Name: Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Naucz się mikrodysekcji i dysocjacji mysiego jajowodu, aby identyfikować poszczególne segmenty i izolować pojedyncze komórki. Ta metoda umożliwia analizę RNA i badań komórkowych w biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została częściowo wsparta przez Nagrodę Przełomową Departamentu Obrony dla AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR był częściowo wspierany przez stypendia stacjonarne: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship i Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences oraz University of California, Riverside, nagrody stacjonarne: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant oraz Graduate Division Dissertation Year Program Award. Autorzy dziękują Gillian M. Wright i Alyssie M. Kumari za pomoc we wczesnym rozwiązywaniu problemów związanych z tą metodą.

Wszystkie zabiegi i procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Riverside i były zgodne z wytycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych oraz Narodowych Instytutów Zdrowia. Opisana metoda została zastosowana u dorosłych samic myszy szczepu C57BL/6. Wszystkie zwierzęta zostały uśmiercone poprzez dekapitację przed pobraniem tkanek.
UWAGA: Przegląd protokołu, w którym wykorzystuje się niebieski barwnik w celu ułatwienia efektywnej sekcji i rozwijania jajowodu, przedstawiono na pierwszej rycinie (Rycina 1).
<img alt="Jajnik i jajowód z barwnikiem, usunięcie i rozwijanie; schemat anatomiczny struktur macicy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63168/63168fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd metody mikrodysekcji. (A) Panel lewy przedstawia nienaruszoną strukturę, z której usunięto większość tkanki tłuszczowej jajnika oraz pozostałości tkanki łącznej otaczającej jajowód. Następnie dodanie błękitu toluidyny pomaga odróżnić sploty jajowodu (panel środkowy). Panel prawy przedstawia struktury po usunięciu jajnika. (B) Rozwinięty jajowód z zaznaczonymi wewnętrznymi zakrętami w celu określenia punktów początkowych i końcowych każdego segmentu. (C) Schemat zastosowanego podziału na segmenty (nie w skali). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63168/63168fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
1. Przygotowanie powierzchni do sekcji
<ol>
	<li>Przymocuj kawałek wosku dentystycznego do szalki Petriego za pomocą kleju i pozostaw do wyschnięcia (Rysunek 2A). Zdezynfekuj szalkę 70% ethanolem. Powierzchnia jest gotowa do sekcji.</li>
</ol>
2. Makrodysekcja jajnika, jajowodu i macicy
<ol>
	<li>Gdy nadejdzie czas sekcji, unieruchom szalkę Petriego zawierającą wosk dentystyczny na wybranej zimnej platformie (np. wkładzie chłodzącym przechowywanym przed użyciem w temperaturze -20 °C) pod mikroskopem sekcyjnym (Rysunek 2A).</li>
	<li>Zdezynfekuj powierzchnię brzuszną zwierzęcia 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszną i miedniczną za pomocą sterylnych nożyczek sekcyjnych i odsuń przewód pokarmowy na bok, aby zlokalizować grzbietową macicę dwurożną. Podążaj wzdłuż każdego rogu macicy w kierunku rostralnym, aby zlokalizować odpowiedni jajowód i jajnik otulone tkanką tłuszczową macicy, znajdujące się tuż poniżej nerki (Rysunek 2B,C).</li>
	<li>Wycinij oba boczne jajowody wraz z jajnikami i fragmentem dystalnego rogu macicy, nadal do nich przytwierdzonym, używając nożyczek sekcyjnych. Odetnij każdy boczny róg macicy, pozostawiając około 1-2 cm rogu przytwierdzonego do zwiniętego jajowodu i jajnika (Rysunek 2D). Natychmiast zanurz tkankę w 2 mL zimnego medium sekcyjnego (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
<img alt="Konfiguracja techniki kriogenicznej z zimną platformą i igłą; schematy: anatomia jajnika, jajowodu i dystalnej części macicy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63168/63168fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Makrosekcja jajnika i konfiguracja sekcyjna. Jajowód znajduje się grzbietowo w jamie miednicznej u podstawy nerki, w obrębie tkanki tłuszczowej jajnika (B). Zlokalizuj rozwidlenie macicy w jamie miednicznej (C) i podążaj wzdłuż bocznego rogu macicy, aby odnaleźć ciąg macica-jajowód-jajnik (B). Usuń te struktury, przecinając jeden róg macicy i wykonując wstępną sekcję. Umieść je na platformie sekcyjnej (A) i przymocuj część macicy do wosku dentystycznego za pomocą igły (A i D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63168/63168fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
