Kwantyfikacja transportu żelaza przez łożysko myszy in vivo przy użyciu nieradioaktywnych izotopów żelaza
10 maja 2022
Ten artykuł pokazuje, jak przygotować i podawać nieradioaktywne izotopowe żelazo związane z transferyną do badań nad transportem żelaza w ciąży myszy. Opisano również podejście do ilościowego oznaczania izotopowego żelaza w przedziałach płodowo-łożyskowych.
Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia naukowcom śledzenie i ilościowe określanie rozkładu żelaza in vivo bez konieczności stosowania radioaktywności. Ponieważ w tej samej próbce można wykryć jednocześnie wiele stabilnych izotopów żelaza, technika ta może być wykorzystana do zrozumienia wychwytu, regulacji i dystrybucji żelaza z różnych źródeł. Na początek dodaj 12 normalnych kwasów solnych do żelaza-58 w szklanej fiolce dostarczonej przez sprzedawcę i luźno załóż nakrętkę.
Aby rozpuścić żelazko, podgrzej roztwór w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Jeśli roztwór nadal się nie rozpuści, pozostaw roztwór na noc w temperaturze pokojowej w dygestoriach do rozpuszczenia. Następnie, aby wytworzyć roztwór chlorku żelaza, utlenić pozostały chlorek żelazawy, podgrzewając roztwór do 60 stopni Celsjusza ze zdjętą nakrętką, aby ułatwić utlenianie.
Dodaj jeden mikrolitr 35% nadtlenku wodoru na 50 mikrolitrów roztworu, aby jeszcze bardziej ułatwić utlenianie. Pozostawić roztwór chlorku żelaza w okapie w temperaturze 60 stopni Celsjusza ze zdjętą nakrętką, aby odparować próbkę. Następnie rozpuść chlorek żelaza do 100 milimoli w ultraczystej wodzie.
Oblicz wymaganą ilość wody na podstawie początkowej masy metalu. Następnie przygotuj jeden mililitr nitrylotrioctanu żelaza, inkubując przygotowany roztwór chlorku żelaza z nitrylotriooctanem w stosunku od jednego do pięciu molowych w obecności 20 milimolowego wodorowęglanu sodu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuść 500 miligramów apotransferyny w czterech mililitrach buforu do przenoszenia i ładowania i dodaj cztery mililitry tego roztworu apotransferyny do przygotowanego roztworu nitrylotrioctanu żelaza w 15-mililitrowej probówce.
Aby umożliwić maksymalne obciążenie azotrylotrioctanu żelaza apotransferyną, należy sprawdzić, czy roztwór ma pH 7,5 i w razie potrzeby dostosować pH za pomocą wodorowęglanu sodu lub kwasu solnego. Inkubować mieszaninę przez 2 1/2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie usuń nadmiar niezwiązanego nitrylotrioctanu żelaza i uwolnionego azotrylotrioctanu, przenosząc roztwór transferyny żelaza-58 do kolumny odcinającej masę cząsteczkową i odwirowując kolumnę.
Po odwirowaniu przemyć kolumnę dwukrotnie, dodając 10 mililitrów buforu ładującego transferynę i odwirowując kolumnę. Następnie umyj kolumnę 10 mililitrami soli fizjologicznej i ponownie odwiruj. Na koniec wysterylizuj roztwór transferyny żelaza-58 za pomocą filtra strzykawkowego o grubości 0,22 mikrona i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.
Przygotuj 35 miligramów na mililitr roztworu transferyny żelaza-58 w soli fizjologicznej. Następnie umieść znieczuloną ciężarną mysz na poduszce grzewczej i powoli i ostrożnie wstrzyknij roztwór transferyny żelaza-58 do zatoki zaoczodołowej. Sześć godzin po wstrzyknięciu poddaj mysz eutanazji i ostrożnie usuń macicę za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek do preparowania.
Odetnij płodową jednostkę łożyskową składającą się z pojedynczego płodu i łożyska w worku owodniowym otoczonym częścią macicy. Następnie ostrożnie przeciąć macicę i worek owodniowy, nie naruszając płodu i łożyska. Następnie odklej worek owodniowy i usuń płód i łożysko.
Po przecięciu pępowiny osusz płód i łożysko czystą chusteczką zadaniową, aby usunąć nadmiar płynu owodniowego i zapisz wagę całego łożyska. Przetnij każde łożysko na pół żyletką. Umieść każdą połówkę w dwumililitrowej probówce i zatrzaskowo zamroź w ciekłym azocie.
