Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. W tym artykule przedstawiamy ważną i wiarygodną technikę przygotowania i badania przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych in vitro.

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar maksymalnej zdolności generowania siły izometrycznej przez poszczególne włókna z próbek mięśni szkieletowych przepuszczalnych chemicznie. Osiąga się to poprzez najpierw wystawienie błon włókien mięśniowych na działanie chemicznego detergentu, usuwając w ten sposób barierę między treścią zewnątrzkomórkową i wewnątrzkomórkową. Drugim krokiem jest ekstrakcja pojedynczego włókna z małego wiązki włókien i przymocowanie go do aparatury doświadczalnej.

Następnie wykorzystuje się wzorce interferencji laserowej do ustawienia optymalnej długości sarkomeru dla pojedynczego włókna. Na koniec podaje się wapń w celu wywołania maksymalnej izometrycznej siły skurczu. Ostatecznie, technika trwałej ondulacji z pojedynczych włókien zapewnia ocenę właściwości kurczliwych mięśni szkieletowych bez złożoności związanej z architekturą całych mięśni.

Wizualna demonstracja tej metody jest przydatna, ponieważ kluczowe kroki do pomyślnego wykonania protokołu mogą być trudne do nauczenia. Zacznij od przygotowania roztworów do preparacji, przechowywania i testowania zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie za pomocą kleszczy przygotuj pętle do szwów z pasm nylonowego szwu monofilamentowego USP 10 zero.

Korzystając z techniki podwójnego węzła overhand, przygotuj cztery pętle dla każdego badanego włókna. Po uformowaniu umieść węzeł pod mikroskopem i zmniejsz jego rozmiar do około 750 mikrometrów średnicy. Posługiwanie się oznaczeniami IPS GTI jako wskazówką.

Następnie przytnij nadmiar szwu, pozostawiając tylko pętlę i małe ogonki o długości 500 mikrometrów po obu stronach. Przenieść niewielką masę tkanki mięśniowej uzyskaną w wyniku biopsji otwartej lub igłowej do naczynia zawierającego schłodzony roztwór preparacyjny i dodać więcej roztworu preparacyjnego, aby upewnić się, że tkanka pozostaje zanurzona. Sprawdź próbkę pod mikroskopem i zmanipuluj nią, aby wyrównać oś podłużną włókien w kierunku prawego ramienia badacza.

Następnie zakotwicz próbkę w naczyniu, przypinając ją w rogach kleszczami w lewej ręce i mikronożyczkami preparacyjnymi w prawej. Zacznij delikatnie rozcinać wiązkę wzdłuż podłużnych brzegów między włóknami. Usuń i wyrzuć wszelkie tkanki, które zostały uszkodzone przez kleszcze lub szpilki.

W wyniku procesu preparacji przenieść wiązki z roztworu preparacyjnego do trzymililitrowej fiolki zawierającej 2,5 mililitra świeżo schłodzonego roztworu preparacyjnego z dodatkiem niejonowego detergentu. Inkubować próbkę na lodzie przez 30 minut, od czasu do czasu delikatnie mieszając, i upewnić się, że wiązki pozostają zanurzone przez cały czas inkubacji. Następnie przenieść wiązki do fiolki zawierającej świeży roztwór preparacyjny i delikatnie i krótko mieszać, aby usunąć pozostały detergent.

Po wypłukaniu przenieść wiązki do fiolki zawierającej schłodzony roztwór do przechowywania i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wyjmij fiolkę z magazynu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieś wszystkie zawiniątka do kubka na lek lub naczynia do sekcji. Przygotowując się do przechowywania, przenieś wiązki do indywidualnie oznakowanych fiolek kriogenicznych, wypełnionych od 200 do 400 mikrolitrów świeżego roztworu do przechowywania i upewnij się, że wiązka nie przykleja się do boku probówki ani nie unosi się na powierzchni.

Następnie zakryj probówkę i przechowuj próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ustaw aparaturę doświadczalną, taką jak ta pokazana tutaj i opisana w dołączonym protokole tekstowym. Następnie napełnij pierwszą komorę doświadczalną roztworem relaksującym, drugą komorę roztworem wstępnie reaktywującym, a trzecią roztworem aktywującym.

Dostosuj temperaturę w komorze, aż ustabilizuje się na poziomie 15 stopni Celsjusza za pomocą aparatu w roztworze relaksacyjnym. Nawlecz dwie z przygotowanych pętli szwów na powierzchnie mocujące ze stali nierdzewnej wystające zarówno z przetwornika siły, jak i regulatora długości. Następnie rozmrażaj interesujący Cię pakiet włókien na lodzie przez około 15 minut, a następnie przenieś go na pokrytą elastomerem silikonowym szalkę Petriego wypełnioną świeżym, schłodzonym roztworem relaksującym.

