Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek
23 września 2021
Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.
Technika wzmacniania relaksacji paramagnetycznej może być wykorzystana do scharakteryzowania i pomiaru odległości międzycząsteczkowych oraz ilościowego określenia przejściowych i/lub słabo zaludnionych oddziaływań biomolekularnych. Tutaj zastosowaliśmy tę technikę do uchwycenia interakcji, które poprzedzają kondensację białek. Czułość PBEFORE umożliwia identyfikację, detekcję i kwantyfikację stanu dynamicznego w rozdzielczości atomowej, który pozostaje niewidoczny i niedostępny dla innych technik NMR.
Kluczowe kroki w tym protokole obejmują usunięcie niesprzężonej etykiety spinowej nitroksydu i dokładną analizę widm w celu dokładnego zmierzenia wysokości piku. Ponadto należy zachować ostrożność podczas ustawiania eksperymentu NMR i kalibracji impulsów. Na początek dodaj 3-maleimido-PROXYL z roztworu podstawowego przy 20-krotnym nadmiarze molowym interesującego nas izotopowo znakowanego białka 15N.
Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza, chroniąc przed światłem i tlenem, z delikatnym kołysaniem lub nutacją. Następnego dnia należy usunąć etykietę z nieprzereagowanym swobodnym wirowaniem, aby zapobiec niespecyficznemu PRE rozpuszczalnika, stosując albo intensywną dializę próbki białka, albo filtrację żelową. Następnie użyj odczynnika Ellmana, aby określić ilościowo wolne grupy sulfhydrylowe w roztworze.
Zmierz absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek i skonstruuj krzywą wzorcową. Aby zmierzyć wewnątrzcząsteczkowy PRE, należy przygotować 15N wzbogacone izotopowo białko znakowane spinem do stężenia co najmniej 100 mikromolowych, ale nie większych niż 300 mikromolowych, w buforze odpowiednim dla NMR. Następnie za pomocą szklanej pipety lub mikropipety z długim trzonkiem przenieś próbkę NMR do pięciomilimetrowej probówki NMR odpowiedniej do stosowania w magnesach o wysokim polu.
Umieść próbkę w magnesie. Namierz sygnał deuteru za pomocą polecenia lock i dostrój i dopasuj kanał protonowy zgodnie z protokołami urządzenia. Następnie wyreguluj podkładki regulacyjne za pomocą podprogramu górna podkładka, aby zoptymalizować tłumienie sygnału rozpuszczalnika.
Następnie skalibruj impuls protonowy za pomocą programu P-OPT. Następnie skalibruj impuls 15N względem próbki wzorcowej. Określ prawidłowe tłumienie impulsów kształtowych za pomocą podprogramu narzędzia kształtu.
Następnie otwórz odpowiedni plik kształtu impulsu, klikając ikonę folderu. Ukształtowane impulsy znajdują się w sekcji parametrów impulsów parametrów akwizycji. Po załadowaniu pliku definicji impulsów kliknij Analizuj przebieg, a następnie Zintegruj kształt.
Wprowadź skalibrowany twardy impuls protonu 90 stopni, pożądany kształt, długość impulsu i obrót. Następnie oblicz poziom mocy kształtowanego impulsu, dodając zmianę poziomu mocy do tłumienia dla skalibrowanego impulsu 90 stopni. Nagraj standardowy proton 15N HSQC, aby zoptymalizować szerokość przemiatania, częstotliwość nośnej i sprawdzić tłumienie wody.
Na koniec dostosuj szerokość przeciągnięcia i liczbę przyrostów wymiarów pośrednich za pomocą poleceń SW i TD lub bezpośrednio w odpowiednich oknach dialogowych. Skalibruj ukształtowane impulsy, jak pokazano wcześniej. Następnie wprowadź skalibrowane długości impulsów w sekcji parametrów impulsów na karcie Parametry akwizycji.
Aby zmierzyć proton amidowy T2 przy użyciu podejścia z dwoma punktami opóźnienia czasowego, ustaw opóźnienia czasowe, edytując plik z listą VD. Pierwsze opóźnienie jest ustawione na 0,01 milisekundy. Korzystając z relacji do oczekiwanej maksymalnej wartości PRE, wybierz drugie opóźnienie.
Następnie określ odpowiednią wartość, porównując pierwsze przyrosty pierwszego i drugiego widma opóźnienia i dostosowując drugie opóźnienie tak, aby sygnał zanikał do 40 do 50% swojej wartości początkowej. Określ liczbę złożonych punktów do zarejestrowania i liczbę skanów, aby uzyskać wystarczające uśrednienie sygnału. Następnie użyj polecenia EXPT, aby obliczyć czas eksperymentu i rozpocznij eksperyment za pomocą polecenia ZG. Po rozpuszczeniu askorbinianu sodu w buforze NMR należy dostosować pH do pH oryginalnego buforu NMR.
Następnie dodaj kwas askorbinowy do probówki NMR w 10-krotnym nadmiarze molowym w stosunku do stężenia etykiety wirowania, umieszczając kroplę poniżej krawędzi probówki. Zakryj probówkę i ostrożnie odwróć, aby wymieszać. Wirować z prędkością od 200 do 400 g przez 10 do 20 sekund w wirówce z korbą, aby osadzać próbkę na dnie probówki.
