Name: Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Naucz się mierzyć maksymalną siłę izometryczną pojedynczych włókien mięśni szkieletowych. Ta metoda pozwala ocenić właściwości kurczliwe bez złożoności całych mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez następujące źródła finansowania: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

<ol><li>Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+specific+force+and+power+production+of+muscle+fibers+from+myostatin-deficient+mice+are+associated+with+a+suppression+of+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation.</a> J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).</li>
<li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li>
<li>Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Shoulder+Elbow+Surg%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+contraction+of+rabbit+fast+and+slow+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers.</a> Biophys J. 53, 935-946 (1988).</li>
<li>Moisescu, D. G., Thieleczek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+strontium+concentration+changes+within+skinned+muscle+preparations+following+a+change+in+the+external+bathing+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution.</a> J Physiol. 275, 241-262 (1978).</li>
<li>Walker, S. M., Schrodt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I+Segment+lengths+and+thin+filament+periods+in+skeletal+muscle+fibers+of+the+Rhesus+monkey+and+the+human%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human.</a> Anat Rec. 178, 63-81 (1974).</li>
<li>Gollapudi, S. K., Lin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+sarcomere+force-length+relationship+in+type-1+human+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers.</a> J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).</li>
<li>Brenner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+stabilizing+the+striation+pattern+in+maximally+calcium-activated+skinned+rabbit+psoas+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers.</a> Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).</li>
<li>Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+deficits+and+breakage+rates+after+single+lengthening+contractions+of+single+fast+fibers+from+unconditioned+and+conditioned+muscles+of+young+and+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).</li>
<li>Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+human+muscle%3A+understanding+sarcopenia+at+the+single+muscle+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Rehabil+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level.</a> Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).</li>
<li>Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+single-fiber+studies+tell+us+about+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">What do single-fiber studies tell us about exercise training.</a> Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).</li>
<li>Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+muscle+fibers+after+short-term+resistance+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regulatory+Integrative+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training.</a> Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).</li>
<li>Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+spaceflight%2C+simulated+spaceflight+and+countermeasures+on+single+muscle+fiber+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gravit+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology.</a> J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).</li>
<li>Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+long-term+muscle+paralysis+on+human+single+fiber+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics.</a> J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).</li>
<li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li>
<li>Russell, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+fast+skeletal+muscle+troponin+as+a+potential+therapeutic+approach+for+treating+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases.</a> Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).</li>
<li>Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber+function+and+rate+of+disease+progression+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).</li>
<li>Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+EDL+and+soleus+muscles+of+myostatin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice.</a> J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).</li>
<li>Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-induced+injury+to+single+permeabilized+muscle+fibers+from+mdx%2C+transgenic+mdx+and+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).</li>
<li>Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+high-resolution+separation+of+rodent+myosin+heavy+chain+isoforms+in+a+mini-gel+electrophoresis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system.</a> Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).</li>
<li>Hill, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+of+shortening+and+the+dynamic+constants+of+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The heat of shortening and the dynamic constants of muscle.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).</li>
<li>Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-velocity+properties+of+human+skeletal+muscle+fibres%3A+myosin+heavy+chain+isoform+and+temperature+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence.</a> J Physiol. 495, 573-586 (1996).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+velocity+of+unloaded+shortening+and+its+relation+to+sarcomere+length+and+isometric+force+in+vertebrate+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres.</a> J Physiol. 291, 143-159 (1979).</li>
<li>Brenner, B., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+force+generation+in+muscle%3A+Correlation+with+actomyosin+ATPase+activity+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution.</a> PNAS. 83, 3542-3546 (1986).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+on+the+maximum+velocity+of+shortening+in+skinned+skeletal+muscle+fibres+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).</li>
<li>Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+inhibitory+effects+of+orthovanadate+on+shortening+velocity+in+fast+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle.</a> Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).</li>
<li>Ashley, C. C., Moisescu, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changing+the+composition+of+the+bathing+solutions+upon+the+isometric+tension-pCa+relationship+in+bundles+of+crustacean+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils.</a> J Physiol. 270, 627-652 (1977).</li>
<li>Godt, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+tension+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog.+Dependence+on+magnesium+adenosine+triphosphate+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li>
<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Physiologie+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+physiological+ADP+concentrations+on+contraction+of+single+skinned+fibers+from+rabbit+fast+and+slow+muscles%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles).</a> Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).</li>
<li>Godt, R. E., Maughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swelling+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Swelling of skinned muscle fibers of the frog.</a> Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).</li>
<li>Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+lattice+spacing+change+on+cross-bridge+kinetics+in+chemically+skinned+rabbit+psoas+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers.</a> Biophys J. 64, 187-196 (1993).</li>
<li>Millman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filament+lattice+of+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The filament lattice of striated muscle.</a> Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+mouse+single+muscle+fibers%2C+a+comparison+with+amphibian+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers.</a> J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).</li>
<li>Phillips, S. K., Woledge, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+isometric+force%2C+maximum+power+and+isometric+heat+rate+as+a+function+of+sarcomere+length+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle.</a> Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).</li>
<li>Stephenson, D. G., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sarcomere+length+on+the+force-pCa+relation+in+fast+and+slow-twitch+skinned+muscle+fibres+from+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat.</a> J Physiol. 333, 637-653 (1982).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez Aurora Scientific

