Name: Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych za pomocą spektroskopii NMR na przykładzie białka Tau. Technika ta pozwala na określenie miejsc fosforylacji i powiązanie ich ze zmianami strukturalnymi oraz funkcjonalnymi białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Urządzenia NMR zostały sfinansowane przez Région Nord, CNRS, Instytut Pasteura w Lille, Wspólnotę Europejską (FEDER), francuskie Ministerstwo Badań Naukowych oraz Uniwersytet Nauk i Technologii w Lille. Dziękujemy za wsparcie ze strony TGE RMN THC (FR-3050, Francja), FRABio (FR 3688, Francja) oraz głównego ośrodka Lille NMR i RPE Health and Biology. Nasze badania są wspierane przez granty z LabEx (Laboratory of Excellence), DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer's disease), EU ITN TASPPI oraz ANR BinAlz.

1. Produkcja 15N, 13C-Tau (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Przekształć rekombinowany plazmid13,14 ekspresji T7 pET15b-Tau w kompetentne komórki bakteryjne Escherichia coli BL21(DE3)15, 
	UWAGA: cDNA kodujące najdłuższą (441 reszt aminokwasowych) izoformę Tau jest klonowana między miejscami restrykcyjnymi NcoI i XhoI w plazmidzie pET15b.
	<ol>
		<li>Delikatnie wymieszaj 50 μl kompetentnych komórek BL21(DE3), tworząc 1-5 x 107 kolonii na μg plazmidowego DNA, ze 100 ng plazmidowego DNA w plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Szczepy bakteryjne zoptymalizowane pod kątem użycia kodonów do eukariotycznej ekspresji cDNA nie są niezbędne do produkcji ludzkiego Tau.</li>
		<li>Umieść mieszaninę komórek na lodzie na 30 minut, a następnie poddaj szokowi termicznemu przez 10 sekund w temperaturze 42 °C. Umieść probówkę z powrotem na lodzie na 5 minut i dodaj 1 ml pożywki LB (Luria-Bertani) o temperaturze pokojowej. Zawiesinę bakteryjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut pod delikatnym mieszaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozprowadzić za pomocą pętli inokulacyjnej 100 μl zawiesiny komórkowej równomiernie na płytce agarowej z pożywką LB zawierającą 100 μg/ml antybiotyku ampicyliny.</li>
	<li>Inkubować płytkę selekcyjną przez 15 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przechowywać płytkę selekcyjną w temperaturze 4 °C do momentu przejścia do etapu hodowli, maksymalnie przez około 2 tygodnie. 
	UWAGA: można przygotować zapas glicerolu w kulturze bakteryjnej (50% glicerolu), przechowywany w temperaturze -80 °C, w celu rozpoczęcia hodowli na późniejszym etapie.</li>
	<li>Dodać 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100 x dopełniacza witaminowego MEM, 1 ml 100 mg/ml ampicyliny do 1 l autoklawowanych soli M9 (6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl). 
	UWAGA: Po dodaniu roztworu CaCl2 do soli M9 utworzy się biały osad, który szybko się rozprasza.</li>
	<li>Rozpuścić 300 mg pożywki 15N, 13C-complete, 1 g 15NH4Cl i 2 g 13C6-glukozy w 10 ml pożywki M9. Przefiltrować i wysterylizować roztwór izotopowy za pomocą filtra 0,2 μm, bezpośrednio do pożywki M9.</li>
	<li>Zawiesić za pomocą pętli inokulacyjnej jedną kolonię bakterii przekształconych w pET15b-Tau z płytki selekcyjnej w 20 ml pożywki LB uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny.</li>
	<li>Inkubować zaszczepioną pożywkę w temperaturze 37 °C przez około 6 godzin.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) na 1 ml dziesięciokrotnego rozcieńczenia kultury bakteryjnej w plastikowej kuwecie spektrometru. 
