Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek

Nasze badania zagłębiają się w badanie różnych układów lektyn glikanowych, badając ich powiązania ze zdrowiem i chorobą. Połączyliśmy metodologie z chemii, biologii i biomedycyny, aby dogłębnie zbadać rolę w odpowiedziach immunologicznych na patologów, od raka po infekcje bakteryjne i wirusowe. Ostatnio nauki glikologiczne wyznaczyły przełomowe kamienie milowe, przekształcając projektowanie glikanów, syntezę i analizę strukturalnych aspektów rozpoznawania molekularnego z poziomu atomowego na poziom komórki.

Postępy te wspólnie przygotowały czwarty etap rozkwitu zaawansowanych terapii opartych na glikanie. Protokół ten określa procedury pozyskiwania, przetwarzania i analizowania dwóch najpotężniejszych metodologii NMR stosowanych w dziedzinie glikanów. Te metodologie, różnica transferu nasycenia i chemicznie bezpieczna analiza perturbacji uzupełniają się precyzyjnymi informacjami na temat strukturalnych i dynamicznych aspektów molekularnego rozpoznawania glikanów.

Rozpocznij od przygotowania próbki z kompleksem białko-ligand. Następnie za pomocą pipety ostrożnie przenieś 0,6 mililitra przygotowanego roztworu do pięciomililitrowej probówki NMR. Aby ustawić przyrząd NMR do wymaganej temperatury, użyj polecenia edte, aby otworzyć monitor kontroli temperatury i dostosować żądaną temperaturę.

Następnie umieść próbkę w podajniku próbek. Użyj automatycznego próbnika, aby włożyć próbkę do magnesu i uruchom polecenie sx, a następnie numer pozycji i odpowiadający położeniu rurki NMR w tacy automatycznego próbnika. Następnie próbka wchodzi do magnesu NMR.

Aby zablokować sygnał rozpuszczalnika, wpisz polecenie lock i wybierz odpowiedni rozpuszczalnik z menu. Użyj modułu automatycznego ATMA lub modułu ręcznego ATMM, aby zakończyć proces dostrajania i dopasowywania. Teraz za pomocą polecenia topshim uruchom automatyczne podkładkowanie.

Następnie wykonaj polecenie pulsekalne, aby określić impuls 90 stopni protonu. Następnie utwórz nowy zestaw danych i prześlij sekwencję impulsów STD NMR. Zdefiniuj częstotliwości rezonansu włączonego i wyłączonego dla eksperymentu STD NMR pod pozycją listy FQ w oknie ACQUPARS.

Ustaw wyłączoną częstotliwość rezonansową w obszarze, w którym nie ma żadnych sygnałów ligandowych lub białkowych protonów. Następnie wybierz częstotliwość rezonansową w obszarze widmowym pozbawionym sygnałów glikanowych. Zdefiniuj impuls kształtowy, który ma być używany w czasie nasycenia, w parametrach ACQUPARS okna ASED.

Następnie ustaw długość impulsu protonu o 90 stopni, dostosuj całkowity czas nasycenia i opóźnienie relaksacji do trzech sekund. Ustaw liczbę skanów na wielokrotność ośmiu, a skany fikcyjne na osiem. Następnie ustaw liczbę punktów w F2 na 16K, 32K lub 64K, a F1 na dwa.

Teraz za pomocą automatycznego polecenia rga ustaw wzmocnienie odbiornika, aby uniknąć przepełnienia. Oblicz łączny czas eksperymentu za pomocą polecenia experiment. Na koniec użyj polecenia zg, aby wysłać eksperyment do pobrania.

Po doświadczeniu należy wykonać transformację Fouriera pierwszego fid i wybrać miejsce docelowe przetwarzanych widm. Następnie za pomocą polecenia lb dostosuj współczynnik poszerzenia linii. Aby ręcznie fazować widmo, uzyskaj dostęp do zakładki proces, a następnie podmenu dostosuj fazę.

Kliknij i przeciągnij odpowiedni przycisk, aby wykonać korekty zera i pierwszego rzędu oraz zapisać wyniki fazowania. Po wykonaniu transformaty Fouriera dla drugiego eksperymentu, zapisz przetworzone widmo innym kodem. Załaduj dwa przetworzone widma wieloma funkcjami i za pomocą przycisku odejmowania dostępnego w wizualizacji wielokrotności, odejmij je.

Następnie otwórz widmo rezonansowe i wykonaj polecenie md, aby zainicjować okno z wieloma wyświetlaczami. Następnie prześlij widmo chorób przenoszonych drogą płciową. Następnie przeprowadź analizę porównawczą częstotliwości i intensywności sygnałów obecnych w widmie STD NMR.

W eksperymencie z rezonansem wyłączonym zmierz natężenie sygnału. Poruszaj się po menu, aby wybrać proces, a następnie zintegruj. Starannie zdefiniuj obszary zainteresowania i zapisz całki w pliku.

Podobnie, zmierz intensywności w eksperymencie STD NMR, upewniając się, że używane są identyczne parametry i udokumentuj te całki w osobnym pliku. Alternatywnie, wartości STD można określić, porównując intensywność sygnału między STD a widmami rezonansowymi off. Aby obliczyć względną chorobę przenoszoną drogą płciową w procentach, przypisz wartość 100% do protonu wykazującego maksymalną intensywność choroby przenoszonej drogą płciową.

Widmo protonów STD NMR dla interakcji N-acetylolaktozaminy z ludzką galektyną-7 wykazało sygnały STD NMR wskazujące na wiązanie. Co więcej, pojawiły się sygnały należące do protonów i bliski kontakt z białkiem, co pozwoliło na wyznaczenie epitopu wiążącego. Zacznij od przygotowania próbki przy użyciu interesującej Cię lektyny.

Aby utworzyć buforowany roztwór, użyj mieszaniny składającej się z 90% wody i 10% tlenku deuteru. Po uzyskaniu widma NMR protonów należy utworzyć nowy zestaw danych i wybrać program impulsowy HSQCETFPF3GP, a następnie zdefiniować wymagane parametry eksperymentalne. Wyślij eksperyment do pobrania i przetwórz fid za pomocą polecenia xfb.

Następnie ten sam eksperyment jest uzyskiwany dla różnych 15 stosunków N-galektyny-7 związanych z N-acetylolaktozaminami w widmach. Następnie, korzystając z dodatkowego oprogramowania, wygeneruj obszerną listę częstotliwości protonów i azotu 15 dla wszystkich zaobserwowanych pików krzyżowych. Następnie oblicz maksymalne perturbacje przesunięcia chemicznego.

Skonstruuj wykres 2D z maksymalnymi perturbacjami przesunięcia chemicznego wykreślonymi na pionowej osi y w stosunku do odpowiedniej reszty aminokwasowej na poziomej osi x. Jeśli struktura 3D białka jest dostępna, otwórz odpowiedni plik PDB za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Podkreślić pozostałości wykazujące najwyższe maksymalne perturbacje przesunięcia chemicznego wyraźnym kolorem, aby zidentyfikować prawdopodobne miejsce wiązania.

Super nałożenie widm HSQC azotu protonowego 15 zarejestrowanych w celu miareczkowania N-acetylolaktozaminy do ludzkiego roztworu galektyny-7 przedstawiło kilka pików krzyżowych doświadczających zmian chemicznych wskazujących na interakcję. Najbardziej zaburzone aminokwasy ludzkiej galektyny-7 są mapowane w pięciogalonowej strukturze PDB. Kolorowy obszar prawdopodobnie reprezentuje miejsce wiązania.