Oceny właściwości skurczowych przepuszczalnych pojedynczych włókien mięśni szkieletowych są wykorzystywane do badania funkcji mięśni w wielu różnych kontekstach. Przykłady obejmują badania, w których oceniano wpływ starzenia się12, ćwiczeń10,13,14, lotów kosmicznych15, urazów2,3,16, leczenia farmakologicznego17,18, chorób19 i manipulacji genetycznych20,21 na strukturę i funkcję włókien. Ze względu na możliwość bezpośredniej oceny zdolności skurczowej miofibryli w ich natywnej konfiguracji, technika ta stanowi atrakcyjną platformę, na podstawie której można zrozumieć funkcję miofibrylarną bez potencjalnie zakłócających efektów, które występują, gdy transmisja sygnału nerwowo-mięśniowego i wywołane wzbudzeniem uwalnianie wapnia są uwzględnione w badanym systemie. Ponadto testy funkcjonalne pojedynczych włókien mogą być stosowane w celu uzupełnienia wyników identyfikacji białek kurczliwych, takich jak te uzyskane za pomocą immunohistochemii lub elektroforezy żelowej + western blot22.
Jedną z podstawowych funkcji mięśni szkieletowych jest wytwarzanie siły. W związku z tym sFo, miara wewnętrznej zdolności układu skurczowego do generowania siły, jest bardzo interesująca dla fizjologów mięśni. Wiarygodne szacunki sFo wymagają dokładnych pomiarów zarówno włókna CSA, jak i Fo. Ponieważ włókna na ogół nie są ani okrągłe w przekroju, ani jednolite w CSA na całej swojej długości, należy zachować dużą ostrożność przy szacowaniu CSA. W tym celu pomiary wykonuje się w kilku miejscach na całej długości światłowodu i w każdym miejscu z dwóch perspektyw oddalonych od siebie o 90°. Wiarygodne pomiary Fo wymagają zwrócenia uwagi na kilka szczegółów, w tym uwzględnienie siły biernej, dostosowanie długości sarkomeru w celu maksymalizacji nakładania się grubych i cienkich włókien, zastosowanie roztworu aktywującego o stężeniu wapnia, które powoduje maksymalną aktywację, utrzymanie pożądanej temperatury eksperymentalnej i utrzymanie optymalnych warunków przechowywania (temperatura i czas trwania) włókien przed dniem eksperymentu.
Chociaż przedstawione tutaj kroki opisują procedurę oceny maksymalnej siły izometrycznej, często pożądana jest ocena innych ważnych cech funkcjonalnych włókien mięśni szkieletowych. Można to osiągnąć poprzez rozszerzenie protokołu eksperymentalnego o dodatkowe mechaniczne manipulacje włóknem. Na przykład pomiar prędkości, z jaką światłowód zwarla się pod wpływem szeregu różnych obciążeń, pozwala na wyznaczenie zależności siła-prędkość, z której można obliczyć zależności siła-moc i prędkość-moc10,23,24. Dodatkowo, prędkość nieobciążonego skracania można określić za pomocą "testu luzu"25, który polega na zastosowaniu serii etapów skracania powodujących luz i pomiarze czasu wymaganego przez włókno do usunięcia luzu. Innym parametrem kinetycznym, który jest często zgłaszany, jest ktr, stała szybkości przebudowy siły po zaburzeniu mechanicznym, które tymczasowo odłącza wszystkie mosty poprzeczne26. Wreszcie, związek między stężeniem wapnia a wytwarzaniem siły czynnej ("zależność siła-pCa") jest często interesujący18 i można go określić, wystawiając włókno na działanie szeregu roztworów o stężeniach wapnia w zakresie od poniżej progu aktywacji układu skurczowego do tych wystarczających do wywołania maksymalnej aktywacji, a tym samym maksymalnej siły (Fo).
Chociaż wiele z wymienionych urządzeń jest potrzebnych do oceny kurczliwości pojedynczych włókien, inne urządzenia nie są absolutnie konieczne. Regulator długości, na przykład, jest niezbędny dla każdego protokołu eksperymentalnego, który wymaga szybkiego lub precyzyjnego wydłużenia lub skrócenia włókna, ale nie jest absolutnie konieczny do oceny maksymalnej siły izometrycznej (chociaż zerowy poziom siły w rejestrze siły musi być nadal zidentyfikowany w jakiś sposób). Pryzmaty, które umożliwiają obserwację światłowodu z boku, choć przydatne do oceny pola przekroju poprzecznego, nie są absolutnie konieczne przy ustawianiu światłowodu w komorze doświadczalnej. Ponadto można zastosować alternatywne sposoby wystawiania włókna na działanie różnych roztworów eksperymentalnych, w tym opracowanie ręcznie obsługiwanego systemu komór lub pojedynczej komory, która pozwala na szybkie napełnianie i opróżnianie roztworów. Wreszcie, podczas gdy subfizjologiczne temperatury doświadczalne, takie jak 15 °C, są powszechnie stosowane w celu poprawy odtwarzalności pomiarów mechanicznych1,2,3,5,8,12,17,27, możliwe jest wygenerowanie ważnych danych w innych temperaturach23,28, o ile uwzględni się wpływ temperatury na właściwości roztworu (stężenie wapnia, pH itp.).
Skład roztworów testowych jest jednym z najbardziej krytycznych aspektów opisanych tutaj technik włókien przepuszczalnych. Zagadnienia dotyczące kompozycji rozwiązania są złożone i wykraczają poza zakres tego artykułu. Rozwiązania opisane w kroku 5 sekcji protokołu zostały zaprojektowane z naciskiem na szybką aktywację światłowodu przepuszczalnego po jego przejściu z roztworów wstępnych do aktywujących przy zachowaniu stałej siły jonowej, składu kationowego i osmolarności6,29. Inne podejścia do kompozycji roztworów zostały zastosowane ze znaczącym powodzeniem przez inne grupy badawcze i zazwyczaj wykorzystują opublikowane stałe wiązania i narzędzia obliczeniowe27,30,31. Stężenia jonów wapnia w różnych roztworach aktywujących są szczególnie ważne w badaniach obejmujących submaksymalną aktywację, takich jak ocena siły pCa. W przypadku eksperymentów, w których włókna są w pełni aktywowane, takich jak te opisane tutaj, stężenie wapnia w roztworze aktywującym zazwyczaj przekracza komfortowy margines wymagany do osiągnięcia maksymalnej siły, co sprawia, że jego dokładna wiedza jest mniej krytyczna. Dodanie fosforanu kreatyny jest ważne dla buforowania wewnątrzmiofibrylarnych wahań ATP i ADP, które w przeciwnym razie byłyby związane z aktywnością skurczową. Kinaza kreatynowa jest niezbędna do katalizowania transferu fosforanów z fosforanu kreatyny do ADP. W warunkach eksperymentalnych, które skutkują wysokimi wskaźnikami obrotu ATP, w tym pracy w wysokich temperaturach lub mierzeniu szybkiego skracania włókien szybkich32, kinaza kreatynowa musi zostać dodana do roztworu w celu uzupełnienia endogennej kinazy kreatynowej, która pozostaje związana z błonnikiem. W przypadku mniej wymagających warunków eksperymentalnych system regeneracji ATP jest mniej krytyczny27.
Ograniczenia techniki przepuszczalnego pojedynczego włókna są następujące. Dane wygenerowane przez te testy określają właściwości kurczliwe specyficznej jednostki miofibrylarnej, która została przyłączona do aparatury doświadczalnej. W związku z tym wychwytuje to tylko niewielką część całego włókna wielojądrowego, z którego uzyskano segment, który z kolei stanowi niewielki ułamek całkowitej liczby włókien w mięśniu. Badacze powinni zatem dokładnie rozważyć pobieranie próbek wymaganych do poparcia wszelkich wniosków wyciągniętych z eksperymentów. Dodatkowo, ocena wpływu interwencji treningu fizycznego na funkcję włókien zakłada, że oceniane włókna były rzeczywiście rekrutowane podczas treningu. Chociaż protokół próbuje naśladować naturalne środowisko wewnątrzkomórkowe włókna, proces przenikania sarcolemmy jest niespecyficzny i koniecznie pozwala rozpuszczalnym składnikom wewnątrzkomórkowym swobodnie dyfundować do roztworów kąpielowych. Kolejną konsekwencją przepuszczalności błony jest zmiana równowagi osmotycznej objawiająca się pęcznieniem objętości włókien33. Pęcznienie włókien zwiększa odległość między włóknami aktyny i miozyny, co skutkuje zmniejszoną wrażliwością układu miofilamentów na wapń34,35, ale może być odwrócone przez wprowadzenie dużych, osmotycznie aktywnych związków34. Ostatnim ograniczeniem, które należy wziąć pod uwagę, jest konsekwencja techniki stosowanej do mocowania włókien do aparatury doświadczalnej. Wymaga to niezmiennie zniekształcenia relacji przestrzennych w systemie żarników w punktach mocowania i w ich pobliżu, z towarzyszącymi deficytami funkcjonalnymi. W szczególności obszary włókna w punktach mocowania i przylegające do nich są funkcjonalnie naruszone, a tym samym przyczyniają się do sztucznej elastyczności szeregowej systemu pomiarowego.
Podsumowując, opisaliśmy sposób, za pomocą którego można ocenić zdolność do generowania siły przez chemicznie przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych in vitro. Chociaż w tym artykule skupiono się na ocenie maksymalnej zdolności generowania siły izometrycznej przez włókna ludzkich mięśni szkieletowych, podejście eksperymentalne może być modyfikowane i rozszerzane w celu określenia różnych parametrów kinetycznych i relacji między różnymi gatunkami, ssakami lub innymi.