Aby zebrać zarodek wątroby, poświęć zarodek i przygwoźdź zarodek do stabilizacji, pozostawiając odsłonięty brzuch. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj małe nacięcie w miejscu, do którego przymocowana była pępowina. Włóż jeden koniec nożyczek preparacyjnych do nacięcia i wykonaj cięcie w płaszczyźnie środkowej 1/4 cala w kierunku płaszczyzny koronalnej.
Następnie wykonaj cięcia w płaszczyźnie poprzecznej, aby odsłonić wątrobę płodu. Za pomocą kleszczy usuń wątrobę płodu i zapisz masę całej wątroby zarodka. Umieść całą wątrobę zarodka w dwumililitrowej probówce i zatrzaskowo zamroź ją w ciekłym azocie.
Przechowuj tkanki przez czas nieokreślony w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić ilościowo zawartość żelaza niehemowego w łożyskach i wątrobach płodów, należy rozmrozić połówki łożyska i całe wątroby płodów. Następnie zważ połówki łożyska.
Dodać 400 mikrolitrów roztworu do wytrącania białek do próbek tkanek i homogenizować tkankę za pomocą homogenizatora elektrycznego. Próbki należy inkubować w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie schłodzić je w wodzie o temperaturze pokojowej przez dwie minuty.
Otwórz nakrętki, aby zwolnić ciśnienie. Następnie ponownie zamknij rurki. Po odwirowaniu próbki w celu osadzenia resztek tkanki, ostrożnie przenieś supernatant do nowej znakowanej probówki do analizy ICP-MS.
Następnie, aby określić ilościowo żelazo hemowe, zapisz masę osadu otrzymanego po odwirowaniu. Następnie strawić granulki w 10 mililitrach stężonego 70% kwasu azotowego, uzupełnionego jednym mililitrem 30% nadtlenku wodoru. Podgrzej próbki do 200 stopni Celsjusza przez 15 minut przed wysłaniem ich do analizy ICP-MS.
Pomiar ICP-MS pozwolił na wykrycie dwóch różnych izotopów żelaza. Najobficiej występujący izotop żelaza, żelazo-56, odzwierciedla przewlekłe zmiany jonów w tkankach. Inny izotop, żelazo-58, odzwierciedla ostre zmiany w dystrybucji wstrzykiwanego żelaza.
Pomiar żelaza-56 potwierdził, że wątroby zarodkowe z ciąż z niedoborem żelaza miały zmniejszone zapasy żelaza w porównaniu z tymi w ciążach bogatych w żelazo. Pomiar żelaza-58 potwierdził, że w ciążach z niedoborem żelaza mniej żelaza było przenoszone do wątroby zarodka w ciągu sześciu godzin niż w ciążach bogatych w żelazo. Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać o zapisaniu masy tkanek.
Wagi te są niezbędne do obliczenia stężeń żelaza. Ponieważ żelazo-58 nie wymaga specjalnych środków ostrożności związanych z obchodzeniem się z nim i usuwania, nieprzetworzona tkanka może być wykorzystana do innych analiz, w tym między innymi do western blotting lub qPCR.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół przygotowania i podawania niepromiennych izotopów żelaza związanych z transferyną w celu zbadania transportu żelaza podczas ciąży u myszy. Metoda ta umożliwia ilościowe określenie transportu żelaza w przedziałach płodo-łożyskowych za pomocą izotopów stabilnych, bez użycia substancji radioaktywnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Transport żelaza w ciąży
- Macierzyno-płodowy transport składników odżywczych
- Analiza stabilnych izotopów
Wstęp
- Żelazo jest kluczowe dla rozwoju płodu i zdrowia matki w trakcie ciąży.
- Możliwość badania dystrybucji żelaza in vivo w istniejących protokołach jest ograniczona ze względu na obawy związane z radioaktywnością.
- Technika ta wykorzystuje izotopy stabilne w celu bezpieczniejszej analizy transportu żelaza.
Zastosowane metody
- Przygotowanie żelaza-58 związanego z transferryną
- Mysi model ciąży
- ICP-MS do ilościowego oznaczenia izotopów żelaza
Główne wyniki
- Wykazano, że żelazo-58 może służyć do śledzenia rozkładu żelaza w tkankach płodu i matki.
- Ciąże z niedoborem żelaza wykazują mniejszy transport żelaza do wątrób płodowych w porównaniu do ciąż z odpowiednim poziomem żelaza.