UWAGA: Należy pozostawić wystarczającą część rogu macicy nienaruszoną i przytwierdzoną do jajowodu, aby umożliwić zamocowanie jej na platformie sekcyjnej (Rysunek 2D).
<ol start="4">
	<li>Przymocuj tkankę macicy do wosku dentystycznego za pomocą sterylnej igły 25 G, aby ustabilizować tkankę do sekcji (Rycina 2A,D oraz Rycina 3A). Pracując pod mikroskopem sekcyjnym, oczyść i usuń tkankę tłuszczową jajnika oraz tkankę łączną, aby umożliwić wyraźną wizualizację jajowodu (Rycina 3B).</li>
</ol>
<img alt="Proces anatomii porównawczej, struktura macicy, poduszka tłuszczowa, jajowód, schemat, znakowanie histologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63168/63168fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Mikrodyssekcja jajowodu krok po kroku. Po usunięciu pozostałości tłuszczu i tkanki łącznej (A, B) należy dodać do tkanki błękit toluidyny (C), a następnie go wypłukać, aby ułatwić wizualizację, a w konsekwencji usunięcie jajnika i rozwinięcie rurki (D-H). Lejek jajowodu znajduje się obok proksymalnego odcinka szyjki oraz połączenia maciczno-jajowodowego (UTJ). Należy lekko pociągnąć dystalny koniec, przecinając kłyk jajowodu, aby rozwinąć i odsłonić naturalne zwoje jajowodu (H) w celu właściwej orientacji do segmentacji. Rysunek A-C pasek skali = 500 μm, D-H pasek skali = 400 μm (I) Schemat różnych segmentów (nie w skali). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63168/63168fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="5">
	<li>Za pomocą strzykawki 1 ml nanieść i inkubować jajowód przymocowany do macicy w 1-2 kroplach sterylnego 1% roztworu barwnika błękitu toluidyny przez 30 s – 1 min. Przepłukać zimnym buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) i usunąć cały płyn (Rysunek 3C).</li>
	<li>Delikatnie wyciągnij jajnik ze zwiniętego jajowodu, a następnie odetnij błonę kalotki i więzadło szerokie, aby oddzielić jajnik od jajowodu, nie uszkadzając tkanki jajowodu (Rysunek 3D,E). 
	UWAGA: Jajnik nie jest przytwierdzony do jajowodu, lecz wraz z jajowodem otoczony jest błoną kalikalną (Rycina 2D) i połączony z boczną stroną macicy poprzez wiązadło szerokie.</li>
</ol>
3. Mikrodyssekcja i segmentacja jajowodu
<ol>
	<li>Zlokalizuj dystalny, frędzlity koniec jajowodu, znajdujący się bocznie względem połączenia maciczno-jajowodowego (UTJ). Jajowód zwija się w spiralę, zatem koniec frędzlisty może znajdować się bocznie względem końca proksymalnego i stanowi odpowiedni punkt wyjścia do orientacji przy rozwijaniu jajowodu (Rysunek 3F,I).
	<ol>
		<li>Delikatnie pociągając za przewód, przetnij mesosalpinx (Rysunek 3I) za pomocą mikro-nożyczek sprężynowych, aby rozwinąć jajowód (Rysunek 3G).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po rozwinięciu przetnij przewód, aby wydzielić regiony lejka, ampuli i przesieki (Rysunek 3H).
	<ol>
		<li>Po wycięciu lejka (końca frędzlistego i proksymalnego szypułki), wycięcie regionu ampuli poprzez przecięcie przewodu po drugim wyraźnym zakręcie (przecięcie między zakrętem drugim a trzecim, na długości około 1 cm). Na koniec odetnij pozostałą część aż do UTJ, która stanowi region przesieki (Rysunek 3H). 
		UWAGA: Jajowód nie rozwinie się całkowicie w prostą strukturę. Przewód zachowa swoje zakręty (Rysunek 3H)3. Na podstawie kolejnych zakrętów następujących po regionie ampuli, można dalej podzielić pozostały odcinek przewodu na połączenie ampularno-przesiekowe oraz przesiekę3. Po wycięciu ampuli, przetnij odcinek między zakrętem piątym a szóstym, aby uzyskać połączenie ampularno-przesiekowe; pozostały fragment przewodu (od zakrętu szóstego do początku UTJ) to przesieka3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast zamroź zsekcjonowane fragmenty tkanki w ciekłym azocie w celu izolacji RNA lub utrwal i przetraktuj każdy segment do orientowanego zatapiania i analizy immunohistologicznej.
	<ol>
		<li>Jeśli planowana jest ekstrakcja RNA, dodaj do tkanki 200 μL zimnego odczynnika do ekstrakcji RNA oraz mieszankę kulek do homogenizacji w stosunku 1:1 (patrz Tabela materiałów) (patrz krok 5.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dysocjacja jajcowodu