Podstawową funkcją mięśni szkieletowych jest generowanie siły. Siła mięśniowa jest wywoływana in vivo poprzez złożoną sekwencję zdarzeń, która obejmuje potencjały czynnościowe nerwów ruchowych, przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe, potencjały czynnościowe włókien mięśniowych, uwalnianie wewnątrzkomórkowego wapnia oraz aktywację systemu białek regulatorowych i kurczliwych. Ponieważ generowanie siły jest ostatecznym wynikiem tej sekwencji, deficyt siły może być spowodowany awarią jednego lub więcej pojedynczych kroków. Kluczową cechą preparatu z włókien przepuszczalnych jest to, że eliminuje on większość etapów wymaganych do wytworzenia siły in vivo, pozostawiając tylko funkcje regulacyjne i kurczliwe związane z aparatem miofibrylarnym. Badacz przejmuje kontrolę nad dostarczaniem aktywującego wapnia i energii (ATP) i jest nagradzany uproszczonym systemem, który umożliwia ocenę izolowanych struktur regulacyjnych i kurczliwych w ich natywnej konfiguracji. Pomiary siły przy użyciu przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych są zatem cenne przy ocenie zmian w funkcjonowaniu mięśni obserwowanych in vivo. Na przykład użyliśmy tej techniki do scharakteryzowania zdolności generowania siły przez włókna myszy z niedoborem miostatyny1 oraz do oceny przyczyny utrzymującego się osłabienia mięśni po przewlekłym zerwaniu stożka rotatorów2,3.
Nowoczesna metodologia włókien przepuszczalnych może być śledzona we wczesnych wpływowych badaniach4,5 i jest obecnie używana przez wiele grup badawczych. Chociaż techniki te zostały opisane w literaturze, nie zostały one jeszcze przedstawione w formie wideo. Celem tego artykułu jest zilustrowanie zaktualizowanej, ważnej i wiarygodnej techniki pomiaru maksymalnej zdolności generowania siły przez pojedyncze włókna z chemicznie przepuszczalnych próbek mięśni szkieletowych. Aby to osiągnąć, pojedynczy segment włókna (określany tutaj jako "włókno") jest ekstrahowany ze wstępnie przepuszczalnej wiązki włókien i umieszczany w komorze doświadczalnej zawierającej roztwór relaksujący, którego cechą definiującą jest stężenie wapnia <10 nM. Włókno jest następnie podłączane z jednej strony do przetwornika siły, a z drugiej do regulatora długości. Gdy włókno jest utrzymywane na optymalnej długości sarkomeru, jest przenoszone do roztworu aktywującego, który ma stężenie wapnia wystarczające do wywołania maksymalnej aktywacji, a tym samym maksymalnej izometrycznej siły skurczu. Dane dotyczące siły są pozyskiwane, przechowywane i analizowane za pomocą komputera osobistego.

