Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

W ostatnich latach enkapsulacja w dwuwarstwowych pęcherzykach lipidowych wielkości komórki okazała się przydatną metodą w eksperymentach rekonstytucji in vitro. Przedstawiona przez nas metoda znacznie pomoże w rekonstytucji cytoszkieletu w badaniach nad komórkami syntetycznymi. Dzięki tej metodzie możemy wygenerować gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe o niejednorodnej wielkości z wysoką wydajnością.

Czas generowania pęcherzyków jest znacznie skrócony w porównaniu z konwencjonalną techniką cDICE. Możemy hermetyzować bezkomórkowe systemy transkrypcyjno-translacyjne odizolowane od złożonych, jednocześnie zachodzących procesów komórkowych w celu zbadania szlaków molekularnych. Ta metoda może być wykorzystana do składania minimalnych protokomórek w celu stworzenia funkcjonalnych komórek syntetycznych.

Rozpocznij przygotowanie mieszaniny olejowo-lipidowej, przenosząc dioleoilofosfocholinę, cholesterol i rodaminę PE do 15-mililitrowej szklanej fiolki. Następnie dodaj 0,5 mililitra chloroformu do fiolki. Odpipetuj 7,2 mililitra oleju silikonowego i 1,8 mililitra oleju mineralnego w osobnej 15-mililitrowej tubie i wymieszaj oleje, wirując z prędkością 3 200 obrotów na minutę przez 10 sekund.

Następnie dodaj mieszaninę oleju do fiolki zawierającej mieszaninę lipidów i chloroformu i wiruj mieszaninę z prędkością 3 200 obrotów na minutę przez 10 do 15 sekund, aż powstała mieszanina lipidów w oleju będzie lekko mętna, ponieważ lipidy nie są całkowicie rozpuszczone w oleju. Następnie sonikować lipid w dyspersji olejowej w sonikatorze kąpielowym o mocy ultradźwiękowej 80 watów i częstotliwości roboczej 40 kiloherców przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli nie zostanie natychmiast zużyta, przechowuj mieszaninę lipidów i oleju w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Aby wygenerować pęcherzyki, użyj zespołu z wydrukowanym w 3D wałem wykonanym z czarnej żywicy zamontowanym na płycie mieszającej na stole z prędkością 1 200 obrotów na minutę. Następnie zamontuj wydrukowaną w 3D ciągłą obudowę interfejsu kropelkowego lub komorę cDICE, wykonaną z przezroczystej żywicy na czarnym trzonie żywicy. Przygotuj 1-10-mikromolowy roztwór aktyny w globularnym buforze aktyny lub buforze G, zawierającym 10% aktynę ATO 488.

Aby rozpocząć polimeryzację aktyny, dodaj nitkowaty bufor polimeryzacji aktyny lub bufor F w roztworze aktyny na lodzie, a następnie utrzymuj roztwory na lodzie, aby spowolnić polimeryzację aktyny przed dodaniem środka sieciującego. Aby przygotować białka wiążące aktynę lub ABP, od 1,75 miligrama na mililitr faszyny, podwielokrotność 1,57 mikrolitra faszyny w osobnej mikroprobówce. Następnie dodaj 7,5% pożywki o gradiencie gęstości do roztworu aktyny, aby utworzyć gradient gęstości między zewnętrzną i wewnętrzną fazą wodną i ułatwić gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe lub GUV, sedymentację.

Następnie wlej do komory 700 mikrolitrów 200-milimolowej glukozy jako roztwór zewnętrzny. Dodaj wystarczającą ilość mieszanki lipidowo-olejowej do komory, aż komora zostanie wypełniona w 60% do 80%. Między mieszaniną lipidowo-olejową a roztworem zewnętrznym zostanie utworzony interfejs.

Przygotuj mieszaninę aktyny-ABP, przenosząc ABP do roztworu aktyny. Następnie użyj zwykłej pipety o pojemności od 100 do 1 000 mikrolitrów, aby przenieść 700 mikrolitrów mieszaniny lipidów i oleju do mieszaniny aktyny-ABP. Pipetuj w górę i w dół osiem razy, aby wytworzyć kropelki monowarstwowej emulsji lipidowej wielkości komórki o średnicy od 7 do 100 mikronów.

Użyj tej samej pipety o pojemności od 100 do 1 000 mikrolitrów, aby dozować całą emulsję do komory obrotowej. Kropelki uzyskają drugą warstwę lipidów, przechodząc przez monowarstwę lipidową na granicy faz olej-roztwór zewnętrzny, tworząc w ten sposób GUV. Po zakończeniu wyjmij komorę z płytki mieszającej i wyrzuć większość mieszaniny lipidów i olejów, przechylając komorę w pojemniku na odpady.

Trzymając komorę pokrywą skierowaną do wewnątrz, otwórz pokrywę komory i lekko przechyl komorę do wewnątrz. Granica faz między zewnętrznym roztworem zawierającym GUV a mieszaniną lipidów i oleju będzie widoczna z otworu komory, w którym znajduje się pokrywa. Za pomocą pipety zebrać wystarczającą ilość roztworu zewnętrznego zawierającego GUV i dozować od 50 do 300 mikrolitrów roztworu zewnętrznego do płytki 96-dołkowej, aby uzyskać odpowiednią gęstość GUV.

Aby zobrazować GUV, ustaw 96-dołkową płytkę na stoliku odwróconego mikroskopu wyposażonego w soczewkę obiektywu 60X zanurzoną w olejku. Otwórz interesującą sekwencję obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, ImageJ Fiji, i zidentyfikuj obraz o najwyższej intensywności. Przytrzymaj Control Shift C, aby otworzyć okno jasności i kontrastu i kliknij kartę resetowania.

W menu ImageJ Fiji przejdź do kart Analizuj i Ustaw skalę, aby wprowadzić znaną odległość fizyczną i jednostkę dla każdego piksela obrazu. Po zakończeniu przejdź do Obraz, Stosy, a następnie Projekt 3D przyciski, aby zrekonstruować obraz 3D ze stosu Z. Ustaw metodę projekcji na Punkt jasności, odstępy między plasterkami na 0,5 mikrometra, a następnie zaznacz pole wyboru Interpolacja.

Użyj opcji domyślnych dla pozostałych ustawień i przechwytuj obrazy. Reprezentatywny obraz przedstawia konfokalny obraz GUV znakowanych rodaminą PE z zamkniętymi wiązkami faszynowo-aktynowymi . Przeniesienie białek wiążących aktynę do roztworu aktyny, a następnie dodanie mieszaniny lipidowo-olejowej i wytworzenie kropelek monowarstwy lipidowej powinno nastąpić w ciągu kilku sekund, aby uniknąć tworzenia się sieci aktynowych przed enkapsulacją.

Wykorzystaliśmy tę zmodyfikowaną technikę cDICE do zbadania ról różnych sieciowców sieciujących aktyny w organizowaniu sieci aktynowych. Spodziewamy się, że ta metoda pomoże innym badaczom w zbadaniu regulacji innych białek cytoszkieletu.