Name: Preparatyka biologiczna i technika mechaniczna do określania właściwości lepkosprężystych włókien strefowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Poznaj metodę określania właściwości lepkosprężystych włókien strefowych myszy z mutacjami genów. Technika ta pozwala badać wpływ zmian genetycznych na biomechanikę mikrofibryli i zrozumieć dziedziczne zespoły okulistyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH R01 EY029130 (S.B.) i P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 i Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), Fundację Marfan, a także nieograniczony grant dla Wydziału Okulistyki i Nauk Wizualnych Uniwersytetu Waszyngtońskiego z Research to Prevent Blindness. J.R. otrzymał również grant z Uniwersytetu Nauk o Zdrowiu i Farmacji na wsparcie tego projektu.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Waszyngtońskiego i przestrzegały Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Produkcja specjalistycznych części i budowa aparatury
<ol>
	<li>Produkcja specjalistycznych części
	<ol>
		<li>Produkcja sondy. Trzymaj szklaną kapilarnę pod kątem, jak pokazano na lewym panelu <silna klasa="xfig">Rysunek 2A. Umieść płomień z zapalniczki w odległości około 2 cm od jednego końca i trzymaj go tam, aż koniec wygina się o 90°, jak pokazano w prawym panelu <silna klasa="xfig">Rysunek 2A.</li>
		<li>Przykładowa produkcja platformy. Korzystając z oprogramowania do rysowania 3D, zaprojektuj platformę o wymiarach 30 x 30 x 5 mm i zawierającą półkuliste wgłębienia o średnicy 2,0, 2,5 i 3,0 mm, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2B.</li>
		<li>Produkcja uchwytu sondy. Korzystając z oprogramowania do rysowania 3D, zaprojektuj uchwyt, który trzyma sondę kapilarną i przymocuj ją do mikromanipulatora (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
		UWAGA: Przykładowy plik 3D do produkcji platformy i produkcji uchwytu sondy w formacie STL jest dostępny na żądanie u autora korespondencyjnego.</li>
		<li>Montaż obiektywu negatywowego. Umieść ujemną soczewkę cylindryczną (ogniskowa -75 mm i około 50 mm wysokości i długości), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1C i <silna klasa="xfig">Rysunek 1D, aby skorygować zniekształcenia spowodowane dodaniem płynu do szalki Petriego (dodanie płynu zniekształca widok wypreparowanego oka, gdy jest obrazowane z boku).</li>
		<li>Przyklej soczewkę negatywową do jednej z 2-szczelinowych podstaw (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2D, aby zapoznać się z ustawieniem soczewki na podstawie).</li>
		<li>Złóż pozostałe części, jak pokazano na Rysunek 2D.</li>
		<li>Wyreguluj wysokość słupka tak, aby obiektyw ledwo unosił się nad skalą i dokręć w uchwycie słupka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa aparatury
	<ol>
		<li>Zainstaluj na komputerze program rejestrujący dostarczony z wagą, oprogramowanie kamery mikroskopu i aplikację sterownika mikrometru z napędem.</li>
		<li>Podłącz zmotoryzowany mikrometr do sterownika serwomotoru, a ten ostatni do komputera. Uruchom aplikację sterownika silnika i edytuj ustawienia silnika. 
		UWAGA: Ustawienia motoryczne, które są wymienione poniżej, zostały wybrane po wstępnych eksperymentach, które wykazały, że stresy rozluźniają się w skali czasowej 10-20 s. Na podstawie tego oznaczenia wybraliśmy prędkość i przyspieszenie, które pozwoliły silnikowi na wykonanie przemieszczenia o 50 μm w czasie krótszym niż czas relaksacji, ale nie za krótkim, aby uniknąć wstrząsów próbki. Tutaj wybraliśmy czas przemieszczenia około 5-10 s.</li>
		<li>Ustaw maksymalną prędkość na 0,01 mm/s, a przyspieszenie na 0,005 mm/s2.</li>
		<li>Zainstaluj kamerę w mikroskopie inspekcyjnym i przetestuj oprogramowanie do obrazowania kamery.</li>
		<li>Umieść wagę na stole przeznaczonym na urządzenie.</li>
		<li>Przyklej wydrukowaną w 3D platformę (z kroku 1.1.2) do szalki Petriego i dodaj szklany koralik o średnicy 2-3 mm do jednego z dołków. Umieść szalkę Petriego na wadze tak, aby koralik znajdował się w pobliżu środka patelni.</li>
		<li>Wymień mikrometr ręczny z mikromanipulatora na zmotoryzowany.</li>
		<li>Wkręć dwie 4-40 w uchwyt sondy. Przymocuj uchwyt sondy do manipulatora, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1C.</li>
		<li>Przygotuj sondę, jak pokazano na rysunku Rysunek 2A, umieść ją w uchwycie sondy wygiętą częścią skierowaną w dół i dokręć.</li>