<table><tbody><tr><td>Probówka do hodowli polistyrenu z nakrętką</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka z nakrętką 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki do mikrowirówek 0,5 ml z o-ringiem</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>Kriobox do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>5055-5005</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Mettler-Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Niesterylny szew 10-0 monofilament</td><td>Ashaway Line Sznurek</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>Napędy</td> mikrometryczne MZ8 <td></td></tr> Parker <tr><td></td><td>Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td>Termometr</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Cyrkulator kąpieli wodnej&nbsp;</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>Seria 800</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie LabVIEW</td><td>National Instruments-Computer</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>System zróżnicowanych</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>komór</td><td>Aurora</td><td>Scientific 802D</td><td></td></tr><tr><td>Regulator długości</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik siły</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Odczynniki</td></tr><tr><td>K-proprionate</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imadizole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (kwas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2ATP&bull; 0.56H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (kwas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA (kwas)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCL (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na2CrP&bull; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Norma pH 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>Norma pH 7</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. Badania pojedynczych włókien mięśniowych są przydatne zarówno w naukach podstawowych, jak i badaniach klinicznych. W przypadku badań podstawowych, pomiary kurczliwości pojedynczych włókien mięśniowych pozwalają na zbadanie podstawowych mechanizmów wytwarzania siły oraz analizę funkcji mięśni w kontekście manipulacji genetycznych. Klinicznie badania pojedynczych włókien mięśniowych dostarczają użytecznych informacji na temat wpływu urazów i chorób na funkcjonowanie mięśni i mogą być wykorzystane do zrozumienia patologii mięśniowych. W tym artykule wideo przedstawiamy kroki wymagane do przygotowania i wyizolowania pojedynczego segmentu włókien mięśni szkieletowych, przymocowania go do aparatury do pomiaru siły, aktywacji w celu wytworzenia maksymalnej siły izometrycznej i oszacowania jego pola przekroju poprzecznego w celu normalizacji wytwarzanej siły.