	UWAGA: Zmętnienie kultury bakteryjnej odpowiadające OD600 wynoszące 3,0-4,0 wskazuje, że osiągnięto fazę wzrostu nasycenia.</li>
	<li>Dodać 20 ml nasyconej kultury LB do 1 l pożywki wzrostowej M9 uzupełnionej ampicyliną (100 μg/ml stężenie końcowe) do 2 l plastikowej kolby hodowlanej Erlenmeyera.</li>
	<li>Umieścić kolbę hodowlaną w programowalnym inkubatorze ustawionym na 10 °C i 50 obr./min. Zaprogramować inkubator tak, aby przełączał się na 200 obr./min i 37 °C wcześnie rano następnego dnia.</li>
	<li>Zmierzyć OD600 na 1 ml kultury bakteryjnej w plastikowej kuwecie spektrometru. Dodać 400 μl 1 M roztworu podstawowego IPTG (izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu) (przechowywanego w temperaturze -20 °C), gdy OD600 osiągnie wartość około 1,0, w celu wywołania ekspresji rekombinowanego białka Tau.</li>
	<li>Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez kolejne 3 godziny. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 20 minut.</li>
	<li>Zamrozić granulat bakteryjny w temperaturze -20 °C. Przechowywać w stanie zamrożonym do momentu oczyszczenia, w razie potrzeby przez dłuższy czas.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie 15 N, 13 C-Tau (Rysunek 2)
<ol>
	<li>do oczyszczania kationowymiennego w autoklawie (CEX) w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 psi przez 20 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozmrozić osad komórek bakteryjnych i dokładnie zawiesić w 45 ml ekstrakcji Bufor CEX A (50 mM NaPi, bufor pH 6,5, 1 mM EDTA) świeżo uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy 1x (1 tabletka) i DNAseI (2,000 jednostek).</li>
	<li>Rozbić komórki bakteryjne za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego o ciśnieniu 20 000 psi. Konieczne są 3-4 przejścia. Wirować przy 20 000 x g przez 40 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału.</li>
	<li>Podgrzewać ekstrakt z komórek bakteryjnych przez 15 minut w temperaturze 75 °C w łaźni wodnej. 
	UWAGA: po kilku minutach obserwuje się biały osad.</li>
	<li>Wirować przy 15 000 x g przez 20 minut i utrzymywać supernatant zawierający stabilne termicznie białko Tau.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C do następnego etapu oczyszczania, jeśli jest to konieczne.</li>
	<li>Przeprowadzić chromatografię kationowymienną na mocnej żywicy CEX wypełnionej jako kolumna ze złożem o pojemności 5 ml przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) (Rysunek 3 A).
	<ol>
		<li>Ustawić natężenie przepływu na 2,5 ml/min.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę w buforze CEX A</li>
		<li>Załadować 60-70 ml podgrzanego ekstraktu zawierającego Tau za pomocą pompy do próbki lub alternatywnie pompy A, w zależności od systemu. Pobrać przepływ do analizy w celu sprawdzenia, czy białko Tau skutecznie wiąże się z żywicą (patrz 2.8).</li>
		<li>Przemyć żywicę buforem CEX A, aż absorbancja przy 280 nm powróci do wartości wyjściowej.</li>
		<li>Eluować Tau z kolumny za pomocą trzystopniowego gradientu NaCl otrzymanego przez stopniowe zwiększanie buforu CEX B (bufor CEX A z 1 M NaCl). Zaprogramuj FPLC w następujący sposób: pierwszy krok gradientu do 25% bufora CEX B w 10 objętościach kolumn (CV), aby osiągnąć 250 mM NaCl, drugi krok do 50% bufora CEX B w 5 CV, aby osiągnąć 500 mM NaCl, a trzeci krok do 100% bufora CEX B w 2 CV, aby osiągnąć 1 M NaCl. Zebrać 1,5 ml frakcji podczas etapów elucji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizować 10 μl frakcji zebranych na etapie elucji za pomocą SDS-PAGE (12% SDS-akryloamidu w żelu) i barwienia Coomassie (ryc. 3 A)16. Sprawdź również stopień załadunku kolumny, analizując 10 μl przepływu.</li>
	<li>Wybierz frakcje zawierające Tau i połącz te frakcje w następnym kroku.</li>
	<li>Przeprowadzić wymianę buforową na frakcjach zbiorczych zawierających Tau (Rysunek 3 B).
