Name: Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj szybką metodę enkapsulacji odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych. Technika ta umożliwia badanie interakcji cytoszkielet-błona w biologii syntetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

APL dziękuje za wsparcie ze strony Humboldt Research Fellowship dla doświadczonych badaczy oraz National Science Foundation (1939310 i 1817909) oraz National Institutes of Health (R01 EB030031).

1. Przygotowanie mieszaniny olejowo-lipidowej
UWAGA: Krok ten musi być wykonany w dygestorio, przestrzegając wszystkich wytycznych bezpieczeństwa dotyczących obchodzenia się z chloroformem.
<ol>
	<li>Pobrać 0,5 ml chloroformu do szklanej fiolki o pojemności 15 ml. Dodać 88 μl 25 mg/ml dioleoilofosfocholiny (DOPC), 9,3 μl 50 mg/ml cholesterolu i 5 μl 1 mg/ml dioleoilo-fosfoetanoloaminy-lizaminy B (rodamina PE) (patrz tabela materiałów) do 15 ml szklanej fiolki. 
	UWAGA: Końcowe frakcje molowe DOPC i cholesterolu w oleju silikonowym/oleju mineralnym wynoszą odpowiednio 69,9% i 30%. Ustalono, że cholesterol o stężeniu 20-30 mol% jest zoptymalizowanym pod kątem płynności błonowej i stabilności GUV generowanych przy użyciu przedstawionej techniki25,26. Fizjologicznie wartości te mieszczą się w zakresie stężeń cholesterolu występujących w błonach plazmatycznych komórek ssaków6. Zapasy lipidów są pozyskiwane w postaci roztworów chloroformu i przechowywane w temperaturze -20 °C. Fiolki z lipidami powinny być zaaklimatyzowane do temperatury pokojowej przed ich otwarciem.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 7,2 ml oleju silikonowego i 1,8 ml oleju mineralnego do drugiej fiolki o pojemności 15 ml (patrz tabela materiałów). Ogólnie rzecz biorąc, należy to zrobić w schowku rękawicowym o niskiej wilgotności, głównie jeśli olej mineralny jest ponownie używany.</li>
	<li>Mieszać oleje wirując z maksymalną prędkością obrotową (3200 obr./min) przez 10 s, dodać mieszaninę do fiolki zawierającej mieszaninę lipidów w chloroformie i natychmiast umieścić ją w mieszalniku wirowym. Wir przez 10-15 s przy maksymalnej prędkości obrotowej (3200 obr./min). Powstała mieszanina lipidów w oleju powinna być lekko mętna, ponieważ lipidy nie są całkowicie rozpuszczone w oleju, ale raczej rozproszone jako małe agregaty24.</li>
	<li>Umieścić dyspersję lipidów w oleju w sonikatorze kąpielowym (patrz Tabela Materiałów) o mocy ultradźwiękowej 80 W i częstotliwości roboczej 40 kHz w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Mieszaninę należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie pęcherzyków
<ol>
	<li>Zamontuj wydrukowany w 3D wałek (plik uzupełniający 1) wykonany z czarnej żywicy (patrz tabela materiałów) na płycie mieszającej na stole i ustaw prędkość obrotową na 1200 obr./min.</li>
	<li>Zamontuj wydrukowaną w 3D komorę cDICE (plik uzupełniający 2) wykonaną z przezroczystej żywicy (patrz tabela materiałów) na wale (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A,B).</li>
	<li>Roztwory aktyny i białek wiążących aktynę (ABP) należy przygotować oddzielnie w łącznej objętości 20 μl.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1-10 μM aktyny w globularnym buforze aktyny (bufor G), w tym 10% aktyny ATTO 488 (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: 1x G-buffer zawiera 5 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 0,2 mM CaCl2.</li>
		<li>Dodaj nitkowaty bufor polimeryzacyjny aktyny (bufor F), aby rozpocząć polimeryzację aktyny na lodzie. Utrzymuj roztwory na lodzie, aby spowolnić polimeryzację aktyny przed dodaniem środka sieciującego. 
		UWAGA: 1x bufor F zawiera 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 i 3 mM ATP w 10 mM Tris, pH 7,5.</li>
		<li>Odczekaj 15 minut, aby umożliwić rozpoczęcie polimeryzacji aktyny na lodzie przed dodaniem interesujących środków sieciujących przy pożądanym stosunku molowym. Roztwór należy przechowywać na lodzie do momentu kapsułkowania.</li>
		<li>Przygotuj białka wiążące aktynę (ABP) oddzielnie w mikroprobówce (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
		UWAGA: Ten krok jest wykonywany, gdy kombinacja ABP (np. miozyna, α-aktynina, faszyna, kompleks Arp2/3) otacza się aktyną25,26,27. W takich przypadkach żądana ilość każdego ABP jest pobierana z jego zapasu i dodawana do mikroprobówki przeznaczonej dla ABP. Ponieważ całkowity roztwór ma wynosić 20 μl, należy przygotować podstawowe porcje ABP tak, aby pożądana ilość całkowitej mieszaniny ABP nie przekraczała 5-6 μl. Jedynym ABP użytym w reprezentatywnych wynikach jest faszyna, o której przygotowaniu wspomniano poniżej.
		<ol>
			<li>Podwielokrotność 1,57 μl faszyny z 1,75 mg/ml materiału faszynowego (patrz tabela materiałów) i bezpośrednio dodać do roztworu aktyny w kroku 2.7. Odpowiada to 2,5 μM faszyny w roztworze.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 7,5% pożywki o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) do roztworu aktyny, aby utworzyć gradient gęstości między zewnętrzną i wewnętrzną fazą wodną, aby ułatwić sedymentację GUV.</li>
	<li>Dozować 700 μl zewnętrznego roztworu 200 mM glukozy do komory (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D, po lewej). 
	UWAGA: Osmolarność roztworu wewnętrznego decyduje o stężeniu glukozy. W tych eksperymentach osmolarność roztworu wewnętrznego wynosi ~200 mOsm, więc jako roztwór zewnętrzny stosuje się roztwór glukozy o stężeniu 200 mM.</li>