Zdrowe, chemicznie permeabilizowane pojedyncze włókna powinny mieć jednolity kształt i spójne odstępy między prążkami podczas obserwacji przy dużym powiększeniu. Włókna, które są sztywne podczas manipulacji pęsetą lub wykazują wyraźne uszkodzenia strukturalne, należy odrzucić.
Cyfrowe obrazy o dużym powiększeniu wykonane w kroku 15 są analizowane w celu uzyskania 5 par pomiarów średnicy wzdłuż środkowej sekcji włókna. Powierzchnię przekroju poprzecznego (CSA) włókna szacuje się, zakładając eliptyczny przekrój poprzeczny i wyciągając średnią z 5 indywidualnych pomiarów CSA, jak przedstawiono na Rysunku 7A. Rysunek 7B służy również do zilustrowania, że wymiary włókna w jednym rzucie mogą znacznie różnić się od wymiarów parzystych w drugim rzucie (tzn. przekroje poprzeczne zazwyczaj nie są okrągłe).
Reprezentatywne przebiegi siły dla ludzkich włókien wolnokurczliwych i szybkokurczliwych przedstawiono odpowiednio na Rysunku 8A oraz 8B. Wyjściowe napięcie przetwornika siły jest rejestrowane podczas testu i przeliczane na siłę (mN) przy użyciu oprogramowania do akwizycji i analizy danych (LabVIEW). Rysunek 9 ilustruje metodę stosowaną do oceny maksymalnej siły aktywnej (Fo), która jest obliczana poprzez odjęcie siły wymaganej do utrzymania włókna w optymalnej długości sarkomeru w stanie rozluźnienia (siła pasywna, FP) od największej siły izometrycznej wygenerowanej podczas maksymalnej aktywacji włókna (siła całkowita, FT). Ponieważ wartość wyjściowa przetwornika siły odpowiadająca zerowej sile jest zazwyczaj inna dla każdej z komór kąpielowych, krótko poluzowujemy włókno zarówno w roztworze przedaktywacyjnym, jak i aktywującym, aby zarejestrować poziom zerowy w zapisie eksperymentalnym. Normalizacja maksymalnej siły aktywnej przez przekrój poprzeczny (CSA) włókna jest wykorzystywana do wyznaczenia bardziej informacyjnej wartości siły specyficznej (sFo). Dzięki uwzględnieniu CSA włókna, sFo stanowi miarę wewnętrznej zdolności do generowania siły przez aparat kurczliwy włókna, co umożliwia funkcjonalne porównania między włóknami o różnych rozmiarach. Należy jednak zauważyć, że pomiary CSA nie pozwalają na rozróżnienie proporcji włókna zajmowanej przez filamenty kurczliwe od proporcji zajmowanej przez inne struktury subkomórkowe.
Typowe charakterystyki zdrowych włókien dorosłych osobników podane przez Claflin et al. 201110 dla ludzi, Mendias et al. 20111 dla myszy oraz Gumucio et al. 20122 dla szczurów szczegółowo opisano w tabeli 3. Wszystkie dane przedstawione w tabeli 3 zostały wygenerowane przy użyciu technik opisanych w niniejszym artykule.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td>
			<td colspan="4">Człowiek 
			(mięsień obszerny boczny)</td>
			<td>Mysz 
			(EDL)</td>
			<td nowrap>Szczur 
			(mięsień podgrzebieniowy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Samiec</td>
			<td colspan="2">Kobieta</td>
			<td>Samiec</td>
			<td>Samiec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typ 1</td>
			<td>Typ 2a</td>
			<td>Typ 1</td>
			<td>Typ 2a</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.</td>
			<td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSA (μm2)</td>
			<td>4880 - 6900</td>
			<td>5270 - 8380</td>
			<td>3870 - 5470</td>
			<td>4010 - 5610</td>
			<td>1850 - 3080</td>
			<td>5290 - 8010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fo (mN)</td>
			<td>0.79 - 1.17</td>
			<td>1.02 - 1.54</td>
			<td>0.64 - 0.97</td>
			<td>0.71 - 1.07</td>
			<td>0.14 - 0.25</td>
			<td>0.55 - 0.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sFo (kPa)</td>
			<td>142 - 182</td>
			<td>165 - 210</td>
			<td>156 - 193</td>
			<td>172 - 214</td>
			<td>67 - 94</td>
			<td>102 - 131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n</td>
			<td>129</td>
			<td>160</td>
			<td>149</td>
			<td>207</td>
			<td>37</td>
			<td>94</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Tabela 3. Typowe charakterystyki zdrowych włókien dorosłych z mięśnia obszernobocznego człowieka10, mięśnia prostownika palców długiego myszy1 oraz mięśnia podrostkowego szczura2. Optymalne długości sarkomerów ustalono na 2,7 µm dla włókien ludzkich7,8 oraz 2,5 µm zarówno dla włókien mysich (36,37), jak i szczurzych (38). Eksperymentalne zakresy Lf (kwartyle 25ny i 75ny) wynosiły odpowiednio 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm i 1,32-1,59 mm dla człowieka, myszy i szczura. Przedstawione zakresy wskazują kwartyle 25ny i 75ny, a n oznacza liczbę przebadanych włókien.
Do najczęstszych problemów występujących podczas testowania należą poślizg pętli szwu, który skutkuje odpowiedzią siły z „skokiem”, takim jak ten przedstawiony na Rysunku 10A, oraz częściowe lub pełne przerwanie włókna, co prowadzi do odpowiedzi siły, która gwałtownie wraca w stronę zera lub do zera (zerwanie), podczas gdy włókno wciąż jest zanurzone w roztworze aktywującym (Rysunek 10B). Jeśli podczas eksperymentu dojdzie do poślizgu, przerwania lub zerwania, włókno należy odrzucić, a dane wykluczyć, choć prowadzenie rejestru uszkodzeń włókien może być również informacyjne11. Innym negatywnym wynikiem, który może wystąpić, jest przedwczesna aktywacja włókna podczas przebywania w roztworze przedaktywującym (Rysunek 10C). Częściowa aktywacja w roztworze przedaktywującym sugeruje znaczną kontaminację między studzienkami (t.j. niezamierzoną zwiększenie stężenia wapnia w studzience przedaktywującej). W takim przypadku wszystkie kąpiele należy odessać i dokładnie wypłukać wodą dejonizowaną. Zaleca się również osuszenie powierzchni oddzielających komory, ponieważ wilgoć lub kondensacja w tych obszarach mogą prowadzić do podsiąkania roztworu między kąpielami. Decyzja o włączeniu lub wykluczeniu danych będzie ostatecznie zależeć od celu eksperymentu i powinna zostać zatem rozważona podczas projektowania badania.