	<ol>
		<li>Wyrównać kolumnę odsalającą z 53 ml złoża wypełnionego żywicą G25 (26 x 10 cm) w 50 mM wodorowęglanu amonu (bufor lotny) za pomocą systemu FPLC.</li>
		<li>Ustawić natężenie przepływu na 5 ml/min. Wstrzyknąć próbkę Tau do kolumny za pomocą pętli iniekcyjnej o pojemności 5 ml. Zebrać frakcje odpowiadające pikowi absorpcji przy 280 nm.</li>
		<li>Powtórzyć wstrzyknięcie 3-4 razy, w zależności od objętości początkowej puli CEX.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć ilość oczyszczonego białka Tau, wykorzystując pole piku chromatogramu przy 280 nm (1 mg Tau odpowiada 140 mAU*ml). 
	UWAGA: Współczynnik ekstynkcji białka Tau przy 280 nm wynosi 7 550 M-1 cm-1. Tau nie zawiera żadnych pozostałości Trp.</li>
	<li>Zbierz wszystkie frakcje Tau.</li>
	<li>Podwielokrotność próbki rozmieścić w probówkach zawierających równoważnik 1-5 mg Tau. Należy wybrać te probówki tak, aby objętość roztworu była mała w porównaniu z objętością probówki (na przykład 5 ml roztworu w probówce o pojemności 50 ml).</li>
	<li>Przebij otwory w nakrętkach probówek za pomocą igły. Próbki Tau należy zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Liofilizuj próbki Tau. Liofilizowane białko Tau może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez długi czas.</li>
</ol>
3. Fosforylacja in vitro 15N-Tau
<ol>
	<li>Rozpuścić 5 mg liofilizowanego Tau w 500 μl buforu do fosforylacji (50 mM Hepes·KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).</li>
	<li>Dodać 2,5 mM ATP (25 μl 100 mM roztworu podstawowego utrzymywanego w temperaturze -20 °C), 1 mM DTT (1 μl 1 M roztworu podstawowego utrzymywanego w temperaturze -20 °C), 1 mM EGTA (2 μl 0,5 M roztworu podstawowego), 1 x koktajl inhibitora proteazy (25 μl z 40 x roztworu podstawowego otrzymanego przez rozpuszczenie 1 tabletki w 1 ml buforu fosforylacyjnego) i 1 μM aktywowany His-ERK2 (250 μl w buforze konserwującym 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl i 10% glicerolu, przechowywanym w temperaturze -80 °C) w całkowitej objętości próbki 1 ml. 
	UWAGA: Aktywowany His-ERK2 można wytworzyć we własnym zakresie5,8 przez fosforylację kinazą MEK.</li>
	<li>Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Podgrzewać próbkę w temperaturze 75 °C przez 15 minut w celu inaktywacji kinazy ERK.</li>
	<li>Wirować przy 20 000 x g przez 15 minut. Zebrać i przechowywać supernatant.</li>
	<li>Odsalić próbkę białka do 50 mM wodorowęglanu amonu za pomocą kolumny wypełnionej żywicą G25 o pojemności 3,45 ml (1,3 x 2,6 cm), która jest odpowiednia dla próbki o objętości 1 ml.</li>
	<li>Uruchom 12% SDS-PAGE16 z 2,5 μl próbki białka, aby sprawdzić zarówno jej integralność, jak i wydajną fosforylację (ryc. 4).</li>
	<li>Liofilizuj ufosforylowaną próbkę Tau. Przechowywać proszek w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Akwizycja widm NMR (Rysunek 5)
<ol>
	<li>Rozpuścić 4 mg liofilizowanego 15N, 13C ERK-fosforylowanego-Tau w 400 μl buforu NMR (50 mM NaPi lub 50 mM deuterowanego Tris-d11. Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA i 1 mM DTT).</li>
	<li>Dodać 5% D2O do blokowania pola spektrometru NMR i 1 mM TMSP (sól sodowa kwasu 3-(trimetylosililo)propionowego-2,2,3,3-d4)) jako wewnętrznego odniesienia sygnału NMR. Dodać 10 μl 40-krotnego roztworu podstawowego kompletnego koktajlu inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Przenieść próbkę w probówce NMR o średnicy 5 mm za pomocą elektronicznej strzykawki z długą igłą lub pipety Pasteura. Zamknąć rurkę NMR za pomocą tłoka. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między tłokiem a cieczą za pomocą ruchów tłoka.</li>