	<li>Dodaj wystarczającą ilość mieszaniny lipidów i olejów (>3 ml w zależności od wielkości komory) do komory, aż 60%-80% komory zostanie wypełnione (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, po prawej). Między mieszaniną lipidowo-olejową a roztworem zewnętrznym zostanie utworzony interfejs.</li>
	<li>Przenieść ABP (przygotowane w kroku 2.3.4) do roztworu aktyny. Używając zwykłej pipety o pojemności 100-1000 μl, natychmiast przenieś 700 μl mieszaniny lipidów i oleju do mieszaniny aktyny-ABP (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1E, po lewej). Pipetuj w górę i w dół 8 razy, aby wytworzyć jednowarstwowe kropelki lipidowe wielkości komórki o średnicy w zakresie 7-100 μm (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1E, środek). 
	UWAGA: Krok 2.7 należy wykonać w ciągu kilku sekund, aby uniknąć montażu sieci aktynowej przed enkapsulacją. Dlatego przed wykonaniem tego kroku upewnij się, że końcówki pipet są już włożone do pipet i gotowe do przenoszenia mieszanin.</li>
	<li>Używając tej samej pipety o pojemności 100-1000 μl, natychmiast dozuj całą emulsję do komory obrotowej. Kropelki uzyskają drugą warstwę lipidów, przechodząc przez monowarstwę lipidową na granicy faz olej-zewnętrzny roztwór roztworu, tworząc w ten sposób GUV (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E, po prawej).</li>
	<li>Wyjąć komorę z płytki mieszającej i wyrzucić większość mieszaniny lipidów i olejów, przechylając komorę w pojemniku na odpady tak, aby duża część mieszaniny lipidów i oleju została spuszczona z dużego otworu pośrodku komory. 
	UWAGA: W ten sposób mieszanina lipidowo-olejowa jest wyciągana z komory, unikając mieszania mieszaniny lipidowo-olejowej z roztworem zewnętrznym w kolejnym kroku.</li>
	<li>Trzymaj komorę z pokrywą skierowaną w stronę użytkownika. Otwórz pokrywę komory i lekko przechyl komorę w kierunku użytkownika. Granica faz między zewnętrznym roztworem zawierającym GUV a mieszaniną lipidów i oleju jest widoczna z otworu komory (gdzie znajduje się pokrywa).</li>
	<li>Za pomocą pipety zebrać wystarczającą ilość roztworu zewnętrznego zawierającego GUV i dozować 50-300 μl roztworu zewnętrznego do płytki 96-dołkowej, aby uzyskać odpowiednią gęstość GUVs. 
	UWAGA: Zgodnie z tym protokołem, w roztworze zewnętrznym wewnątrz komory uwalnia się łącznie około 2 x 105 GUV. Dyspersja GUV nie została określona ilościowo; jednak średnica około 90% GUV mieści się w zakresie 12-30 μm. W populacji można znaleźć GUV o dowolnej średnicy w zakresie 7-50 μm. W zależności od zamkniętego ośrodka gradientu gęstości, wielkości GUV i głębokości roztworu w płytce studziennej, GUV potrzebuje 2-15 minut, aby osiąść na powierzchni. Wydajność GUV z rozpuszczonymi wiązkami aktyny wynosi około 90%.</li>
</ol>
3. Obrazowanie i rekonstrukcja obrazu 3D
<ol>
	<li>Ustaw 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w jednostkę konfokalną z wirującym dyskiem (lub skanowaniem laserowym), kamerę EMCCD lub sCMOS oraz soczewkę obiektywu 60x zanurzoną w oleju (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Skoncentruj się na dowolnym obszarze zainteresowania (ROI) i utwórz sekwencję obrazów stosu z obszaru zainteresowania z interwałem kroku z wynoszącym 0,5 μm. 
	UWAGA: Ponieważ GUV mogą z czasem ulegać nieznacznemu przemieszczeniu na powierzchni, zaleca się uchwycenie zestawu obrazów o wielu długościach fal w każdej płaszczyźnie z, jeśli obrazowanych jest wiele fluoroforów, tj. należy wykonać grupę obrazów o długości fali 561 nm i 488 nm na każdym pasie z naraz, aby uchwycić obrazy aktyny ATTO 488 i Rhod PE.</li>
	<li>Zapisz każdą sekwencję obrazów z-stack w .tiff formacie.</li>
	<li>Otwórz interesującą sekwencję obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów (ImageJ/Fiji). Zidentyfikuj obraz o największej intensywności. Przytrzymaj "ctrl+shift+c", aby otworzyć okno Jasność i kontrast i kliknij Resetuj.</li>
	<li>Z menu ImageJ/Fiji przejdź do opcji Analizuj > ustaw skalę i wprowadź znaną odległość fizyczną oraz jej jednostkę dla każdego piksela obrazu.</li>
	<li>Z menu ImageJ/Fiji przejdź do pozycji Image > Stacks > 3D project, aby zrekonstruować obraz 3D ze stosu z. Ustaw "Metoda projekcji" jako Punkt jasności, "Odstępy między warstwami (μm)" na 0,5 i zaznacz pole wyboru Interpoluj. Opcje domyślne mogą być używane dla pozostałych ustawień. 
	UWAGA: Interwały z w niektórych mikroskopach mogą nie być skalibrowane, a rzeczywisty ruch w kierunku z może nieznacznie różnić się od wprowadzonego interwału Z (tj. 0,5 μm). W takich przypadkach do uzyskania rzeczywistego interwału Z można użyć próbki kalibracyjnej 3D, takiej jak mikrosfery fluorescencyjne o znanej średnicy. Wartość ta będzie zatem używana jako "Odstęp między warstwami (μm)" do projekcji 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Groaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+spatiotemporal+organization+and+dynamics+in+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685(2021).</li>
<li>Diltemiz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+artificial+cells+as+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Chemistry+Frontiers%22%5BJournal%5D)">Use of artificial cells as drug carriers.</a> Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li>
<li>Ganzinger, K. A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+from+less+-+bottom-up+reconstitution+of+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">More from less - bottom-up reconstitution of cell biology.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), 227488(2019).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+the+cytoskeleton%3A+Towards+mimicking+the+mechanics+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell.</a> Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).</li>