<img alt="Zwinięty drut pod mikroskopem, prezentujący strukturę cienkiej warstwy, skala 250 µm, do analizy materiałowej." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pętla szwy (monofilamentowa szew nylonowy 10-0).
<img alt="Konfiguracja eksperymentu mikroskopowego, technik laboratoryjny używa mikromanipulatora do precyzyjnej analizy próbki." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Disekcja wiązki. Pęseta znajduje się w lewej ręce, nożyczki do mikrodysekcji w prawej ręce. Czerwona linia wskazuje korzystną orientację nadgarstka i nożyczek względem osi podłużnych włókien.
<img alt="Układ mikroskopowy do badania optycznego z regulowanymi stolikami i aparaturą do mocowania próbek." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: (A) Aparatura pomiarowa z opisanymi elementami. (a) Komory eksperymentalne z przezroczystym dnem. (b) Kontroler długości. (c) Przetwornik siły. (d) Źródło światła. (e) Mikrometryczny napęd x-y-z kontrolera długości z wyświetlaczem cyfrowym. (f) Mikrometryczny napęd stolika z wyświetlaczem cyfrowym. (g) Mikrometryczny napęd x-y-z przetwornika siły. (h) Platforma dla kalibrowanego ekranu celu dyfrakcji laserowej. (i) Stół wibroizolacyjny. (B) Widok zbliżony komór eksperymentalnych. (j) Powierzchnia mocowania ze stali nierdzewnej wystająca z kontrolera długości. (k) Powierzchnia mocowania ze stali nierdzewnej wystająca z przetwornika siły. (l) Pryzmat do widoku bocznego. (m) Obudowa modułów chłodzenia termoelektrycznego. (n) Termopara do pomiaru temperatury w komorze.
<img alt="Obraz z mikroskopu przedstawiający geometrię dyszy, widok z góry i z boku; skala 1 mm, analiza precyzyjnego instrumentu." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zmodyfikowany końcówka do pipety 100 µl użyta do przeniesienia włókna z naczynia do sekcji do komory eksperymentalnej.
<img alt="Proces autotomii w mikroskali; odrywanie włókna; układ eksperymentalny; analiza separacji mechanicznej." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Montaż pojedynczego włókna w aparaturze eksperymentalnej. (A) Przygotowane pętle szewne nawleczone na stalowe powierzchnie mocujące. (B) Włókno przeniesione do komory eksperymentalnej. (C) Włókno zakotwiczone do stalowych powierzchni mocujących za pomocą pierwszej pary pętli szewnych z usunięciem nadmiaru nici. (D) Druga para pętli szewnych nawleczona nad pierwszą parą pętli i zawiązana na miejscu.
<img alt="Układ mikroskopii z wzbudzeniem optycznym do analizy DNA z wyrównaniem lasera i detekcją spektroskopową." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Długość sarkomeru jest oceniana poprzez projekcję wzoru interferencyjnego lasera na skalibrowany ekran docelowy. (a) Źródło laserowe. (b) Lustro. (c) Ekran docelowy. (d) Wzór interferencyjny lasera.
<img alt="Schemat optyczny mikroskopu; równania: CSA=ΣAᵢ/5, Σπaᵢbᵢ/5; analiza światłowodowa." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7A">
<img alt="Obraz mikroskopowy, widoki włókna z góry i z boku, podkreślające segmenty strukturalne w skali 100µm." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7B"> 
Rycina 7: (A) Wyznaczanie pola przekroju poprzecznego włókna przy optymalnej długości sarkomeru (człowiek = 2.7 µm). Przy założeniu eliptycznego przekroju poprzecznego, CSA jest obliczane dla każdego z pięciu miejsc wzdłuż środkowej sekcji włókna, a średnia z pięciu poszczególnych pomiarów jest raportowana jako CSA włókna. 2a reprezentuje średnicę w widoku z góry i jest jedną osią elipsy, 2b reprezentuje średnicę w widoku z boku i jest drugą osią elipsy. (B) Reprezentatywne obrazy włókien ilustrujące każdy z pięciu odpowiadających im pomiarów średnicy wykonanych zarówno w widoku z góry, jak i z boku.
<img alt="Wykres skurczu włókien mięśniowych; Typ 1 vs Typ 2a; pomiar siły; kPa; czas w sekundach." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Reprezentatywne zapisy siły z włókien mięśnia vastus lateralis zdrowego człowieka. (A) Włókno typu 1 (CSA: 5710 µm2, Fo: 0.89 mN i sFo: 156 kPa). (B) Włókno typu 2a (CSA: 9510 µm2, Fo: 1.66 mN i sFo: 174 kPa). Typ ciężkiego łańcucha miozyny włókien określono za pomocą rozdziału elektroforetycznego i technik barwienia srebrem22.
<img alt="schemat równowagi statycznej; analiza siła-długość; wykres napięcie-przemieszczenie; badanie mechaniki" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Obliczenie maksymalnej siły aktywnej (Fo). (a) Powiększony widok odpowiedzi siłowej włókna podczas ruchu kontrolera długości wywołującego luz, zainicjowanego w roztworze preaktywującym. FP to siła wymagana do utrzymania długości sarkomeru 2.7 µm przy włóknie w spoczynku. (b) Powiększony widok ruchu kontrolera długości wywołującego luz. Należy zauważyć, że Fo = FT– FP.
<img alt="Wykres siły w funkcji czasu pokazujący odpowiedź mechaniczną przy naprężeniu 50 kPa, schematy A, B, C." src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10: (A) Ześlizgnięcie się pętli szwu, objawiające się „skokiem” w przebiegu siły podczas jej wzrostu. Należy upewnić się, że pętle są zabezpieczone przed aktywacją włókna. (B) Przerwanie włókna podczas aktywacji. Może wynikać z niskiej integralności włókna lub zbyt agresywnego traktowania włókna podczas umieszczania pętli szwu. (C) Przedwczesna częściowa aktywacja włókna spowodowana zanieczyszczeniem komory przedaktywacyjnej jonami Ca2+.