<ol>
	<li>(Kontynuacja kroku 3.1.1 powyżej) Aby uzyskać optymalną dysocjację nabłonka, w możliwych miejscach należy naciąć jajowód (tj. w obrębie lejka i ampuli), aby odsłonić nabłonek światła (Rycina 4A).</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomii jajowodu, wycinek nabłonka; konfiguracja naczynia eksperymentalnego do analizy tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63168/63168fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Dysocjacja komórek jajowodu, część 1. Schemat pokazujący sposób odsłonięcia dystalnego nabłonka w celu optymalnej dysocjacji komórek (A) oraz obraz przedstawiający najprostszy sposób użycia analitycznego sita o oczkach 1 mm2 (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63168/63168fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="1" style="margin-left: 40px;">
	<li>Zaczynając od obszaru prątników, używając pęsety jako podparcia, naciąć rurkę wzdłuż za pomocą nożyczek sprężynowych.</li>
</ol>
<ol start="2">
	<li>Posiekaj rozcięte fragmenty oraz pozostałą część jajowodu na segmenty (o wielkości ok. 1-2 mm) i dodaj 5 ml ciepłego, nieenzymatycznego buforu do dysocjacji (patrz Tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Resuspender fragmenty tkanki i zdysocjowane komórki za pomocą pipety z gruszką co 3 min przez 9–10 min. Rozcieńczyć bufor do dysocjacji w stosunku 1:1 zimnym podłożem do sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać komórki poprzez wirowanie (350 x g, 3 min, 4 °C). Resuspenduj komórki w 2 ml buforu do lizy erytrocytów przez 2 min w temperaturze pokojowej, a następnie rozcieńcz w stosunku 1:1 zimnym medium do sekcji.</li>
	<li>Zebrać komórki poprzez wirowanie (350 x g, 3 min, 4 °C) i resuspendować w 5 ml zimnego roztworu pronazy.
	<ol>
		<li>Inkubować w medium do trawienia pronazą i resuspender agregaty komórkowe za pomocą pipety z gruszką co 3–5 min, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek (~25–30 min). 
		UWAGA: Ten etap najlepiej przeprowadzić w płytce lub kolbie do hodowli tkankowych, aby umożliwić stałą obserwację i zapobiec niepotrzebnej nadmiernej ekspozycji na pronazę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuść komórki przez sterylną makrositkę (siatkę o oczkach 1 mm x 1 mm przymocowaną gumką recepturką do probówki stożkowej (Rysunek 4B)) w celu usunięcia wszelkich pozostałych niezdysocjowanych fragmentów tkanki. Zebrać komórki poprzez wirowanie (350 x g, 3 min, 4 °C) i resuspender w zimnym medium odpowiednim do dalszych analiz (np. w buforze FACS, jeśli planowane jest barwienie do cytometrii przepływowej).</li>
</ol>
5. Ekstrakcja RNA z fragmentów jajowodu
<ol>
	<li>Homogenizować próbki zamrożone błyskawicznie w 200 µL odczynnika do ekstrakcji RNA w homogenizatorze tkankowym typu bead bullet blender na poziomie 12 przez dwa cykle (po 3 min każdy) w temperaturze 4 °C, używając mieszanki kulek ze stali nierdzewnej. 
	UWAGA: Aby zachować integralność RNA, próbki należy niezwłocznie przenieść ze stanu zamrożenia błyskawicznego do odczynnika do ekstrakcji RNA i nie ważyć ich.</li>
	<li>Krótko wirować homogenizat przy 100-200 x g w wirówce stołowej przez około 5 s w temperaturze pokojowej, aby oddzielić ciecz od kulek. Przenieść nadsącz do nowej probówki.</li>
	<li>Dodać kolejne 200 µL odczynnika do ekstrakcji RNA do kulek w celu odzyskania pozostałej części próbki, a następnie odwirować (100-200 x g, 5 s, temperatura pokojowa). Połączyć nadsącze. 
	UWAGA: Użyć wąskiego końcówki do pipety (odpowiednie są większość końcówek p200), aby zapobiec przeniesieniu kulek podczas pobierania nadsączu.</li>
	<li>Postępować zgodnie z wytycznymi producenta w celu rozdzielenia faz i wytrącenia RNA. Reprezentatywne próbki wytrącano przez noc w temperaturze -20 °C przy użyciu 100% izopropanolu (stosunek objętości izopropanol: odzyskana faza wodna wynosił około 2:1).</li>
	<li>Przenieść cały osad RNA wraz z roztworem do kolumny wiążącej RNA i wirować przez 30 s przy 9 500 x g. Oczyścić RNA na kolumnie zgodnie z wytycznymi producenta, a następnie eluować RNA do 20 µL wody wolnej od nukleaz. Ocenić jakość i ilość za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru i/lub bioanalizatora.</li>
</ol>