		<li>Umieść mikromanipulator na stole tak, aby końcówka sondy znajdowała się nad koralikiem na platformie. Przymocuj mikromanipulator do stołu, aby zapobiec przypadkowemu ruchowi podczas eksperymentu.</li>
		<li>Ustaw mikroskop boczny na stole tak, aby koralik znajdował się w środku swojego pola view i był ostry.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki i akwizycja danych
<ol>
	<li>Fiksacja i rozwarstwienie oka
	<ol>
		<li>Utrzymuj myszy typu dzikiego i zwierzęta o zerowej wartości Magp1 na identycznym tle C57/BL6J. Eutanazja 1-miesięcznych lub rocznych myszy przez wdychanie CO2 .</li>
		<li>Usunąć oczy cienkimi kleszkami i utrwalić wyłuszczone kule w temperaturze 4 °C przez noc w 4% paraformaldehydzie/roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4). Utrzymuj dodatnie ciśnienie 15-20 mmHg w oku podczas procesu fiksacji, zgodnie z opisem6. 
		UWAGA: Eksperymenty przeprowadza się na samcach myszy, aby kontrolować możliwe związane z płcią różnice w wielkości gałki ocznej. Nadciśnienie zapewnia, że gałka ziemska pozostaje napompowana, zachowując szczelinę między soczewką a ścianą oka rozpiętą przez włókna strefowe.</li>
		<li>Myj oczy przez 10 minut w PBS. Za pomocą okulistycznych nożyczek chirurgicznych i pracując pod mikroskopem stereoskopowym wykonaj nacięcie na całej grubości w ścianie oka w pobliżu głowy nerwu wzrokowego.</li>
		<li>Przedłuż cięcie do przodu do równika, a następnie wokół równikowego obwodu oka. Uważaj, aby oszczędzić delikatne wyrostki rzęskowe i związane z nimi włókna strefowe.</li>
		<li>Zdejmij tylną część kuli ziemskiej, odsłaniając tylną powierzchnię soczewki.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby usunąć wypreparowane oko z roztworu buforowego i umieść je na suchej chusteczce z rogówką skierowaną w dół. Delikatnie przeciągnij rogówkę po powierzchni chusteczki, aby ją wysuszyć.</li>
		<li>Dodaj 3 μl kleju instant do dołków platformowych, które pomieszczą oko na szalce Petriego.</li>
		<li>Umieść naczynie na płycie scenicznej mikroskopu stereoskopowego tak, aby studzienka z klejem była widoczna.</li>
		<li>Przenieś oko z chusteczki na krawędź studzienki zawierającej klej. Następnie ostrożnie przeciągnij oko do studzienki i szybko dostosuj jego orientację tak, aby tył soczewki znajdował się powyżej.</li>
		<li>Osusz odsłoniętą stronę soczewki, delikatnie osuszając ją rogiem suchej chusteczki.</li>
		<li>Nałóż odrobinę kleju błyskawicznego na spód szalki Petriego o średnicy 50 mm i przymocuj do niej platformę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar strefowej odpowiedzi lepkosprężystej
	<ol>
		<li>Włącz wagę, uruchom program rejestrujący wagę i oprogramowanie aparatu. Upewnij się, że program rejestrowania może pobierać dane przez 30 minut, ponieważ niektóre wersje próbne mogą trwać tak długo.</li>
		<li>Włącz sterownik serwomotoru i uruchom aplikację sterownika na komputerze. Upewnij się, że kontroler jest ustawiony na ruch w krokach co 50 μm przy użyciu parametrów ruchu podobnych do tych opisanych w UWAGA w kroku 1.2.2.</li>
		<li>Utwórz zagięcie pod kątem 90° w pręcie kapilarnym zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.</li>
		<li>Wsuń wygiętą kapilę do uchwytu sondy kapilarnej i dokręć mocujące. 
		UWAGA: Aby zminimalizować odwodnienie próbki, zalecamy wykonanie kroków 1-4 przed lub w trakcie sekcji oka.</li>
		<li>Dodaj małą (~1 mm) kulkę kleju utwardzanego promieniami UV na końcówkę kapilary.</li>
		<li>Korzystając z ręcznych regulacji na manipulatorze, przesuń końcówkę sondy kapilarnej tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad środkiem soczewki. Sprawdź, czy dolna część kleju UV wydaje się wyśrodkowana nad górną częścią soczewki, gdy patrzy się na nią z przodu (kontrola wzrokowa) i z boku (przez kamerę mikroskopu).</li>
		<li>Patrząc przez kamerę, opuść końcówkę sondy, aż klej UV zetknie się z obiektywem i pokryje jedną trzecią do połowy jego górnej powierzchni.</li>
		<li>Do utwardzenia kleju należy użyć kierunkowego, prawie widocznego źródła światła UV o niskiej intensywności (~ 1 mW). 
		UWAGA: Te specyfikacje wystarczą, aby utwardzić klej w ciągu kilku sekund, jednocześnie minimalizując możliwość indukowania sieciowania białek. Źródła światła UV dostarczane z komercyjnymi pisakami do kleju UV spełniają te specyfikacje.</li>
		<li>Dodać roztwór PBS do naczynia, aż oko zostanie pokryte płynem na głębokość co najmniej 2 mm.</li>