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. W tym artykule przedstawiamy ważną i wiarygodną technikę przygotowania i badania przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych in vitro.

Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar maksymalnej zdolności generowania siły izometrycznej przez pojedyncze włókna z próbek mięśni szkieletowych poddanych permeabilizacji chemicznej. Osiąga się to poprzez najpierw wystawienie błon włókien mięśniowych na działanie detergentu chemicznego, co usuwa barierę między zawartością zewnątrzkomórkową a wewnątrzkomórkową. Drugim krokiem jest wyizolowanie pojedynczego włókna z niewielkiego pęczka włókien i przymocowanie go do aparatury eksperymentalnej.Następnie wykorzystuje się wzory interferencji laserowej do ustawienia optymalnej długości sarkomeru dla poszczególnego włókna. Na koniec podaje się wapń, aby wywołać maksymalną siłę skurczu izometrycznego. W rezultacie technika pojedynczego włókna przepuszczalnego pozwala na ocenę właściwości kurczliwych mięśnia szkieletowego bez komplikacji związanych z architekturą całego mięśnia.Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ kluczowe kroki niezbędne do pomyślnego wykonania protokołu mogą być trudne do opanowania. Należy rozpocząć od przygotowania roztworów do sekcji, przechowywania i testowania, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie, za pomocą pęsety, należy przygotować pętle szewskie z nici monofilamentowego nylonu USP 10 zero.Stosując technikę podwójnego węzła nadgarstkowego, przygotuj cztery pętle dla każdego włókna przeznaczonego do badania. Po zawiązaniu umieść węzeł pod mikroskopem i zmniejsz jego rozmiar do średnicy około 750 mikrometrów, korzystając z oznaczeń IPS GTI jako punktu odniesienia.Następnie odetnij nadmiar nici chirurgicznej, pozostawiając jedynie pętlę oraz krótkie, 500 mikrometry końcówki po obu stronach. Przenieś niewielką masę tkanki mięśniowej uzyskanej w biopsji otwartej lub igłowej do naczynia zawierającego schłodzony roztwór do sekcji i dodaj więcej roztworu, aby zapewnić całkowite zanurzenie tkanki. Obejrzyj próbkę pod mikroskopem i ułoż ją tak, aby oś podłużna włókien była skierowana w stronę prawego barku badacza.Następnie przymocuj próbkę do naczynia, przypinając ją w narożnikach pęsetą w lewej ręce i nożyczkami do mikrodissekcji w prawej. Rozpocznij delikatne oddzielanie pęczków wzdłuż krawędzi podłużnych pomiędzy włóknami. Usuń i odrzuć każdą tkankę uszkodzoną przez pęsetę lub piny.Po zakończeniu procesu sekcji przenieść pęczki z roztworu sekcyjnego do probówki o pojemności trzech mililitrów zawierającej 2,5 mililitrów świeżego, schłodzonego roztworu sekcyjnego z dodatkiem detergentu niejonowego. Inkubować próbkę na lodzie przez 30 minut, okresowo delikatnie wstrząsając i upewniając się, że pęczki pozostają zanurzone przez cały czas inkubacji. Następnie przenieść pęczki do probówki zawierającej świeży roztwór sekcyjny i delikatnie oraz krótko wstrząsnąć, aby usunąć pozostałości detergentu.Po wypłukaniu przenieś wiązki do probówki zawierającej schłodzony roztwór do przechowywania i inkubuj przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia wyjmij probówkę z przechowywania w temperaturze 4°C i przenieś wszystkie wiązki do kubka medycznego lub naczynia sekcyjnego. W celu przygotowania do przechowywania przenieś wiązki do indywidualnie oznakowanych probówek kriogenicznych, wypełnionych od 200 do 400 µL świeżego roztworu do przechowywania, i upewnij się, że wiązka nie przykleiła się do ścianki probówki i nie pływa na powierzchni.Następnie zamknij probówkę i przechowuj próbkę w temperaturze -80 °C. Przygotuj aparat doświadczalny taki, jak pokazano tutaj i opisano w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie napełnij pierwszą komorę eksperymentalną roztworem relaksacyjnym, drugą roztworem przedreaktywującym, a trzecią roztworem aktywującym.Dostosuj temperaturę w komorze, aż ustabilizuje się ona na poziomie 15 °C przy aparaturze zanurzonej w roztworze relaksacyjnym. Przeważ dwie przygotowane pętle szwów przez stalowe powierzchnie mocujące wystające zarówno z przetwornika siły, jak i kontrolera długości. Następnie rozmroź wybrany pęczek włókien na lodzie przez około 15 minut, a potem przenieś go do płytki Petriego pokrytej elastomerem silikonowym, wypełnionej świeżym, schłodzonym roztworem relaksacyjnym.Zabezieczyć wiązkę za pomocą szpilek na obu końcach i upewnić się, że jest ona zanurzona, używając pęsety. Chwycić włókno na jednym z końców i powoli wyciągać je wzdłuż jego osi podłużnej. Należy zachować ostrożność podczas wyciągania włókien z wiązki, ponieważ przyleganie włókien do macierzy zewnątrzkomórkowej może spowodować nadmierne napięcie, co w konsekwencji doprowadzi do uszkodzeń spowodowanych rozciąganiem.Po wyekstrahowaniu włókno należy wprowadzić do zmodyfikowanego końcówki pipety wraz z niewielką ilością roztworu relaksującego i przenieść do komory eksperymentalnej zawierającej roztwór relaksujący, delikatnie prowadząc je pęsetą. Należy wyjąć włókno z końcówki pipety i przymocować do kontrolera długości. Za pomocą pierwszej pętli szwu należy skierować drugi koniec włókna w stronę przetwornika siły i zabezpieczyć włókno, stosując tę samą procedurę.Usunąć nadmiar szwu za pomocą nożyczek do mikrosekcji. Następnie przełożyć drugą pętlę nad pierwszą i zakotwiczyć włókno w punkcie oddalonym o nie więcej niż 0,2 milimetra od krawędzi powierzchni mocowania kontrolera długości. Powtórzyć tę czynność z drugą pętlą po stronie przetwornika siły włókna.Dostosuj pozycję kontrolera długości wzdłuż osi Y, aby wyrównać światłowód równolegle do ścian bocznych komory eksperymentalnej. Następnie sprawdź położenie światłowodu, korzystając z widoku bocznego pryzmatu, i koryguj pozycję kontrolera długości wzdłuż osi Z, aż światłowód będzie równoległy do dna komory. Jeśli światłowód w jakikolwiek sposób uległ uszkodzeniu, należy go odrzucić i przymocować nowy.Włącz laser i dostosuj położenie stolika tak, aby wiązka lasera przechodziła przez środek włókna. Następnie ustaw długość sarkomeru, zwiększając lub zmniejszając napięcie włókna za pomocą mikrometrycznego napędu osi X kontrolera długości, aż do uzyskania pożądanego rozstawu światła dyfrakcyjnego na ekranie docelowym. Po ustawieniu optymalnej długości sarkomeru zmierz odległość między dwiema wewnętrznymi szwami.Ustaw komorę w taki sposób, aby pionowa nitka krzyża okulara pokrywała się z wewnętrzną krawędzią jednego ze szwów wewnętrznych i ustaw zero. Cyfrowy odczyt napędu mikrometrycznego przesuwa stolik wzdłuż osi x względem mikroskopu, aż pionowa nitka krzyża okulara wyrówna się z wewnętrznym szwem. Wyświetlacz cyfrowy wskaże długość włókna; utrzymując włókno o zmierzonej długości, należy użyć zamontowanej w mikroskopie kamery do wykonania obrazu o dużym powiększeniu środkowej części włókna w rzucie z góry oraz z boku.Wykorzystaj te obrazy do obliczenia pola przekroju włókna. Użyj oprogramowania sterującego komorą, aby przenieść włókno do komory zawierającej roztwór przedreaktywujący i inkubuj je tam przez trzy minuty. Podczas gdy włókno znajduje się w roztworze inaktywującym, zmierz jego napięcie pasywne, a następnie przenieś włókno do komory zawierającej roztwór aktywujący i poczekaj na rozwinięcie maksymalnej siły izometrycznej, co zostanie potwierdzone przez osiągnięcie plateau siły po gwałtownym wzroście.Następnie należy użyć kontrolera długości, aby zastosować gwałtowną i krótkotrwałą redukcję odległości między punktami mocowania włókna, a następnie szybko powrócić do pierwotnej długości, w celu zidentyfikowania sygnału z przetwornika siły odpowiadającego wartości zero. Przedstawione tutaj siły obejmują widoki z góry i z boku włókna o kształcie eliptycznym. Powierzchnię przekroju poprzecznego określono poprzez pomiar średnic w pięciu punktach wzdłuż długości włókna, a następnie obliczenie średniej z pięciu otrzymanych pól powierzchni.Zapisy siły z ludzkich włókien mięśniowych wolnych i szybkich pokazują, że włókna szybkie generują siłę z wyższą prędkością niż włókna wolne przy zastosowaniu techniki przedstawionej w tym filmie. Pomiarowi poddano typowe cechy włókien mięśniowych człowieka, myszy i szczura, które zaprezentowano w niniejszym materiale. Wyświetlony zakres wskazuje kwartyle od 25% do 75%, a N oznacza liczbę przebadanych włókien.Należy zwrócić uwagę na znaczną zmienność siły właściwej pomiędzy poszczególnymi gatunkami. Przedstawione tutaj procedury umożliwiają ocenę maksymalnej wewnętrznej zdolności generowania siły pojedynczego włókna mięśnia szkieletowego poprzez wprowadzenie dodatkowych interwencji, obejmujących istotne aspekty fizjologii mięśni szkieletowych, w tym między innymi zależności siła-długość, siła-prędkość oraz relacje siły i wapnia.