<ol><li>Stewart, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+CA+%22Mouse+oviduct+developmemt+in+Mouse+Development%3A+From+Oocyte+to+Stem+Cells%22">Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells</a>. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).</li>
<li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677(2021).</li>
<li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li>
<li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Zoologica%22%5BJournal%5D)">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1(1927).</li>
<li>Pulkkinen, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviductal+function+is+critical+for+very+early+human+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oviductal function is critical for very early human life.</a> Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).</li>
<li>Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepithelial+carcinoma+of+the+fimbria+and+pelvic+serous+carcinoma%3A+Evidence+for+a+causal+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship.</a> American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).</li>
<li>Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genetic+cell+lineage+tracing+reveals+that+oviductal+secretory+cells+self-renew+and+give+rise+to+ciliated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells.</a> Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-grade+serous+ovarian+cancer+arises+from+fallopian+tube+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).</li>
<li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca%3BTp53%3BPten+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li>
<li>Sherman-Baust, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li>
<li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li>
<li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li>
<li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+prolactin+receptor+%28PRLR%29+in+mouse+and+human+fallopian+tubes%3A+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li>
<li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li>
<li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102(2015).</li>
<li>Lõhmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660(2020).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298(2017).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565(2010).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).</li>
<li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Trzy segmenty jajowodu są histologicznie, morfologicznie i funkcjonalnie odrębne 1,2,3. Nabłonek różni się znacznie od jednego końca jajowodu do drugiego. Komórki rzęskowe dominują na końcu fimbrialnym/lejkowatym, podczas gdy komórki wydzielnicze dominują w obszarze przesmyku1. Chociaż ten ogólny gradient jest znany od jakiegoś czasu, ostatnie prace ujawniły więcej różnic między segmentami jajowodów. Tak ...