	<li>Umieść probówkę NMR w wirówce. Dostosuj jego pionowe położenie w wirówce za pomocą odpowiedniego miernika dla używanej głowicy sondy NMR, tak aby większość roztworu próbki znajdowała się wewnątrz cewki NMR.</li>
	<li>Uruchom przepływ powietrza: kliknij przycisk lift w oknie systemu sterowania magnesami. Ostrożnie umieść kołpak z rurką w strumieniu powietrza w górnej części otworu magnesu. Zatrzymaj przepływ powietrza (kliknij podnoszenie) i pozwól, aby rurka opadła na miejsce wewnątrz głowicy sondy w magnesie.</li>
	<li>Ustawić temperaturę na 25 °C (298 K).</li>
	<li>Wykonaj półautomatyczne dostrajanie i dopasowywanie głowicy sondy, aby zoptymalizować przenoszenie mocy. Wpisz atmm w wierszu poleceń.</li>
	<li>Zablokować częstotliwość spektrometru za pomocą sygnału D2O próbki zarejestrowanej na kanale deuteru. Kliknij kłódkę w oknie systemu sterowania magnesami.</li>
	<li>Rozpocznij procedurę podkładkowania, aby zoptymalizować jednorodność pola magnetycznego w pozycji próbki. Wpisz topshim gui w wierszu poleceń, aby otworzyć okno podkładki. Kliknij przycisk start w oknie podkładki. Sprawdź resztkową wartość odchylenia standardu B0, aby upewnić się, że podkładki regulacyjne są optymalne (mniej niż 2 Hz jest dobre).</li>
	<li>Skalibruj parametr p1 (długość impulsu o częstotliwości radiowej protonu w μs), który jest niezbędny do uzyskania rotacji spinów protonów o 90°. Celuj w impuls 360° za pomocą widma 1D protonów wodnych (ryc. 6).</li>
	<li>Dostosuj przesunięcie częstotliwości, ustawiając parametr o1 (w Hz) na częstotliwość wody protonowej w widmie 1D (rysunek 6).</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję widma protonów 1D (sekwencja impulsów z sekwencją watergate do tłumienia sygnału wodnego, na przykład zggpw5) w celu weryfikacji sygnałów z próbki (rysunek 7). Dostosuj liczbę skanów do względnego stężenia białka. Wpisz zg w wierszu polecenia, aby rozpocząć pobieranie.</li>
	<li>Ustaw dodatkowe parametry do akwizycji widma 2D [1 H,15N] HSQC (sekwencja impulsów hsqcetfpf3gpsi, rysunki 8-9).
	<ol>
		<li>W przypadku próbki znakowanej 15 N,13C należy odsprzęgnąć 13C podczas pośredniej ewolucji 15N.</li>
		<li>Ustaw liczbę punktów i szerokość widmową (ppm) w wymiarach 1H (F2) i 15N (F1). 
		UWAGA: Dostosuj liczbę punktów danych akwizycji do pola spektrometru, aby utrzymać podobną liczbę Hz na punkt i ograniczyć czasy rozprzęgania: użyj 3 072 punktów przy 900 MHz i 2 048 punktów przy 600 MHz, w wymiarze 1H.</li>
		<li>Zoptymalizuj dodatkowe parametry w sekwencjach impulsów, odpowiadające opóźnieniom, długościom impulsów, częstotliwościom przesunięcia, poziomom mocy. Wpisz ased w wierszu polecenia, aby wyświetlić wszystkie parametry istotne dla eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić parametry akwizycji widma 3D [1 H,15 N,13C] HNCACB (sekwencja impulsów hncacbgpwg3d, rysunek 10A) przy 600 MHz.</li>
	<li>Ustaw parametry dla eksperymentu 3D [1 H,15 N,15N] HNCANNH (sekwencja impulsów hncannhgpwg3d) na częstotliwości 600 MHz. Ustaw liczbę punktów na 2048 w 1H oraz 64 i 128 punktów w dwóch wymiarach 15N. Zdefiniuj szerokości spektralne jako 14, 25, 25 części na milion (ppm) wyśrodkowane na 4,7, 119, 119 ppm w wymiarach 1H, 15N i 15N. Czas akwizycji z 16 skanami wynosi 1 dzień i 22 godziny.</li>
</ol>
5. Identyfikacja miejsc fosforylacji
<ol>
	<li>Przetwarzaj widma za pomocą oprogramowania do akwizycji i przetwarzania NMR.
