Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

Różne segmenty jajowodu mają różne funkcje fizjologiczne i są różnie podatne na zmiany patologiczne. Identyfikacja różnych segmentów w bardzo małym jajowodzie myszy jest trudna, podobnie jak produkcja dobrej wydajności dobrze zróżnicowanych komórek poprzez dysocjację tkanek. W tym filmie pokażemy, jak rozwinąć jajowód myszy, rozpoznać różne segmenty, aby można je było analizować indywidualnie, i wreszcie, jak uzyskać stosunkowo wysoką wydajność zróżnicowanych zdysocjowanych komórek.

Lepsze zrozumienie środowiska specyficznego dla bańki może poprawić techniki zapłodnienia in vitro. Ponadto, porównując lejek z innymi segmentami, możemy lepiej zrozumieć skłonność infundibulum do złośliwej transformacji. Procedura dysocjacji pojedynczych komórek uwalnia komórki zrębu, a także nabłonkowe z jajowodu.

Nasza metoda daje również możliwość oddzielnej analizy wkładu komórek układu odpornościowego, mięśni gładkich i komórek nabłonka w fizjologię i patologię jajowodu. Praca pod mikroskopem preparacyjnym może być na początku trudna. Radziłbym ćwiczyć z większą rurką, taką jak macica, aby upewnić się, że twoje narzędzia są odpowiednie do mikrodysekcji jajowodu.

Zacznij od przyklejenia kawałka wosku dentystycznego do szalki Petriego za pomocą kleju i pozostawienia go do wyschnięcia. Następnie zdezynfekuj naczynie 70% etanolem. Powierzchnia jest teraz gotowa do sekcji.

Unieruchomić szalkę Petriego zawierającą wosk dentystyczny na zimnej platformie pod mikroskopem preparacyjnym, gdy jest gotowa do sekcji. Zdezynfekuj powierzchnię brzuszną zwierzęcia 70% etanolem. Następnie otwórz jamę brzuszną i miednicę sterylnymi nożyczkami do preparacji.

Przesuń przewód pokarmowy na bok, aby zlokalizować grzbietową macicę dwurogową. Podążaj za każdym rogiem macicy rostralnie, aby zlokalizować każdy jajowód i jajnik, które są otoczone poduszeczką tłuszczową macicy tuż pod nerką. Następnie wytnij oba boczne jajowody z jajnikami i część dystalnego rogu macicy, nadal przyczepioną za pomocą nożyczek do preparacji.

Przetnij każdy boczny róg macicy z około jednym do dwóch centymetrów rogu nadal przymocowanego do zwiniętego jajowodu i jajnika. Natychmiast zanurz tkankę w dwóch mililitrach zimnego podłoża preparacyjnego, a następnie przymocuj tkankę macicy do wosku dentystycznego za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 25, aby zabezpieczyć tkankę do wycięcia. Oczyść i wypreparuj poduszeczkę tłuszczową jajnika i tkankę łączną, aby wyraźnie uwidocznić jajowód.

Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby dozować jedną lub dwie krople sterylnego roztworu 1% niebieskiego barwnika toluidyny i inkubować przez 30 sekund do jednej minuty. Spłucz zimnym DPBS, a następnie usuń cały płyn. Lekko wyciągnij jajnik ze zwiniętego jajowodu.

Przeciąć błonę kaletki w szerokim więzadle, aby usunąć jajnik z jajowodu bez naruszania tkanki jajowodów. Zlokalizuj dystalny koniec fimbrii jajowodu znajdujący się po stronie połączenia jajowodów macicy. Delikatnie pociągnij rurkę i odetnij mesosalpinx mikronożyczkami, aby rozwinąć jajowód.

Przetnij rurkę, aby wytworzyć obszar lejka. Następnie wytnij obszar ampułki, przecinając między zwojami drugim i trzecim. Na koniec odetnij pozostałą część do połączenia jajowodów macicy, które jest obszarem przesmyku.

Natychmiast zamroź wypreparowane segmenty tkanki w ciekłym azocie, a następnie dodaj 200 mikrolitrów zimnego odczynnika do ekstrakcji RNA i mieszanki kulek homogenizacyjnych jeden do jednego do tkanki w celu izolacji RNA. Zaczynając od okolicy fimbrialnej, rozetnij rurkę wzdłużnie nożyczkami i użyj kleszczy jako dźwigni, aby odsłonić nabłonek światła. Zmiel rozcięte otwarte części i pozostały jajowód na około jedno- lub dwumilimetrowe segmenty.

Następnie dodaj pięć mililitrów ciepłego nieenzymatycznego buforu dysocjacyjnego do tkanki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pokazano tutaj obrazy fluorescencyjne i kontrastowe klastra komórkowego dodatniego dla okludyny, jąder i acetylowanej tubuliny. Czerwony oznacza okludynę, niebieski oznacza jądra, a zielony oznacza acetylowaną tubulinę.

Rzęskowata granica wierzchołkowa pozostaje nienaruszona przez cały protokół i wytrzymuje dalsze trawienie do pojedynczych komórek. Na tych reprezentatywnych obrazach pokazane są scalone, czerwone, niebieskie, kontrast fazowy i zielony kanały. Po krótkiej inkubacji pronazy większość komórek jest pojedyncza.

Barwienie jodkiem propidyny wykazuje około 93% żywotności w Brightfield, dodatnim PI kanału czerwonego i łączeniu. Wstawka po scaleniu pokazuje nienaruszoną obramowanie rzęskowe na pojedynczej zdysocjowanej komórce. Takie komórki mają aktywnie bijące rzęski.

Całe RNA oceniano pod kątem wydajności i jakości za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i bioanalizatora. Wyniki pokazują, że metoda ta daje od 800 do 1 200 nanogramów RNA na segment, z wyjątkiem próbek lejkowych, w przypadku których może być konieczne połączenie dwóch zwierząt w celu uzyskania odpowiedniej wydajności do dalszych testów. Przedstawione wyniki dla infundibulum zostały zebrane od dwóch zwierząt, w sumie z czterech regionów lejka.

Protokół ten z powodzeniem pozwala uzyskać czyste RNA analizowane za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i bioanalizatora. Próbki mają współczynnik absorpcji 260 na 280 nanometrów między 1,8 a 2, typowy dla czystych gatunków nukleotydów RNA. Bioanaliza próbek wykazała wysoką integralność RNA z ocenioną liczbą integralności RNA powyżej siedmiu, odpowiednią do dalszej ekspresji i analizy sekwencjonowania.

Pamiętaj, aby zachować od jednego do dwóch centymetrów rogu macicy, aby przymocować układ jajowodowy do platformy preparcyjnej. Ponadto zastosowanie niebieskiego barwnika toluidynowego pomaga w szybkim rozwijaniu jajowodu. Im szybsze rozwijanie, tym lepsza konserwacja i najmniejsza degradacja RNA.

Metoda ta jest wystarczająca do otrzymania RNA o odpowiedniej jakości do sekwencjonowania RNA umożliwiającego sekwencjonowanie pojedynczych segmentów. Dysocjacja komórek jest odpowiednia do sekwencjonowania pojedynczych komórek lub cytometrii przepływowej, co pozwala na bardziej precyzyjną analizę segmentów i komórek. Metoda ta pomoże przenieść tę dziedzinę poza analizę całej rurki, która maskuje różnice na poziomie segmentu lub pojedynczej komórki.