<li>Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics%2C+architecture%2C+and+mechanics+in+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+reviews%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility.</a> Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions+of+the+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).</li>
<li>Bailey, A. L., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+with+cationic+liposomes%3A+Effects+of+target+membrane+lipid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition.</a> Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).</li>
<li>Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+scales+of+membrane+fusion+revealed+by+direct+imaging+of+vesicle+fusion+with+high+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).</li>
<li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li>
<li>Noireaux, V., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+age+of+cell-free+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The new age of cell-free biology.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).</li>
<li>Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+cells+by+combining+HeLa-based+cell-free+expression+and+ultrathin+double+emulsion+template%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template.</a> Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).</li>
<li>Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+giant+liposomes+in+physiological+conditions+and+their+characterization+under+an+optical+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).</li>
<li>Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+unilamellar+vesicle+electroformation%3A+From+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles%3A+Preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles: Preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+induced+by+11-mer+anionic+and+cationic+peptides%3A+A+structure%E2%88%92+function+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study.</a> Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).</li>
<li>Morigaki, K., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicle+formation+from+oleic+acid%2Fsodium+oleate+on+glass+surfaces+induced+by+adsorbed+hydrocarbon+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules.</a> Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).</li>
<li>Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+complex+solutions+using+droplet+microfluidics+towards+the+synthesis+of+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001(2019).</li>
<li>Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+droplet+interface+crossing+encapsulation+%28cDICE%29+for+high+throughput+monodisperse+vesicle+design%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design.</a> Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).</li>
<li>Van de Cauter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cDICE+for+efficient+reconstitution+of+biological+systems+in+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).</li>
<li>Claudet, C., In, M., Massiera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+disperse+lipids+as+aggregates+in+oil+for+bilayers+production%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+E%22%5BJournal%5D)">Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production.</a> The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+Geometry+tunes+fascin-actin+bundle+structures+and+consequently+the+shape+of+a+lipid+bilayer+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277(2020).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+crosslinker+competition+and+sorting+drive+emergent+GUV+size-dependent+actin+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture.</a> Communications Biology. 4, 1136(2021).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Litschel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+rings+in+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li>
<li>Vitale, S. A., Katz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+dispersions+formed+by+homogeneous+liquid%E2%88%92+liquid+nucleation%3A%26%2334%3BThe+Ouzo+effect.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:&#34;The Ouzo effect.&#34.</a> Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+asymmetric+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering asymmetric vesicles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).</li>
<li>Deshpande, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+microfluidic+production+of+cell-sized+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes.</a> Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).</li>
<li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447(2016).</li>
<li>Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin-induced+actin+protrusions+are+suppressed+by+dendritic+networks+in+GUVs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs.</a> Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Badano różne metody generowania GUV w celu tworzenia komórek syntetycznych, jednak złożoność procedur, wydłużony czas osiągnięcia enkapsulacji, ograniczenie typów lipidów i składu molekularnego enkapsulantu, potrzeba niefizjologicznych substancji chemicznych ułatwiających enkapsulację, niska wydajność GUV i niespójności w skuteczności enkapsulacji nadal stanowią wyzwanie dla naukowców w tej dziedzinie. Biorąc pod uwagę szeroki zakres potencjalnych badań, które można rozpocząć w oddolnej biologii syntetycznej, bezproblemo...

