Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek
4 listopada 2021
Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.
Różne segmenty jajowodu mają różne funkcje fizjologiczne i są różnie podatne na zmiany patologiczne. Identyfikacja różnych segmentów w bardzo małym jajowodzie myszy jest trudna, podobnie jak produkcja dobrej wydajności dobrze zróżnicowanych komórek poprzez dysocjację tkanek. W tym filmie pokażemy, jak rozwinąć jajowód myszy, rozpoznać różne segmenty, aby można je było analizować indywidualnie, i wreszcie, jak uzyskać stosunkowo wysoką wydajność zróżnicowanych zdysocjowanych komórek.
Lepsze zrozumienie środowiska specyficznego dla bańki może poprawić techniki zapłodnienia in vitro. Ponadto, porównując lejek z innymi segmentami, możemy lepiej zrozumieć skłonność infundibulum do złośliwej transformacji. Procedura dysocjacji pojedynczych komórek uwalnia komórki zrębu, a także nabłonkowe z jajowodu.
Nasza metoda daje również możliwość oddzielnej analizy wkładu komórek układu odpornościowego, mięśni gładkich i komórek nabłonka w fizjologię i patologię jajowodu. Praca pod mikroskopem preparacyjnym może być na początku trudna. Radziłbym ćwiczyć z większą rurką, taką jak macica, aby upewnić się, że twoje narzędzia są odpowiednie do mikrodysekcji jajowodu.
Zacznij od przyklejenia kawałka wosku dentystycznego do szalki Petriego za pomocą kleju i pozostawienia go do wyschnięcia. Następnie zdezynfekuj naczynie 70% etanolem. Powierzchnia jest teraz gotowa do sekcji.
Unieruchomić szalkę Petriego zawierającą wosk dentystyczny na zimnej platformie pod mikroskopem preparacyjnym, gdy jest gotowa do sekcji. Zdezynfekuj powierzchnię brzuszną zwierzęcia 70% etanolem. Następnie otwórz jamę brzuszną i miednicę sterylnymi nożyczkami do preparacji.
Przesuń przewód pokarmowy na bok, aby zlokalizować grzbietową macicę dwurogową. Podążaj za każdym rogiem macicy rostralnie, aby zlokalizować każdy jajowód i jajnik, które są otoczone poduszeczką tłuszczową macicy tuż pod nerką. Następnie wytnij oba boczne jajowody z jajnikami i część dystalnego rogu macicy, nadal przyczepioną za pomocą nożyczek do preparacji.
Przetnij każdy boczny róg macicy z około jednym do dwóch centymetrów rogu nadal przymocowanego do zwiniętego jajowodu i jajnika. Natychmiast zanurz tkankę w dwóch mililitrach zimnego podłoża preparacyjnego, a następnie przymocuj tkankę macicy do wosku dentystycznego za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 25, aby zabezpieczyć tkankę do wycięcia. Oczyść i wypreparuj poduszeczkę tłuszczową jajnika i tkankę łączną, aby wyraźnie uwidocznić jajowód.
Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby dozować jedną lub dwie krople sterylnego roztworu 1% niebieskiego barwnika toluidyny i inkubować przez 30 sekund do jednej minuty. Spłucz zimnym DPBS, a następnie usuń cały płyn. Lekko wyciągnij jajnik ze zwiniętego jajowodu.
Przeciąć błonę kaletki w szerokim więzadle, aby usunąć jajnik z jajowodu bez naruszania tkanki jajowodów. Zlokalizuj dystalny koniec fimbrii jajowodu znajdujący się po stronie połączenia jajowodów macicy. Delikatnie pociągnij rurkę i odetnij mesosalpinx mikronożyczkami, aby rozwinąć jajowód.
Przetnij rurkę, aby wytworzyć obszar lejka. Następnie wytnij obszar ampułki, przecinając między zwojami drugim i trzecim. Na koniec odetnij pozostałą część do połączenia jajowodów macicy, które jest obszarem przesmyku.
Natychmiast zamroź wypreparowane segmenty tkanki w ciekłym azocie, a następnie dodaj 200 mikrolitrów zimnego odczynnika do ekstrakcji RNA i mieszanki kulek homogenizacyjnych jeden do jednego do tkanki w celu izolacji RNA. Zaczynając od okolicy fimbrialnej, rozetnij rurkę wzdłużnie nożyczkami i użyj kleszczy jako dźwigni, aby odsłonić nabłonek światła. Zmiel rozcięte otwarte części i pozostały jajowód na około jedno- lub dwumilimetrowe segmenty.
