Preparatyka biologiczna i technika mechaniczna do określania właściwości lepkosprężystych włókien strefowych
16 grudnia 2021
Protokół opisuje metodę badania lepkosprężystości macierzy zewnątrzkomórkowej i jej zależności od składu białka lub czynników środowiskowych. Docelowym systemem matrycowym jest strefa myszy. Skuteczność metody wykazano poprzez porównanie lepkosprężystego zachowania włókien strefowych typu dzikiego z tymi, które nie mają glikoproteiny 1 związanej z mikrofibrylami.
Znaczenie naszej metody polega na tym, że jest ona w stanie odpowiedzieć na pytanie, jakie są właściwości lepkosprężyste włókien strefowych, włókien, które zawieszają soczewkę wewnątrz oka? Główną zaletą naszej techniki jest to, że może ona określić ilościowo właściwości lepkosprężyste małych i delikatnych włókien strefowych od myszy z celowanymi modyfikacjami genów i bez nich. Mutacje w genach kodujących białka mikrofibrylne leżą u podstaw kilku dziedzicznych stanów syndromicznych.
Korzystając z naszej techniki, możemy zbadać, w jaki sposób określone mutacje zmieniają właściwości biomechaniczne mikrofibryli. Aby rozpocząć, po eutanazji myszy, usuń oczy za pomocą cienkich kleszczy. Włóż końcówkę igły do fiksacji przez ścianę oka i umieść ją w środku ciała szklistego, uważając, aby nie uszkodzić soczewki.
Ostrożnie przenieś nabite oko do probówki wypełnionej 4% paraformaldehydem i solą fizjologiczną buforowaną fosforanem. Otworzyć zawór łączący igłę z ustabilizowanym zbiornikiem umieszczonym 25 centymetrów nad próbką, który utrzymuje nadciśnienie równoważne 15 do 20 milimetrom rtęci w oku w okresie utrwalania i pozostawić próbkę do utrwalenia na noc. Następnego dnia wyjmij igłę utrwalającą i przemywaj oko przez 10 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
Używając okulistycznych nożyczek chirurgicznych i mikroskopu stereoskopowego, wykonaj nacięcie pełnej grubości w ścianie oka w pobliżu głowy nerwu wzrokowego. Rozciągnij cięcie do przodu w kierunku równika, a następnie wokół równikowego obwodu oka, ostrożnie oszczędzając delikatne wyrostki rzęskowe i związane z nimi włókna strefowe. Odsłoń tylną powierzchnię soczewki, zdejmując tylną część kuli ziemskiej.
Wyjmij wypreparowane oko z roztworu buforowego za pomocą kleszczy i umieść je na suchej chusteczce z rogówką skierowaną w dół. Delikatnie przeciągnij rogówkę po powierzchni chusteczki, aby ją wysuszyć. Nałóż kroplę kleju błyskawicznego na spód 50-milimetrowej szalki Petriego i przymocuj do niej platformę.
Umieść naczynie na płycie scenicznej mikroskopu stereoskopowego tak, aby studzienka z klejem była widoczna. Aby umieścić oko w dołkach platformy szalki Petriego, dodaj trzy mikrolitry kleju błyskawicznego. Ostrożnie umieść go w studzience i szybko wyreguluj tak, aby tył obiektywu był skierowany do góry.
Osusz odsłoniętą stronę soczewki, delikatnie osuszając ją rogiem suchej chusteczki. Aby zmierzyć strefową odpowiedź lepkosprężystą, włącz wagę, umieść szalkę Petriego na wadze, a następnie uruchom program rejestrujący wagę i oprogramowanie kamery. Włączyć sterownik serwomotoru.
Uruchom aplikację sterownika na komputerze i ustaw parametry ruchu z przyrostem 50 mikrometrów. Utwórz zgięcie pod kątem 90 stopni w pręcie kapilarnym. Wsuń wygiętą kapilę do uchwytu sondy kapilarnej i dokręć mocujące.