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez permeabilizowane włókna mięśniowe szkieletu

W niniejszym filmie przedstawiono modulację aktywności odruchowej, siły wolicjonalnej oraz zdolności do poruszania się, ocenianych za pomocą pomiarów klinicznych i ilościowych u osób z niepełnym uszkodzeniem rdzenia kręgowego (SCI) w obrębie funkcji motorycznych, po ostrym podaniu doustnym inhibitora wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRI).

Metody ilościowego pomiaru farmakologicznie indukowanych zmian w funkcji motorycznej u ludzi z niepełnym uszkodzeniem rdzenia kręgowego

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Niniejszy film prezentuje chirurgiczne przygotowanie i procedury niezbędne do badania odpowiedzi skurczowej preparatu przyśrodkowej części mięśnia brzuchatego szczura in situ. Preparat ten umożliwia pomiar właściwości skurczowych mięśnia szkieletowego w warunkach fizjologicznych. Zwierzę zostaje poddane znieczuleniu, a mięsień zostaje oddzielony od otaczających go tkanek na jego końcu dystalnym. Ścięgno Achillesa zostaje przymocowane do przetwornika siły, co pozwala na pomiar odpowiedzi...

Procedury badania właściwości kurczliwych mięśni szkieletowych szczura in situ

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca2+ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Pomiary funkcji mięśni przyczyniają się do oceny potencjalnych metod leczenia patologii mięśni, jak również do określenia mechanizmów leżących u podstaw fizjologii tej tkanki.   Zademonstrujemy przygotowanie mięśni prostownika długiego palca i przepony do testów funkcjonalnych. Pokazane zostaną protokoły skurczów izometrycznych i ekscentrycznych, a także różnice w wynikach między mięśniami dystroficznymi, reprezentującymi stan patologiczny, a mięśniami typu dzikiego.

Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Przedstawiamy protokół oceny zmian w funkcjonowaniu nerwowo-mięśniowym. Przezskórna elektryczna stymulacja nerwów to nieinwazyjna metoda, która wywołuje reakcje mięśniowe. Właściwości elektrofizjologiczne i mechaniczne tych reakcji pozwalają na ocenę funkcji nerwowo-mięśniowej od mózgu do mięśni (poziom nardzeniowy, rdzeniowy i obwodowy).

Ocena funkcji nerwowo-mięśniowej za pomocą przezskórnej elektrycznej stymulacji nerwów

Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.

Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny właściwości kurczliwych miofibryli mięśni prążkowanych z rozdzielczością nano-Newtona. Protokół wykorzystuje konfigurację z opartą na interferometrii sondą siły optycznej. Taka konfiguracja generuje dane o wysokim stosunku sygnału do szumu i umożliwia ocenę kinetyki kurczliwości miofibryli.

Izolowanie miofibryli z biopsji mięśni szkieletowych i określanie funkcji skurczu za pomocą przetwornika siły o rozdzielczości nano-Newtona

Ocena regeneracji motorycznej pozostaje punktem odniesienia w eksperymentalnych badaniach nerwów obwodowych. Izometryczny pomiar siły tężcowej mięśnia piszczelowego przedniego u szczura jest nieocenionym narzędziem do oceny wyników funkcjonalnych po rekonstrukcji wad nerwu kulszowego. Metody i niuanse są szczegółowo opisane w tym artykule.

Maksymalny izometryczny pomiar siły tężcowej mięśnia piszczelowego przedniego u szczura

Obecny protokół opisuje zwięzłe szczegóły eksperymentalne dotyczące oceny i interpretacji danych in vivo dotyczących momentu obrotowego uzyskanych za pomocą elektrycznej stymulacji wspólnego nerwu strzałkowego u znieczulonych świń.

In vivo (in vivo) Pomiar izometrycznego momentu obrotowego zginacza grzbietowego kończyny tylnej od świni

Naucz się mierzyć maksymalną siłę izometryczną pojedynczych włókien mięśni szkieletowych. Ta metoda pozwala ocenić właściwości kurczliwe bez złożoności całych mięśni.

Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów