Name: Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metody oceny patofizjologii siatkówki w modelu cukrzycowym szczura. Techniki histologiczne, badanie przepuszczalności bariery krwio-siatkówkowej i angiografia fluorescencyjna wspierają odkrywanie nowych leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Indyjskiej Radzie Badań Medycznych (ICMR; ITR-2020-2882) o wsparcie finansowe dla dr Nirmala J. Chcielibyśmy również podziękować University Grant of Commission za zapewnienie stypendium Junior Research Fellowship dla Manishy Malani oraz Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, kampus Hyderabad za zapewnienie infrastruktury obiektowej.

Ten protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami dostarczonymi przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt, BITS-Pilani, kampus w Hajdarabadzie.
1. Histologia siatkówki
<ol>
	<li>Wyłuszczenie i unieruchomienie oka
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji 2-3-miesięcznego samca szczura rasy Wistar z cukrzycą wraz z grupą kontrolną w tym samym wieku (14 do 15 tygodni) za pomocą wysokiej dawki pentobarbitalu (150 mg / kg) wstrzykniętej drogą dootrzewnową. Brak wykrywalnego bicia serca potwierdza śmierć w ciągu 2-5 minut.</li>
		<li>Wyłuszczenie oka poprzez wykonanie nacięć za pomocą ostrza skalpela w okolicy nosowej i skroniowej oka. Następnie przetnij wzdłuż jego krawędzi za pomocą kleszczy i mikronożyczek, aby usunąć oko z oczodołu. 
		UWAGA: Przed złożeniem szczurów w ofierze należy przygotować roztwory utrwalające. 
		UWAGA: Formaldehyd działa drażniąco na skórę, oczy, nos i drogi oddechowe. Może również powodować raka, ponieważ jest silnym środkiem uczulającym skórę. Załóż rękawice i zajmij się nim pod maską21.</li>
		<li>Dokładnie przemyć oko 10 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na szalce Petriego w celu usunięcia krwi. Usuń nadmiar tłuszczu otaczającego oko, aby ułatwić penetrację roztworu utrwalającego.</li>
		<li>Natychmiast umieść oko w 5 ml roztworu utrwalającego za pomocą kleszczy i upewnij się, że nie przykleiło się do ścianek szklanych fiolek. Mieszaj delikatnie przez kilka sekund i załóż nakrętkę z odpowiednim oznaczeniem. Inkubować oko w roztworze utrwalającym przez 24 do 48 godzin w ciemnych warunkach w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przycinanie tkanki
	<ol>
		<li>Po utrwaleniu wyjąć oko z roztworu utrwalającego, przemyć je 10 ml PBS i umieścić na szalce Petriego zawierającej 10 ml PBS schłodzonego w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Za pomocą mikrokleszczy przytrzymaj oko nerwem wzrokowym i wykonaj nacięcie na pars plana za pomocą mikronożyczek. Przeciąć cały brzeg rogówki, aby oddzielić przednią miseczkę oka. Za pomocą kleszczy delikatnie podnieś soczewkę, wyrzuć ją i przetnij nerw wzrokowy.</li>
		<li>Za pomocą zakrzywionych mikronożyczek wykonaj podłużny przekrój tylnej muszli ocznej, przechodząc przez tarczę nerwu wzrokowego, dzieląc ją na dwie połowy. Umieść go w podstawie kasety i prawidłowo zamknij pokrywę, nie naruszając tkanki. Oznacz kasety nazwą próbki tkanki i datą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnienie, oczyszczanie i impregnacja parafinowa tkanek
	<ol>
		<li>Odwodnić przyciętą tkankę poprzez stopniowy transfer w 80 ml 50%, 70%, 90% i 100% etanolu. Podczas przenoszenia kaset z jednego stężenia do drugiego należy pamiętać o natarciu ich na czystą bibułkę, aby zminimalizować zanieczyszczenie. 
		UWAGA: Pozostaw tkankę w każdym transferze na 30 minut (dwukrotnie). Całkowity czas potrzebny na ten etap to około 4 godziny.</li>
		<li>Po odwodnieniu przenieś kasety do 80 ml ksylenu na 30 minut (dwukrotnie), aby zastąpić etanol ksylenem. 
		UWAGA: Po inkubacji z ksylenem tkanka staje się przezroczysta. 
		UWAGA: Ksylen jest związkiem aromatycznym z pierścieniem benzenowym. Podrażnia oko i błonę śluzową, a także może powodować depresje.</li>
		<li>Na koniec zaimpregnować tkankę wstępnie podgrzaną parafiną w temperaturze 60 °C w celu zastąpienia ksylenu w tkance. Przetrzyj kasety kilka razy na bibułce, aby zminimalizować zawartość ksylenu i umieść w 200 ml parafiny (płyn o temperaturze 60 °C) na 2 godziny (1 h x 2). 
		UWAGA: Unikaj wdychania stopionej parafiny, ponieważ wytwarza ona drobne kropelki lipidów, które mogą powodować dyskomfort w oddychaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatapianie parafiny
	<ol>
		<li>Włącz maszynę do zatapiania parafiny co najmniej 1 godzinę przed użyciem, aby stopić parafinę i aby stacje osiągnęły żądaną temperaturę. Napełnij stalową formę stopionym woskiem parafinowym, umieszczając go na gorącej powierzchni, a następnie wyjmij jedną kasetę na raz z pojemnika na parafinę.</li>
		<li>Przenieś stalową formę z gorącej na zimną powierzchnię (4 °C). W tym momencie wosk w formie zacznie krzepnąć. Zanim całkowicie zastygnie, umieść tkankę w wosku za pomocą kleszczy i ustaw tkankę tak, aby część tarczy wzrokowej tylnej miseczki była skierowana w stronę podstawy formy. 
		UWAGA: Upewnij się, że tkanka się nie porusza i utrzymuj pożądaną orientację. Jeśli nie, umieść formę z powrotem na ciepłej powierzchni roboczej, aż cała parafina się upłynni, a następnie zacznij od kroku 1.4.2.</li>
		<li>Gdy wosk w formie zacznie krzepnąć, natychmiast umieść podstawę kasety na wierzchu formy. Ostrożnie napełnij formę parafiną powyżej górnej krawędzi kasety i powoli przenieś ją na zimną powierzchnię (w pobliżu -20 °C) w celu szybkiego zestalenia. Aż zastygnie, powtarzaj proces z innymi kasetami od kroku 1.4.2.</li>
		<li>Gdy wszystkie formy zestalą się, oddziel stalową formę od kasety. Jeśli jest twardy, poczekaj trochę dłużej i spróbuj ponownie (nie usuwaj go na siłę). Separacja staje się łatwiejsza po całkowitym zestaleniu. Teraz kaseta staje się podstawą bloku parafinowego, który ma być trzymany podczas cięcia za pomocą mikrotomu. 
		UWAGA: Ten blok może być przechowywany w temperaturze pokojowej do dalszego użytku. W tym momencie proces można zatrzymać i kontynuować później (jeśli jest to wymagane).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cięcia
	<ol>
		<li>Zamontuj jednorazowe ostrze do mikrotomu w uchwycie ostrza. Usuń nadmiar wosku parafinowego wokół kaset tak, aby zarówno górna, jak i dolna część bloków pozostały równoległe do noża. Zamontuj blok na uchwycie kasety.</li>