Następnie dodaj pięć mililitrów ciepłego nieenzymatycznego buforu dysocjacyjnego do tkanki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pokazano tutaj obrazy fluorescencyjne i kontrastowe klastra komórkowego dodatniego dla okludyny, jąder i acetylowanej tubuliny. Czerwony oznacza okludynę, niebieski oznacza jądra, a zielony oznacza acetylowaną tubulinę.
Rzęskowata granica wierzchołkowa pozostaje nienaruszona przez cały protokół i wytrzymuje dalsze trawienie do pojedynczych komórek. Na tych reprezentatywnych obrazach pokazane są scalone, czerwone, niebieskie, kontrast fazowy i zielony kanały. Po krótkiej inkubacji pronazy większość komórek jest pojedyncza.
Barwienie jodkiem propidyny wykazuje około 93% żywotności w Brightfield, dodatnim PI kanału czerwonego i łączeniu. Wstawka po scaleniu pokazuje nienaruszoną obramowanie rzęskowe na pojedynczej zdysocjowanej komórce. Takie komórki mają aktywnie bijące rzęski.
Całe RNA oceniano pod kątem wydajności i jakości za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i bioanalizatora. Wyniki pokazują, że metoda ta daje od 800 do 1 200 nanogramów RNA na segment, z wyjątkiem próbek lejkowych, w przypadku których może być konieczne połączenie dwóch zwierząt w celu uzyskania odpowiedniej wydajności do dalszych testów. Przedstawione wyniki dla infundibulum zostały zebrane od dwóch zwierząt, w sumie z czterech regionów lejka.
Protokół ten z powodzeniem pozwala uzyskać czyste RNA analizowane za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i bioanalizatora. Próbki mają współczynnik absorpcji 260 na 280 nanometrów między 1,8 a 2, typowy dla czystych gatunków nukleotydów RNA. Bioanaliza próbek wykazała wysoką integralność RNA z ocenioną liczbą integralności RNA powyżej siedmiu, odpowiednią do dalszej ekspresji i analizy sekwencjonowania.
Pamiętaj, aby zachować od jednego do dwóch centymetrów rogu macicy, aby przymocować układ jajowodowy do platformy preparcyjnej. Ponadto zastosowanie niebieskiego barwnika toluidynowego pomaga w szybkim rozwijaniu jajowodu. Im szybsze rozwijanie, tym lepsza konserwacja i najmniejsza degradacja RNA.
Metoda ta jest wystarczająca do otrzymania RNA o odpowiedniej jakości do sekwencjonowania RNA umożliwiającego sekwencjonowanie pojedynczych segmentów. Dysocjacja komórek jest odpowiednia do sekwencjonowania pojedynczych komórek lub cytometrii przepływowej, co pozwala na bardziej precyzyjną analizę segmentów i komórek. Metoda ta pomoże przenieść tę dziedzinę poza analizę całej rurki, która maskuje różnice na poziomie segmentu lub pojedynczej komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, umożliwiającą pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Opisano w nim również nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodu, odpowiednią do analizy genów i białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozrodu
Wstęp
- Różne segmenty jajowodu pełnią unikalne funkcje fizjologiczne.
- Segmenty te różnią się podatnością na zmiany patologiczne.
- Identyfikacja segmentów w małych jajowodach mysich jest trudna.
- Uzyskanie dobrze zróżnicowanych komórek poprzez dysocjację tkanki jest trudne.
Cel badania
- W celu zademonstrowania rozwijania jajowodu myszy.
- W celu zidentyfikowania i przeanalizowania poszczególnych segmentów jajowodu indywidualnie.
- W celu pogłębienia wiedzy na temat środowiska kąpieli jajowodu w celu usprawnienia technik IVF.
Zastosowane metody
- Mikrodysekcja jajowodu mysiego.
- Identyfikacja poszczególnych segmentów jajowodu.
- Dysocjacja komórek jajowodu metodą nieenzymatyczną.
- Analiza komórek zrębowych i nabłonkowych.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja poszczególnych segmentów jajowodu.
- Uzyskanie wysokiej wydajności zróżnicowanych komórek dysocjowanych.
- Wnioski dotyczące roli lejka jajowodu w transformacji nowotworowej.
- Potencjalne ulepszenia technik zapłodnienia in vitro.
Wnioski
- Przedstawione metody ułatwiają szczegółową analizę segmentów jajowodu.