	<ol>
		<li>Wykonaj transformację Fouriera danych (Rysunek 7). Wpisz ft dla widma 1D, xfb dla widma 2D lub ft3d dla widma 3D w wierszu polecenia.</li>
		<li>Phase i odniesienie wszystkich widm (rysunek 7C) za pomocą okien interaktywnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj interesujące rezonanse w 2D HSQC potencjalnie odpowiadające fosforylowanym resztom Ser i Thr (ryc. 9, czerwona ramka).</li>
	<li>Wyodrębnij płaszczyzny (tj. widma 2D 1 H-13C) z widma 3D 1 H-15 N-13C, wykorzystując 15N przesunięć chemicznych rezonansów będących przedmiotem zainteresowania w 2D. Użyj kursora wymiaru 2 (w2), aby wybrać częstotliwość 15N odpowiadającą płaszczyźnie (w1-w3), która ma być wizualizowana (Rysunek 10B).</li>
	<li>Wybierz częstotliwości rezonansowe jąder 'CA' i 'CB' 13C reszt 'i' i 'i-1' (słabszy zestaw sygnałów w porównaniu do reszt i) dla każdego [1H, 15N] rezonansu będącego przedmiotem zainteresowania w widmie HNCACB 3D, klikając na rezonans, w menu trybu wskaźnika znajdź/dodaj pik, , aby dodać wartość przesunięcia chemicznego w pliku listy pików.
	<ol>
		<li>Zidentyfikować typ reszty i, pSer lub pThr, porównując przesunięcia chemiczne w wykazie pików ze znanymi wartościami przesunięć chemicznych CA i CB pSer i pThr17.</li>
		<li>Zidentyfikować obecność pozostałości Pro w pozycji i+1 poprzez charakterystyczne dodatkowe przesunięcie o +2 ppm wartości przesunięcia chemicznego CA18.</li>
		<li>Porównaj wartości przesunięcia chemicznego rezonansów CA i CB odpowiadających resztce i-1 z tabelą przesunięć chemicznych przewidywanych dla reszt aminokwasowych Tau19 w celu określenia charakteru reszty w pozycji i-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz częstotliwości rezonansowe 15jąder N reszt "i" i "i-1" dla każdego [1H, 15N] rezonansu będącego przedmiotem zainteresowania w widmie HNCANNH.</li>
	<li>Porównaj wartości przesunięcia chemicznego 15N z przypisaniem przesunięcia chemicznego białka Tau20-23.</li>
	<li>Porównaj zidentyfikowane dipeptydy z sekwencją Tau, aby zdefiniować przypisanie specyficzne dla sekwencji.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystaliśmy spektroskopię NMR do scharakteryzowania enzymatycznie modyfikowanych próbek Tau. Opisana tutaj rekombinowana ekspresja i oczyszczanie dla pełnowymiarowego ludzkiego białka Tau może być podobnie wykorzystane do produkcji zmutowanych Tau lub domen Tau. Do spektroskopii NMR potrzebne jest białko wzbogacone izotopowo, co wymaga ekspresji rekombinowanej. Identyfikacja miejsc fosforylacji wymaga przypisania rezonansu i podwójnie znakowanego białka 15N, 13C. Biorąc pod uwagę koszt izotopów,...