		<li>Odblokuj pokrętło, aby przesunąć je, aż powierzchnia bloku zetknie się z krawędzią noża. Przytnij nadmiar wosku parafinowego na bloku, aż tkanka zostanie uwidoczniona na powierzchni bloku. Ustaw grubość przekroju na 5 μm i przetnij wstęgę od pięciu do sześciu sekcji.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków delikatnie przenieś wstążkę na powierzchnię podgrzanej kąpieli wodnej (około 50 °C), aby rozłożyć wstążkę. Zbierz skrawki na szkiełku pokrytym albuminą Mayera, przytrzymując szkiełko pod sekcją. Delikatnie podnieś sekcje i pozostaw szkiełka do wyschnięcia poziomo przez noc w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Preparaty można przechowywać w temperaturze pokojowej w suchych pudełkach przez kilka miesięcy. Na tym etapie proces można zatrzymać i kontynuować później.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Podgrzej szkiełka do barwienia w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę przed użyciem, aby parafina się stopiła, i postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w tabeli 1. 
		UWAGA: Plamy z hematoksyliny i eozyny są toksyczne w przypadku wdychania lub spożycia. Doniesiono, że są rakotwórcze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Czas odstania</td>
			<td>Powtórzenie (liczba razy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ksylen</td>
			<td>Czas trwania: 5 min</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% etanol</td>
			<td>Czas trwania: 5 min</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90% etanolu</td>
			<td>Czas trwania: 5 min</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% etanolu</td>
			<td>Czas trwania: 5 min</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% etanolu</td>
			<td>Czas trwania: 5 min</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td>Czas trwania: 5 min</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoksyliną</td>
			<td>Czas trwania: 4 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Mycie wodą</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% kwaśny alkohol w 70% etanolu</td>
			<td>30 sekund</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Mycie wodą</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda Scotta</td>
			<td>1 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Mycie wodą</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% etanolu</td>
			<td>1 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% etanolu</td>
			<td>1 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,25% eozyny</td>
			<td>5 sekund</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Mycie wodą</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td>Czas trwania: 2 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% etanolu</td>
			<td>1 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% etanol</td>
			<td>1 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ksylen</td>
			<td>Czas trwania: 5 min</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Mocowanie i szkiełko nakrywkowe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Procedura barwienia hematoksyliną i eozyną
2. Test przełamania bariery krew-mózg
<ol>
	<li>Pobieranie krwi i ciała szklistego
	<ol>
		<li>Znieczulenie 2-3-miesięcznego samca szczura rasy Wistar z cukrzycą wraz z grupą kontrolną dopasowaną do wieku (14 do 15 tygodni) za pomocą ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (8 mg/kg). Potwierdź stan znieczulenia za pomocą odruchu wycofania pedału (szczypanie palców). Natychmiast pobrać 1 ml krwi przez nakłucie serca do probówki pokrytej kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w celu oddzielenia osocza od krwi pełnej.</li>
		<li>Poddać szczura eutanazji za pomocą dużej dawki pentobarbitalu (150 mg/kg), wstrzykniętej drogą dootrzewnową. Brak wykrywalnego bicia serca potwierdza śmierć w ciągu 2-5 minut. Wyłuszczyć oko i natychmiast umieścić je na suchym lodzie.</li>
		<li>Umieścić oko na czystej szalce Petriego nad suchym lodem (zalecane) i rozpocząć sekcję oka, jak wspomniano w kroku 1.2.2.</li>
		<li>Wyjmij soczewkę, ostrożnie wyciągnij ciało szkliste z tylnej miseczki za pomocą mikrokleszczyków i umieść ją w probówce homogenizacyjnej zawierającej trzy do czterech szklanych koralików (2-4 mm). 
		UWAGA: Zaleca się preparację na suchym lodzie, ponieważ usunięcie soczewki i ciała szklistego jest łatwiejsze w warunkach zamarzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek
	<ol>
		<li>Homogenizować ciało szkliste w homogenizatorze perełkowym ze średnią prędkością przez 10 s.</li>
		<li>Przenieść krew (1 ml) i próbki szkliste (10-20 μl) do probówek do mikrowirówek i odwirować obie próbki w temperaturze 5200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: W przypadku udanej homogenizacji ciało szkliste ma jednolitą konsystencję po odwirowaniu. Jednakże w przypadku niejednorodnej konsystencji ciała szklistego powtórzyć czynności od kroku 2.2.1 ze zwiększonym czasem homogenizacji.</li>
		<li>Zebrać supernatant z obu próbek i rozcieńczyć próbki ciała szklistego i osocza odpowiednio w stosunku 1:10 i 1:20 za pomocą PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja białek i stosunek białek w ciele szklistym do osocza
	<ol>
		<li>Aby określić ilościowo stężenie białka w próbkach ciała szklistego i osocza, dodaj 5 μl rozcieńczonych próbek do 250 μl odczynnika Bradforda, dobrze wymieszaj i odczytaj absorbancję przy 590 nm w ciągu 40 min. 
		UWAGA: Jeżeli wartość absorpcji próbek jest wyższa niż 1,0, należy je dalej rozcieńczyć i powtórzyć procedurę od kroku 2.2.3.</li>
		<li>Znormalizuj poziom białka szklistego do poziomu białka w osoczu tego samego szczura i zmierz różnicę w krotności między szczurami zdrowymi a szczurami z cukrzycą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Angiografia fluorescencyjna
<ol>
	<li>FITC-dextran70000 iniekcja barwnika
	<ol>
		<li>Znieczulij 2-3-miesięcznego samca szczura Wistar z cukrzycą wraz z grupą kontrolną dopasowaną do wieku (14 do 15 tygodni) za pomocą 3% izofluranu i potwierdź odruch wycofania pedału (szczypanie palców). Zanurzyć ogon w zlewce zawierającej ciepłą wodę (37–40 °C). Oczyść ogon 70% etanolem przed wstrzyknięciem barwnika. Zlokalizować żyłę boczną ogona i zaznaczyć miejsce wstrzyknięcia w dolnej części ogona. 
		UWAGA: Jeśli wkłucie igły nie powiedzie się, spróbuj włożyć igłę w innym miejscu powyżej bieżącej pozycji (końcówka do podstawy ogona). Zaleca się jednak jednorazowe wstrzyknięcie, ponieważ powtarzające się nakłuwanie może prowadzić do rozwoju stresu u szczura, co może spowodować zwężenie naczyń krwionośnych.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 ml roztworu barwnika FITC-dextran70000 o stężeniu 50 mg/ml przez żyłę ogonową i pozwolić barwnikowi krążyć przez 5 minut. Szczura należy poddać eutanazji wysoką dawką pentobarbitalu (150 mg/kg), wstrzykniętą drogą dootrzewnową. Brak wykrywalnego bicia serca potwierdza śmierć w ciągu 2-5 minut. Wyłuszczyć oko, jak wspomniano w kroku 1.1.1. 
		UWAGA: W razie potrzeby oko można utrwalić w 4% roztworze formaldehydu, nie dłużej niż 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do montażu płaskiego
	<ol>
		<li>Do przygotowania płaskich mocowań należy przygotować narzędzia do preparowania wraz ze szkiełkami i szkiełkami nakrywkowymi. Umieścić oko na szalce Petriego wypełnionej schłodzonym PBS i rozpocząć sekcję oka, jak wspomniano w kroku 1.2.2.</li>
		<li>Teraz umieść końcówkę spiczastego kleszcza między twardówką a siatkówką. Delikatnie przesuwaj go wzdłuż krawędzi miseczki, upewniając się, że siatkówka nie jest w żadnym miejscu przyczepiona do twardówki. Jeśli jest jakaś przeszkoda, powoli odetnij tę część wzdłuż krawędzi za pomocą zakrzywionych mikronożyczek.</li>
		<li>Po potwierdzeniu, że siatkówka nie jest przymocowana do twardówki z żadnej strony, przeciąć w pobliżu tarczy nerwu wzrokowego, wykonując mały otwór, tak aby siatkówka całkowicie odłączyła się od twardówki. Powoli wepchnij siatkówkę do roztworu PBS i umieść ją na czystym, płaskim szkiełku za pomocą szpatułki lub kleszczyków.</li>
		<li>Za pomocą mikronożyczek lub ostrzy skalpela wykonaj drobne nacięcia w tkance siatkówki, dzieląc ją na cztery ćwiartki. Upewnij się, że nacięcia są oddalone o co najmniej 2 mm od otworu pozostawionego przez tarczę nerwu wzrokowego pośrodku, jak pokazano na Rysunek 1.</li>
		<li>Usuń nadmiar PBS z boków tkanki za pomocą końcówek o pojemności 0,2 ml, nie naruszając płaskiego mocowania.</li>
		<li>Umieść kroplę przeciwblaknięcia środka montażowego (od 50 μl do 100 μl) na płaskim uchwycie, przykryj szkiełkiem nakrywkowym i natychmiast wyświetl pod mikroskopem konfokalnym. 
		UWAGA: Utrzymuj minimalne światło podczas całej procedury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja montażu płaskiego
	<ol>
		<li>Wizualizuj płaskie mocowanie pod 10-krotnym obiektywem mikroskopu konfokalnego. Wykonaj skanowanie kafelków, aby uchwycić cały płaski uchwyt jako pojedynczy obraz. Liczba płytek zależy od wielkości płaskiego mocowania siatkówki. Wykonaj również układanie Z, aby uwidocznić żyły i tętnice w różnych ogniskach (preferowany rozmiar stosu Z to 5 μm, w zależności od tego, liczba kroków stosu Z jest różna).</li>
		<li>Użyj detektora PMT i HyD przy wzmocnieniu % odpowiednio 700-900 i 100-150. Wybierz zakres emisji od 510 do 530 nm dla barwnika FITC-dekstranu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Retinopathy+and+Cardiovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li>
<li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPandova%2C+MG+%22Visual+Impairment+and+Blindness%22">Visual Impairment and Blindness</a>. , IntechOpen. (2019).</li>
<li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+national%2C+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research%3A+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Ethnicity+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).</li>
<li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li>
<li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li>
<li>Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+monocytes+and+granulocytes%2C+capillary+nonperfusion%2C+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81(1991).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li>
<li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li>
<li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+pathophysiology+and+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816(2018).</li>
<li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li>
<li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptozocin%3A+a+review+of+its+pharmacology%2C+efficacy%2C+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reports%22%5BJournal%5D)">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li>
<li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li>
<li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuna%2C+LG+%22Manual+of+Histologic+Staining+Methods+of+the+Armed+Forces+Institute+of+Pathology%22">Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology</a>. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).</li>
<li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li>
<li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li>
<li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li>
<li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li>
<li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li>
<li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+refresher+course%3A+Here%27s+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Optometry%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li>
<li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li>
<li>Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php">http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php</a> (2009).</li>
<li>Szabó, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+%28ZDF%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li>
<li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+whole+eyes%3A+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li>
<li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology%3A+a+comparison+with+Davidson%27s+fixative+and+other+fixation+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li>
<li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuna%2C+LG+%22Manual+of+Histologic+Staining+Methods+of+the+Armed+Forces+Institute+of+Pathology.+Third+edition%22">Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition</a>. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).</li>
<li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795(2011).</li>
<li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li>
<li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Histologia Histologia siatkówki jest wykonywana w celu uwidocznienia zmian morfologicznych komórek i warstw siatkówki. Należy zoptymalizować różne etapy, w tym wybór roztworu utrwalającego, czas utrwalania, odwodnienie i impregnację parafiną. Rozmiar tkanki nie powinien przekraczać 3 mm, ponieważ penetracja utrwalacza staje się powolna. Powszechnie stosowany 4% paraformaldehyd prowadzi do odwarstwienia siatkówki nawet w zdrowym oku ze względu na stosunkowo wysoką osmolarność roztworu w porównaniu z ...

