Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Ogólnym celem tych technik jest ocena patofizjologii siatkówki w modelu szczurzej retinopatii cukrzycowej wywołanej streptozotocyną. Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Trwają nieustanne poszukiwania środków farmakologicznych o lepszej skuteczności i dłuższym działaniu w leczeniu retinopatii cukrzycowej.

Proces odkrywania środków farmakologicznych w przedklinicznych modelach zwierzęcych odgrywa istotną rolę. Te modele zwierzęce pomagają zrozumieć strukturalne i funkcjonalne zmiany w tkankach tylnego segmentu oka. Dlatego zademonstrujemy trzy różne techniki badania tych zmian w problemach z tylnym segmentem.

Demonstrujemy histologię w celu zbadania zmian morfologicznych komórek siatkówki w warstwach, test rozpadu BRB w celu zbadania upośledzonego BRB poprzez ilościowe określenie wycieku białka w ciele szklistym z osocza, a także angiografię fluorescencyjną w celu wizualizacji unaczynienia siatkówki za pomocą barwnika FITC-dekstranu. Poddaj szczura eutanazji za pomocą dużej dawki pentobarbitalu i potwierdź jego śmierć bez wykrywalnego bicia serca. Wyłuszczenie oka poprzez wykonanie nacięć za pomocą ostrza skalpela w okolicy nosowej i skroniowej oka.

Następnie przetnij wzdłuż jego krawędzi, aby usunąć oko z oczodołu. Usuń nadmiar tłuszczu otaczającego oko i umieść go w 5 ml roztworu utrwalającego. Inkubować oko w roztworze utrwalającym przez 24 do 48 godzin.

Po utrwaleniu wyjąć oko z roztworu utrwalającego i przenieść na szalkę Petriego wypełnioną 10 ml PBS. Za pomocą mikrokleszczyków przytrzymaj oko nerwem wzrokowym i wykonaj nacięcie na pars plana za pomocą mikronożyczek. Przeciąć cały brzeg rogówki, aby oddzielić przednią miseczkę i tylną miseczkę oka.

Zdejmij soczewkę i przetnij nerw wzrokowy. Przetnij tylną miseczkę na dwie połowy, przechodząc przez nerw wzrokowy. Przenieś każdą połówkę do oddzielnych kaset.

Odwodnić tkankę, stopniowo zwiększając stężenie etanolu z 50% do 100% etanolu. I na koniec usuń etanol za pomocą ksylenu. Zaimpregnuj tkankę podgrzaną parafiną w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby zastąpić ksylen w tkance.

Przygotuj bloki parafiny za pomocą stalowej formy, aby przytrzymać chusteczkę i kasetę jako podstawę. Podczas przygotowywania bloku, część tarczy wzrokowej oka powinna być skierowana w stronę dolnej części stalowej formy. Napełnij kasetę parafiną i przenieś ją na chłodną powierzchnię.

Zamontuj ostrze i kasetę na odpowiednich uchwytach na mikrotomie. Za pomocą mikrotomu odetnij nadmiar wosku parafinowego i przetnij wstęgę od pięciu do sześciu odcinków o grubości 5 mikrometrów. Przenieś wstążkę na powierzchnię wstępnie podgrzanej łaźni wodnej, aby rozłożyć wstążkę.

Zebrać skrawki na szkiełku podstawowym pokrytym albuminą. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wykonać barwienie Hematoksyliną i Eozyną, podgrzej szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 1 godzinę, aby stopić parafinę.

Postępuj zgodnie z procedurą barwienia podaną w rękopisie. Rozpocznij od ponownego nawodnienia tkanki, a następnie wybarwić hematoksyliną, a następnie eozyną. Teraz odwodnić tkankę i dodać pożywkę montażową na sekcje.

Umieść szkiełko nakrywkowe na odcinkach i wizualizuj pod mikroskopem świetlnym. Aby wykonać test przełamania bariery krew-siatkówka, znieczulij szczura za pomocą ketaminy i ksylazyny i potwierdź stan znieczulenia przez uszczypnięcie palca. Zlokalizuj serce i włóż strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 24, aby pobrać krew przez nakłucie serca.

Po zebraniu wystarczającej ilości krwi przenieś ją do probówki pokrytej EDTA. Wymieszaj go delikatnie, aby zapobiec hemolizie. Wyłuszczyć oko i natychmiast przenieść je do suchego lodu.

W warunkach zamrożenia rozpocznij sekcję oka od usunięcia rogówki i soczewki. Wyciągnij ciało szkliste z tylnego odcinka oka za pomocą kleszczy bez zanieczyszczenia siatkówki. Przenieś go do probówki homogenizującej z trzema do czterech kulek.

Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora kulkowego ze średnią prędkością przez 10 sekund. Przenieś próbki krwi i ciała szklistego do probówek mikrowirówkowych w celu dalszego przetwarzania. Odwirować obie próbki w temperaturze 5,200 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 250 mikrolitrów odczynnika Bradford do studzienek. Próbki ciała szklistego rozcieńczyć 10 razy, a próbki osocza 20 razy za pomocą PBS. Dodaj 5 mikrolitrów rozcieńczonych próbek do odczynnika Bradforda i dobrze wymieszaj.