Mysi jajowód jest podobny pod względem funkcji i morfologii do ludzkiego jajowodu1. Oba składają się z pseudostratyfikowanego nabłonka rzęskowego, składającego się z dwóch historycznie opisanych komórek rezydujących w nabłonku: komórek rzęskowych i komórek wydzielniczych1,2. Jajowód ma trzy klasycznie rozpoznane segmenty: lejek, bańkę i przesmyk. W niedawnym badaniu Harwalkar i wsp.3 badał morfologię jajowodów i ekspresję genów, co doprowadziło do rozszerzenia kategoryzacji rezydentnych komórek nabłonkowych na siedem odrębnych populacji. Ponadto ustalili połączenie ampułkowo-przesmykowe jako odrębny segment oviduct3. Opisana tutaj metoda, która koncentruje się na lejku, bańce i przesmyku, może być łatwo rozszerzona o połączenie ampułkowo-przesmykowe2,3. Obszar lejkowy zawiera ujście lub otwór jajowodu i obejmuje obszar fimbrialny, a także bliższą łodygę. Poruszając się w kierunku macicy, następnie jest bańka, a następnie przesmyk. Komórki rzęskowe są najbardziej widoczne na dystalnym końcu regionu, proksymalnym do jajnika lub lejka, podczas gdy komórki wydzielnicze są najbardziej widoczne w bliższym końcu lub segmencie przesmyku1. W przeciwieństwie do ludzkiego jajowodu, mysi jajowód jest zwiniętą strukturą podtrzymywaną przez mesosalpinx, przedłużenie szerokiego więzadła otrzewnej1,4. Ponadto jajowód myszy jest zamknięty w worku kaletkowym, który zwiększa prawdopodobieństwo transferu oocytów do jajowodu4. Bańka jest identyfikowana jako miejsce zapłodnienia, z którego rozwijające się zarodki przechodzą do przesmyku przed wejściem do macicy5. Segmenty jajowodów mają średnicę 200-400 μm, a dłuższe obszary ampułki i przesmyku mają około 0,5-1,0 cm długości4. Janowód rozszerza się podczas cyklu rujowego, a bańka i lejek są bardziej rozciągliwe niż przesmyk1.
Nadmierna proliferacja komórek, zwłaszcza komórek wydzielniczych, charakteryzuje zmiany prekursorowe do surowiczych guzów znajdujących się w jamie miednicy6. Te prekursorowe surowicze zmiany śródnabłonkowe powstają w nabłonku jajowodu wyłącznie w okolicy fimbulicznej; Nie wiadomo, dlaczego tworzenie zmian jest ograniczone do tego regionu, w którym zwykle dominującym typem komórek jest orzęsiony, a nie wydzielniczy2,7,8. Regionalność pod względem prawidłowych funkcji fizjologicznych, a także zwiększone zainteresowanie jajowodowym pochodzeniem raka jajnika9,10,11,12,13, podkreśla znaczenie oddzielnej oceny segmentów jajowodu.
Opisana tutaj metoda szczegółowo opisuje zbiór oddzielnych segmentów jajowodów do późniejszych analiz ekspresji genów specyficznych dla segmentu i funkcji zdysocjowanych komórek. Tradycyjnie, wiele tkanek jest przetwarzanych w celu ekstrakcji całego RNA metodą fenolu: chloroformu lub metodą pełnej ekstrakcji na kolumnie; Stwierdziliśmy jednak, że jakość RNA została utrzymana przy jednoczesnym uzyskaniu wystarczającej wydajności przy użyciu opisanej metody łączenia. Korzystając z tej metody, bardzo małe funkcjonalne segmenty jajowodu mogą być przetwarzane do dalszych analiz, zamiast badać jajowód jako całość, co może maskować wyniki reprezentatywne dla różnych segmentów14.
Zdysocjowane mysie komórki jajowodowe rzadko były badane za pomocą cytometrii przepływowej, najprawdopodobniej z powodu ograniczenia wydajności komórek z tej tkanki. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu była dysocjacja komórek, hodowanie ich w hodowli, a następnie stymulowanie ponownego różnicowania in vitro w celu uzyskania odpowiedniej liczby komórek do dalszej analizy komórek15,16,17,18. Ograniczeniem tego podejścia jest czas ex vivo i zmienione mikrośrodowisko w hodowli, które prawdopodobnie zmieniają ekspresję genów. Istnieje również założenie, że redyferencjacja morfologiczna ma taką samą sygnaturę transkrypcyjną i proteomiczną, jaka była obecna u nienaruszonego zwierzęcia. Obecna metoda dysocjacji została zaprojektowana w celu uzyskania jak największej liczby komórek nabłonkowych w heterogenicznej populacji komórek jajowodowych przy zachowaniu różnicowania pojedynczych komórek. Co więcej, podejście w większości nieenzymatyczne prawdopodobnie ogranicza utratę białek powierzchniowych komórek.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Mieszanka kulek ze stali nierdzewnej</td><td>Next Advance</td><td>SSB05</td><td>Mix 1:1 z 1,4 mm SSB14B, sterylizowana</td></tr><tr><td>1,4 mm Mieszanka kulek ze stali nierdzewnej</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td>Mix 1:1 z 0,5 mm SSB05, sterylizowana</td></tr><tr><td>1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7,4 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td>Zimna, sterylna</td></tr><tr><td>igła 25G</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne szalki Petriego 60 mm</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m siatki komórkowe</td><td>Fisherbrand</td><td>22-636-548</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Eukariont Total RNA 6000 Pico Chip kit</td><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bullet Blender Homogenizator tkankowy</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Bioanlyzer</td><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Zimno talerz/opakowanie/powierzchnia do wyboru</td><td>NIE DOTYCZY</td><td></td><td>Utrzymywane w temperaturze -20 &#176; C do preparacji</td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny</td><td>Polysciences Inc.