Retinopatia cukrzycowa (DR) jest jednym z najbardziej złożonych wtórnych powikłań cukrzycy. Jest to również główna przyczyna możliwej do uniknięcia ślepoty w populacji w wieku produkcyjnym na całym świecie. W niedawnej metaanalizie obejmującej 32,4 miliona osób niewidomych, 830 000 (2,6%) osób było niewidomych z powodu DR1. Odsetek utraty wzroku przypisywanej cukrzycy znalazł się na siódmym miejscu w 2015 r. i wynosił 1,06% (0,15-2,38) na całym świecie2,3.
Retinopatia cukrzycowa jest diagnozowana na podstawie nieprawidłowości naczyniowych w tylnych tkankach oka. Klinicznie dzieli się go na dwa etapy - nieproliferacyjny DR (NPDR) i proliferacyjny DR (PDR), w oparciu o unaczynienie siatkówki. Hiperglikemia jest uważana za silny regulator DR, ponieważ wiąże się z kilkoma szlakami zaangażowanymi w neurodegenerację4,5, zapalenie6,7 i mikrokrążenie8 w siatkówce. Wiele powikłań metabolicznych wywołanych hiperglikemią obejmuje akumulację zaawansowanych produktów końcowych glikacji (AGE), szlaku poliolowego, szlaku heksozaminy i szlaku kinazy białkowej C. Szlaki te są odpowiedzialne za proliferację komórek (komórki śródbłonka), migrację (perycyty) i apoptozę (nerwowe komórki siatkówki, perycyty i komórki śródbłonka) w oparciu o różne stadia retinopatii cukrzycowej. Te zmiany metaboliczne mogą prowadzić do zmian fizjologicznych, takich jak odwarstwienie siatkówki, utrata komórek siatkówki, uszkodzenie bariery krew-siatkówka (BRB), tętniaki i angiogeneza9.
Cukrzyca typu 1 wywołana streptozotocyną (STZ) jest dobrze ugruntowaną i akceptowaną praktyką u szczurów do oceny patogenezy cukrzycy i jej powikłań. Cukrzycotwórcze działanie STZ wynika z selektywnego niszczenia komórek β wysp trzustkowych10. W rezultacie, zwierzęta będą doświadczać niedoboru insuliny, hiperglikemii, polidypsji i wielomoczu, z których wszystkie są charakterystyczne dla ludzkiej cukrzycy typu 1 11. W przypadku ciężkiej indukcji cukrzycy STZ podaje się w dawce 40-65 mg/kg masy ciała dożylnie lub dootrzewnowo w wieku dorosłym. Po około 72 godzinach poziom glukozy we krwi u tych zwierząt przekracza 250 mg/dl10,12.
Aby zrozumieć fizjologiczne zmiany siatkówki spowodowane neurodegeneracją, stanem zapalnym i angiogenezą, różne techniki powinny być zoptymalizowane w eksperymentalnych modelach zwierzęcych. Zmiany strukturalne i funkcjonalne w komórkach siatkówki i naczyniach siatkówki można badać za pomocą różnych technik, takich jak histologia, test rozpadu BRB i angiografia fluorescencyjna.
Histologia obejmuje badanie anatomii komórek, tkanek i organów na poziomie mikroskopowym. Ustanawia korelację między strukturą a funkcją komórek/tkanek. Wykonuje się kilka kroków w celu wizualizacji i identyfikacji mikroskopijnych zmian w strukturze tkanki, porównując w ten sposób zdrowe i chore odpowiedniki13. Dlatego tak ważna jest skrupulatna standaryzacja każdego etapu histologii. Różne etapy związane z histologią siatkówki to utrwalenie próbki, przycinanie próbki, odwodnienie, oczyszczanie, impregnacja parafiną, zatapianie parafiny, cięcie i barwienie (barwienie hematoksyliną i eozyną)13,14.
W zdrowej siatkówce transport cząsteczek przez siatkówkę jest kontrolowany przez BRB, złożony z komórek śródbłonka i perycytów po wewnętrznej stronie oraz komórek nabłonka barwnikowego siatkówki po zewnętrznej stronie. Jednak wewnętrzne komórki śródbłonka BRB i perycyty zaczynają się degenerować podczas choroby, a BRB jest również zagrożony15. Z powodu tego rozpadu BRB, wiele cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej przecieka do tkanki ciała szklistego i siatkówki16. W miarę postępu choroby wiele innych cząsteczek białka (o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej) również przedostaje się do tkanki ciała szklistego i siatkówki z powodu zaburzenia homeostazy17. Prowadzi to do różnych innych powikłań, a ostatecznie obrzęku plamki żółtej i ślepoty. W związku z tym ilościowe określenie poziomów białka w ciele szklistym i porównanie stanów zdrowych i cukrzycowych zmierzyło w naruszeniu BRB.
Angiografia fluorescencyjna to technika używana do badania krążenia krwi w siatkówce i naczyniówce za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Służy do wizualizacji unaczynienia siatkówki i naczyniówki poprzez wstrzyknięcie barwnika fluoresceinowego drogą dożylną lub wstrzyknięcie do serca18. Po wstrzyknięciu barwnik najpierw dociera do tętnic siatkówkowych, a następnie do żył siatkówki. Ta cyrkulacja barwnika jest zwykle zakończona w ciągu 5 do 10 minut od wstrzyknięcia barwnika19. Jest to ważna technika diagnozowania różnych chorób tylnego odcinka oka, w tym retinopatii cukrzycowej i neowaskularyzacji naczyniówki20. Pomaga wykryć większe i mniejsze zmiany naczyniowe w normalnych i chorobowych stanach.

