Name: Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metody NMR do badania interakcji białko-glikan w roztworze. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, analizę STD i perturbacji przesunięcia chemicznego oraz identyfikację epitopów wiązania dla glikobiologii strukturalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Agencia Estatal de Investigación z Hiszpanii za akredytację Centrum Doskonałości Severo Ochoa CEX2021-001136-S, ufundowaną przez MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, oraz CIBERES, inicjatywę Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madryt, Hiszpania). Dziękujemy również Komisji Europejskiej za projekt GLYCOTWINNING.

Advanced NMR Techniques for Glycan-Protein Interaction Analysis

<ol><li>Solís, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+into+glycosciences%3A+How+chemistry%2C+biochemistry+and+biology+cooperate+to+crack+the+sugar+code%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).</li>
<li>Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+studies+of+carbohydrate-protein+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution.</a> Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).</li>
<li>Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+structural+insights+into+carbohydrate-protein+interactions+from+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).</li>
<li>Widmalm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+shape%2C+motions%2C+and+interactions+explored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy.</a> JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).</li>
<li>Marchetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BRules+of+Engagement%26%2334%3B+of+protein-glycoconjugate+interactions%3A+A+molecular+view+achievable+by+using+NMR+spectroscopy+and+molecular+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">34;Rules of Engagement&#34; of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling.</a> ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).</li>
<li>Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recognition+of+glycans+by+protein+receptors.+Insights+from+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy.</a> Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).</li>
<li>Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+structures+and+their+interactions+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22A+NMR+view.+Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Glycan structures and their interactions with proteins.</a> A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).</li>
<li>Cañada, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+and+structural+characterization+of+carbohydrates+and+their+interactions+studied+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR.</a> Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).</li>
<li>Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+NMR+avenues+to+explore+the+conformation+and+interactions+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans.</a> ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).</li>
<li>Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+protein-bound+carbohydrate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Free and protein-bound carbohydrate structures.</a> Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).</li>
<li>Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+multivalent+carbohydrate-protein+interactions+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR.</a> Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).</li>
<li>Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate-protein+interactions%3A+a+3D+view+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR.</a> Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).</li>
<li>Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+of+glycoproteins%3A+profiling%2C+structure%2C+conformation%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions.</a> Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).</li>
<li>del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-carbohydrate+interactions+studied+by+NMR%3A+from+molecular+recognition+to+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design.</a> Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).</li>
<li>Angulo, J., Nieto, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STD-NMR%3A+application+to+transient+interactions+between+biomolecules-a+quantitative+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach.</a> Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).</li>
<li>Mayer, M., Meyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+epitope+mapping+by+saturation+transfer+difference+NMR+to+identify+segments+of+a+ligand+in+direct+contact+with+a+protein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor.</a> J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).</li>
<li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+chemical+shift+perturbation+to+characterise+ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nucl+Magn+Reson+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding.</a> Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).</li>
<li>Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+relaxation-optimized+NMR+spectroscopy+with+the+outer+membrane+protein+OmpX+in+dihexanoyl+phosphatidylcholine+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).</li>
<li>Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+in+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Solution NMR in structural genomics.</a> Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).</li>