- Zrozumienie funkcji specyficznych dla poszczególnych segmentów może usprawnić badania nad reprodukcją.
- Przyszłe badania mogą skupić się na implikacjach dla leczenia niepłodności.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda umożliwia precyzyjną analizę molekularną i komórkową jajowodu mysiego, pokonując bariery techniczne wynikające z jego niewielkiego rozmiaru i złożonej anatomii. Wspiera ona walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w biologii rozrodu, onkologii i immunologii, pozwalając na specyficzną dla poszczególnych segmentów analizę procesów fizjologicznych i patologicznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez zachowanie integralności RNA i uzyskanie żywotnych, zróżnicowanych pojedynczych komórek do dalszych zastosowań, takich jak RT-qPCR, RNAseq i cytometria przepływowa.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznych dla segmentu funkcji fizjologicznych oraz różnicowej podatności na zmiany patologiczne, takie jak transformacja złośliwa w lejku jajowodu.
- Wartość operacyjna: Pozwala na uzyskanie czystego RNA w ilości 800–1,200 ng na segment, co jest wystarczające do analiz RT-qPCR i RNAseq, wspierając wiarygodne procesy walidacji celów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych analiz poprzez izolację w pełni zróżnicowanych komórek jajowodu z nienaruszonymi rzęskami i wysoką żywotnością (około 93%).
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje głównie nieenzymatyczny bufor dysocjacyjny, który zachowuje integralność komórek, umożliwiając powtarzalną izolację pojedynczych komórek do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (single-cell RNAseq).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera analizę systemową istotną dla badania chorób, umożliwiając oddzielną ocenę wkładu komórek odpornościowych, mięśni gładkich oraz nabłonkowych w fizjologię i patologię jajowodu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, dostarczając danych molekularnych i komórkowych w rozdzielczości segmentowej, zgodnych z pochodzeniem embriologicznym i proporcjami typów komórek nabłonkowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje proces odkrywczy, od wczesnej biologii po identyfikację związków wiodących, umożliwiając weryfikację hipotez na poziomie segmentów jajowodu oraz wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez precyzyjne przygotowanie systemów biologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie indywidualnej analizy czterech funkcjonalnych segmentów jajowodu o odmiennych proporcjach typów komórek nabłonkowych.
- Przesiewy: Umożliwia przygotowanie do analizy dzięki standaryzowanej dysocjacji, która dostarcza żywe, zróżnicowane komórki odpowiednie do analizy ilościowej w platformach przesiewowych.
- Analityka: Dostarcza wysokiej jakości RNA (RIN >7) oraz mierzalne wyniki z pojedynczych komórek, co pozwala na porównanie warunków w różnych segmentach i typach komórek.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie analizy podatności na choroby specyficznej dla segmentów, takich jak zmiany prekursorowe pochodzące z lejka jajowodu w obrębie surowiczych raków wewnątrznabłonkowych.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy powtarzalną możliwość prowadzenia badań nad jajowodem w ramach programów dotyczących rozrodu, płodności, nowotworów i immunologii, zmniejszając zależność od analizy całego przewodu, która maskuje różnice na poziomie poszczególnych segmentów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej dzięki walidacji celów specyficznych dla poszczególnych segmentów oraz redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w złożonych systemach tkankowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zdefiniowanemu protokołowi mikrodysekcji i dysocjacji, który minimalizuje degradację RNA.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnemu wykrywaniu podatności patologicznych specyficznych dla danego segmentu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, oparte na wglądach mechanistycznych uzyskanych z poszczególnych segmentów jajowodu oraz populacji komórek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikroskopowej dyssekcji i obchodzeniu się z tkankami; zaleca się przeprowadzenie wstępnych ćwiczeń na większych strukturach, takich jak macica.
- Wymagane oprzyrządowanie obejmuje mikroskopy do dyssekcji, mikro-nożyczki sprężynowe, igły 25G oraz sprzęt do ekstrakcji RNA i analizy komórkowej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie czasu dyssekcji, barwienia błękitem toluidyny oraz obchodzenia się z tkankami w niskiej temperaturze, aby zapewnić spójność wyników między użytkownikami i eksperymentami.
- Uwzględnia kwestie adaptacji do różnych systemów modelowych, ponieważ protokół jest zoptymalizowany pod kątem wymiarów jajowodu mysiego (średnica 200–400 μm).
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność łączenia próbek z lejków jajowodów od dwóch zwierząt w celu uzyskania wystarczającej ilości RNA do dalszych analiz.