Po owinięciu probówki folią pozwól reakcji postępować przez co najmniej trzy godziny. Następnie zapisz proton amidowy T2 na próbce diamagnetycznej, używając tych samych parametrów, które są używane dla próbki paramagnetycznej. Wewnątrzcząsteczkowe pre gamma protonów amidowych zarejestrowano na samoasocjującym, wewnętrznie nieuporządkowanym fragmencie pochodzącym z domeny o niskiej złożoności białka wiążącego RNA EWSR1.
Oczekuje się, że pozostałości znajdujące się w bliskiej sekwencyjnej odległości od punktu mocowania etykiety spinowej zostaną znacznie poszerzone i nie będą wykrywalne w widmie. Pozostałości, które były sekwencyjnie oddalone od punktu przyczepu, ale wykazywały zwiększony współczynnik gamma, były przestrzennie blisko etykiety spinu. W przypadku białek wewnętrznie nieuporządkowanych, rejestrowanie i analizowanie przecierów dostarczy informacji o kontaktach wewnątrzcząsteczkowych i powierzchniach oddziaływań przejściowych.
Połączenie pomiarów PRE z innymi metodami biofizycznymi, takimi jak dynamiczne rozpraszanie światła, chromatografia wykluczania wielkości, ultrawirowanie analityczne i metody obliczeniowe, może dostarczyć głębszych informacji. Pomiar PRE pomaga w charakterystyce przejściowego stanu słabo zaludnionego. Podejście to można rozszerzyć w celu scharakteryzowania interakcji ważnych dla niezliczonych procesów biologicznych, takich jak rozpoznawanie molekularne, allosteryczna selekcja konformacyjna i procesy składania, w tym składanie organelli bezbłonowych poprzez separację faz.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
This article presents a protocol for utilizing paramagnetic relaxation enhancement (PRE) NMR spectroscopy to detect weak and transient interactions in intrinsically disordered proteins. The technique allows for the characterization of intermolecular distances and quantification of lowly populated biomolecular interactions.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Biophysics
- Structural Biology
Background
- Paramagnetic relaxation enhancement is a powerful NMR technique.
- It can identify dynamic states that are often inaccessible to other methods.
- Understanding protein interactions is crucial for elucidating biological processes.
- Intrinsically disordered proteins play significant roles in cellular functions.
Purpose of Study
- To provide a detailed protocol for applying PRE NMR spectroscopy.
- To capture interactions that occur prior to protein condensation.
- To enhance the sensitivity and resolution of NMR measurements.
Methods Used
- Utilization of 3-maleimido-PROXYL spin label.
- Preparation of a stock solution at a 20 times molar excess.
- Careful analysis of NMR spectra to measure peak heights.
- Attention to NMR experiment setup and pulse calibration.
Main Results
- Successful detection of transient protein interactions.
- Atomic resolution identification of dynamic states.
- Quantification of biomolecular interactions that are otherwise invisible.
- Demonstration of the technique's sensitivity in capturing weak interactions.
Conclusions
- PRE NMR spectroscopy is effective for studying intrinsically disordered proteins.
- The protocol enhances our understanding of protein dynamics.
- Future applications may extend to various biomolecular interactions.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Paramagnetic relaxation enhancement (PRE) NMR enables detection and quantification of weak, transient biomolecular interactions that are invisible to conventional structural methods. This capability supports target validation by characterizing low-population encounter complexes in intrinsically disordered proteins, which are increasingly recognized as therapeutic targets. The technique provides atomic-resolution insights into dynamic states relevant to molecular recognition and phase separation processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by detecting transient protein-protein or protein-nucleic acid interactions.
- Operational Value: Enables functional target validation through measurement of intermolecular distances in dynamic systems.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by characterizing interaction surfaces that drive promiscuous binding in disordered regions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining interaction interfaces.
- Quantitative Output: Delivers distance constraints and population estimates for sparsely populated states.
- Reproducibility: Requires careful spin-label removal and peak-height analysis to ensure reliable measurements.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to biomolecular condensates and membraneless organelle formation via phase separation.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by characterizing interaction thermodynamics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed effects stem from specific binding or nonspecific aggregation.
Pipeline & Workflow Integration
PRE NMR fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for disordered protein targets where traditional structural methods fail.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by detecting encounter complexes prior to stable complex formation.
- Screening: Enables assay standardization through quantifiable PRE effects on amide proton T2 relaxation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (PRE rates, distance estimates) for comparing binding conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by characterizing interactions relevant to assembly processes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing weak interactions across multiple disordered protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through detection of transient, low-affinity interactions.
- Operational Value: Standardization via controlled spin-label conjugation and diamagnetic/paramagnetic sample comparison.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in disordered protein systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on interaction strength and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy and spin-label chemistry.
- Needs high-field NMR instrumentation with pulse calibration capabilities.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Must account for protein-specific factors affecting spin-label accessibility and relaxation.
- Limited to systems where spin labeling does not perturb native interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:49
Conjugating the 3-Maleimido-PROXYL Nitroxide Spin Label
1:38
Preparing the NMR Sample for Measuring Intramolecular PRE
2:11
Setting Up the NMR Spectrometer and Experiment Specific Parameters
3:51
Setting Up the 1HN-T2 Experiment
4:58
Making a Diamagnetic Sample by Reducing Spin-Label with Ascorbic Acid
5:52
Results: 1HN-T2 Rates for Residues 171 - 264 of the Intrinsically Disordered Domain of EWSR1
6:30
Conclusion
![Pomiar zależności pola magnetycznego od relaksacji sieci spinowej hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59399.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A20.672Z&w=384&q=75)