Dwuwarstwowe kompartmenty lipidowe są używane jako modelowe komórki syntetyczne do badania zamkniętych reakcji organicznych i procesów opartych na błonach lub jako moduły nośnikowe w aplikacjach dostarczania leków1,2. Biologia oddolna z oczyszczonymi składnikami wymaga minimalnych systemów eksperymentalnych do badania właściwości i interakcji między biomolekułami, takimi jak białka i lipidy3,4. Jednak wraz z postępem tej dziedziny rośnie zapotrzebowanie na bardziej złożone systemy eksperymentalne, które lepiej imitują warunki panujące w komórkach biologicznych. Enkapsulacja w GUV jest praktycznym podejściem, które może zaoferować niektóre z tych właściwości podobnych do komórek, zapewniając odkształcalną i selektywnie przepuszczalną dwuwarstwę lipidową oraz ograniczoną przestrzeń reakcyjną. W szczególności rekonstrukcja in vitro układów cytoszkieletu, jako modeli komórek syntetycznych, może odnieść korzyści z enkapsulacji w przedziałach błonowych5. Wiele białek cytoszkieletu wiąże się i oddziałuje z błoną komórkową. Ponieważ większość zespołów cytoszkieletu tworzy struktury obejmujące całą komórkę, ich kształt jest naturalnie determinowany przez uwięzienie wielkości komórki6.
Do generowania GUV używane są różne metody, takie jak sphing7,8, small bubble fusion9,10, transfer emulsji11,12, pulsacyjny odrzutowiec13, oraz inne podejścia mikroprzepływowe14,15. Chociaż te metody są nadal stosowane, każda z nich ma swoje ograniczenia. W związku z tym wysoce pożądane jest solidne i proste podejście z wysoką wydajnością enkapsulacji GUV. Chociaż techniki takie jak spontaniczne pęcznienie i pęcznienie elektryczne są szeroko stosowane do tworzenia GUV, metody te są przede wszystkim kompatybilne z określonymi składami lipidów16, o niskim stężeniu soli17, mniejszy rozmiar cząsteczki enkapsulantu18 i wymagają dużej objętości enkapsulantu. Łączenie wielu małych pęcherzyków w GUV jest z natury niekorzystne energetycznie, co wymaga specyficzności w naładowanych składach lipidowych9 i/lub zewnętrznych środkach indukujących fuzję, takich jak peptydy19 lub inne chemikalia. Z drugiej strony przenoszenie emulsji i metody mikroprzepływowe mogą wymagać stabilizacji kropel poprzez usunięcie środka powierzchniowo czynnego i rozpuszczalnika po utworzeniu dwuwarstwy18,20. Złożoność konfiguracji eksperymentalnej i urządzenia w technikach mikroprzepływowych, takich jak natryskiwanie impulsowe, stanowi dodatkowe wyzwanie21. cDICE to metoda oparta na emulsji, wywodząca się z podobnych zasad rządzących transferem emulsji22,23. Roztwór wodny (roztwór zewnętrzny) i mieszanina lipidowo-olejowa są rozwarstwiane przez siły odśrodkowe w obracającej się cylindrycznej komorze (komora cDICE), tworząc granicę faz nasyconą lipidami. Przenoszenie jednowarstwowych kropelek wody lipidowej do obracającej się komory cDICE powoduje zatrzaskiwanie się dwuwarstwy, gdy kropelki przechodzą przez nasycony lipidami interfejs do zewnętrznego roztworu wodnego22,24. Podejście cDICE jest solidną techniką enkapsulacji GUV. Dzięki przedstawionej zmodyfikowanej metodzie uzyskuje się nie tylko typowy dla cDICE wysoki plon pęcherzyków przy istotnie krótszym czasie enkapsulacji (kilka sekund), ale także znacznie skraca się czas generowania GUV, który pozwala na obserwację procesów zależnych od czasu (np. tworzenia się sieci cytoszkieletowej aktyny). Protokół trwa około 15-20 minut od rozpoczęcia do pobrania GUV i obrazowania. W tym miejscu wytwarzanie GUV opisano przy użyciu zmodyfikowanej metody cDICE do enkapsulacji aktyny i białek wiążących aktynę (ABP). Przedstawiona technika ma jednak zastosowanie do enkapsulacji szerokiego zakresu reakcji biologicznych i interakcji błonowych, od składania biopolimerów, przez ekspresję białek bezkomórkowych, po transfer ładunku oparty na fuzji błonowej.