<li>Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCPNMR+AnalysisAssign%3A+a+flexible+platform+for+integrated+NMR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+NMR%22%5BJournal%5D)">CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis.</a> J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).</li>
<li>Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+entropy+penalty+for+ligand+binding%3A+Lessons+from+the+molecular+recognition+of+the+histo+blood-group+antigens+by+human+Galectin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Różnica transferu nasycenia NMR (STD-NMR) stała się najczęściej stosowaną i wszechstronną metodą NMR do badania oddziaływań ligand-białko. Jak pokazano powyżej, opiera się on na zjawisku transferu nasycenia, a układ eksperymentalny obejmuje akwizycję dwóch jednowymiarowych (1D) widm 1H: widma rezonansowego i widma rezonansowego poza nim. Podczas eksperymentu rezonansowego nasycenie określonych protonów białka uzyskuje się poprzez zastosowanie ciągu impulsów o częstotliwości radiowej małej mocy w określonym czasie (czas nasycenia zwykle waha się od 1 do 3 s). Aby uniknąć bezpośredniego nasycenia liganda, częstotliwość i długość impulsów nasycenia są zoptymalizowane pod kątem selektywnego napromieniania określonych protonów białka; tj. muszą być stosowane przy częstotliwości wolnej od jakichkolwiek sygnałów ligandowych i o odpowiedniej długości (rysunek 1). Z reguły w przypadku impulsów nasycenia 50 ms należy zachować różnicę 1 ppm od obszaru nasycenia do najbliższych sygnałów liganda. Ogólnie rzecz biorąc, selektywne impulsy nasycenia stosowane na alifatyczny region białka zapewniają zwiększone efekty nasycenia. Alternatywnie, protony aromatyczne (6-7 ppm) mogą być również napromieniane, jeśli cząsteczka liganda nie zawiera żadnych sygnałów aromatycznych. Jest to bardzo przydatne w przypadku naturalnie występujących glikanów, ponieważ nie zawierają one grup aromatycznych. Gdy pewien region białka zostanie selektywnie napromieniowany, nasycenie rozchodzi się wzdłuż białka poprzez dipolarną relaksację krzyżową 1 H-1H (dyfuzja spinowa). Ostatecznie nasycenie dociera do protonów białkowych w miejscu wiązania, które są następnie przenoszone do protonów cukrowych, które są w bliskim kontakcie (r < 5 A) z receptorem za pośrednictwem międzycząsteczkowych 1 H-1H NOE. Oczywiście intensywność sygnałów nasyconych protonów ligandów maleje. Po otrzymaniu nasycenia, ze względu na kinetykę wiązania, przejściowo związane ligandy (wymagana jest szybka wymiana) dysocjują, a informacja o nasyceniu jest gromadzona w stanie swobodnym. Ze względu na ten proces, widma rezonansowe NMR prezentują zmniejszone sygnały (ryc. 2).
Aby wyraźnie pokazać tę intensywność zaburzeń jąder 1H wiążącego glikanu, uzyskuje się kontrolne widmo NMR protonów (off-resonance), w którym nasycenie jest stosowane z dala od jakiegokolwiek sygnału receptora lub węglowodanów (zwykle między 40-100 ppm), w tych samych warunkach. Odjęte widmo 1D między rezonansem a rezonansem pokazuje wyłącznie sygnały jąder 1H liganda, które mają zmodyfikowaną intensywność: te, które były wystarczająco blisko miejsca wiązania receptora, aby otrzymać namagnesowanie (ryc. 2).
Niemniej jednak nie wszystkie jądra 1H związanego węglowodanu otrzymują taką samą ilość nasycenia. Teoretycznie przeniesienie namagnesowania z receptora do związanego liganda jest zależne od odległości (1/r6). Oznacza to, że intensywności przenoszonego nasycenia między jądrami glikanu 1H zawierają informacje o bliskości przestrzennych między protonami liganda a protonami receptora, a intensywności STD NMR są większe dla tych protonów, które znajdują się bliżej receptora. W związku z tym eksperyment STD NMR pozwala również określić epitop wiążący węglowodan (ryc. 2 i ryc. 3), ponieważ protony liganda znajdujące się bliżej powierzchni białka wykazują wyższą intensywność niż te, które nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu.
Eksperyment może być zastosowany do układów o słabym powinowactwie do średniego, rzadziej do układów o silnym powinowactwie w niskim zakresie μM lub nM. Rzeczywiście, wymaga to, aby tempo dysocjacji było szybkie w skali czasu relaksacji. W przeciwnym razie informacja o transferze nasycenia jest tracona przez relaksację, zanim ligand się rozłączy.
Z drugiej strony, eksperymenty NMR oparte na białkach są unikalne w rozwikłaniu interakcji ligand-białko z dokładnością na poziomie aminokwasów bez rozwiązywania struktur rozdzielczości atomowej. Bezpośrednio bada zjawiska rozpoznawania molekularnego w roztworze bez konieczności kokrystalizacji. Mapowanie analizy CSP jest wyjątkowo skuteczne w odkrywaniu ligandów i mapowaniu miejsca wiązania białek (Figura 4 i Figura 5). Metoda ta ma zastosowanie do dowolnego zakresu powinowactwa między zakresem mM i nM, nawet w przypadku układów, w których kurs wymiany jest niski w skali czasu przesunięcia chemicznego21.
Niemniej jednak takie podejście prawdopodobnie nie zadziała w przypadku białek o masie cząsteczkowej powyżej 30-40 kDa ze względu na problemy z relaksacją. Następnie można zastosować alternatywę TROSY18 , która jest szczególnie skuteczna w połączeniu z deuteracją białek. Co więcej, białko powinno być równomiernie znakowane 15N (a inna próbka podwójnie znakowana 13C i 15N, aby móc wykonać wymagane przypisanie szkieletu). W związku z tym warunki ekspresji białka, w tym odpowiadający im system ekspresji, powinny być zoptymalizowane, aby móc uzyskać miligramowe ilości białka. Białka, które wykazują tendencję do oligomeryzacji lub agregacji, również nie nadają się do tej analizy. Przyrządem używanym w niniejszym dokumencie do rejestracji danych NMR jest spektrometr Bruker 800 MHz wyposażony w kriosondę TCI. Zastosowanie tej metodologii przy użyciu instrumentów pracujących poniżej 600 MHz lub bez sondy kriogenicznej byłoby dużym wyzwaniem.