<table><tbody><tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td></td><td>Środek znieczulający</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Troikaa Pharmaceuticals</td><td></td><td>Środek znieczulający</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Indian Immunologicals Limited</td><td></td><td>Środek znieczulający</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodowy</td><td>Zora Pharma</td><td></td><td>Środek do eutanazji</td></tr><tr><td>Roztwór utrwalający (1 % formaldehydu, 1,25 % aldehydu glutarowego</td><td>HiMedia, Avra</td><td>MB059, ASG2529</td><td>Przygotowany we własnym zakresie</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Hayman</td><td>F204325</td><td>Odwodnienie</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>HiMedia</td><td>MB-180</td><td>Usuwanie etanolu lub parafiny</td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>HiMedia</td><td>GRM10702</td><td>służy do zatapiania tkanek</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>HiMedia</td><td>TC503</td><td>Do przygotowania preparatów powlekanych albuminą. Glicerol i albuminę jaja miesza się w stosunku 1:1 w celu pokrycia na szkiełkach</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td><td>65955</td><td>Do przygotowania 1 % alkoholu kwasowego</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>HiMedia</td><td>AS119</td><td>Do przygotowania eozyny</td></tr><tr><td>Scotts water</td><td>Leica</td><td>3802900</td><td>Odczynnik do niebieszczenia</td></tr><tr><td>Roztwór Papanicolaou 1b Roztwór hematoksyliny</td><td>Sigma</td><td>1.09254.0500</td><td>Barwienie jąder</td></tr><tr><td>Eozyna</td><td>HiMedia</td><td>GRM115</td><td>Barwienie cytoplazmy, przygotowano 0,25 % roztwór Własny</td></tr><tr><td>DPX Mountant media</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td>Wizualizacja i ochrona przekrojów siatkówki</td></tr> <tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glassware</td><td>Borosil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz rogówkowy</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1200</td><td>Preparacja</td></tr><tr><td>Kleszcz Colibri</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1135</td><td>Sekcja</td></tr><tr><td>Zakrzywione mikronożyczki</td><td>Stephens Instruments</td><td>S7-1311</td><td>Nożyczki do preparacji</td></tr><tr><td>Vannas</td><td>Stephens Instruments</td><td>S7-1387</td> Nożyczki <td>do preparacji</td></tr><tr><td>tęczówki</td><td>Stephens Instruments</td><td>S7-1015</td><td></td></tr><tr><td>Kasety</td> preparacyjne <td>HiMedia</td><td>PW1292</td><td>Do trzymania tkanki podczas przetwarzania histologicznego</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>GT Sonic</td><td>GT Sonic-D9</td><td>Utrzymanie temperatury</td></tr><tr><td>Stacja zatapiania parafiny</td><td>Myr</td><td>EC 350</td><td>Przygotowanie bloków parafinowych</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td><td>YD-335A</td><td>Ostrza do cięcia</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>Leica 818</td><td>Prowadnice sekcyjne</td></tr><tr><td></td><td>HiMedia</td><td>BG005</td><td>Przechowywanie skrawków parafiny</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>HiMedia</td><td>BG014C</td><td>Do pokrycia tkanki po dodaniu podłoża montażowego</td></tr><tr><td>Blood Retinal Barrier breakdown</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>Anestezjolizacja</td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td>Odczynnik do rozwarstwienia</td></tr><tr><td>Bradforda</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td>Kwantyfikacja białek</td></tr> <tr><td>Wyposażenia</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kleszcz rogówkowy</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1200</td><td>Preparacja</td></tr><tr><td>Colibri kleszcz</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1135</td><td>Preparacja</td></tr><tr><td>Zakrzywione mikronożyce</td><td>Stephens Instruments</td><td>S7-1311</td><td>Nożyczki do rozwarstwiania</td></tr><tr><td>Vannas</td><td>Stephens Instruments</td><td>S7-1387</td><td>Nożyczki do rozwarstwiania</td></tr><tr><td>tęczówki</td><td>Stephens Instruments</td><td>S7-1015</td><td>Wyroby szklane do preparacji</td></tr><tr><td></td><td>Borosil</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z powłoką EDTA</td><td>J.K Diagnostics</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oddziel osocze od krwi pełnej</td></tr><tr><td>Probówki homogenizacyjne</td><td>MP Biomedicals</td><td>SKU: 115076200-CF</td><td>Homogenizacja ciała szklistego</td></tr><tr><td>Nakrętki homogenizacyjne</td><td>MP Biomedicals</td><td>SKU: 115063002-CF</td><td>Homogenizacja ciała szklistego</td></tr><tr><td>Kulki szklane</td><td>MP Biomedicals</td><td>SKU: 116914801</td><td>Homogenizacja ciała szklistego</td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td>Homogenizacja szklistej</td></tr><tr><td>płytki 96-dołkowej - Przezroczysta</td><td>GN655101</td><td>Greniera</td><td>Kwantyfikacja białek</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectrMax M4</td><td>Pomiar absorbancji</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>REMI</td><td>CPR240 Plus</td><td>Wirowanie</td></tr><tr><td><silna>Angiografia fluorescencyjna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dilaurynian Dibutyliny, DMSO</td><td>FITC, Dekstran i Dilaurynian Dibutyliny z Sigma; DMSO od HiMedia</td><td>FITC-F3651, Dextran-31390, Dilaurynian dibutyliny -29123, DMSO-TC185</td><td>Przygotowany we własnym</td></tr><tr><td>zakresie Fluoroshied</td><td>Sigma</td><td>F6182</td><td>Anty-blaknięcie medium montażowe</td></tr> <tr><td>< mocne>Wyposażenie< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kleszcz rogówkowy</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1200</td><td>Preparacja</td></tr><tr><td>kleszczyk Colibri</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1135</td><td>Rozwarstwienie</td></tr><tr><td>Zakrzywione mikronożyczki</td><td>Stephens Instruments</td><td>S7-1311</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do</td> rozwarstwiania Vannas <td>Stephens Instruments</td><td>S7-1387</td><td>Nożyczki do rozwarstwiania</td></tr><tr><td>tęczówki</td><td>Stephens Instruments</td><td>S7-1015</td><td>Wyroby szklane do preparacji</td></tr><tr><td></td><td>Borosil</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>HiMedia</td><td>BG005</td><td>Przygotowanie do montażu płaskiego</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>HiMedia</td><td>BG014C</td><td>Do pokrycia tkanki po dodaniu podłoża montażowego</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td>Wizualizacja płaskiego mocowania</td></tr></tbody></table>

ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Choroba tylnego odcinka oka, taka jak retinopatia cukrzycowa, zmienia fizjologię siatkówki. Retinopatia cukrzycowa charakteryzuje się odwarstwieniem siatkówki, rozpadem bariery krew-siatkówka (BRB) i angiogenezą siatkówki. Model szczura in vivo jest cennym narzędziem eksperymentalnym do badania zmian w strukturze i funkcji siatkówki. Proponujemy trzy różne techniki eksperymentalne w modelu szczurzym w celu identyfikacji zmian morfologicznych komórek siatkówki, unaczynienia siatkówki i upośledzonego BRB. Histologia siatkówki służy do badania morfologii różnych komórek siatkówki. Pomiar ilościowy odbywa się również za pomocą liczby komórek siatkówki i pomiaru grubości różnych warstw siatkówki. Test rozpadu BRB służy do określenia wycieku białek zewnątrzgałkowych z osocza do tkanki szklistej w wyniku rozpadu BRB. Angiografia fluorescencyjna służy do badania angiogenezy i nieszczelności naczyń krwionośnych poprzez wizualizację unaczynienia siatkówki za pomocą barwnika FITC-dekstran.

Histologia siatkówki 
W siatkówce cukrzycowej komórki siatkówki ulegają degeneracji. Ponadto grubość warstw siatkówki zwiększa się z powodu obrzęku22. Obrazy uzyskane po barwieniu hematoksyliną i eosiną mogą być wykorzystane do zliczania komórek oraz pomiaru grubości poszczególnych warstw, co przedstawiono na Rysunku 2 z wykorzystaniem programu ImageJ.
Test przełamania bariery krew-siatkówka 
Ponieważ...