<table><tbody><tr><td>18:1 Liss Rhod PE lipid w chloroformie</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150C</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Optical Btm Pit PolymerBase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Aktyna z mięśni szkieletowych królika</td><td>Cytoszkielet</td><td>AKL99-A</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488-aktyna z mięśni szkieletowych królika</td><td>Hypermol</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Axygen (200 &mikro; L)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-222-262</td><td>do obsługi ABP</td></tr><tr><td>żywica</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPBK-04</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (proszek)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700100P</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Żywica bezbarwna</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Skaner konfokalny</td><td>YOKOGAWA</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Medium gradientu gęstości (Optiprep)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Lipid DOPC w chloroformie</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Faszynowy</td><td>domowy</td> bufor F N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>domowej roboty</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Fisherbrand (1,5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>FS02 Sonicator</td><td>Fischer Scientific</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>G-buffer</td><td>domowej roboty</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 kamera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Acros Organics</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX21</td><td></td></tr><tr><td>Olympus PlanApo N 60x Mikroskop olejowy Obiektyw</td><td>Olumpus</td><td>1-U2B933</td><td></td></tr><tr><td>Olej silikonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317667</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) są często używane jako modele błon biologicznych i dlatego są doskonałym narzędziem do badania procesów komórkowych związanych z błonami in vitro. W ostatnich latach enkapsulacja w GUV okazała się pomocnym podejściem do eksperymentów rekonstytucji w biologii komórki i dziedzinach pokrewnych. Lepiej naśladuje warunki uwięzienia wewnątrz żywych komórek, w przeciwieństwie do konwencjonalnej rekonstytucji biochemicznej. Metody enkapsulacji wewnątrz GUV często nie są łatwe do wdrożenia, a wskaźniki sukcesu mogą się znacznie różnić w zależności od laboratorium. Jedną z technik, która okazała się skuteczna w kapsułkowaniu bardziej złożonych systemów białkowych, jest ciągła enkapsulacja przez interfejs kropelki (cDICE). W tym artykule przedstawiono metodę opartą na cDICE do szybkiej enkapsulacji białek cytoszkieletu w GUV o wysokiej wydajności enkapsulacji. W tej metodzie najpierw kropelki jednowarstwowe lipidów są generowane przez emulgowanie roztworu białka będącego przedmiotem zainteresowania w mieszaninie lipidów i olejów. Po dodaniu do obracającej się komory wydrukowanej w 3D, te jednowarstwowe kropelki lipidów przechodzą następnie przez drugą monowarstwę lipidową na granicy faz woda/olej wewnątrz komory, tworząc GUV, które zawierają układ białkowy. Metoda ta upraszcza ogólną procedurę enkapsulacji w obrębie GUV i przyspiesza ten proces, a tym samym pozwala nam ograniczyć i obserwować dynamiczną ewolucję składania się sieci wewnątrz pęcherzyków dwuwarstwowych lipidów. Platforma ta jest przydatna do badania mechaniki interakcji cytoszkielet-błona w zamknięciu.