Molekularne rozpoznawanie glikanów jest niezbędne dla wielu procesów związanych ze zdrowiem i chorobą. Specyficzność i selektywność receptorów biologicznych (lektyn, przeciwciał, enzymów) dla glikanów w dużym stopniu zależy od dostosowania niepewnej równowagi między różnymi składnikami entalpii (CH-π i van der Waalsa, wiązania wodorowe, elektrostatyka) i entropii (hydrofobowość, dynamika, solwatacja-desolwatacja)1.
Biorąc pod uwagę dużą różnorodność chemiczną i dynamiczną naturę glikanów, metody NMR są szeroko stosowane do analizy interakcji glikanów od ponad 25 lat2, ponieważ te metodologie dostarczają doskonałych informacji na temat zdarzeń rozpoznawania molekularnego z precyzyjnymi szczegółami, w rozdzielczości atomowej3,4, nawet jeśli nie można uzyskać wymaganych dowodów interakcji przy użyciu innych metodologii. Co najważniejsze, NMR jest wszechstronny i umożliwia badanie zdarzeń dynamicznych na poziomie atomowym, w różnych skalach czasowych, stanowiąc zdecydowanie najlepszą technikę do badania struktury, konformacji i dynamiki glikanów w roztworze. Niemniej jednak, rozwikłanie tych informacji może być dość złożonym procesem, który wymaga zastosowania dobrze zdefiniowanych strategii wraz ze staranną analizą danych5.
Techniki NMR są różnorodne, a w rzeczywistości istnieje wiele metodologii, które można zastosować do rozwikłania interakcji glikan-białko6. Opisujemy tutaj dwa podstawowe podejścia NMR, które są obecnie stosowane do rozszyfrowywania interakcji glikan-receptor7,8, kładąc nacisk na to, jak rozplątać prezentację kluczowego epitopu glikanu, a także miejsca wiązania białka9.
W każdym zdarzeniu rozpoznawania molekularnego, gdy receptor wiąże się z danym ligandem, zachodzi proces wymiany chemicznej, który wpływa na wiele parametrów NMR uczestników w binding10. W związku z tym, z perspektywy NMR, interakcja może być monitorowana albo z punktu widzenia liganda glikanów, albo z punktu widzenia receptora białkowego11. Ogólnie rzecz biorąc, receptor białkowy jest dużą biomolekułą (powolny ruch rotacyjny, z szybkościami w skali czasowej ns, a zatem szybką relaksacją poprzeczną), podczas gdy oddziałujący glikan można uznać za cząsteczkę o małym-średnim rozmiarze (szybki ruch rotacyjny, z szybkościami w skali czasu ps i powolną relaksacją poprzeczną)12. Z perspektywy standardowej sygnały NMR glikanu są wąskie, podczas gdy sygnały receptora są szerokie13.
Metody NMR oparte na liganach polegają na dramatycznej zmianie, jakiej doświadcza wiele parametrów NMR glikanów podczas przechodzenia ze stanu wolnego do związanego14. STD-NMR jest najczęściej stosowaną eksperymentalną techniką NMR do oceny różnych cech wiązania glikanów15, od wydedukowania istnienia wiązania w stanie roztworu do określenia epitopu wiążącego glikan; Oznacza to, że atomy liganda, które mają kontakt z receptorem białka<klasa SUP="xref">16.
Alternatywnie, metody NMR oparte na receptorach monitorują zmiany, które zachodzą w sygnałach receptora białkowego w obecności glikanu w stosunku do tych zarejestrowanych dla stanu apo17. Koncentrują się one głównie na badaniach przesiewowych zaburzeń przesunięć chemicznych sygnałów białkowych między oboma stanami. Najczęściej stosowanym eksperymentem jest 1 H-15N HSQC, lub jego alternatywy TROSY 18.
Połączenie obu podejść pozwala na zastosowanie NMR do wielu różnych systemów, które wykazują szeroki zakres pokrewieństw. Jednak w przypadku metod NMR opartych na receptorach, w przeciwieństwie do metod opartych na ligandzie, musi być dostępna stosunkowo duża ilość rozpuszczalnego, niezagregowanego, stabilnego białka znakowanego izotopowo (15N).
Opisujemy tutaj obie metody, podkreślając ich mocne i słabe strony. Należy pamiętać, że podstawowe kroki opisane w protokole służą jako przykłady użycia spektrometrów firmy Bruker. W związku z tym nazwy poleceń i parametrów są zgodne z tymi używanymi w TopSpin (oprogramowaniu sterującym spektrometrami firmy Bruker).