Inkubować próbki przez 20 do 30 minut, a następnie zmierzyć absorbancję przy 590 nanometrach za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek. Intensywność próbki jest wprost proporcjonalna do stężenia białka. Aby wykonać angiografię fluorescencyjną, znieczulij szczura za pomocą 3% izofluranu i potwierdź stan znieczulenia za pomocą uderzenia w palec u nogi.

Zanurz ogon w ciepłej wodzie przed wstrzyknięciem barwnika. Wstrzyknąć 1 ml roztworu FITC-dekstranu w dawce 50 mg na ml do żyły ogonowej bocznej. Pozwól barwnikowi krążyć przez 5 do 10 minut.

Poddaj szczura eutanazji za pomocą pentobarbitalu i potwierdź jego śmierć bez wykrywalnego bicia serca. Wyłuszczyć oko i przystąp do przygotowania do montażu płaskiego. Aby przygotować płaskie mocowanie siatkówki, umieść oko na bezbłonnikowym Kimwipe i przetnij przednią część oka.

Powoli wyciągnij soczewkę wraz z ciałem szklistym z tylnego odcinka oka. Przenieś tylny segment na szalkę Petriego wypełnioną PBS i przetnij nerw wzrokowy. Teraz umieść końcówkę spiczastego kleszcza między twardówką a siatkówką.

Delikatnie przesuwaj go wzdłuż krawędzi kubka, aby upewnić się, że siatkówka nie jest przyczepiona do twardówki w żadnym miejscu. Wyciąć w pobliżu tarczy nerwu wzrokowego, tak aby siatkówka całkowicie odłączyła się od twardówki. Po potwierdzeniu, że siatkówka nie jest przyczepiona do twardówki z żadnej strony, powoli wepchnij ją do roztworu PBS.

Za pomocą kleszcza przenieś siatkówkę na czyste szkiełko podstawowe, nie powodując jej uszkodzenia. Za pomocą mikronożyczek lub ostrza skalpela wykonaj cztery nacięcia na siatkówce, jak pokazano, aby podzielić ją na cztery ćwiartki. Usuń nadmiar PBS z otoczenia siatkówki i dodaj pożywkę mocującą zapobiegającą blaknięciu na płaskim mocowaniu siatkówki.

Przykryj go szkiełkiem nakrywkowym i wizualizuj płaskie mocowanie pod mikroskopem konfokalnym. Należy tutaj zauważyć, że cały proces angiografii fluorescencyjnej odbywa się przy minimalnym oświetleniu, aby uniknąć wygaszenia fluorescencji przez barwnik FITC-dekstran. U szczura z cukrzycą komórki siatkówki ulegają zwyrodnieniu, co prowadzi do dalszych powikłań.

Te zmiany strukturalne można uwidocznić za pomocą techniki histologicznej w celu określenia liczby komórek i grubości siatkówki. W przypadku szczurów z cukrzycą grubość warstw siatkówki zwiększa się z powodu obrzęku. W związku z tym technika ta pomaga w badaniach przesiewowych różnych potencjalnych środków farmakologicznych w leczeniu retinopatii cukrzycowej.

Zmiany metaboliczne w siatkówce spowodowane cukrzycą powodują utratę perycytów i rozpad bariery krew-siatkówka. Ponieważ dochodzi do wycieku białka i innych biomolekuł do siatkówki i ciała szklistego, poziom całkowitego białka w ciele szklistym szczurów z cukrzycą wzrasta. Zapobieganie przerwaniu bariery krew-siatkówka może znacznie zahamować postęp retinopatii cukrzycowej.

W retinopatii cukrzycowej zwiększa się ekspresja czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, co prowadzi do powstawania nowych naczyń. Naczynia te zaburzają normalną strukturę siatkówki, dlatego jej unerwienie ma zasadnicze znaczenie w leczeniu retinopatii cukrzycowej. Technika angiografii fluorescencyjnej jest wykorzystywana do wizualizacji nowych naczyń krwionośnych, a także nieszczelności naczyń krwionośnych, jak podkreślono tutaj.

Jednak angiogeneza jest widoczna dopiero po sześciu do 12 miesiącach od indukcji cukrzycy. Technika ta pomaga nam określić ilościowo wpływ leczenia farmakologicznego na unerwienie angiogenezy i nietrzymanie naczyń. Przyszłe leczenie retinopatii cukrzycowej wymaga bardziej skutecznych środków farmakologicznych, ale przyszłe metody leczenia można osiągnąć tylko dzięki lepszemu zrozumieniu patogenezy choroby.

Opanowanie tych technik może pomóc naukowcom w lepszym zrozumieniu patogenezy retinopatii cukrzycowej, co może doprowadzić do odkrycia lepszych interwencji farmakologicznych.