Aby zademonstrować pomyślne generowanie GUV z cytoszkieletem przy użyciu obecnego protokołu, zrekonstruowano struktury wiązek fascyna-aktyna w GUV. Fascyna jest krótkim łącznikiem filamentów aktyny, który tworzy sztywne, równolegle ułożone wiązki aktyny i jest oczyszczana z E. coli jako białko fuzyjne z S-transferazą glutationową (GST)26. Najpierw zrekonstruowano 5 µM aktyny, w tym 0,53 µM aktyny ATTO488 w buforze do polimeryzacji aktyny oraz 7,5% medium do gradientu gęstości. Po dodaniu ...

Ten artykuł przedstawia prostą metodę szybkiego wytwarzania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych z zamkniętymi białkami cytoszkieletu. Metoda ta okazuje się przydatna do oddolnego odtwarzania struktur cytoszkieletu w zamknięciu i interakcjach cytoszkielet-błona.

Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...

W ostatnich latach enkapsulacja w dwuwarstwowych pęcherzykach lipidowych wielkości komórki okazała się przydatną metodą w eksperymentach rekonstytucji in vitro. Przedstawiona przez nas metoda znacznie pomoże w rekonstytucji cytoszkieletu w badaniach nad komórkami syntetycznymi. Dzięki tej metodzie możemy wygenerować gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe o niejednorodnej wielkości z wysoką wydajnością.Czas generowania pęcherzyków jest znacznie skrócony w porównaniu z konwencjonalną techniką cDICE. Możemy hermetyzować bezkomórkowe systemy transkrypcyjno-translacyjne odizolowane od złożonych, jednocześnie zachodzących procesów komórkowych w celu zbadania szlaków molekularnych. Ta metoda może być wykorzystana do składania minimalnych protokomórek w celu stworzenia funkcjonalnych komórek syntetycznych.Rozpocznij przygotowanie mieszaniny olejowo-lipidowej, przenosząc dioleoilofosfocholinę, cholesterol i rodaminę PE do 15-mililitrowej szklanej fiolki. Następnie dodaj 0,5 mililitra chloroformu do fiolki. Odpipetuj 7,2 mililitra oleju silikonowego i 1,8 mililitra oleju mineralnego w osobnej 15-mililitrowej tubie i wymieszaj oleje, wirując z prędkością 3 200 obrotów na minutę przez 10 sekund.Następnie dodaj mieszaninę oleju do fiolki zawierającej mieszaninę lipidów i chloroformu i wiruj mieszaninę z prędkością 3 200 obrotów na minutę przez 10 do 15 sekund, aż powstała mieszanina lipidów w oleju będzie lekko mętna, ponieważ lipidy nie są całkowicie rozpuszczone w oleju. Następnie sonikować lipid w dyspersji olejowej w sonikatorze kąpielowym o mocy ultradźwiękowej 80 watów i częstotliwości roboczej 40 kiloherców przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli nie zostanie natychmiast zużyta, przechowuj mieszaninę lipidów i oleju w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny.Aby wygenerować pęcherzyki, użyj zespołu z wydrukowanym w 3D wałem wykonanym z czarnej żywicy zamontowanym na płycie mieszającej na stole z prędkością 1 200 obrotów na minutę. Następnie zamontuj wydrukowaną w 3D ciągłą obudowę interfejsu kropelkowego lub komorę cDICE, wykonaną z przezroczystej żywicy na czarnym trzonie żywicy. Przygotuj 1-10-mikromolowy roztwór aktyny w globularnym buforze aktyny lub buforze G, zawierającym 10% aktynę ATO 488.Aby rozpocząć polimeryzację aktyny, dodaj nitkowaty bufor polimeryzacji aktyny lub bufor F w roztworze aktyny na lodzie, a następnie utrzymuj roztwory na lodzie, aby spowolnić polimeryzację aktyny przed dodaniem środka sieciującego. Aby