<table><tbody><tr><td>Zestaw mikroprobówek 5 mm Shigemi Mat</td><td>CortecNet SAS</td><td>S30BMS-005B</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-Laktoza-Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich Quìiacute; mika S.L.</td><td>7634-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (15 N, 99%)</td> <td>LC-0179-N-50G</td><td>Tracer Tecnolog&iacute; jako Anal &iacute; ticas S.L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina (sól sodowa)&nbsp;</td><td>Melford Laboratories LTD</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>BIOVIA Discovery studio&nbsp;</td><td>BIOVIA, Dassault Syst&egrave; mes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Kompetentne chemicznie komórki&nbsp;</td><td>Merck Life Science, S.L.U.</td><td>CMC0014-40X40UL</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-22R</td><td></td></tr><tr><td>D2O&nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-1000</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Eppendorf</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl &szlig;-D-1-tiogalactopyranoside)</td><td>VWR International Eurolab S.L.</td><td></td><td></td>VW437144N</tr><tr><td>LacNAc</td><td>Elicityl</td><td>GLY008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Bulion</td><td>Merck Life Science, S.L.U.</td><td>3397-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC&nbsp;</td><td>VWR International Eurolab S.L.</td><td>214-1137</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>System grafiki molekularnej PyMOL</td><td>wersja 2.0 Schr&ouml; dinger</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics & Materiały, Inc.</td><td>VC 505</td><td></td></tr><tr><td>Nadprzewodzący magnes NMR</td><td>Bruker</td><td>600 MHz AVANCE III</td><td></td></tr><tr><td>Nadprzewodzący magnes NMR</td><td>Bruker</td><td>800 MHz AVANCE III</td><td></td></tr></tbody></table>

rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (nmr) na ratunek

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

Interakcje glikanów z białkami modulują wiele zdarzeń związanych ze zdrowiem i chorobą. W rzeczywistości ustalenie tych zdarzeń rozpoznawania i ich biologiczne konsekwencje są ściśle związane z trójwymiarowymi strukturami obu partnerów, a także z ich cechami dynamicznymi i prezentacją w odpowiednich przedziałach komórkowych. Techniki NMR są unikalne w rozplątywaniu tych cech i rzeczywiście, opracowano i zastosowano różne metodologie oparte na NMR do monitorowania zdarzeń wiązania glikanów z powiązanymi z nimi receptorami. Protokół ten przedstawia procedury pozyskiwania, przetwarzania i analizy dwóch najpotężniejszych metodologii NMR stosowanych w dziedzinie glikobiologii NMR, eksperymentów miareczkowania 1H-Saturation transfer difference (STD) i 1 H,15N-heteronuclear single quantum coherence (HSQC), które komplementarnie oferują informacje odpowiednio z perspektywy glikanów i białek. Rzeczywiście, w połączeniu stanowią one potężny zestaw narzędzi do wyjaśniania zarówno strukturalnych, jak i dynamicznych aspektów procesów rozpoznawania molekularnego. To kompleksowe podejście poszerza naszą wiedzę na temat interakcji glikan-białko i przyczynia się do postępu badań w dziedzinie glikobiologii chemicznej.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół wykorzystania eksperymentów 1H-STD NMR oraz 1H-15N HSQC w celu szczegółowego zbadania oddziaływań wiązania między lektynami a małymi oligosacharydami. Do celów ilustracyjnych, aby zaprezentować pomyślną implementację protokołu oraz skuteczność tych metod NMR w badaniu szczegółów procesu rozpoznawania molekularnego, przedstawiono wyniki analizy rozpoznawania LacNAc przez hGalektynę-7 (hGal-7). Rysunek 3 przedstawia widmo 1H-STD NMR dla oddziaływania LacNAc z hGal-7. Obecność sygnałów STD NMR wskazuje na zachodzenie wiązania (Rysunek 3A). Ponadto pojawiają się jedynie te sygnały, które należą do protonów w bezpośrednim kontakcie z białkiem, co pozwala na wyznaczenie epitopu wiązania (Rysunek 3B). Rysunek 4 podkreśla, w jaki sposób widmo &#160;1H-15N HSQC białka może służyć jako jego „odcisk palca” (fingerprint), a Rysunek 5 ilustruje zastosowanie eksperymentów miareczkowania z wykorzystaniem heteronuklearnej pojedynczej spójności kwantowej (1H-15N HSQC) w celu określenia perturbacji przesunięć chemicznych grup amidowych szkieletu hGalektyny-7 po związaniu LacNAc. Dane te nie tylko potwierdzają istnienie oddziaływania, ale także pozwalają wyznaczyć powierzchnię wiązania lektyny. Rysunek 6 demonstruje, jak analiza danych miareczkowania umożliwia oszacowanie powinowactwa wiązania LacNAc przez hGalektynę-7, które mieści się w wysokim zakresie mikromolarnym. Wynik ten jest zgodny z rezultatami uzyskanymi przy użyciu alternatywnych technik.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig01.jpg" /> 
Rysunek 1Wybór częstotliwości rezonansowej. 1Widmo H-NMR LacNAc:hPrzedstawiono stosunek Gal-7 50:1 w deuterowanym roztworze soli fosforanowej o pH 7,4. Sygnały liganda (LacNAc) ograniczają się do obszaru między 2,0 a 5,2 ppm. Częstotliwość saturacji została starannie dobrana tak, aby zapewnić brak protonów liganda w zakresie 1–2 ppm, co umożliwia selektywne naświetlanie protonów białka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig02.jpg" /> 