- Potwierdzono potencjał izotopów stabilnych w badaniach biologicznych bez konieczności utylizacji odpadów niebezpiecznych.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia nową metodę ilościowego oznaczania transportu żelaza w czasie ciąży.
- Wyniki mogą służyć jako podstawa do wdrażania interwencji w przypadku niedoboru żelaza u osób w ciąży.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ilościowe określanie transportu żelaza przez łożysko jest kluczowe dla zrozumienia transferu składników odżywczych między matką a płodem oraz identyfikacji ryzyk związanych z niedoborem żelaza w okresie ciąży. Ta niepromieniotwórcza metoda z wykorzystaniem stabilnych izotopów umożliwia bezpieczniejsze i powtarzalne pomiary in vivo, które wspierają walidację celów w badaniach żywieniowych i metabolicznych. Dzięki zapewnieniu ilościowych odczytów przepływu żelaza, podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych zaburzeń związanych z ciążą.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów transportu żelaza oraz walidację funkcjonalną łożyskowych transporterów składników odżywczych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe odczyty specyficzne dla izotopów, które wspierają testowanie hipotez bez ograniczeń związanych z radioaktywnością.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia porównanie warunków niedoboru żelaza z warunkami nasycenia żelazem w celu zmniejszenia ryzyka związanego z hipotezami terapeutycznymi.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ustandaryzowanych, mierzalnych wyników pobierania żelaza w tkankach łożyska i płodu poprzez detekcję Fe-58 metodą ICP-MS.
- Wartość operacyjna: Wspiera powtarzalność analizy dzięki śledzeniu izotopów stabilnych i ilościowemu oznaczaniu w konkretnych tkankach.
- Skalowalność: Umożliwia równoległą, multipleksową detekcję wielu izotopów żelaza w celu porównawczego śledzenia źródeł.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy status żelaza u matki z zapasem żelaza u płodu, potwierdzając istotność biomarkera w modelach ciążowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną analizę tkanek po zakończeniu eksperymentu dzięki stabilności izotopu nieradioaktywnego.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera ekstrapolację do badań nad ciążą u ludzi poprzez uniknięcie ograniczeń radiologicznych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając uzyskanie wglądu w mechanizmy szlaków transportu składników odżywczych, które wpływają na rozwój płodu oraz wyniki zdrowotne w okresie ciąży.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków i walidację celów białek regulujących gospodarkę żelazem w łożysku.
- Screening: Dostarcza ilościowych pomiarów z rozdzielczością izotopową, które umożliwiają porównanie warunków eksperymentalnych.
- Analityka: Detekcja Fe-58 metodą ICP-MS dostarcza odczytów gwałtownych zmian, podczas gdy Fe-56 odzwierciedla chroniczny status żelaza.
- Badania translacyjne: Łączy dane dotyczące transportu żelaza u myszy z potencjalnymi strategiami interwencji żywieniowych w trakcie ciąży.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania dynamiki składników odżywczych będących metalami w różnych modelach fizjologicznych lub chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad transportem składników odżywczych dzięki bezpośredniemu, mierzalnemu śledzeniu żelaza.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność pracy z materiałami promieniotwórczymi, co umożliwia bezpieczniejszy przebieg pracy oraz ponowne wykorzystanie tkanek w analizach omicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań nad terapeutykami żywieniowymi poprzez dostarczenie przejrzystych wskaźników transportu żelaza.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków ukierunkowanych na szlaki transportu składników odżywczych między matką a płodem w oparciu o analizę ryzyka.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie przygotowania izotopów, obsługi ICP-MS oraz technik chirurgicznych u myszy.
- Aparatura obejmuje wirówki, kolumny z odcięciem masy cząsteczkowej oraz ICP-MS zdolny do detekcji Fe-56, Fe-57 i Fe-58.
- Standaryzacja między laboratoriami wymaga spójnego dawkowania izotopów, czasu wstrzyknięcia oraz protokołów pobierania tkanek.
- Adaptacja do innych modeli wymaga walidacji wiązania transferyny i fizjologii łożyska.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność precyzyjnego ważenia tkanek w celu obliczenia dokładnych stężeń żelaza.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:37
Preparation of 58Fe‐Transferrin
3:37
Administration of Fe‐Transferrin Intravenously to E17.5 Pregnant Mice
5:53
Tissue Processing for Quantitative Iron Analysis by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP‐MS)
7:14
Results: Physiological Regulation of Mouse Placental Ferroportin During Maternal Iron Deficiency
8:08
Conclusion