przygotować białka wiążące aktynę lub ABP, od 1,75 miligrama na mililitr faszyny, podwielokrotność 1,57 mikrolitra faszyny w osobnej mikroprobówce. Następnie dodaj 7,5% pożywki o gradiencie gęstości do roztworu aktyny, aby utworzyć gradient gęstości między zewnętrzną i wewnętrzną fazą wodną i ułatwić gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe lub GUV, sedymentację.Następnie wlej do komory 700 mikrolitrów 200-milimolowej glukozy jako roztwór zewnętrzny. Dodaj wystarczającą ilość mieszanki lipidowo-olejowej do komory, aż komora zostanie wypełniona w 60% do 80%. Między mieszaniną lipidowo-olejową a roztworem zewnętrznym zostanie utworzony interfejs.Przygotuj mieszaninę aktyny-ABP, przenosząc ABP do roztworu aktyny. Następnie użyj zwykłej pipety o pojemności od 100 do 1 000 mikrolitrów, aby przenieść 700 mikrolitrów mieszaniny lipidów i oleju do mieszaniny aktyny-ABP. Pipetuj w górę i w dół osiem razy, aby wytworzyć kropelki monowarstwowej emulsji lipidowej wielkości komórki o średnicy od 7 do 100 mikronów.Użyj tej samej pipety o pojemności od 100 do 1 000 mikrolitrów, aby dozować całą emulsję do komory obrotowej. Kropelki uzyskają drugą warstwę lipidów, przechodząc przez monowarstwę lipidową na granicy faz olej-roztwór zewnętrzny, tworząc w ten sposób GUV. Po zakończeniu wyjmij komorę z płytki mieszającej i wyrzuć większość mieszaniny lipidów i olejów, przechylając komorę w pojemniku na odpady.Trzymając komorę pokrywą skierowaną do wewnątrz, otwórz pokrywę komory i lekko przechyl komorę do wewnątrz. Granica faz między zewnętrznym roztworem zawierającym GUV a mieszaniną lipidów i oleju będzie widoczna z otworu komory, w którym znajduje się pokrywa. Za pomocą pipety zebrać wystarczającą ilość roztworu zewnętrznego zawierającego GUV i dozować od 50 do 300 mikrolitrów roztworu zewnętrznego do płytki 96-dołkowej, aby uzyskać odpowiednią gęstość GUV.Aby zobrazować GUV, ustaw 96-dołkową płytkę na stoliku odwróconego mikroskopu wyposażonego w soczewkę obiektywu 60X zanurzoną w olejku. Otwórz interesującą sekwencję obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, ImageJ Fiji, i zidentyfikuj obraz o najwyższej intensywności. Przytrzymaj Control Shift C, aby otworzyć okno jasności i kontrastu i kliknij kartę resetowania.W menu ImageJ Fiji przejdź do kart Analizuj i Ustaw skalę, aby wprowadzić znaną odległość fizyczną i jednostkę dla każdego piksela obrazu. Po zakończeniu przejdź do Obraz, Stosy, a następnie Projekt 3D przyciski, aby zrekonstruować obraz 3D ze stosu Z. Ustaw metodę projekcji na Punkt jasności, odstępy między plasterkami na 0,5 mikrometra, a następnie zaznacz pole wyboru Interpolacja.Użyj opcji domyślnych dla pozostałych ustawień i przechwytuj obrazy. Reprezentatywny obraz przedstawia konfokalny obraz GUV znakowanych rodaminą PE z zamkniętymi wiązkami faszynowo-aktynowymi . Przeniesienie białek wiążących aktynę do roztworu aktyny, a następnie dodanie mieszaniny lipidowo-olejowej i wytworzenie kropelek monowarstwy lipidowej powinno nastąpić w ciągu kilku sekund, aby uniknąć tworzenia się sieci aktynowych przed enkapsulacją.Wykorzystaliśmy tę zmodyfikowaną technikę cDICE do zbadania ról różnych sieciowców sieciujących aktyny w organizowaniu sieci aktynowych. Spodziewamy się, że ta metoda pomoże innym badaczom w zbadaniu regulacji innych białek cytoszkieletu.