Rycina 2Eksperyment STD NMR. Schematyczny przebieg eksperymentu STD: pierwsze widmo (poza rezonansem) służy jako referencyjne, natomiast w drugim (w rezonansie) przeprowadza się nasycenie białka. Nasycenie jest efektywnie propagowane w obrębie całego białka i przenoszone na protony ligandu znajdujące się w bliskim kontakcie z białkiem. Wynikowe widmo różnicowe (widmo STD) wykazuje jedynie te rezonanse, które uległy nasyceniu. Analiza eksperymentu STD pozwala na mapowanie epitopów wiążącego się cukru. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig03.jpg" /> 
Rysunek 3Analiza wiązania z perspektywy liganda. (A) Nałożenie sygnałów poza rezonansem i 1Widma H STD-NMR dla oddziaływania LacNAc z hGal-7. W widmie STD pojawiają się jedynie sygnały pochodzące od protonów w bliskim kontakcie z białkiem. Adnotacja 1Sygnały rezonansowe protonów liganda są widoczne w widmie poza rezonansem.BWzględne intensywności sygnałów STD zostały naniesione w formie mapy kolorystycznej na strukturę chemiczną LacNAc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig04.jpg" /> 
Rycina 4The 1H-15Widmo N HSQC białka stanowi jego odcisk palca. (A) 1H-15widmo N-HSQC 100 &#181;M z hGal-7 w formie apo. Widmo zarejestrowano przy 25 &#176;CNiektóre sygnały krosowe NH zostały opisane etykietami odpowiadających im aminokwasów.B) Każda para NH wykazuje unikalny przesunięcie chemiczne, które zależy od otoczenia chemicznego, a w konsekwencji od struktury 3D białka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig05.jpg" /> 
Rysunek 5Analiza wiązania z perspektywy białka. (A) Superpozycja 1H-15Widma N HSQC zarejestrowane podczas miareczkowania LacNAc do hPrzedstawiono roztwór Gal-7. Analiza widm, w których kilka sygnałów korelacyjnych wykazuje zmiany przesunięcia chemicznego, jednoznacznie wskazuje na oddziaływanie.BWykres maksymalnych perturbacji przesunięcia chemicznego (maxCSP) sygnałów amidowych szkieletu białkowego, wyznaczony na podstawie miareczkowania LacNAc (15 równoważników) z hGal-7. (C) Najbardziej zaburzone aminokwasy w hZgodnie z analizą CSP, Gal-7 został zmapowany na strukturę PDB 5gal. W modelu 3D kolor czerwony oznacza wartość CSP powyżej 2.&#963;, natomiast różowe do wartości między 1&#963; i 2&#963;Kolorowy obszar prawdopodobnie reprezentuje miejsce wiązania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig06.jpg" /> 
Rysunek 6KD oznaczenie na podstawie 1H-15Eksperymenty miareczkowania N-HSQC. (A) Przedstawienie wzoru 1H-15Miareczkowanie oparte na HSQC, w zależności od szybkości wymiany chemicznej w skali czasowej NMR badanego układu (szybkiej, pośredniej lub wolnej). W przypadku LacNAc zaobserwowano reżim szybkiej wymiany.hInterakcja Gal-7. (B) Dopasowanie krzywej i KD estymacja uzyskana z analizy CSP przy różnych stężeniach ligandu dla systemu modelowego hGal-7 i disacharyd LacNAc. Szacowana wartość KD podaje się wraz z odpowiadającym błędem jako średnią z danych dla 20 różnych aminokwasów; (CFragmenty z 1H,15Widma N-HSQC wykazujące przesunięcie wybranych sygnałów krosowych podczas miareczkowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół szczegółowo opisujący pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę serii eksperymentów NMR mających na celu scharakteryzowanie interakcji białko-glikan w roztworze. Przedstawiono najpopularniejsze metodologie oparte na ligandach i białkach, które niewątpliwie przyczyniają się do rozwoju glikobiologii strukturalnej i badań nad rozpoznawaniem molekularnym.

Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

Nasze badania zagłębiają się w badanie różnych układów lektyn glikanowych, badając ich powiązania ze zdrowiem i chorobą. Połączyliśmy metodologie z chemii, biologii i biomedycyny, aby dogłębnie zbadać rolę w odpowiedziach immunologicznych na patologów, od raka po infekcje bakteryjne i wirusowe. Ostatnio nauki glikologiczne wyznaczyły przełomowe kamienie milowe, przekształcając projektowanie glikanów, syntezę i analizę strukturalnych aspektów rozpoznawania molekularnego z poziomu atomowego na poziom komórki.Postępy te wspólnie przygotowały czwarty etap rozkwitu zaawansowanych terapii opartych na glikanie. Protokół ten określa procedury pozyskiwania, przetwarzania i analizowania dwóch najpotężniejszych metodologii NMR stosowanych w dziedzinie glikanów. Te metodologie, różnica transferu nasycenia i chemicznie bezpieczna analiza perturbacji uzupełniają się precyzyjnymi informacjami na temat strukturalnych i dynamicznych aspektów molekularnego rozpoznawania glikanów.Rozpocznij od przygotowania próbki z kompleksem białko-ligand. Następnie za pomocą pipety ostrożnie przenieś 0,6 mililitra przygotowanego roztworu do pięciomililitrowej probówki NMR. Aby ustawić przyrząd NMR do wymaganej temperatury, użyj polecenia edte, aby otworzyć monitor kontroli temperatury i dostosować żądaną temperaturę.Następnie umieść próbkę w podajniku próbek. Użyj automatycznego próbnika, aby włożyć próbkę do magnesu i uruchom polecenie sx, a następnie numer pozycji i odpowiadający położeniu rurki NMR w tacy automatycznego próbnika. Następnie próbka wchodzi do magnesu NMR.Aby zablokować sygnał rozpuszczalnika, wpisz polecenie lock i wybierz odpowiedni rozpuszczalnik z menu. Użyj modułu automatycznego ATMA lub modułu ręcznego ATMM, aby zakończyć proces dostrajania i dopasowywania. Teraz za pomocą polecenia topshim uruchom automatyczne podkładkowanie.Następnie wykonaj polecenie pulsekalne, aby określić impuls 90 stopni protonu. Następnie utwórz nowy zestaw danych i prześlij sekwencję impulsów STD NMR. Zdefiniuj częstotliwości rezonansu włączonego i wyłączonego dla eksperymentu STD NMR pod pozycją listy FQ w oknie ACQUPARS.Ustaw wyłączoną częstotliwość rezonansową w obszarze, w którym nie ma żadnych sygnałów ligandowych lub białkowych protonów. Następnie wybierz częstotliwość rezonansową w obszarze widmowym pozbawionym sygnałów glikanowych. Zdefiniuj impuls kształtowy, który ma być używany w czasie nasycenia, w parametrach ACQUPARS okna ASED.Następnie ustaw długość impulsu protonu o 90 stopni, dostosuj całkowity czas nasycenia i opóźnienie relaksacji do trzech sekund. Ustaw liczbę skanów na wielokrotność ośmiu, a skany fikcyjne na osiem. Następnie ustaw liczbę punktów w F2 na 16K, 32K lub 64K, a F1 na dwa.Teraz za pomocą automatycznego polecenia rga ustaw wzmocnienie odbiornika, aby uniknąć przepełnienia. Oblicz łączny czas eksperymentu za pomocą polecenia experiment. Na koniec użyj polecenia zg, aby wysłać eksperyment do pobrania.Po doświadczeniu należy wykonać transformację Fouriera pierwszego fid i wybrać miejsce docelowe przetwarzanych widm. Następnie za pomocą polecenia lb dostosuj współczynnik poszerzenia linii. Aby ręcznie fazować widmo, uzyskaj dostęp do zakładki proces, a następnie podmenu dostosuj fazę.Kliknij i przeciągnij odpowiedni przycisk, aby wykonać korekty zera i pierwszego rzędu oraz zapisać wyniki fazowania. Po wykonaniu transformaty Fouriera dla drugiego eksperymentu, zapisz przetworzone widmo innym kodem. Załaduj dwa przetworzone widma wieloma funkcjami i za pomocą przycisku odejmowania dostępnego w wizualizacji wielokrotności, odejmij je.Następnie otwórz widmo rezonansowe i wykonaj polecenie md, aby zainicjować okno z wieloma wyświetlaczami. Następnie prześlij widmo chorób przenoszonych drogą płciową. Następnie przeprowadź analizę porównawczą częstotliwości i intensywności sygnałów obecnych w widmie STD NMR.W eksperymencie z rezonansem wyłączonym zmierz natężenie sygnału. Poruszaj się po menu, aby wybrać proces, a następnie zintegruj. Starannie zdefiniuj obszary zainteresowania i zapisz całki w pliku.Podobnie, zmierz intensywności w eksperymencie STD NMR, upewniając się, że używane są identyczne parametry i udokumentuj te całki w osobnym pliku. Alternatywnie, wartości STD można określić, porównując intensywność sygnału między STD a widmami rezonansowymi off. Aby obliczyć względną chorobę przenoszoną drogą płciową w procentach, przypisz wartość 100% do protonu wykazującego maksymalną intensywność choroby przenoszonej drogą płciową.Widmo protonów STD NMR dla interakcji N-acetylolaktozaminy z ludzką galektyną-7 wykazało sygnały STD NMR wskazujące na wiązanie. Co więcej, pojawiły się sygnały należące do protonów i bliski kontakt z białkiem, co pozwoliło na wyznaczenie epitopu wiążącego. Zacznij od przygotowania próbki przy użyciu interesującej Cię lektyny.Aby utworzyć buforowany roztwór, użyj mieszaniny składającej się z 90% wody i 10% tlenku deuteru. Po uzyskaniu widma NMR protonów należy utworzyć nowy zestaw danych i wybrać program impulsowy HSQCETFPF3GP, a następnie zdefiniować wymagane parametry eksperymentalne. Wyślij eksperyment do pobrania i przetwórz fid za pomocą polecenia xfb.Następnie ten sam eksperyment jest uzyskiwany dla różnych 15 stosunków N-galektyny-7 związanych z N-acetylolaktozaminami w widmach. Następnie, korzystając z dodatkowego oprogramowania, wygeneruj obszerną listę częstotliwości protonów i azotu 15 dla wszystkich zaobserwowanych pików krzyżowych. Następnie oblicz maksymalne perturbacje przesunięcia chemicznego.Skonstruuj wykres 2D z maksymalnymi perturbacjami przesunięcia chemicznego wykreślonymi na pionowej osi y w stosunku do odpowiedniej reszty aminokwasowej na poziomej osi x. Jeśli struktura 3D białka jest dostępna, otwórz odpowiedni plik PDB za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Podkreślić pozostałości wykazujące najwyższe maksymalne perturbacje przesunięcia chemicznego wyraźnym kolorem, aby zidentyfikować prawdopodobne miejsce wiązania.Super nałożenie widm HSQC azotu protonowego 15 zarejestrowanych w celu miareczkowania N-acetylolaktozaminy do ludzkiego roztworu galektyny-7 przedstawiło kilka pików krzyżowych doświadczających zmian chemicznych wskazujących na interakcję. Najbardziej zaburzone aminokwasy ludzkiej galektyny-7 są mapowane w pięciogalonowej strukturze PDB. Kolorowy obszar prawdopodobnie reprezentuje miejsce wiązania.

