Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Ogólnym celem tej metodologii jest identyfikacja wielokrotnej fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego z wykorzystaniem białka tau jako studium przypadku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w regulacji molekularnej związane z chorobą, takie jak wpływ fosforylacji na interakcję białka z jego partnerem molekularnym. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy zidentyfikować fosforylację specyficzną dla miejsca w nieuporządkowanym białku i powiązać ją ze zmianami strukturalnymi i funkcjonalnymi.

Ta metoda może zapewnić wgląd w funkcję. Może być również stosowany do innych białek, takich jak nieuporządkowane pozostałości białka DNA wirusa aPtc Zastosowania tej techniki rozciągają się w kierunku terapii poprzez rozwój białka, inhibitorów interakcji białkowych. Metodę tę zademonstrują doktoranci z naszej grupy: Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa i Hamida Merzougui.

Na początek delikatnie wymieszaj 50 mikrolitrów kompetentnych komórek BL21 ze 100 nanogramami plazmidowego DNA, tworząc od 10 do 15 milionów kolonii na mikrogram DNA osocza w plastikowej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Po umieszczeniu mieszaniny komórek na lodzie na 30 minut, szok termiczny przez 10 sekund w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Następnie umieść probówkę z powrotem na lodzie na pięć minut przed dodaniem jednego mililitra pożywki Luria Bertani lub LB o temperaturze pokojowej.

Inkubować zawiesinę bakteryjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut pod delikatnym mieszaniem. Za pomocą rozsiewacza równomiernie rozprowadzić 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na płytce agarowej z podłożem LB zawierającym 100 mikrogramów na mililitr antybiotyku ampicyliny. Inkubować płytkę selekcyjną przez 15 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie rozpuść 300 miligramów pożywki wzbogaconej w azot 15 i węgiel 13, jeden gram chlorku amonu azotu 15 i dwa gramy glukozy znakowanej węglem 13 w 10 mililitrach pożywki M9. Filtruj roztwór izotopu bezpośrednio do pożywki M9 za pomocą filtra 0,2 mikrona. Za pomocą pipety Pasteura zawiesić jedną kolonię rekombinowanych bakterii przekształconych w osocze z płytki selekcyjnej w 20 mililitrach pożywki LB, uzupełnionej 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny.

Inkubować zaszczepioną pożywkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około sześć godzin. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD600 za pomocą jednego mililitra dziesięciokrotnego rozcieńczenia kultury bakteryjnej w plastikowej kuwecie spektrometru. Następnie dodać 20 mililitrów nasyconej kultury LB do jednego litra pożywki wzrostowej M9 uzupełnionej ampicyliną w dwulitrowej szklanej kolbie hodowlanej Erlenmeyera.

Umieścić kolbę hodowlaną w programowalnym inkubatorze ustawionym na 10 stopni Celsjusza i 50 obr./min. Zaprogramuj inkubator tak, aby przełączał się na 200 obr./min i 37 stopni Celsjusza wcześnie rano następnego dnia. Zmierz OD600 na jednym mililitrze kultury bakteryjnej w plastikowej kuwecie spektrometru.

Dodać 400 mikrolitrów jednego molowego roztworu podstawowego IPTG, gdy OD600 osiągnie wartość około 1,0, aby indukować ekspresję rekombinowanego białka tau. Po inkubacji komórek bakteryjnych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe trzy godziny, zbierz je przez odwirowanie w temperaturze 5 000 razy g przez 20 minut. Rozmrozić osad komórek bakteryjnych i dokładnie zawiesić go w 45 mililitrach buforu kationowymiennego A, świeżo uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy DNasel 1.

Rozbij komórki bakteryjne za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego o ciśnieniu 20 000 PSI, konieczne są trzy do czterech przejść, aby odpowiednio zakłócić działanie komórek. Odwirować uszkodzone komórki pod ciśnieniem 20 000 g przez 40 minut, aby usunąć nierozpuszczalny materiał. Podgrzewaj ekstrakt z komórek bakteryjnych przez 15 minut w temperaturze 75 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.

Po kilku minutach zaobserwuje się biały osad. Następnie odwirować podgrzany ekstrakt w temperaturze 15 000 g przez 20 minut i przechowywać supernatant zawierający stabilne termicznie białko tau. Następnie wykonaj chromatografię kationowymienną na mocnej żywicy CEX wypełnionej jako 5-mililitrowa kolumna złożowa przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek.

Ustaw natężenie przepływu na 2,5 mililitra na minutę i zrównoważ kolumnę w buforze CEX A. Następnie załaduj od 60 do 70 mililitrów podgrzanego ekstraktu tau za pomocą pompy do próbki, zbierz przepływ do analizy, aby sprawdzić, czy białko tau skutecznie wiąże się z żywicą. Przemyć żywicę buforem CEX A, aż absorbancja przy 280 nanometrach powróci do wartości wyjściowej.

Zaprogramuj FPLC z gradientem do 25% bufora CEX B w 10 objętościach kolumn, aby osiągnąć 250 milimolowy chlorek sodu. Następnie użyj 50% buforu CEX B w pięciu objętościach kolumn, aby osiągnąć 500 milimolowy chlorek sodu. Na koniec zwiększ gradient do 100% buforu CEX B w dwóch objętościach kolumn, aby osiągnąć jeden molowy chlorek sodu.