Do końcówki kapilarnej dodaj małą kulkę kleju utwardzanego promieniami UV. Przesuń końcówkę sondy kapilarnej za pomocą ręcznych regulacji na manipulatorze i umieść ją bezpośrednio nad górną częścią soczewki. Poprzez przednią kontrolę wzrokową i widok z boku za pomocą kamery mikroskopowej, sprawdź, czy dolna część kleju UV wydaje się wyśrodkowana nad górną częścią soczewki.
Patrząc przez kamerę, opuść końcówkę sondy, aż klej UV zetknie się z obiektywem i pokryje 1/3 do 1/2 jego górnej powierzchni. Utwardź klej za pomocą kierunkowego, prawie widzialnego źródła światła UV o długości fali od 380 do 400 nanometrów i intensywności około jednego miliwata. Dodać roztwór PBS do szalki Petriego, aż oko zostanie pokryte na głębokość co najmniej dwóch milimetrów.
Umieść cylindryczną soczewkę przed mikroskopem i w pobliżu szalki Petriego, nie dotykając jej. W tym samym czasie rozpocznij rejestrowanie w programie czasowym. Zrób zdjęcie oka i sondy za pomocą aparatu.
Po 60 sekundach rozpocznij przemieszczenie o 50 mikrometrów. Powtarzaj co 60 sekund, aż eksperyment zostanie zakończony, na co wskazuje zerwanie wszystkich włókien strefowych. Zapisz dane rejestrowania wagi po zakończeniu przebiegu i wyeksportuj je do zgodnego formatu arkusza kalkulacyjnego.
Zapisz także zdjęcia obiektywu uzyskane podczas biegu. Zaimportuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Korzystając z pierwszego i ostatniego odczytu skali, przeinterpoluj dryft w odczycie tła w czasie spowodowany parowaniem, a następnie odejmij interpolowane tło od odczytu w każdym punkcie czasowym.
Po wykonaniu testu i skorygowaniu o parowanie, wykres danych lepkosprężystych jest odwracany. Wielkość chwilowych i zrelaksowanych sił wzrasta z każdym krokiem do około 1000 sekund, a następnie spada, gdy włókna strefowe zaczynają pękać, aż do osiągnięcia punktu czasowego 1500 sekund, w którym wszystkie włókna zostaną zerwane. W tej demonstracji porównano również odpowiedź lepkosprężystą u myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem MAGP-1.
W początkowym czasie od zera do 600 sekund wykresy są do siebie podobne, co sugeruje, że właściwości lepkosprężyste włókien strefowych nie uległy znaczącym zmianom. Jednak w myszy z nokautem MAGP-1 włókna przedwcześnie pękają. Strefowe siły zrywania włókien uzyskano metodą pull-up dla MAGP-1 w porównaniu z myszami typu dzikiego w stadium miesięcznym i rocznym.
Wyniki wykazały, że wytrzymałość włókien wzrasta wraz z wiekiem u myszy typu dzikiego. Każdy przypadkowy kontakt z szalką Petriego podczas tych etapów może spowodować przesunięcie ściany oka względem soczewki oka, potencjalnie uszkadzając włókna strefowe. Ten test podciągania pomaga zidentyfikować białka, które przyczyniają się do wytrzymałości mikrowłókien na rozciąganie.
Wykorzystamy te informacje do zbudowania bardziej realistycznych modeli wnętrza włókien strefowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę badania właściwości wizkootycznych macierzy zewnątrzkomórkowej, ze szczególnym uwzględnieniem zonuli mysich. Podkreśla, jak skład białkowy i czynniki środowiskowe wpływają na te właściwości, co jest demonstrowane poprzez porównanie włókien zonularnych typu dzikiego z tymi, którym brakuje glikoproteiny skojarzonej z mikrofibryłami-1.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Biomechanika
Tło
- Włókna zonularne zawieszają soczewkę w oku.
- Właściwości wizkootyczne są kluczowe dla zrozumienia zachowania biomechanicznego.
- Mutacje w białkach mikrofibrył mogą prowadzić do dziedziczonych zespołów syndromowych.
