Wykrywanie akumulacji i naprawy luk poreplikacyjnych w komórkach ludzkich za pomocą testu włókien DNA

Nasz protokół otwiera nowe możliwości zbadania, w jaki sposób zachodzi replikacja na uszkodzonym DNA. Techniki te mogą wykrywać powstawanie i naprawę jednoniciowych luk DNA, naprzeciwko uszkodzenia DNA. Nukleaza S1 rozszczepia jednoniciowe DNA i umożliwia wykrycie luk poreplikatywnych.

Podejście to zostało po raz pierwszy zastosowane przez dr Meneghiniego i dr Cordiero-Stone'a w latach siedemdziesiątych XX wieku w Brazylii, a ostatnio zaadaptowane przez nas do testu włókien DNA. Wykorzystanie opisanej tutaj techniki do badania powstawania i naprawy luk po replikacji może dostarczyć informacji na temat mechanizmu naprawy DNA i odpowiedzi na stres replikacyjny, które utrzymują integralność genomu. W przypadku obu opisanych tutaj protokołów, włókna S1 i testów wypełniania luk, kluczowe znaczenie ma uwzględnienie wszystkich kontroli, aby zapewnić dokładną interpretację danych.

Procedura zostanie zademonstrowana przez Davi J. Martinsa, doktoranta z naszego laboratorium oraz dr Annabel Quinet, współpracowniczkę, która wcześniej opracowała te techniki podczas pracy w naszej grupie. Na początek odessać pożywkę hodowlaną i natychmiast dodać do komórek pożywkę hodowlaną z 20-mikromolową pożywką dożylną. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dokładnie 20 minut.

Następnie szybko umyj komórki dwukrotnie podgrzanym PBS i naświetl je promieniowaniem UV-C o natężeniu 20 dżuli na metr kwadratowy. Używaj nieleczonych komórek jako kontroli. Natychmiast dodaj pożywkę z 200-mikromolowym CldU do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla dokładnie przez 60 minut.

Następnie dwukrotnie umyj komórki wstępnie podgrzanym PBS i przepuszczaj je buforem CSK 100 przez dwie do 10 minut zgodnie z linią komórkową w temperaturze pokojowej. Po permeabilizacji CSK można zobaczyć jądra prawie bez cytoplazmy w porównaniu z tymi przed przepuszczalnością. Ostrożnie wlej PBS po bokach każdej studzienki, aby umyć jądra PBS.

Następnie przemyć jądra buforem S1. Inkubować jądra w buforze S1 z 20 jednostkami na mililitr nukleazy S1 i bez nukleazy S1 przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odessaj bufor S1 i dodaj 0,1% BSA do PBS.

Zeskrob jądra i przenieś je do około oznaczonej adnotacją rurki o pojemności 1,5 mililitra. Trzymaj rurki na lodzie przez cały czas. Odwirować jądra w temperaturze około 4 600 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ponownie zawiesić granulki w PBS w stężeniu około 1,500 komórek na mikrolitr. Umieść probówki na lodzie i natychmiast przystąp do przygotowania włókna DNA poprzez rozprowadzenie protokołu. Opisz szkiełka mikroskopowe ołówkiem węglowym i umieść je płasko na tacy.

Postukaj w dolną część probówki, aby zapewnić homogenizację i dodaj dwa mikrolitry komórek na górze odpowiedniego szkiełka. Dodać sześć mikrolitrów buforu do lizy i poddać komórki lizie, pipetując w górę iw dół około pięć razy. Za pomocą końcówki pipety lekko pociągnij kroplę w kierunku dna szkiełka i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu lizy jąder.

Przechyl zjeżdżalnię pod kątem około 20 do 40 stopni i pozwól, aby kropla rozprzestrzeniła się na dno zjeżdżalni ze stałą niską prędkością. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 do 15 minut. Następnie zanurz je w słoiku zawierającym świeżo przygotowany roztwór utrwalający i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić DNA na szkiełkach.

Przemyj szkiełka PBS dwa razy przez pięć minut i denaturuj DNA świeżo przygotowanym 2,5-molowym kwasem klorydrynowym przez 40 do 60 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka PBS trzy razy przez pięć minut i zablokuj 5% BSA uprzednio podgrzanym przez 30 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie postukaj w papier, aby usunąć nadmiar płynu ze szkiełek.

Dodaj kroplami 30 mikrolitrów przeciwciał pierwszorzędowych do szkiełek i umieść na nich szkiełko nakrywkowe. Inkubować przez 1 do 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemnej, wilgotnej komorze. Umieść szkiełka w słoiku z PBS na jedną do dwóch minut, a następnie ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe.

Umyj PBST w słoiku trzy razy przez pięć minut i umieść szkiełka w PBS. Usuń nadmiar płynu, delikatnie stukając w papier i kroplami dodaj 30 mikrolitrów przeciwciał wtórnych do szkiełek. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.

Inkubować przez 45 do 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemnej i wilgotnej komorze. Powtórz czynności mycia szkiełek i ponownego usuwania nadmiaru PBS i dodaj kroplami 20 mikrolitrów odczynnika montażowego do szkiełek. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i unikaj pęcherzyków.

Umieść kroplę olejku immersyjnego w pobliżu górnej części szkiełka, w którym komórki zostały poddane lizie. Użyj zielonego kanału i przeszukaj zielone kropki w tle, aby znaleźć fokus. Otwórz oprogramowanie Leica Application Suite, kliknij Acquire (Pobierz) i wybierz zielony kanał.

Dostosuj ustawienia kanału zielonego przed analizą. Następnie zmień na czerwony kanał i dostosuj ustawienia. Znajdź główne stężenie włókien i przejdź do krawędzi, aby znaleźć dobrze rozłożone, nienakładające się na siebie pojedyncze włókna.

Użyj tylko jednego kanału, aby wybrać regiony dla zdjęć i uniknąć potencjalnych uprzedzeń. Kliknij ikonę Pobierz nakładkę i dostosuj oprogramowanie, aby uzyskać prawidłowe powiększenie mikroskopu. Zrób około 15 do 20 zdjęć na każdym slajdzie wzdłuż całego slajdu w kanale zielonym, a następnie w kanale czerwonym.

Dwa kanały są teraz łączone, a utworzona nakładka jest przenoszona do unikalnego folderu. Możliwe jest zobaczenie włókien w kolorach czerwonym i zielonym. Otwórz oprogramowanie ImageJ, kliknij lewym przyciskiem myszy piątą ikonę, wybierz drugą opcję, a następnie wybierz narzędzie Linia segmentowa.

Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby narysować dokładną ścieżkę czerwonego lub zielonego traktu, a kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zatrzymać rysowanie. Naciśnij przycisk M na klawiaturze, aby zmierzyć długość. W przypadku światłowodu S1 śledź pomiary czerwonych i zielonych odcinków dla każdego włókna i mierz długości czerwonych i zielonych odcinków z co najmniej 150 włókien z różnych zdjęć.

Włókno S1 jest pokazane na tych reprezentatywnych obrazach. Pokazano tutaj kontrolny przewód DNA bez przerw i odporny na rozszczepienie przez nukleazę S1. Dodatni wynik odcinka DNA dla luk rozszczepionych przez nukleazę S1 skutkował krótszą długością przewodu CldU.

Schemat etykietowania różnicowego, obszernie opisany w manuskrypcie tekstowym, może być wykonany w celu oznaczenia zdarzeń wypełniających luki. W tym teście, nazwanym testem wypełniania luk, dłuższe ścieżki IDU z co najmniej jedną łatą CldU lub mniejszą liczbą łat CldU odpowiadają niskiej gęstości wypełniania luk. Krótsze drogi dożylne, z co najmniej jednym plastrem CldU, i dłuższe drogi dożylnie z większą liczbą plastrów CldU, odpowiadają wysokiej gęstości wypełniania luk.

Etap przenikania tego protokołu ma kluczowe znaczenie dla działania nukleazy S1 na luki powstałe podczas replikacji uszkodzonego DNA. Nukleaza S1 może być również wykorzystana w protokole testu kometarnego do wykrywania luk powstałych podczas replikacji uszkodzonego DNA, które utrzymują się po leczeniu. Test włókien S1 utorował drogę nowemu paradygmatowi, zgodnie z którym luki poreplikacyjne mogą powodować podatność na nowotwory, szczególnie w przypadku raka piersi i jajnika z mutacjami w genach BRCA1 i 2.