Kwantyfikacja transportu żelaza przez łożysko myszy in vivo przy użyciu nieradioaktywnych izotopów żelaza

Protokół ten jest istotny, ponieważ umożliwia naukowcom śledzenie i ilościowe określanie rozkładu żelaza in vivo bez konieczności stosowania radioaktywności. Ponieważ w tej samej próbce można wykryć jednocześnie wiele stabilnych izotopów żelaza, technika ta może być wykorzystana do zrozumienia wychwytu, regulacji i dystrybucji żelaza z różnych źródeł. Na początek dodaj 12 normalnych kwasów solnych do żelaza-58 w szklanej fiolce dostarczonej przez sprzedawcę i luźno załóż nakrętkę.

Aby rozpuścić żelazko, podgrzej roztwór w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Jeśli roztwór nadal się nie rozpuści, pozostaw roztwór na noc w temperaturze pokojowej w dygestoriach do rozpuszczenia. Następnie, aby wytworzyć roztwór chlorku żelaza, utlenić pozostały chlorek żelazawy, podgrzewając roztwór do 60 stopni Celsjusza ze zdjętą nakrętką, aby ułatwić utlenianie.

Dodaj jeden mikrolitr 35% nadtlenku wodoru na 50 mikrolitrów roztworu, aby jeszcze bardziej ułatwić utlenianie. Pozostawić roztwór chlorku żelaza w okapie w temperaturze 60 stopni Celsjusza ze zdjętą nakrętką, aby odparować próbkę. Następnie rozpuść chlorek żelaza do 100 milimoli w ultraczystej wodzie.

Oblicz wymaganą ilość wody na podstawie początkowej masy metalu. Następnie przygotuj jeden mililitr nitrylotrioctanu żelaza, inkubując przygotowany roztwór chlorku żelaza z nitrylotriooctanem w stosunku od jednego do pięciu molowych w obecności 20 milimolowego wodorowęglanu sodu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuść 500 miligramów apotransferyny w czterech mililitrach buforu do przenoszenia i ładowania i dodaj cztery mililitry tego roztworu apotransferyny do przygotowanego roztworu nitrylotrioctanu żelaza w 15-mililitrowej probówce.

Aby umożliwić maksymalne obciążenie azotrylotrioctanu żelaza apotransferyną, należy sprawdzić, czy roztwór ma pH 7,5 i w razie potrzeby dostosować pH za pomocą wodorowęglanu sodu lub kwasu solnego. Inkubować mieszaninę przez 2 1/2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie usuń nadmiar niezwiązanego nitrylotrioctanu żelaza i uwolnionego azotrylotrioctanu, przenosząc roztwór transferyny żelaza-58 do kolumny odcinającej masę cząsteczkową i odwirowując kolumnę.

Po odwirowaniu przemyć kolumnę dwukrotnie, dodając 10 mililitrów buforu ładującego transferynę i odwirowując kolumnę. Następnie umyj kolumnę 10 mililitrami soli fizjologicznej i ponownie odwiruj. Na koniec wysterylizuj roztwór transferyny żelaza-58 za pomocą filtra strzykawkowego o grubości 0,22 mikrona i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.

Przygotuj 35 miligramów na mililitr roztworu transferyny żelaza-58 w soli fizjologicznej. Następnie umieść znieczuloną ciężarną mysz na poduszce grzewczej i powoli i ostrożnie wstrzyknij roztwór transferyny żelaza-58 do zatoki zaoczodołowej. Sześć godzin po wstrzyknięciu poddaj mysz eutanazji i ostrożnie usuń macicę za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek do preparowania.

Odetnij płodową jednostkę łożyskową składającą się z pojedynczego płodu i łożyska w worku owodniowym otoczonym częścią macicy. Następnie ostrożnie przeciąć macicę i worek owodniowy, nie naruszając płodu i łożyska. Następnie odklej worek owodniowy i usuń płód i łożysko.

Po przecięciu pępowiny osusz płód i łożysko czystą chusteczką zadaniową, aby usunąć nadmiar płynu owodniowego i zapisz wagę całego łożyska. Przetnij każde łożysko na pół żyletką. Umieść każdą połówkę w dwumililitrowej probówce i zatrzaskowo zamroź w ciekłym azocie.

Aby zebrać zarodek wątroby, poświęć zarodek i przygwoźdź zarodek do stabilizacji, pozostawiając odsłonięty brzuch. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj małe nacięcie w miejscu, do którego przymocowana była pępowina. Włóż jeden koniec nożyczek preparacyjnych do nacięcia i wykonaj cięcie w płaszczyźnie środkowej 1/4 cala w kierunku płaszczyzny koronalnej.

Następnie wykonaj cięcia w płaszczyźnie poprzecznej, aby odsłonić wątrobę płodu. Za pomocą kleszczy usuń wątrobę płodu i zapisz masę całej wątroby zarodka. Umieść całą wątrobę zarodka w dwumililitrowej probówce i zatrzaskowo zamroź ją w ciekłym azocie.

Przechowuj tkanki przez czas nieokreślony w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić ilościowo zawartość żelaza niehemowego w łożyskach i wątrobach płodów, należy rozmrozić połówki łożyska i całe wątroby płodów. Następnie zważ połówki łożyska.

Dodać 400 mikrolitrów roztworu do wytrącania białek do próbek tkanek i homogenizować tkankę za pomocą homogenizatora elektrycznego. Próbki należy inkubować w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie schłodzić je w wodzie o temperaturze pokojowej przez dwie minuty.

Otwórz nakrętki, aby zwolnić ciśnienie. Następnie ponownie zamknij rurki. Po odwirowaniu próbki w celu osadzenia resztek tkanki, ostrożnie przenieś supernatant do nowej znakowanej probówki do analizy ICP-MS.

Następnie, aby określić ilościowo żelazo hemowe, zapisz masę osadu otrzymanego po odwirowaniu. Następnie strawić granulki w 10 mililitrach stężonego 70% kwasu azotowego, uzupełnionego jednym mililitrem 30% nadtlenku wodoru. Podgrzej próbki do 200 stopni Celsjusza przez 15 minut przed wysłaniem ich do analizy ICP-MS.

Pomiar ICP-MS pozwolił na wykrycie dwóch różnych izotopów żelaza. Najobficiej występujący izotop żelaza, żelazo-56, odzwierciedla przewlekłe zmiany jonów w tkankach. Inny izotop, żelazo-58, odzwierciedla ostre zmiany w dystrybucji wstrzykiwanego żelaza.

Pomiar żelaza-56 potwierdził, że wątroby zarodkowe z ciąż z niedoborem żelaza miały zmniejszone zapasy żelaza w porównaniu z tymi w ciążach bogatych w żelazo. Pomiar żelaza-58 potwierdził, że w ciążach z niedoborem żelaza mniej żelaza było przenoszone do wątroby zarodka w ciągu sześciu godzin niż w ciążach bogatych w żelazo. Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać o zapisaniu masy tkanek.

Wagi te są niezbędne do obliczenia stężeń żelaza. Ponieważ żelazo-58 nie wymaga specjalnych środków ostrożności związanych z obchodzeniem się z nim i usuwania, nieprzetworzona tkanka może być wykorzystana do innych analiz, w tym między innymi do western blotting lub qPCR.