Preparatyka biologiczna i technika mechaniczna do określania właściwości lepkosprężystych włókien strefowych

Znaczenie naszej metody polega na tym, że jest ona w stanie odpowiedzieć na pytanie, jakie są właściwości lepkosprężyste włókien strefowych, włókien, które zawieszają soczewkę wewnątrz oka? Główną zaletą naszej techniki jest to, że może ona określić ilościowo właściwości lepkosprężyste małych i delikatnych włókien strefowych od myszy z celowanymi modyfikacjami genów i bez nich. Mutacje w genach kodujących białka mikrofibrylne leżą u podstaw kilku dziedzicznych stanów syndromicznych.

Korzystając z naszej techniki, możemy zbadać, w jaki sposób określone mutacje zmieniają właściwości biomechaniczne mikrofibryli. Aby rozpocząć, po eutanazji myszy, usuń oczy za pomocą cienkich kleszczy. Włóż końcówkę igły do fiksacji przez ścianę oka i umieść ją w środku ciała szklistego, uważając, aby nie uszkodzić soczewki.

Ostrożnie przenieś nabite oko do probówki wypełnionej 4% paraformaldehydem i solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Otworzyć zawór łączący igłę z ustabilizowanym zbiornikiem umieszczonym 25 centymetrów nad próbką, który utrzymuje nadciśnienie równoważne 15 do 20 milimetrom rtęci w oku w okresie utrwalania i pozostawić próbkę do utrwalenia na noc. Następnego dnia wyjmij igłę utrwalającą i przemywaj oko przez 10 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.

Używając okulistycznych nożyczek chirurgicznych i mikroskopu stereoskopowego, wykonaj nacięcie pełnej grubości w ścianie oka w pobliżu głowy nerwu wzrokowego. Rozciągnij cięcie do przodu w kierunku równika, a następnie wokół równikowego obwodu oka, ostrożnie oszczędzając delikatne wyrostki rzęskowe i związane z nimi włókna strefowe. Odsłoń tylną powierzchnię soczewki, zdejmując tylną część kuli ziemskiej.

Wyjmij wypreparowane oko z roztworu buforowego za pomocą kleszczy i umieść je na suchej chusteczce z rogówką skierowaną w dół. Delikatnie przeciągnij rogówkę po powierzchni chusteczki, aby ją wysuszyć. Nałóż kroplę kleju błyskawicznego na spód 50-milimetrowej szalki Petriego i przymocuj do niej platformę.

Umieść naczynie na płycie scenicznej mikroskopu stereoskopowego tak, aby studzienka z klejem była widoczna. Aby umieścić oko w dołkach platformy szalki Petriego, dodaj trzy mikrolitry kleju błyskawicznego. Ostrożnie umieść go w studzience i szybko wyreguluj tak, aby tył obiektywu był skierowany do góry.

Osusz odsłoniętą stronę soczewki, delikatnie osuszając ją rogiem suchej chusteczki. Aby zmierzyć strefową odpowiedź lepkosprężystą, włącz wagę, umieść szalkę Petriego na wadze, a następnie uruchom program rejestrujący wagę i oprogramowanie kamery. Włączyć sterownik serwomotoru.

Uruchom aplikację sterownika na komputerze i ustaw parametry ruchu z przyrostem 50 mikrometrów. Utwórz zgięcie pod kątem 90 stopni w pręcie kapilarnym. Wsuń wygiętą kapilę do uchwytu sondy kapilarnej i dokręć mocujące.

Do końcówki kapilarnej dodaj małą kulkę kleju utwardzanego promieniami UV. Przesuń końcówkę sondy kapilarnej za pomocą ręcznych regulacji na manipulatorze i umieść ją bezpośrednio nad górną częścią soczewki. Poprzez przednią kontrolę wzrokową i widok z boku za pomocą kamery mikroskopowej, sprawdź, czy dolna część kleju UV wydaje się wyśrodkowana nad górną częścią soczewki.

Patrząc przez kamerę, opuść końcówkę sondy, aż klej UV zetknie się z obiektywem i pokryje 1/3 do 1/2 jego górnej powierzchni. Utwardź klej za pomocą kierunkowego, prawie widzialnego źródła światła UV o długości fali od 380 do 400 nanometrów i intensywności około jednego miliwata. Dodać roztwór PBS do szalki Petriego, aż oko zostanie pokryte na głębokość co najmniej dwóch milimetrów.

Umieść cylindryczną soczewkę przed mikroskopem i w pobliżu szalki Petriego, nie dotykając jej. W tym samym czasie rozpocznij rejestrowanie w programie czasowym. Zrób zdjęcie oka i sondy za pomocą aparatu.

Po 60 sekundach rozpocznij przemieszczenie o 50 mikrometrów. Powtarzaj co 60 sekund, aż eksperyment zostanie zakończony, na co wskazuje zerwanie wszystkich włókien strefowych. Zapisz dane rejestrowania wagi po zakończeniu przebiegu i wyeksportuj je do zgodnego formatu arkusza kalkulacyjnego.

Zapisz także zdjęcia obiektywu uzyskane podczas biegu. Zaimportuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Korzystając z pierwszego i ostatniego odczytu skali, przeinterpoluj dryft w odczycie tła w czasie spowodowany parowaniem, a następnie odejmij interpolowane tło od odczytu w każdym punkcie czasowym.

Po wykonaniu testu i skorygowaniu o parowanie, wykres danych lepkosprężystych jest odwracany. Wielkość chwilowych i zrelaksowanych sił wzrasta z każdym krokiem do około 1000 sekund, a następnie spada, gdy włókna strefowe zaczynają pękać, aż do osiągnięcia punktu czasowego 1500 sekund, w którym wszystkie włókna zostaną zerwane. W tej demonstracji porównano również odpowiedź lepkosprężystą u myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem MAGP-1.

W początkowym czasie od zera do 600 sekund wykresy są do siebie podobne, co sugeruje, że właściwości lepkosprężyste włókien strefowych nie uległy znaczącym zmianom. Jednak w myszy z nokautem MAGP-1 włókna przedwcześnie pękają. Strefowe siły zrywania włókien uzyskano metodą pull-up dla MAGP-1 w porównaniu z myszami typu dzikiego w stadium miesięcznym i rocznym.

Wyniki wykazały, że wytrzymałość włókien wzrasta wraz z wiekiem u myszy typu dzikiego. Każdy przypadkowy kontakt z szalką Petriego podczas tych etapów może spowodować przesunięcie ściany oka względem soczewki oka, potencjalnie uszkadzając włókna strefowe. Ten test podciągania pomaga zidentyfikować białka, które przyczyniają się do wytrzymałości mikrowłókien na rozciąganie.

Wykorzystamy te informacje do zbudowania bardziej realistycznych modeli wnętrza włókien strefowych.