Przymocuj wiązkę za pomocą kołków na obu końcach i upewnij się, że jest zanurzona za pomocą kleszczy. Chwyć włókno na jednym końcu i zacznij płynnie wyciągać je wzdłuż jego osi podłużnej. Należy zachować ostrożność podczas ekstrakcji włókien z wiązki, ponieważ zrosty między włóknami a macierzą zewnątrzkomórkową mogą powodować nadmierne napięcie, co ostatecznie prowadzi do uszkodzeń spowodowanych rozciąganiem.

Po ekstrakcji wprowadź włókno do zmodyfikowanej końcówki pipety wraz z niewielką ilością roztworu relaksującego i przenieś je do komory eksperymentalnej, która zawiera roztwór relaksujący, delikatnie prowadząc kleszczami. Usuń włókno z końcówki pipety i zakotwicz je w regulatorze długości. Używając pierwszej pętli do szwów, manipuluj drugim końcem włókna w kierunku przetwornika siły i zabezpiecz włókno przy użyciu tej samej procedury.

Usuń nadmiar szwów za pomocą mikronożyczek preparacyjnych. Następnie nawlecz drugą pętlę na pierwszą i zakotwicz włókno w punkcie w odległości 0,2 milimetra od końca powierzchni mocowania regulatora długości. Powtórz z drugą pętlą na końcu przetwornika siły światłowodu.

Wyreguluj położenie regulatora długości w kierunku osi Y, aby wyrównać światłowód równolegle do bocznych ścianek komory doświadczalnej. Następnie zbadaj światłowód za pomocą pryzmatu bocznego view i wyreguluj położenie regulatora długości w kierunku osi Z, aż światłowód będzie równoległy do podłogi komory. Jeśli włókno jest w jakikolwiek sposób uszkodzone, włókno należy wyrzucić i dołączyć nowe włókno.

Włącz laser i dostosuj położenie stolika tak, aby laser przechodził przez środek światłowodu. Następnie ustaw długość sarkomeru, zwiększając lub zmniejszając napięcie światłowodu za pomocą sterownika mikrometru osi X kontrolera długości, aż na ekranie docelowym zostanie zaobserwowany pożądany odstęp między światłem dyfrakcyjnym. Po ustaleniu optymalnej długości sarkomeru zmierz odległość między dwoma najbardziej wewnętrznymi szwami.

Ustaw komorę tak, aby pionowy krzyż nitkowy okularu był wyrównany na najbardziej wewnętrznej granicy jednego szwu wewnętrznego i zera. Cyfrowy odczyt na napędzie mikrometrycznym przesuwa stolik wzdłuż osi x względem mikroskopu, aż pionowy krzyż nitkowy okularu zrówna się z najbardziej wewnętrznym szwem. Cyfrowy wyświetlacz wskaże długość włókna, utrzyma włókno na zmierzonej długości i użyje kamery zamontowanej na mikroskopie do uchwycenia obrazu w dużym powiększeniu centralnej części światłowodu zarówno z góry, jak i z boku.

Użyj tych obrazów, aby obliczyć pole przekroju poprzecznego włókna. Użyj oprogramowania sterującego komorą, aby przenieść włókno do komory zawierającej roztwór wstępnej reaktywacji i inkubować tam przez trzy minuty. Podczas gdy włókno inaktywuje roztwór, zmierz jego napięcie bierne, a następnie przenieś włókno do komory zawierającej roztwór aktywujący i pozwól, aby wytworzyła się maksymalna siła izometryczna, o czym świadczy plateau siły, które jest poprzedzone szybkim wzrostem.

Następnie użyj kontrolera długości, aby zastosować duże, szybkie i krótkie zmniejszenie odległości między punktami mocowania światłowodu, a następnie szybki powrót do pierwotnej długości, aby zidentyfikować wyjście przetwornika siły, które odpowiada zero. Pokazana tutaj siła to zarówno widok z góry, jak i z boku eliptycznie ukształtowanego włókna z tych widoków. Pole przekroju poprzecznego określono poprzez pomiar średnic w pięciu punktach na długości włókna, a następnie obliczenie średniej z pięciu powstałych obszarów.

Ślady siły z ludzkich, wolnych i szybkich włókien mięśniowych ilustrują, że szybkie włókna generują siłę z większą szybkością niż wolne włókna przy użyciu techniki pokazanej w tym filmie. Zmierzono typowe cechy włókien mięśniowych ludzkich myszy i szczurów, które przedstawiono tutaj. Pokazany zakres oznacza od 25. do 75. kwartyla, a N to liczba badanych włókien.

Zwróć uwagę na duże zróżnicowanie siły właściwej między różnymi gatunkami. Przedstawione tutaj procedury skutkują oceną maksymalnej wewnętrznej zdolności generowania siły pojedynczego włókna mięśnia szkieletowego poprzez dodanie dodatkowych interwencji, ważnych aspektów fizjologii mięśni szkieletowych, w tym między innymi długości, siły, prędkości i siły. Można ujawnić zależności wapniowe.