		<li>Umieścić cylindryczną soczewkę przed mikroskopem inspekcyjnym i jak najbliżej szalki Petriego, nie dotykając jej.</li>
		<li>Jednocześnie uruchom program rejestrujący i program timera. Zrób zdjęcie oka/sondy za pomocą aparatu.</li>
		<li>Po 60 s należy zainicjować kolejne przemieszczenie o 50 μm, a następnie co 60 s aż do zakończenia eksperymentu, tj. do momentu, gdy wszystkie włókna zostaną zerwane. Należy pamiętać, że sygnał nie powróci do poziomu wyjściowego z powodu parowania buforu podczas eksperymentu. Skorygować wynikający z tego dryft odczytów podczas analizy danych, jak pokazano w kroku 2.2.14.</li>
		<li>Po zakończeniu przebiegu zapisz dane rejestrowania wagi i wyeksportuj je do formatu zgodnego z arkuszem kalkulacyjnym, np. formatu .csv. Zapisz zdjęcia obiektywu, które zostały zebrane podczas biegu.</li>
		<li>Importowanie danych do arkusza kalkulacyjnego. Użyj pierwszego i ostatniego odczytu skali, aby interpolować dryft w odczycie tła w czasie spowodowany parowaniem (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Odejmij odczyt interpolowany od odczytu w każdym punkcie czasowym. 
		UWAGA: W przypadku korzystania z arkusza kalkulacyjnego interpolację można wykonać automatycznie, wprowadzając formułę = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B))))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 w komórce po prawej stronie pierwszego odczytu skali, a następnie przesuwając kursor do prawego dolnego rogu komórki i przeciągając go w dół do ostatniej wartości danych. W formule założono, że dane są zorganizowane w kolumnie, w której pierwszy punkt danych znajduje się w komórce B2. W razie potrzeby dane przetworzone w kroku 2.2.14 mogą być analizowane za pomocą quasi-elastycznego modelu lepkosprężystego opracowanego przez jednego ze współautorów, dr Matthew Rileya4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+glass%3A+structural+determinants+of+eye+lens+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li>
<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinn%27s+zonule%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902(2021).</li>
<li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+zonular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+%28LTBP-2%29+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li>
<li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibers%2C+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Histology+and+Cytology%22%5BJournal%5D)">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li>
<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685(2019).</li>
<li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTBPs%2C+more+than+just+an+escort+service%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li>
<li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microfibril-associated+glycoproteins+%28MAGPs%29+and+the+microfibrillar+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li>
<li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+TGF-%CE%B2+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li>
<li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li>
<li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li>
<li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li>
<li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+body+in+accommodation%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Ophthalmological+Societies+of+the+United+Kingdom%22%5BJournal%5D)">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, Pt 2 208-219 (1986).</li>
<li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li>
<li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li>
<li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058(2014).</li>
<li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283(2019).</li>
<li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li>
<li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zonula to nietypowy system ECM, w którym włókna są ułożone symetrycznie i można nimi manipulować identycznie, przesuwając soczewkę oka wzdłuż osi optycznej. Przestrzeń może być również łatwo dostępna bez zakłóceń komórkowych, co pozwala na badanie włókien w środowisku zbliżonym do ich rodzimego stanu. Technika podciągania wykorzystuje tę prezentację ECM do manipulowania delikatnymi włóknami myszy, genetycznie podatnego systemu, i dokładnego ilościowego określania ich właściwości mechanicznych. Pozwoliło nam to na zbadani...

Oko kręgowca zawiera żywą soczewkę optyczną, która pomaga skupić obrazy na siatkówce1. Soczewka jest zawieszona na osi optycznej za pomocą układu delikatnych, promieniście zorientowanych włókien, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A. Na jednym końcu włókna przyczepiają się do równika soczewki, a z drugiej do powierzchni ciała rzęskowego. Ich długości wahają się od 150 μm u myszy do 1 mm u ludzi. Łącznie włókna te są znane jako zonula Zinn2, strefa rzęskowa lub po prostu zonula. Urazy oczu, choroby i niektóre zaburzenia genetyczne mogą wpływać na integralność włókien strefowych3, powodując ich ostateczną awarię i towarzyszącą utratę wzroku. U myszy włókna mają rdzeń składający się głównie z białka fibryliny-2, otoczony płaszczem bogatym w fibrylinę-14. Chociaż włókna strefowe są unikalne dla oka, wykazują wiele podobieństw do włókien ECM na bazie elastyny, które można znaleźć w innych częściach ciała. Te ostatnie są pokryte płaszczem fibryliny-15 i mają podobne wymiary do włókien strefowych6. Inne białka, takie jak białka wiążące czynnik wzrostu β z utajonym czynnikiem wzrostu (LTBP) i glikoproteina 1 związana z mikrofibrylami (MAGP-1), występują w połączeniu z obydwoma typami włókien7,8,9,10,11. Moduł sprężystości włókien strefowych mieści się w zakresie 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, porównywalny z włóknami na bazie elastyny (0,3-1,2 MPa)17. Te podobieństwa architektoniczne i mechaniczne skłaniają nas do przekonania, że każdy wgląd w role białek związanych z zonulami może pomóc w wyjaśnieniu ich roli w innych elastycznych włóknach ECM.
Głównym celem opracowania opisanej tutaj metody jest uzyskanie wglądu w rolę specyficznych białek strefowych w postępie dziedzicznej choroby oczu. Ogólne podejście polega na porównaniu właściwości lepkosprężystych włókien strefowych u myszy typu dzikiego z właściwościami myszy z celowanymi mutacjami w genach kodujących białka strefowe. Chociaż do pomiaru właściwości sprężysto-mechanicznych włókien strefowych stosowano już wcześniej kilka metod, wszystkie zostały zaprojektowane z myślą o oczach znacznie większych zwierząt12,13,14,15,16. W związku z tym modele nie są genetycznie podatne; Staraliśmy się opracować metodę eksperymentalną, która byłaby lepiej dopasowana do małych i delikatnych oczu myszy.
Metoda, którą opracowaliśmy do oceny lepkosprężystości mysich włókien strefowych, to technika, którą nazywamy testem pull-up4,18, który jest wizualnie podsumowany w Rysunek 1. Szczegółowy opis metody pull-up i analizy wyników znajduje się poniżej. Zaczynamy od opisania budowy aparatury, w tym części wydrukowanych w trójwymiarze (3D) wykorzystanych w projekcie. Następnie szczegółowo opisujemy protokół używany do uzyskania i przygotowania oczu do eksperymentu. Na koniec podajemy instrukcje krok po kroku, jak uzyskać dane do określenia właściwości lepkosprężystych włókien strefowych. W sekcji Reprezentatywne wyniki udostępniamy wcześniej niepublikowane dane uzyskane naszą metodą na temat właściwości lepkosprężystych włókien strefowych od myszy pozbawionych MAGP-119, a także zestawu kontrolnego uzyskanego od zwierząt typu dzikiego o dopasowanym wieku. Na koniec kończymy ogólnymi uwagami na temat zalet i ograniczeń metody oraz sugestiami dotyczącymi potencjalnych eksperymentów, które mogą wyjaśnić, w jaki sposób czynniki środowiskowe i biochemiczne wpływają na właściwości lepkosprężyste włókien ECM.

<table><tbody><tr><td>sześciokątne 1/4-20 o długości 3/4 cala</td><td>Thorlabs</td><td>SH25S075</td><td></td></tr><tr><td>nakrętka 1/4-20</td> Drukarka 3D SLA <td>w sklepie</td><td></td><td></td>z narzędziami</tr><tr><td></td><td>Anycubic</td><td>Photon</td><td></td></tr><tr><td>4-40 o długości 3/8 cala, 2</td><td>Kapilary sklepu</td><td></td><td></td>z</tr><tr><td>narzędziami, średnica zewnętrzna 1,2 mm i 3 cale długości, bez filamentu</td><td>WPI</td><td>1B120-3</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan (super) klej</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skala cyfrowa z dokładnością do 0,01 g</td><td>Noniusz</td><td>OHAUS Scout 220</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Arkusz kalkulacyjny</td><td>Microsoft</td><td></td></tr><tr><td>Zapalniczka</td><td></td><td></td><td></td>gazowa</tr><tr><td>Mikroskop inspekcyjny/preparacyjny</td><td>Amscope</td><td>SKU: SM-4NTP</td><td>Odległość robocza ~ 15 cm</td></tr><tr><td>Mikromanipulator, ekonomiczny 4-osiowy</td><td>WPI</td><td>Kite-L</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany mikrometr</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>Ujemna soczewka cylindryczna</td><td>Thorlabs</td><td></td> <td>LK1431L1-75 mm</td></tr><tr><td>Ogniskowa szalki Petriego, 50 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na słupek, 3 cale</td><td>Thorlabs</td><td>PH3</td><td></td></tr><tr><td>Post, 4 cale</td><td>Thorlabs</td><td>TR4</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rejestrowania wagi</td><td>Noniusz</td><td>LoggePro</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik silnika serwo</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterownika serwomotorów</td><td>Thorlabs</td><td>APT</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa szczelinowa, 1</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S</td><td></td></tr><tr><td>Podstawy szczelinowe, 2</td><td>Thorlabs</td><td>BA2</td><td></td></tr><tr><td>Stojak do mikromanipularnej</td><td>WPI</td><td>M-10</td><td></td></tr><tr><td>Kamera USB do mikroskopu</td><td>Amscope</td><td>SKU: MD500</td><td></td></tr><tr><td>Klej aktywowany promieniami UV ze źródłem UV</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparatyka biologiczna i technika mechaniczna do określania właściwości lepkosprężystych włókien strefowych

Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Elastyczność jest niezbędna do funkcjonowania tkanek, takich jak naczynia krwionośne, mięśnie i płuca. Właściwość ta wynika głównie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), siatki białkowej, która łączy ze sobą komórki i tkanki. W jaki sposób właściwości sprężyste sieci ECM odnoszą się do jej składu i czy właściwości relaksacyjne ECM odgrywają rolę fizjologiczną, to pytania, na które nie udzielono jeszcze pełnej odpowiedzi. Część wyzwań polega na złożonej architekturze większości systemów ECM i trudnościach w izolowaniu komponentów ECM bez naruszania ich struktury. Jedynym wyjątkiem jest zonule, system ECM znajdujący się w oku kręgowców. Zonula składa się z włókien o długości od setek do tysięcy mikrometrów, które obejmują wolną od komórek przestrzeń między soczewką a ścianą oka. W tym raporcie opisujemy technikę mechaniczną, która wykorzystuje wysoce zorganizowaną strukturę zonuli do ilościowego określenia jej właściwości lepkosprężystych i określenia udziału poszczególnych składników białkowych. Metoda polega na rozwarstwieniu nieruchomego oka w celu odsłonięcia soczewki i zonuli i wykorzystuje technikę podciągania, która równomiernie rozciąga włókna strefowe, podczas gdy ich napięcie jest monitorowane. Technika ta jest stosunkowo niedroga, ale wystarczająco czuła, aby wykryć zmiany we właściwościach lepkosprężystych włókien strefowych u myszy pozbawionych określonych białek strefowych lub wraz ze starzeniem się. Chociaż przedstawiona tutaj metoda jest przeznaczona przede wszystkim do badania rozwoju i chorób oczu, może również służyć jako model eksperymentalny do badania szerszych pytań dotyczących lepkosprężystych właściwości elastycznych ECM i roli czynników zewnętrznych, takich jak stężenie jonów, temperatura i interakcje z cząsteczkami sygnałowymi.

Opisana tutaj technika uniesienia (pull-up) zapewnia prosty sposób określania właściwości wiskoelastycznych włókien zonularnych u myszy. W skrócie, oko myszy jest najpierw utrwalane poprzez wstrzyknięcie utrwalacza przy fizjologicznym ciśnieniu wewnątrzgałkowym. Podejście to utrzymuje naturalne nadmuchanie oka i sprawia, że włókna pozostają odpowiednio wstępnie napięte (utrwalanie uznano za dopuszczalne po tym, jak wstępne eksperymenty wykazały, że nie zmienia ono znacząco elastyczności ani wytrzymałości włókien). Następ...

Protokół opisuje metodę badania lepkosprężystości macierzy zewnątrzkomórkowej i jej zależności od składu białka lub czynników środowiskowych. Docelowym systemem matrycowym jest strefa myszy. Skuteczność metody wykazano poprzez porównanie lepkosprężystego zachowania włókien strefowych typu dzikiego z tymi, które nie mają glikoproteiny 1 związanej z mikrofibrylami.

Preparatyka biologiczna i technika mechaniczna do określania właściwości lepkosprężystych włókien strefowych

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

Znaczenie naszej metody polega na tym, że jest ona w stanie odpowiedzieć na pytanie, jakie są właściwości lepkosprężyste włókien strefowych, włókien, które zawieszają soczewkę wewnątrz oka? Główną zaletą naszej techniki jest to, że może ona określić ilościowo właściwości lepkosprężyste małych i delikatnych włókien strefowych od myszy z celowanymi modyfikacjami genów i bez nich. Mutacje w genach kodujących białka mikrofibrylne leżą u podstaw kilku dziedzicznych stanów syndromicznych.Korzystając z naszej techniki, możemy zbadać, w jaki sposób określone mutacje zmieniają właściwości biomechaniczne mikrofibryli. Aby rozpocząć, po eutanazji myszy, usuń oczy za pomocą cienkich kleszczy. Włóż końcówkę igły do fiksacji przez ścianę oka i umieść ją w środku ciała szklistego, uważając, aby nie uszkodzić soczewki.Ostrożnie przenieś nabite oko do probówki wypełnionej 4% paraformaldehydem i solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Otworzyć zawór łączący igłę z ustabilizowanym zbiornikiem umieszczonym 25 centymetrów nad próbką, który utrzymuje nadciśnienie równoważne 15 do 20 milimetrom rtęci w oku w okresie utrwalania i pozostawić próbkę do utrwalenia na noc. Następnego dnia wyjmij igłę utrwalającą i przemywaj oko przez 10 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.Używając okulistycznych nożyczek chirurgicznych i mikroskopu stereoskopowego, wykonaj nacięcie pełnej grubości w ścianie oka w pobliżu głowy nerwu wzrokowego. Rozciągnij cięcie do przodu w kierunku równika, a następnie wokół równikowego obwodu oka, ostrożnie oszczędzając delikatne wyrostki rzęskowe i związane z nimi włókna strefowe. Odsłoń tylną powierzchnię soczewki, zdejmując tylną część kuli ziemskiej.Wyjmij wypreparowane oko z roztworu buforowego za pomocą kleszczy i umieść je na suchej chusteczce z rogówką skierowaną w dół. Delikatnie przeciągnij rogówkę po powierzchni chusteczki, aby ją wysuszyć. Nałóż kroplę kleju błyskawicznego na spód 50-milimetrowej szalki Petriego i przymocuj do niej platformę.Umieść naczynie na płycie scenicznej mikroskopu stereoskopowego tak, aby studzienka z klejem była widoczna. Aby umieścić oko w dołkach platformy szalki Petriego, dodaj trzy mikrolitry kleju błyskawicznego. Ostrożnie umieść go w studzience i szybko wyreguluj tak, aby tył obiektywu był skierowany do góry.Osusz odsłoniętą stronę soczewki, delikatnie osuszając ją rogiem suchej chusteczki. Aby zmierzyć strefową odpowiedź lepkosprężystą, włącz wagę, umieść szalkę Petriego na wadze, a następnie uruchom program rejestrujący wagę i oprogramowanie kamery. Włączyć sterownik serwomotoru.Uruchom aplikację sterownika na komputerze i ustaw parametry ruchu z przyrostem 50 mikrometrów. Utwórz zgięcie pod kątem 90 stopni w pręcie kapilarnym. Wsuń wygiętą kapilę do uchwytu sondy kapilarnej i dokręć mocujące.Do końcówki kapilarnej dodaj małą kulkę kleju utwardzanego promieniami UV. Przesuń końcówkę sondy kapilarnej za pomocą ręcznych regulacji na manipulatorze i umieść ją bezpośrednio nad górną częścią soczewki. Poprzez przednią kontrolę wzrokową i widok z boku za pomocą kamery mikroskopowej, sprawdź, czy dolna część kleju UV wydaje się wyśrodkowana nad górną częścią soczewki.Patrząc przez kamerę, opuść końcówkę sondy, aż klej UV zetknie się z obiektywem i pokryje 1/3 do 1/2 jego górnej powierzchni. Utwardź klej za pomocą kierunkowego, prawie widzialnego źródła światła UV o długości fali od 380 do 400 nanometrów i intensywności około jednego miliwata. Dodać roztwór PBS do szalki Petriego, aż oko zostanie pokryte na głębokość co najmniej dwóch milimetrów.Umieść cylindryczną soczewkę przed mikroskopem i w pobliżu szalki Petriego, nie dotykając jej. W tym samym czasie rozpocznij rejestrowanie w programie czasowym. Zrób zdjęcie oka i sondy za pomocą aparatu.Po 60 sekundach rozpocznij przemieszczenie o 50 mikrometrów. Powtarzaj co 60 sekund, aż eksperyment zostanie zakończony, na co wskazuje zerwanie wszystkich włókien strefowych. Zapisz dane rejestrowania wagi po zakończeniu przebiegu i wyeksportuj je do zgodnego formatu arkusza kalkulacyjnego.Zapisz także zdjęcia obiektywu uzyskane podczas biegu. Zaimportuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Korzystając z pierwszego i ostatniego odczytu skali, przeinterpoluj dryft w odczycie tła w czasie spowodowany parowaniem, a następnie odejmij interpolowane tło od odczytu w każdym punkcie czasowym.Po wykonaniu testu i skorygowaniu o parowanie, wykres danych lepkosprężystych jest odwracany. Wielkość chwilowych i zrelaksowanych sił wzrasta z każdym krokiem do około 1000 sekund, a następnie spada, gdy włókna strefowe zaczynają pękać, aż do osiągnięcia punktu czasowego 1500 sekund, w którym wszystkie włókna zostaną zerwane. W tej demonstracji porównano również odpowiedź lepkosprężystą u myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem MAGP-1.W początkowym czasie od zera do 600 sekund wykresy są do siebie podobne, co sugeruje, że właściwości lepkosprężyste włókien strefowych nie uległy znaczącym zmianom. Jednak w myszy z nokautem MAGP-1 włókna przedwcześnie pękają. Strefowe siły zrywania włókien uzyskano metodą pull-up dla MAGP-1 w porównaniu z myszami typu dzikiego w stadium miesięcznym i rocznym.Wyniki wykazały, że wytrzymałość włókien wzrasta wraz z wiekiem u myszy typu dzikiego. Każdy przypadkowy kontakt z szalką Petriego podczas tych etapów może spowodować przesunięcie ściany oka względem soczewki oka, potencjalnie uszkadzając włókna strefowe. Ten test podciągania pomaga zidentyfikować białka, które przyczyniają się do wytrzymałości mikrowłókien na rozciąganie.Wykorzystamy te informacje do zbudowania bardziej realistycznych modeli wnętrza włókien strefowych.

biological-preparation-mechanical-technique-for-determining

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne stosowane w celu przygotowania ścięgien z ogonów szczurów do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych. Przedstawiono kluczowe etapy przygotowania, zaczynając od ekstrakcji, pomiaru powierzchni przekroju poprzecznego, płukania, aż po umieszczenie próbek w komorze bioreaktora.

Przygotowanie ścięgien ogonowych szczura do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych

Omówiono metodę, za pomocą której mechaniczne zachowanie in vivo materiałów reagujących na bodźce jest monitorowane w funkcji czasu. Próbki są badane ex vivo przy użyciu testera mikrorozciągania z kontrolą środowiska w celu symulacji środowiska fizjologicznego. Praca ta dodatkowo przyczynia się do zrozumienia zachowania naszego materiału in vivo.

Kontrolowane środowiskowo badania mikrorozciągalności mechanicznie adaptacyjnych nanokompozytów polimerowych do charakterystyki ex vivo

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. W tym artykule przedstawiamy ważną i wiarygodną technikę przygotowania i badania przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych in vitro.

Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Przedstawiamy protokół zastosowania spektroskopii rozpraszania światła Brillouina do oczyszczonych elastyną i trypsyną włókien kolagenowych typu I macierzy zewnątrzkomórkowej w celu wydobycia ich pełnych właściwości elastycznych.

Przygotowanie włókien białkowych macierzy zewnątrzkomórkowej do spektroskopii Brillouina

Biomechanika tkanek jest ważna dla utrzymania kształtu i funkcji komórki oraz dla określenia fenotypu. W niniejszym raporcie przedstawiono nieniszczące protokoły mechaniczne do charakteryzowania elastycznych i lepkosprężystych właściwości ludzkich tkanek miękkich, które można bezpośrednio zastosować do podłoży inżynierii tkankowej, aby umożliwić ścisłe dopasowanie materiałów inżynieryjnych do tkanek natywnych.

Charakterystyka biomechaniczna tkanek miękkich człowieka za pomocą prób wgnieceń i rozciągania

Ten protokół obejmuje charakterystykę płatków zastawki przedsionkowo-komorowej z kontrolowanymi siłą, przemieszczeniami i relaksacją naprężeń dwuosiowymi procedurami mechanicznymi. Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu mogą być wykorzystane do opracowania modelu konstytutywnego w celu symulacji mechanicznego zachowania działających zaworów w ramach symulacji elementów skończonych.

Dwuosiowa charakterystyka mechaniczna przedsionkowo-komorowych zastawek serca

Mikrowaga kryształu kwarcu może zapewnić dokładne właściwości masy i lepkosprężystości dla folii w zakresie mikronów lub submikronów, co jest istotne dla badań w zakresie czujników biomedycznych i środowiskowych, powłok i nauki o polimerach. Grubość próbki ma wpływ na to, jakie informacje można uzyskać z materiału mającego kontakt z czujnikiem.

Przygotowanie próbki w mikrowadze kwarcowej Pomiary adsorpcji białek i mechaniki polimerów

Protokół przedstawia kompletny przebieg eksperymentów z nanoindentacją miękkiego materiału, w tym hydrożeli i komórek. Po pierwsze, szczegółowo opisano etapy eksperymentalne mające na celu pozyskanie danych ze spektroskopii sił; następnie analiza takich danych jest szczegółowo opisana za pomocą nowo opracowanego oprogramowania Python o otwartym kodzie źródłowym, które można pobrać bezpłatnie z GitHub.

Proces eksperymentowania i analizy danych dla nanotwardości miękkiej materii

Ten protokół opisuje dwuosiową charakterystykę mechaniczną, spolaryzowaną obrazowanie przestrzennej domeny częstotliwości opartej na obrazowaniu kolagenu oraz mikrodysekcję płatków zastawki trójdzielnej. Przedstawiona metoda wyjaśnia, w jaki sposób warstwy ulotek przyczyniają się do holistycznych zachowań ulotek.

Mikrodysekcja warstwowa płatków zastawki trójdzielnej do dwuosiowej charakterystyki mechanicznej i kwantyfikacji mikrostrukturalnej

Ten artykuł przedstawia demonstrację i podsumowanie protokołów tworzenia fantomów żelatynowych, które naśladują tkanki miękkie, oraz odpowiadającą im charakterystykę lepkosprężystą za pomocą elastografii wgłębień i rezonansu magnetycznego.

Lepkosprężysta charakterystyka fantomów żelatynowych naśladujących tkanki miękkie przy użyciu elastografii wgłębień i rezonansu magnetycznego

Poznaj metodę określania właściwości lepkosprężystych włókien strefowych myszy z mutacjami genów. Technika ta pozwala badać wpływ zmian genetycznych na biomechanikę mikrofibryli i zrozumieć dziedziczne zespoły okulistyczne.

Preparatyka biologiczna i technika mechaniczna do określania właściwości lepkosprężystych włókien strefowych

Przeglądaj więcej filmów