rapid-encapsulation-reconstituted-cytoskeleton-inside-giant

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tutaj opisujemy proste metody przygotowania pęcherzyków, enkapsulacji maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej oraz monitorowania produkcji białek. Powstałe w ten sposób systemy bezkomórkowe mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do budowania coraz bardziej złożonych mimik komórkowych.

Enkapsulacja bezkomórkowej maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej w pęcherzykach do budowy mimiki komórkowej

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.

Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

Pokazujemy jednokomórkową hodowlę bakterii wewnątrz gigantycznych pęcherzyków (GV). GV zawierające komórki bakteryjne przygotowano metodą transferu kropelkowego i unieruchomiono na podpartej membranie na szklanym podłożu w celu bezpośredniej obserwacji wzrostu bakterii. To podejście można również dostosować do innych komórek.

Hodowla komórek bakteryjnych na poziomie pojedynczej komórki wewnątrz gigantycznych pęcherzyków

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten protokół opisuje metodę odwróconej emulsji używaną do hermetyzacji systemu ekspresji bezkomórkowej (CFE) w gigantycznym pęcherzyku jednowarstwowym (GUV) w celu zbadania syntezy i włączenia modelowego białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej.

Rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Ten artykuł przedstawia prostą jednoetapową rekonstrukcję sieci cytoszkieletu wewnątrz oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzyków. Metodę tę można uogólnić i zastosować do enkapsulacji lub uwięzienia szerokiego zakresu biomolekuł.

Metody in vitro Rekonstrukcja sieci cytoszkieletu w oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV)

Poznaj szybką metodę enkapsulacji odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych. Technika ta umożliwia badanie interakcji cytoszkielet-błona w biologii syntetycznej.

Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Przeglądaj więcej filmów