Zbierz frakcje 1,5 mililitra podczas etapów elucji. Następnie wykonaj wymianę buforową na tau zawierającym frakcje zbiorcze. Zrównoważyć kolumnę odsalającą z 53-mililitrowym złożem wypełnionym żywicą G25 w 15-milimolowym buforze wodorowęglanowym amonu za pomocą systemu FPLC.

Ustaw natężenie przepływu na pięć mililitrów na minutę i wstrzyknij próbkę tau do kolumny za pomocą pięciomililitrowej pętli wtryskowej. Zbierz frakcje odpowiadające pikowi absorpcji przy 280 nanometrach. Zebrać wszystkie frakcje tau przed umieszczeniem próbki w probówkach.

Wybierz te probówki tak, aby objętość roztworu była mała w porównaniu z objętością probówki. Następnie przebij otwory w nakrętkach probówek za pomocą igły przed zamrożeniem próbek tau w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu późniejszej liofilizacji. Rozpuścić cztery miligramy liofilizowanego azotu 15 i węgla 13 wzbogaconego w fosforylowany erk tau w 400 mikrolitrach buforu NMR.

Dodaj pięcioprocentowy tlenek deuteru do blokowania w polu spektrometru NMR i jeden milimolowy TMSP jako wewnętrzne odniesienie sygnału NMR. Dodaj również 10 mikrolitrów podstawowego roztworu 40 EK kompletnego koktajlu inhibitorów proteazy. Przenieść próbkę w pięciomililitrowej probówce NMR za pomocą elektronicznej strzykawki z długą igłą lub za pomocą pipety Pasteura.

Zamknąć rurkę NMR za pomocą tłoka. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między tłokiem a cieczą, przesuwając tłok. Umieść probówkę NMR w wirówce.

Użyj odpowiedniego miernika, aby dostosować jego pionowe położenie w wirówce tak, aby większość roztworu próbki znajdowała się wewnątrz cewki NMR. Następnie uruchom przepływ powietrza w przyrządzie NMR, klikając podnieś w oknie Magnet Control System. Ostrożnie umieść kołpak z rurką w strumieniu powietrza w górnej części otworu magnesu.

Następnie zatrzymaj przepływ powietrza i pozwól, aby rurka opadła na miejsce wewnątrz głowicy sondy w magnesie. Po zrównoważeniu próbki do 25 stopni Celsjusza, wpisz ATMM w wierszu poleceń, aby wykonać półautomatyczne strojenie i dopasowanie głowicy sondy w celu optymalizacji przenoszenia mocy. Następnie kliknij blokadę w oknie Magnet Control System, aby włączyć blokadę częstotliwości pola spektrometru.

Rozpocznij procedurę podkładkowania, aby zoptymalizować jednorodność pola magnetycznego w pozycji próbki, wpisując najpierw TopShim GUI w wierszu poleceń, aby otworzyć okno podkładki. Następnie kliknij start w oknie podkładki. Sprawdź resztkowe odchylenie standardowe B0, aby upewnić się, że podkładki regulacyjne są optymalne.

Następnie skalibruj parametr P1, który jest długością impulsu o częstotliwości radiowej protonu w mikrosekundach. Ten parametr jest niezbędny do uzyskania obrotu o 90 stopni namagnesowania spinu protonu. Celuj w impuls 360 stopni za pomocą jednowymiarowego spektrum protonów wody.

Dostosuj przesunięcie częstotliwości, ustawiając parametr O1 na częstotliwość wody protonowej w widmie jednowymiarowym. Na koniec rozpocznij akwizycję jednowymiarowego widma protonów, wpisując ZG w wierszu poleceń. Reprezentatywny wynik oczyszczania rekombinowanego tau wskazuje na duży pik absorpcji na głębokości 280 nanometrów obserwowany podczas gradientu elucji.

Pik ten odpowiada oczyszczonemu białku tau, jak widać na żelu akrylamidowym powyżej chromatogramu. Chromatogram do odsalania rekombinowanego oczyszczonego tau pokazuje, że pik absorpcji na 280 nanometrach i pik przewodności są dobrze oddzielone, co zapewnia, że odsalanie białka jest skuteczne na etapie liofilizacji. Jednowymiarowe widmo NMR rekombinowanego azotu 15 tau w częstotliwości 900 megaherców potwierdza, że można wykryć sygnał NMR z próbki białka.

Dobry stosunek sygnału do szumu wskazuje, że podstawowe parametry akwizycji zostały ustawione prawidłowo. Dwuwymiarowe widmo fosforylowanego białka wykazuje dobrą rozdzielczość, rezonanse są wąskie i dobrze oddzielone. Rezonanse w obszarze widma oznaczone na czerwono odpowiadają fosforylowanym resztom.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyprodukować rekombinowane białko z łatwym do wyboru oznakowaniem, oczyścić to białko i ustawić podstawowy parametr do pozyskiwania danych o widmie. Po opanowaniu tego protokołu można go wykonać w ciągu dwóch tygodni, jeśli jest odpowiednio zorganizowany. Nie zapominaj, że spektroskopia NMR wykorzystuje bardzo silne magnesy, do których nie wolno zbliżać się metalowymi przedmiotami.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że te inne białka są wrażliwe na lizę proteazy i należy podjąć szereg środków ostrożności, aby uniknąć degradacji próbki. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak NMR w stanie stałym, do zbadania agregatów podobnych do amyloidu, które często są tworzone przez nieuporządkowane białka. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią chemiczną do badania związków aktywnych o potencjale serapatycznym w modelowych systemach in vitro.