Jednym z głównych wyzwań opieki zdrowotnej w XXIwieku są choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD). Tau jest białkiem związanym z mikrotubulami, które stymuluje tworzenie mikrotubul (MT). Tau jest w równym stopniu zaangażowane w kilka zaburzeń neurodegeneracyjnych, tak zwanych tauopatii, z których najbardziej znaną jest AD. W tych zaburzeniach Tau samoczynnie agreguje się w sparowanych spiralnych włóknach (PHF) i jest modyfikowany na wielu resztach przez modyfikacje potranslacyjne (PTM), takie jak fosforylacja1. Fosforylacja białka Tau jest zaangażowana zarówno w regulację jego fizjologicznej funkcji stabilizacji MT, jak i patologiczną utratę funkcji, która charakteryzuje neurony AD.
Ponadto, białko Tau, gdy jest zintegrowane z PHF w chorych neuronach, jest niezmiennie hiperfosforylowane2. W przeciwieństwie do normalnego Tau, który zawiera 2-3 grupy fosforanowe, hiperfosforylowane Tau w PHF zawiera od 5 do 9 grup fosforanowych3. Hiperfosforylacja Tau odpowiada zarówno wzrostowi stechiometrii w niektórych miejscach, jak i fosforylacji dodatkowych miejsc, które nazywane są patologicznymi miejscami fosforylacji. Jednak istnieje nakładanie się na siebie między AD a normalnymi wzorcami fosforylacji u dorosłych, pomimo różnic ilościowych na poziomie4. To, w jaki sposób określone zdarzenia fosforylacji wpływają na funkcję i dysfunkcję Tau, pozostaje w dużej mierze nieznane. Naszym celem jest rozszyfrowanie regulacji Tau przez PTM na poziomie molekularnym.
Aby pogłębić zrozumienie molekularnych aspektów Tau, musimy zmierzyć się z wyzwaniami technicznymi. Po pierwsze, Tau jest białkiem wewnętrznie nieuporządkowanym (IDP) wyizolowanym w roztworze. Takie białka nie mają dobrze zdefiniowanej trójwymiarowej struktury w warunkach fizjologicznych i wymagają szczególnych metod biofizycznych do badania ich funkcji i właściwości strukturalnych. Tau jest paradygmatem dla rosnącej klasy osób wewnętrznie przesiedlonych, często kojarzonych z patologiami, takimi jak choroby neurodegeneracyjne, co zwiększa zainteresowanie zrozumieniem parametrów molekularnych leżących u podstaw ich funkcji. Po drugie, charakterystyka fosforylacji Tau jest wyzwaniem analitycznym, z 80 potencjalnymi miejscami fosforylacji wzdłuż sekwencji najdłuższej 441 aminokwasowej izoformy Tau. Opracowano szereg przeciwciał przeciwko fosforylowanym epitopom Tau i są one wykorzystywane do wykrywania patologicznego Tau w neuronach lub tkance mózgowej. Zdarzenia fosforylacji mogą zachodzić w co najmniej 20 miejscach, do których skierowane są kinazy skierowane na prolinę, większość z nich znajduje się w bliskiej odległości w regionie bogatym w prolinę. Charakterystyka jakościowa (które miejsca?) i ilościowa (jaka stechiometria?) jest trudna nawet przy użyciu najnowszych technik stwardnieniarozsianego 5.
Spektroskopia NMR może być używana do badania nieuporządkowanych białek, które są wysoce dynamicznymi systemami złożonymi z zespołów konformerów. Spektroskopia NMR o wysokiej rozdzielczości została wykorzystana do zbadania zarówno struktury, jak i funkcji białka Tau. Ponadto złożoność profilu fosforylacji Tau doprowadziła do opracowania narzędzi molekularnych i nowych metod analitycznych wykorzystujących NMR do identyfikacji miejsc fosforylacji 6-8. NMR jako metoda analityczna pozwala na identyfikację miejsc fosforylacji Tau w sposób globalny, wizualizację wszystkich modyfikacji w jednym miejscu w jednym eksperymencie oraz ilościowe określenie stopnia włączenia fosforanu. Punkt ten jest istotny, ponieważ chociaż badania nad fosforylacją Tau obfitują w literaturę, większość z nich przeprowadzono na przeciwciałach, co pozostawia duży stopień niepewności co do pełnego profilu fosforylacji, a tym samym prawdziwego wpływu poszczególnych zdarzeń fosforylacji. W formie aktywnej można przygotować kinazy rekombinowane, w tym PKA, kinazę syntazy glikogenu 3β (Gsk3β), kinazę zależną od cyklin 2/cyklinę A (CDK2/), białko aktywujące kinazę zależną od cykliny 5 (CDK5)/p25, kinazę regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym 2 (ERK2) i kinazę regulującą powinowactwo do mikrotubul (MARK), które wykazują aktywność fosforylacyjną w stosunku do Tau. Ponadto mutanty Tau, które pozwalają na generowanie specyficznych izoform białka Tau o dobrze scharakteryzowanych wzorcach fosforylacji, są wykorzystywane do rozszyfrowania kodu fosforylacji Tau. Spektroskopia NMR jest następnie wykorzystywana do charakteryzowania enzymatycznie modyfikowanych próbek Tau 6-8. Chociaż fosforylacja Tau in vitro jest trudniejsza niż pseudofosforylacja, np. poprzez mutację wybranego Ser/Thr do reszt kwasu glutaminowego (Glu), podejście to ma swoje zalety. Rzeczywiście, ani wpływ strukturalny, ani parametry interakcji fosforylacji nie zawsze mogą być naśladowane przez kwasy glutaminowe. Przykładem jest motyw skrętu obserwowany wokół fosfoseryny 202 (pSer202)/fosfotreoniny 205 (pThr205), który nie jest odtwarzany z mutacjami Glu9.
Tutaj najpierw zostanie opisane przygotowanie izotopowo znakowanego Tau do badań NMR. Białko Tau fosforylowane przez ERK2 jest modyfikowane w wielu miejscach opisywanych jako patologiczne miejsca fosforylacji, a zatem stanowi interesujący model hiperfosforylowanego Tau. Przedstawiono szczegółowy protokół fosforylacji Tau in vitro przez rekombinowaną kinazę ERK2. ERK2 jest aktywowany przez fosforylację przez kinazę białkową aktywowaną mitogenem/kinazę ERK (MEK)10-12. Oprócz otrzymywania zmodyfikowanego, znakowanego izotopowo białka Tau, opisano strategię NMR stosowaną do identyfikacji PTM.

<table><tbody><tr><td>pET15B rekombinowany plazmid ekspresji T7</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>BL21(DE3) kompetentna transformacja E. bakterie coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Przechowywać w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Autoklawizowany bulion LB, Lennox&nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>Pożywka bakteryjna MEM</td></tr><tr><td>Suplementy witaminowe 100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>Bakteryjna pożywka</td></tr> wzrostowa Suplement<tr><td>15N, 13C-ISOGRO kompletne podłoże w proszku</td><td>Sigma</td><td>608297</td><td>Suplement na pożywkę do wzrostu bakterii</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td> Izotop <td>299251 Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>Tabletki</td></tr><tr><td>inhibitora proteazy izotopowej&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>Trzymaj na 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>1 tabletka w 1 ml to 40x roztwór, który można przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>Przechowywać na poziomie -20 stopni; </td></tr><tr><td>C Homogenizator (EmulsiFlex-C3)</td>Liza <td>AVESTIN</td><td></td><td>odbywa się w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Niebarwiony marker białkowy MW</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>Aktywna ludzka kinaza MEK1, GST Tagged</td><td>Sigma</td><td>M8822</td><td>Utrzymuj na poziomie -80 &deg; C</td></tr><tr><td>AKT&Auml; System chromatografii czystej</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (kolumna 5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>Kolumny chromatografii kationowymiennej</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Odsalanie</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>Kolumna do odsalania białek</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>Kolumna do odsalania białek</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Deuterowany bufor NMR</td></tr><tr><td>5 mm Symetryczna mikrorurka SHIGEMI D2O (zestaw 5 rurek wewnętrznych i zewnętrznych)&nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR Shigemi</td></tr><tr><td>Tubes eVol kit-elektroniczny zestaw startowy strzykawki</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>Pipetowanie</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII z potrójnym rezonansem głowica sondy kriogenicznej</td><td>Spektrometr NMR Bruker</td><td></td><td>do akwizycji danych</td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz Avance z głowicą kriogeniczną z potrójnym rezonansem</td> Spektrometr <td>NMR Bruker</td><td></td><td>do akwizycji danych</td></tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania eksperymentów NMR</td></tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard i D. G. Kneller)</td><td></td> <td>Oprogramowanie do analizy danych NMR</td></tr></tbody></table>

spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Agregaty neuronalnego białka Tau znajdują się w neuronach pacjentów z chorobą Alzheimera. Rozwojowi choroby towarzyszy wzmożona, nieprawidłowa fosforylacja Tau. W trakcie badań molekularnych funkcji i dysfunkcji Tau w chorobie stosuje się spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w celu identyfikacji wielorakich fosforylacji Tau. Przedstawiamy szczegółowe protokoły rekombinowanej produkcji Tau w bakteriach, z wzbogacaniem izotopowym do badań NMR. Opisano etapy oczyszczania, które wykorzystują stabilność cieplną Tau i wysoki punkt izoelektryczny. Protokół fosforylacji Tau in vitro przez rekombinowany aktywowany ERK2 pozwala na generowanie wielu fosforylacji. Próbka białka jest gotowa do pozyskania danych na etapie tych kroków. Następnie rozważana jest konfiguracja parametrów w celu rozpoczęcia nagrywania na spektrometrze. Na koniec wyjaśniono strategię identyfikacji miejsc fosforylacji zmodyfikowanego Tau na podstawie danych NMR. Omówiono korzyści płynące z tej metodologii w porównaniu z innymi technikami stosowanymi do identyfikacji miejsc fosforylacji, takimi jak immunodetekcja lub spektrometria mas (MS).

Rysunek 3A przedstawia główny pik absorpcji przy 280 nm zaobserwowany podczas gradientu elucji. Pik ten odpowiada oczyszczonemu białku Tau, co widać na żelu akrylamidowym powyżej chromatogramu. Rysunek 3B pokazuje dobrze oddzielony pik absorpcji przy 280 nm oraz pik przewodności, co potwierdza efektywność odsalania białka. Rysunek 4 przedstawia przesunięcie białka w żelu zaobserwowane w analizie SDS-PAGE16, charakterystyczne dla wielokrotnej fosforylacji białka (porównać ścieżki 2...

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Ogólnym celem tej metodologii jest identyfikacja wielokrotnej fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego z wykorzystaniem białka tau jako studium przypadku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w regulacji molekularnej związane z chorobą, takie jak wpływ fosforylacji na interakcję białka z jego partnerem molekularnym. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy zidentyfikować fosforylację specyficzną dla miejsca w nieuporządkowanym białku i powiązać ją ze zmianami strukturalnymi i funkcjonalnymi.Ta metoda może zapewnić wgląd w funkcję. Może być również stosowany do innych białek, takich jak nieuporządkowane pozostałości białka DNA wirusa aPtc Zastosowania tej techniki rozciągają się w kierunku terapii poprzez rozwój białka, inhibitorów interakcji białkowych. Metodę tę zademonstrują doktoranci z naszej grupy: Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa i Hamida Merzougui.Na początek delikatnie wymieszaj 50 mikrolitrów kompetentnych komórek BL21 ze 100 nanogramami plazmidowego DNA, tworząc od 10 do 15 milionów kolonii na mikrogram DNA osocza w plastikowej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Po umies

nuclear-magnetic-resonance-spectroscopy-for-identification-multiple

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje użycie technik magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) do identyfikacji wielu fosforylacji w białku. Fosforylacja białka przy określonym aminokwasie powoduje deekranację sąsiedniego wodoru amidowego, co generuje różnicę widmową.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w celu identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.

Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Poznaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych za pomocą spektroskopii NMR na przykładzie białka Tau. Technika ta pozwala na określenie miejsc fosforylacji i powiązanie ich ze zmianami strukturalnymi oraz funkcjonalnymi białka.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych (Wideo) | JoVE Journal

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Przeglądaj więcej filmów