
- RPE jest niezbędne do utrzymania funkcji komórek siatkówki.
- Dysfunkcja RPE bierze udział w rozwoju chorób, takich jak związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej.
- Myszy stanowią model do manipulacji genetycznych w celu badania retinopatii.
- Obecne metody izolacji RPE są często długotrwałe i wymagają specjalistycznej wiedzy technicznej.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego i prostego protokołu izolacji pierwotnych komórek RPE od dorosłych myszy.
- Zapewnienie wysokiej wydajności i czystości hodowli komórek RPE do zastosowań badawczych.
- Stworzenie podstaw do badania rozwoju chorób siatkówki.
Zastosowane metody
- Główna metoda polega na izolacji RPE z myszy dorosłych poprzez dysekcję.
- Stosuje się podejście chirurgiczne w celu usunięcia oka, a następnie trawienie enzymatyczne.
- RPE są hodowane w specjalnej pożywce w celu obserwacji i analizy po izolacji.
- Kluczowe etapy obejmują dysekcję oka, inkubację z trypsyną oraz wirowanie.
- Wygląd i adhezja komórek są monitorowane przez kilka dni po rozpoczęciu hodowli.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na uzyskanie wysokiej czystości kultur RPE, odpowiednich do długoterminowych badań.
- Komórki RPE wykazują wyraźne zmiany morfologiczne oraz wzrost konfluencji w czasie.
- Komórki wykazują charakterystyczną pigmentację i tworzą spolaryzowane monowarstwy.
- Wyniki potwierdzają integralność hodowanych RPE, co uzasadnia ich wykorzystanie w dalszych badaniach.
Wnioski
- Badanie dostarcza przystępnej metody izolacji dorosłego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) myszy, co ułatwia prowadzenie badań nad chorobami siatkówki.
- Protokół ten pogłębia zrozumienie mechanizmów komórkowych związanych ze stanem zdrowia i chorobami RPE.
- Potencjalne zastosowania obejmują badania nad związane z wiekiem zwyrodnieniem plamki żółtej oraz innymi patologiami siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna izolacja i hodowla dorosłych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) myszy umożliwia opracowanie istotnych z punktu widzenia chorób modeli patologii siatkówki. Ten usprawniony protokół wspiera wczesne etapy odkryć oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczenie pierwotnych komórek RPE o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz w badaniach translacyjnych dla portfela chorób siatkówki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów chorobowych specyficznych dla RPE w genetycznie modyfikowalnych modelach mysich.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów terapeutycznych w chorobach siatkówki z wykorzystaniem pierwotnych komórek RPE dorosłych osobników.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie fizjologicznie istotnych układów komórkowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną wczesnych hipotez dotyczących terapii siatkówki.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne źródło pierwotnych komórek RPE do standaryzacji testów.
- Umożliwia opracowanie ilościowych, istotnych dla przebiegu choroby odczytów w testach opartych na komórkach.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy do przesiewania związków w badaniach nad siatkówką.
- Poprawia wiarygodność oceny związków dzięki zastosowaniu wysokiej czystości komórek RPE pochodzących od osobników dorosłych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele RPE in vitro do fenotypów istotnych dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Ułatwia odkrywanie i walidację biomarkerów w pierwotnych układach RPE.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem analizy ryzyka, łącząc etap odkryć z walidacją przedkliniczną.
- Umożliwia badania mechanistyczne, które stanowią podstawę do wyboru i zaprojektowania modeli przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół sytuuje izolację pierwotnych komórek RPE na styku wczesnych odkryć i badań przedklinicznych, wspierając procesy badawcze od walidacji celu po identyfikację cząsteczek wiodących w programach dotyczących chorób siatkówki.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania hipotez i wyjaśniania szlaków w chorobach zależnych od RPE.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne komórki pierwotne do ilościowej oceny związków kandydackich.
- Analityka: Umożliwia pomiar parametrów morfologicznych, molekularnych i funkcjonalnych do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami chorób in vivo w celu prowadzenia badań nad biomarkerami i skutecznością.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia ustandaryzowany, wielokrotnie stosowany protokół izolacji RPE dla różnych zespołów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad chorobami siatkówki.
- Wartość operacyjna: Upraszcza przepływy pracy, zwiększa powtarzalność i wspiera skalowalną hodowlę RPE.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową we wczesnych fazach programów dotyczących siatkówki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w obszarze chorób siatkówki.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowych umiejętności sekcji oraz standardowej infrastruktury do hodowli komórkowej.
- Wykorzystuje powszechnie dostępne odczynniki i sprzęt do dysocjacji enzymatycznej i hodowli.
- Standaryzacja między zespołami jest ułatwiona dzięki prostocie i powtarzalności protokołu.
- Adaptacja do innych szczepów lub gatunków gryzoni może wymagać optymalizacji protokołu.
- Jakość komórek może być zależna od wieku lub stanu chorobowego dawcy, co wpływa na dalsze zastosowania.