- Zrozumienie tych właściwości może pomóc w badaniu genetycznych wpływów na zdrowie oczu.
Cel badania
- Aby zmierzyć właściwości wizkootyczne włókien zonularnych.
- Aby ocenić wpływ określonych mutacji genów na te właściwości.
- Aby zapewnić niezawodną metodę badania delikatnych struktur biologicznych.
Stosowane metody
- Eutanazja myszy w celu uzyskania włókien zonularnych.
- Użycie drobnych kleszczy do usunięcia oka.
- Włożenie igły fiksacyjnej do oka w celu analizy.
- Porównanie włókien od myszy typu dzikiego i modyfikowanych genetycznie.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie zmierzyła właściwości wizkootyczne.
- Zaobserwowano różnice właściwości między włóknami typu dzikiego i mutantów.
- Wykazano, że określone mutacje zmieniają ich właściwości biomechaniczne.
- Technika ta jest przydatna do dalszych badań genetycznych.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia wgląd w właściwości biomechaniczne włókien zonularnych.
- Może być wykorzystywana do badania wpływu modyfikacji genetycznych.
- Wyniki mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia zespołów syndromowych związanych z oczami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of viscoelastic properties in zonular fibers, a model extracellular matrix system, to evaluate how specific protein mutations alter biomechanical function. By providing a sensitive, reproducible readout of fiber integrity under controlled mechanical stress, it supports target validation in ocular disease mechanisms and preclinical de-risking of genetic therapies. The approach offers a scalable platform for probing ECM-protein relationships relevant to connective tissue disorders beyond the eye.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking zonular protein composition to measurable changes in viscoelastic behavior.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct comparison of wild-type and genetically modified fibers under standardized mechanical load.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying proteins whose loss correlates with premature fiber failure under defined displacement thresholds.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems (zonular fiber preparations) with quantifiable tension outputs suitable for downstream compound or genetic screening.
- Reproducibility: Standardized fixation, mounting, and displacement protocols ensure consistent baseline measurements across experimental runs.
- Scalability: Platform design allows parallel processing of multiple samples using identical Petri dish wells and capillary probe setups.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human syndromic conditions arising from microfibril protein mutations, enabling preclinical evaluation of genotype-phenotype relationships.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical assessment by providing a common biomechanical readout across wild-type and disease-model systems.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic changes stem from altered ECM viscoelasticity rather than off-target developmental effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by delivering early-phase biomechanical data that informs target confidence and assay readiness for downstream validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how gene mutations affect the load-bearing capacity of zonular microfibrils.
- Screening: Generates assay-ready preparations with force-displacement readouts enabling comparison of wild-type, heterozygous, and homozygous mutant conditions.
- Analytics: Outputs time-resolved tension measurements that allow calculation of instantaneous and relaxed force parameters, facilitating statistical comparison across genotypes.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system for evaluating whether rescued protein expression restores viscoelastic profiles toward wild-type baselines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized biomechanical platform applicable to other tensile ECM systems (e.g., tendons, ligaments) with minimal protocol adaptation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating the contribution of specific ECM proteins to tissue-level viscoelasticity.
- Operational Value: Delivers standardized, low-cost measurements with sensitivity to detect age- and genotype-dependent changes in fiber strength.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective biomechanical criteria for target prioritization in connective tissue-targeted programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by quantifying the functional consequence of genetic modifications on load-bearing ECM networks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ocular dissection, microsurgery, and biomechanical testing under microscopy.
- Depends on precision instrumentation including servomotor controllers, force-sensitive scales, and UV curing systems for probe-lens attachment.
- Necessitates standardized fixation and mounting procedures to prevent sample drift or mechanical artifact during tension measurement.
- Involves adaptation considerations when applying the pull-up technique to ECM systems with differing structural organization or tensile strength.
- Practical limitations include sample preparation time and the need for controlled environmental conditions (e.g., PBS buffering) to minimize evaporation artifacts during extended runs.