disentangling-glycan-protein-interactions-nuclear-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten film opisuje technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego do badania interakcji białko-białko pomiędzy 15znakowanymi N dzikimi i zmutowanymi białkami envoplakiny a nieznakowanym białkiem wimentyny. Udana interakcja między envoplakiną typu dzikiego a wimentyną prowadzi do rozległego poszerzenia linii i zaniku pików w widmach NMR, podczas gdy brak interakcji między zmutowaną envoplakiną a wimentyną skutkuje dobrze rozdzielonymi pikami w widmach NMR.

Magnetyczny rezonans jądrowy do badania oddziaływań białko-białko na poziomie atomowym

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Ten protokół oparty na NMR bada słabe interakcje białko-glikan przy użyciu cyjanowiryny-N i D-mannozy. Łącząc metody wykrywania ligandów i białek, mapuje miejsca wiązania, wykrywa efekty allosteryczne i identyfikuje kompleksy spotkań. Podejście to obejmuje przygotowanie próbek i analizę danych, oferując strukturalne i dynamiczne spostrzeżenia cenne dla mechanizmów diagnostyki i rozpoznawania specyficznych dla glikanów.

Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR

Opisano dwie metody przypisywania sygnałów magnetycznego rezonansu jądrowego α- i ε-dimetyloaminy redukcyjnie 13C-metylowanej N-końcowej lizyny. Jedna metoda wykorzystuje selektywność reakcji metylacji redukcyjnej wywołanej pH, a druga wykorzystuje aminopeptydazę do selektywnego usuwania N-końcowej lizyny.

Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach

Zwiększenie czułości zapewniane przez dynamiczną polaryzację jądrową (DNP) umożliwia śledzenie procesów metabolicznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR i MRI. Omówiono charakterystykę i wydajność dedykowanego zestawu DNP do rozpuszczania, przeznaczonego do badania reakcji enzymatycznych.

Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Przedstawiono tu procedurę izolacji EOB-DTPA i późniejszej kompleksacji z naturalnym Ga(III) i 68Ga, a także dokładną analizę wszystkich związków i badania nad skutecznością znakowania, stabilnością in vitro i współczynnikiem dystrybucji n-oktanol/woda w radioznakowanym kompleksie.

Badania kompleksu Ga(III) EOB-DTPA i jego analogu znakowanego radioizotopowo o masie 68Ga

Szczegółowy protokół opisujący metodę SSTD NMR jest tutaj przedstawiony, aby pomóc nowym użytkownikom zastosować tę nową metodę do uzyskania parametrów kinetycznych ich własnych systemów podlegających wymianie chemicznej.

Różnica transferu nasycenia spinu NMR (SSTD NMR): Nowe narzędzie do uzyskiwania parametrów kinetycznych procesów wymiany chemicznej

Poznaj metody NMR do badania interakcji białko-glikan w roztworze. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, analizę STD i perturbacji przesunięcia chemicznego oraz identyfikację epitopów wiązania dla glikobiologii strukturalnej.

Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek

Przeglądaj więcej filmów