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Ogólnym celem tych technik jest ocena patofizjologii siatkówki w modelu szczurzej retinopatii cukrzycowej wywołanej streptozotocyną. Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Trwają nieustanne poszukiwania środków farmakologicznych o lepszej skuteczności i dłuższym działaniu w leczeniu retinopatii cukrzycowej.Proces odkrywania środków farmakologicznych w przedklinicznych modelach zwierzęcych odgrywa istotną rolę. Te modele zwierzęce pomagają zrozumieć strukturalne i funkcjonalne zmiany w tkankach tylnego segmentu oka. Dlatego zademonstrujemy trzy różne techniki badania tych zmian w problemach z tylnym segmentem.Demonstrujemy histologię w celu zbadania zmian morfologicznych komórek siatkówki w warstwach, test rozpadu BRB w celu zbadania upośledzonego BRB poprzez ilościowe określenie wycieku białka w ciele szklistym z osocza, a także angiografię fluorescencyjną w celu wizualizacji unaczynienia siatkówki za pomocą barwnika FITC-dekstranu. Poddaj szczura eutanazji za pomocą dużej dawki pentobarbitalu i potwierdź jego śmierć bez wykrywalnego bicia serca. Wyłuszczenie oka poprzez wykonanie nacięć za pomocą ostrza skalpela w okolicy nosowej i skroniowej oka.Następnie przetnij wzdłuż jego krawędzi, aby usunąć oko z oczodołu. Usuń nadmiar tłuszczu otaczającego oko i umieść go w 5 ml roztworu utrwalającego. Inkubować oko w roztworze utrwalającym przez 24 do 48 godzin.Po utrwaleniu wyjąć oko z roztworu utrwalającego i przenieść na szalkę Petriego wypełnioną 10 ml PBS. Za pomocą mikrokleszczyków przytrzymaj oko nerwem wzrokowym i wykonaj nacięcie na pars plana za pomocą mikronożyczek. Przeciąć cały brzeg rogówki, aby oddzielić przednią miseczkę i tylną miseczkę oka.Zdejmij soczewkę i przetnij nerw wzrokowy. Przetnij tylną miseczkę na dwie połowy, przechodząc przez nerw wzrokowy. Przenieś każdą połówkę do oddzielnych kaset.Odwodnić tkankę, stopniowo zwiększając stężenie etanolu z 50% do 100% etanolu. I na koniec usuń etanol za pomocą ksylenu. Zaimpregnuj tkankę podgrzaną parafiną w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby zastąpić ksylen w tkance.Przygotuj bloki parafiny za pomocą stalowej formy, aby przytrzymać chusteczkę i kasetę jako podstawę. Podczas przygotowywania bloku, część tarczy wzrokowej oka powinna być skierowana w stronę dolnej części stalowej formy. Napełnij kasetę parafiną i przenieś ją na chłodną powierzchnię.Zamontuj ostrze i kasetę na odpowiednich uchwytach na mikrotomie. Za pomocą mikrotomu odetnij nadmiar wosku parafinowego i przetnij wstęgę od pięciu do sześciu odcinków o grubości 5 mikrometrów. Przenieś wstążkę na powierzchnię wstępnie podgrzanej łaźni wodnej, aby rozłożyć wstążkę.Zebrać skrawki na szkiełku podstawowym pokrytym albuminą. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wykonać barwienie Hematoksyliną i Eozyną, podgrzej szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 1 godzinę, aby stopić parafinę.Postępuj zgodnie z procedurą barwienia podaną w rękopisie. Rozpocznij od ponownego nawodnienia tkanki, a następnie wybarwić hematoksyliną, a następnie eozyną. Teraz odwodnić tkankę i dodać pożywkę montażową na sekcje.Umieść szkiełko nakrywkowe na odcinkach i wizualizuj pod mikroskopem świetlnym. Aby wykonać test przełamania bariery krew-siatkówka, znieczulij szczura za pomocą ketaminy i ksylazyny i potwierdź stan znieczulenia przez uszczypnięcie palca. Zlokalizuj serce i włóż strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 24, aby pobrać krew przez nakłucie serca.Po zebraniu wystarczającej ilości krwi przenieś ją do probówki pokrytej EDTA. Wymieszaj go delikatnie, aby zapobiec hemolizie. Wyłuszczyć oko i natychmiast przenieść je do suchego lodu.W warunkach zamrożenia rozpocznij sekcję oka od usunięcia rogówki i soczewki. Wyciągnij ciało szkliste z tylnego odcinka oka za pomocą kleszczy bez zanieczyszczenia siatkówki. Przenieś go do probówki homogenizującej z trzema do czterech kulek.Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora kulkowego ze średnią prędkością przez 10 sekund. Przenieś próbki krwi i ciała szklistego do probówek mikrowirówkowych w celu dalszego przetwarzania. Odwirować obie próbki w temperaturze 5,200 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 250 mikrolitrów odczynnika Bradford do studzienek. Próbki ciała szklistego rozcieńczyć 10 razy, a próbki osocza 20 razy za pomocą PBS. Dodaj 5 mikrolitrów rozcieńczonych próbek do odczynnika Bradforda i dobrze wymieszaj.Inkubować próbki przez 20 do 30 minut, a następnie zmierzyć absorbancję przy 590 nanometrach za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek. Intensywność próbki jest wprost proporcjonalna do stężenia białka. Aby wykonać angiografię fluorescencyjną, znieczulij szczura za pomocą 3% izofluranu i potwierdź stan znieczulenia za pomocą uderzenia w palec u nogi.Zanurz ogon w ciepłej wodzie przed wstrzyknięciem barwnika. Wstrzyknąć 1 ml roztworu FITC-dekstranu w dawce 50 mg na ml do żyły ogonowej bocznej. Pozwól barwnikowi krążyć przez 5 do 10 minut.Poddaj szczura eutanazji za pomocą pentobarbitalu i potwierdź jego śmierć bez wykrywalnego bicia serca. Wyłuszczyć oko i przystąp do przygotowania do montażu płaskiego. Aby przygotować płaskie mocowanie siatkówki, umieść oko na bezbłonnikowym Kimwipe i przetnij przednią część oka.Powoli wyciągnij soczewkę wraz z ciałem szklistym z tylnego odcinka oka. Przenieś tylny segment na szalkę Petriego wypełnioną PBS i przetnij nerw wzrokowy. Teraz umieść końcówkę spiczastego kleszcza między twardówką a siatkówką.Delikatnie przesuwaj go wzdłuż krawędzi kubka, aby upewnić się, że siatkówka nie jest przyczepiona do twardówki w żadnym miejscu. Wyciąć w pobliżu tarczy nerwu wzrokowego, tak aby siatkówka całkowicie odłączyła się od twardówki. Po potwierdzeniu, że siatkówka nie jest przyczepiona do twardówki z żadnej strony, powoli wepchnij ją do roztworu PBS.Za pomocą kleszcza przenieś siatkówkę na czyste szkiełko podstawowe, nie powodując jej uszkodzenia. Za pomocą mikronożyczek lub ostrza skalpela wykonaj cztery nacięcia na siatkówce, jak pokazano, aby podzielić ją na cztery ćwiartki. Usuń nadmiar PBS z otoczenia siatkówki i dodaj pożywkę mocującą zapobiegającą blaknięciu na płaskim mocowaniu siatkówki.Przykryj go szkiełkiem nakrywkowym i wizualizuj płaskie mocowanie pod mikroskopem konfokalnym. Należy tutaj zauważyć, że cały proces angiografii fluorescencyjnej odbywa się przy minimalnym oświetleniu, aby uniknąć wygaszenia fluorescencji przez barwnik FITC-dekstran. U szczura z cukrzycą komórki siatkówki ulegają zwyrodnieniu, co prowadzi do dalszych powikłań.Te zmiany strukturalne można uwidocznić za pomocą techniki histologicznej w celu określenia liczby komórek i grubości siatkówki. W przypadku szczurów z cukrzycą grubość warstw siatkówki zwiększa się z powodu obrzęku. W związku z tym technika ta pomaga w badaniach przesiewowych różnych potencjalnych środków farmakologicznych w leczeniu retinopatii cukrzycowej.Zmiany metaboliczne w siatkówce spowodowane cukrzycą powodują utratę perycytów i rozpad bariery krew-siatkówka. Ponieważ dochodzi do wycieku białka i innych biomolekuł do siatkówki i ciała szklistego, poziom całkowitego białka w ciele szklistym szczurów z cukrzycą wzrasta. Zapobieganie przerwaniu bariery krew-siatkówka może znacznie zahamować postęp retinopatii cukrzycowej.W retinopatii cukrzycowej zwiększa się ekspresja czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, co prowadzi do powstawania nowych naczyń. Naczynia te zaburzają normalną strukturę siatkówki, dlatego jej unerwienie ma zasadnicze znaczenie w leczeniu retinopatii cukrzycowej. Technika angiografii fluorescencyjnej jest wykorzystywana do wizualizacji nowych naczyń krwionośnych, a także nieszczelności naczyń krwionośnych, jak podkreślono tutaj.Jednak angiogeneza jest widoczna dopiero po sześciu do 12 miesiącach od indukcji cukrzycy. Technika ta pomaga nam określić ilościowo wpływ leczenia farmakologicznego na unerwienie angiogenezy i nietrzymanie naczyń. Przyszłe leczenie retinopatii cukrzycowej wymaga bardziej skutecznych środków farmakologicznych, ale przyszłe metody leczenia można osiągnąć tylko dzięki lepszemu zrozumieniu patogenezy choroby.Opanowanie tych technik może pomóc naukowcom w lepszym zrozumieniu patogenezy retinopatii cukrzycowej, co może doprowadzić do odkrycia lepszych interwencji farmakologicznych.