</td><td>403</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)/ Szynka" s F12</td><td>Corning</td><td>10-090-CV</td><td>Przygotować podłoże preparacyjne: DMEM/ Szynka" s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Corning</td><td>35-015CV</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste do wyboru</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G712b</td><td>Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne</td></tr><tr><td>Koza anty-mysie IgG Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td>Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne</td></tr><tr><td>Koza anty-królicza IgG Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>4082S</td><td>Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop złożony</td><td>Keyence BZ-X700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-mysia Occludin</td><td>Invitrogen</td><td>33-1500</td><td>Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne</td></tr><tr><td>Nieenzymatyczny bufor dysocjacyjny</td><td>N/A</td><td></td><td>5 mM EDTA, 1 g/L glukozy, 0,4% BSA, 1X DPBS</td></tr><tr><td>Nylonowa makrosiatka 1 mm x 1 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>1210U04</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6148</td><td>Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>MP Biomedicals</td><td>10220-718</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblakowy Prolong</td><td>Gold Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>9071S</td><td>Obrazy walidacji immunocytochemicznej: pożywka do montażu zapobiegającego blaknięciu</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td>Przygotuj pożywkę do trawienia pronazy: 0,15% pronazy w DMEM / Ham's F12, sterylne</td></tr><tr><td>jodek propidyny</td><td>Roche</td><td>11 348 639 001</td><td>Obrazy walidacji żywotności</td></tr><tr><td>Królik anty-mysi Acetylowana-tubulina</td><td>Abcam</td><td>ab179484</td><td>Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne</td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Służy do oczyszczania na kolumnie w tekście</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikrodysekcji w formie sprężyny</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5610</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety gruszkowe 3 ml</td><td>Globe Scientific</td><td>137135</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>J66015</td><td>Przygotuj roztwór błękitu toluidynowego: 1% w 1X DPBS, sterylne</td></tr><tr><td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne; 0,1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1% Tween 20</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Mallinckrodt Inc.</td><td>3555</td><td>Immunocytochemiczne obrazy walidacyjne</td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji RNA Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Określany jako odczynnik do ekstrakcji RNA. Woda wolna od nucelazy, chloroform i izoproponal są wymagane jako uzupełnienie ekstrakcji Trizol zgodnie z wytycznymi producenta</td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Systemy modeli mysich nie mają sobie równych w analizie procesów chorobowych ze względu na ich genetyczną podatność na manipulację i niski koszt eksperymentalnych terapii. Jednak ze względu na ich mały rozmiar ciała, niektóre struktury, takie jak jajowód o średnicy 200-400 μm, okazały się stosunkowo trudne do zbadania z wyjątkiem immunohistochemii. Ostatnio badania immunohistochemiczne ujawniły bardziej złożone różnice w segmentach jajowodów, niż wcześniej sądzono; W ten sposób jajowód jest podzielony na cztery funkcjonalne segmenty o różnych proporcjach siedmiu różnych typów komórek nabłonkowych. Różne pochodzenie embriologiczne i proporcje typów komórek nabłonkowych prawdopodobnie sprawiają, że te cztery regiony funkcjonalne są w różny sposób podatne na choroby. Na przykład zmiany prekursorowe surowiczych raków śródnabłonkowych powstają z lejka w modelach mysich i z odpowiedniego regionu fimbrialnego w ludzkim jajowodzie. Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje metodę mikrodysekcji w celu podzielenia jajowodu w taki sposób, aby uzyskać wystarczającą ilość i czystość RNA niezbędną do dalszej analizy, takiej jak PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) i sekwencjonowanie RNA (RNAseq). Opisano również w większości nieenzymatyczną metodę dysocjacji tkanek odpowiednią do cytometrii przepływowej lub analizy RNAseq pojedynczej komórki w pełni zróżnicowanych komórek jajowodowych. Opisane metody ułatwią dalsze badania z wykorzystaniem mysiego jajowodu w dziedzinie rozrodu, płodności, nowotworów i immunologii.