retinal-pathophysiological-evaluation-in-a-rat-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje przygotowanie modelu szczura do badania zdrowia siatkówki i integralności szlaku wzrokowego. Wizualny potencjał wywołany i elektrody referencyjne i aktywne elektroretinografii są podłączone do szczura, a następnie wyrównuje platformę ze szczurem przed misą Ganzfelda, aby uzyskać równomierne oświetlenie siatkówki i zamyka klatkę Faradaya, aby uniknąć zakłóceń zewnętrznych.

Przygotowanie modelu szczura do oceny integralności ścieżki wzrokowej przy użyciu konfiguracji elektrofizjologicznej

Jaskra charakteryzuje się uszkodzeniem komórek zwojowych siatkówki. Indukowanie jaskry w modelach zwierzęcych może zapewnić wgląd w badania nad tą chorobą. W tym miejscu przedstawiamy procedurę, która indukuje utratę RGC w modelu szczura in vivo i demonstrujemy przygotowanie całych siatkówk do analizy.

Procedura indukująca jaskrę w modelu szczura in vivo i preparat siatkówki z pełnym mocowaniem

Ten artykuł opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki przez podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe u myszy. Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne siatkówki spowodowane podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym służy do modelowania ludzkich patologii charakteryzujących się upośledzonym dostarczaniem tlenu i składników odżywczych do siatkówki, umożliwiając naukowcom zbadanie potencjalnych mechanizmów komórkowych i metod leczenia chorób układu...

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego

Ten protokół opisuje nowatorską metodę badania formy chemicznej neurostymulacji całych siatkówek szczurów in vitro za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu. Neurostymulacja chemiczna jest obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej neurostymulacji elektrycznej neuronów siatkówki w leczeniu nieodwracalnej ślepoty spowodowanej chorobami zwyrodnieniowymi fotoreceptorów.

Metodologia biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu in vitro

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane przez zastosowanie szwu okołokończynowego u szczurów i myszy, co prowadzi do funkcjonalnego i strukturalnego pogorszenia komórek zwojowych siatkówki zgodnego z jaskrą.

Model jaskry indukowanej szwem okołolimbowym u szczurów i myszy

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Opisano protokół przewlekłych infuzji glukozy i intralipidów u szczurów. Model ten można wykorzystać do badania wpływu nadmiaru składników odżywczych na funkcjonowanie narządów i parametry fizjologiczne.

Model przewlekłego wlewu składników odżywczych u szczura

Ten protokół opisuje metodę szczegółowej oceny podzbiorów leukocytów w mikrośrodowisku guza w modelu guza myszy. Komórki czerniaka B16 z ekspresją chemeryny wszczepiono podskórnie myszom syngenicznym. Komórki z mikrośrodowiska guza zostały następnie wybarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwoliło na szczegółowe analizy podzbiorów leukocytów.

Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza

Poznaj metody oceny patofizjologii siatkówki w modelu cukrzycowym szczura. Techniki histologiczne, badanie przepuszczalności bariery krwio-siatkówkowej i angiografia fluorescencyjna wspierają odkrywanie nowych leków.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Przeglądaj więcej filmów