Opisany protokół dysocjacji pozwala na uzyskanie od 100 000 do 120 000 komórek z jednej myszy przy łączeniu obu jajowodów. Metoda ta jest na tyle łagodna, że pozostawia nienaruszone brzegi komórek wielorzęskowych, co umożliwia rozróżnienie komórek wielorzęskowych od komórek wydzielniczych oraz potwierdza, że metoda trawienia jest wystarczająco delikatna, aby zapobiec dedyferencjacji. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne na Rysunku 5 pokazują małe skupiska komórek po kroku 4.2.1, utrw...

Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

Różne segmenty jajowodu mają różne funkcje fizjologiczne i są różnie podatne na zmiany patologiczne. Identyfikacja różnych segmentów w bardzo małym jajowodzie myszy jest trudna, podobnie jak produkcja dobrej wydajności dobrze zróżnicowanych komórek poprzez dysocjację tkanek. W tym filmie pokażemy, jak rozwinąć jajowód myszy, rozpoznać różne segmenty, aby można je było analizować indywidualnie, i wreszcie, jak uzyskać stosunkowo wysoką wydajność zróżnicowanych zdysocjowanych komórek.Lepsze zrozumienie środowiska specyficznego dla bańki może poprawić techniki zapłodnienia in vitro. Ponadto, porównując lejek z innymi segmentami, możemy lepiej zrozumieć skłonność infundibulum do złośliwej transformacji. Procedura dysocjacji pojedynczych komórek uwalnia komórki zrębu, a także nabłonkowe z jajowodu.Nasza metoda daje również możliwość oddzielnej analizy wkładu komórek układu odpornościowego, mięśni gładkich i komórek nabłonka w fizjologię i patologię jajowodu. Praca pod mikroskopem preparacyjnym może być na początku trudna. Radziłbym ćwiczyć z większą rurką, taką jak macica, aby upewnić się, że twoje narzędzia są odpowiednie do mikrodysekcji jajowodu.Zacznij od przyklejenia kawałka wosku

microdissection-dissociation-murine-oviduct-individual-segment

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Opisany tutaj jest protokół do izolowania i analizy naciekających leukocytów tkanek na styku matki i płodu (macica, decidua i łożysko) myszy. Protokół ten zachowuje integralność większości markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych komórek do dalszych zastosowań, w tym analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.

Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Ten protokół opisuje wspomaganą transiluminacją mikrodysekcję segmentów kanalików nasiennych dorosłych myszy reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasienia i typy komórek w nim, a następnie barwienie immunologiczne preparatów dyni i nienaruszonych segmentów kanalików.

Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mysich mezenchymów jelitowych, w tym telocytów. Mogą one być wykorzystywane do kilku zastosowań, takich jak współhodowla z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, w celu wsparcia wzrostu i lepszego odzwierciedlenia sytuacji w oryginalnej tkance.

Izolacja mysiej mezenchymy jelitowej skutkująca wysoką wydajnością telocytów

Ten protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek ludzkich i mysich guzów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

Naucz się mikrodysekcji i dysocjacji mysiego jajowodu, aby identyfikować poszczególne segmenty i izolować pojedyncze komórki. Ta metoda umożliwia analizę RNA i badań komórkowych w biologii rozrodu.

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów