Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Ogólnym celem tego eksperymentu z ligacją zbliżeniową jest wizualizacja i ilościowe określenie powstawania odpowiedzi na uszkodzenie DNA i napraw kompleksów białkowych po indukcji uszkodzenia DNA w hodowlach komórek zawiesinowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące naprawy uszkodzeń DNA, takie jak przestrzenna organizacja i regulacja czasowa oraz to, jak różne szlaki naprawcze reagują na różne rodzaje uszkodzeń DNA. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta, wymaga małej liczby komórek i nie wymaga intensywnego przetwarzania, które może zakłócić lub zmienić interakcje białko-białko.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat naprawy DNA, tworzenia kompleksów białkowych w komórkach zawiesinowych hodowli, może być również stosowana w hodowanych komórkach przylegających, tkankach zamrożonych lub zatopionych w parafinie, a nawet całych zwierzętach. Ludzka linia komórek limfoblastycznych BV-173 z dodatnim BCR, BV-173, jest hodowana w IMDM z suplementami w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% CO2. Umieść komórki dwa razy w ilości od 10 do szóstej na mililitr w sześciodołkowej płytce po pięć mililitrów na studzienkę.

Aby zatrzymać komórki w fazie G1 cyklu komórkowego, dodaj pięć mikromolowych metanosulfonianu amonu do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia dodać pięć mikromolowych inhibitorów ATM do każdej z dwóch studzienek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na 30 minut. Następnie wywołaj uszkodzenie DNA, dodając 50 nanogramów na mililitr NCS do jednego z dołków, który został wstępnie potraktowany inhibitorem ATM i do innego dołka, który nie został poddany wstępnej obróbce.

Inkubować przez dwie godziny. Przygotuj 1XPBS plus 10% BSA, nakładając pięć gramów frakcji 5 BSA na 50 mililitrów 1XPBS w zlewce i pozostaw w temperaturze pokojowej bez potrząsania lub mieszania, aż BSA się rozpuści. Powoli przefiltruj PBS plus 10% roztwór BSA przez filtr 0,22 mikrometra i trzymaj na lodzie.

Zbierz komórki, przenosząc zawartość każdej studzienki do 15-mililitrowej probówki. Umyj ogniwa dwukrotnie lodowatym środkiem 1XBPS. Po zliczeniu ogniw ponownie zawieś dwa razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w 1XBPS plus 10% BSA.

Utrzymuj komórki na lodzie. Przygotuj szkiełka mikroskopowe do tej procedury, ostrożnie polerując je niestrzępiącą się chusteczką i odtłuszczając, umieszczając 96% etanol w słoiku Coplin na pięć minut. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.

Zmontuj szkiełka mikroskopowe w lejkach cytologicznych cytospinowych o powierzchni sześciu mililitrów. Wstępnie pokryj szkiełka, pipetując 50 mikrolitrów 1XPBS plus 10% BSA do każdego lejka i odwiruj przez jedną minutę przy 500 obr./min. Do każdego lejka dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek i odwiruj z prędkością 500 obr./min przez pięć minut.

Ostrożnie zdemontuj lejki i uważaj, aby nie dotknąć miejsc na szkiełkach. Użyj blokera płynu Pap pen z pięciomilimetrową końcówką, aby narysować okrąg wokół każdego miejsca. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 4% roztworu utrwalającego PFA do każdego miejsca.

I inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach umyj komórki za pomocą 1XPBS w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Umyj w ten sposób trzy razy przez pięć minut za każdym razem.

Osusz szkiełka wokół miejsc niestrzępiącą się chusteczką i usuń jak najwięcej płynu z miejsc, przechylając szkiełko i osuszając niestrzępiącą się chusteczką. Dodaj 50 mikrolitrów 0,25% Triton X w 1XPBS do każdego miejsca i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Umyj szkiełka w 50 do 60 mililitrach TBS-T w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

Trzy razy po pięć minut za każdym razem. Przed zablokowaniem stuknij TBS-T i osusz szkiełka wokół miejsc niestrzępiącą się chusteczką. Usuń jak najwięcej płynu z miejsca.

Krótko rozmieszaj roztwór blokujący, a następnie dodaj jedną kroplę około 40 mikrolitrów do każdego miejsca. Umieść szkiełka w ogrzanej, wilgotnej komorze i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj koktajle przeciwciał.

Odwiruj, a następnie pipetuj komercyjny rozcieńczalnik przeciwciał do każdej probówki z mikrofugami. Dodaj kozie przeciwciało anty ATM w stosunku 1:1000. I królicze przeciwciało anty-fosfoseryny-15 p53 w stosunku 1:100.

Do eksperymentów kontrolnych z pojedynczym przeciwciałem należy przygotować rozcieńczenia przeciwciał zawierające tylko kozie przeciwciało anty-ATM i tylko królicze przeciwciało anty-fosfoseryny-15 p53. Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji stuknąć roztwór blokujący, ale należy uważać, aby komórki nie wyschły. Dodać 30 mikrolitrów każdego rozcieńczenia koktajlu przeciwciał i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia umyj szkiełka 1X NC2 buforem do mycia A w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem dwa razy przez pięć minut za każdym razem. Po dwukrotnym umyciu szkiełek buforem do płukania, należy stuknąć bufor do płukania szkiełek i dodać 30 mikrolitrów mieszaniny sondy do oznaczania ligacji zbliżeniowej do każdego miejsca. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze przez godzinę.

Umyj szkiełka 50 do 60 mililitrami buforu myjącego A w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Następnie przygotuj roztwór ligazy ligacyjnej na lodzie, dodając jeden mikrolitr ligazy do 39 mikrolitrów roztworu ligacyjnego na każde miejsce. Dodaj 40 mikrolitrów roztworu ligazy ligacyjnej do każdego miejsca.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze przez 30 minut. Umyć szkiełka buforem do mycia A w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Przygotować mieszaninę polimerazy amplifikacyjnej na lodzie.

Najpierw rozcieńczyć roztwór podstawowy do amplifikacji od jednego do pięciu w wodzie. I dodaj 0,5 mikrolitra polimerazy do 39,5 mikrolitra roztworu do amplifikacji 1X dla każdego miejsca. Zdjąć bufor do płukania i dodać 40 mikrolitrów mieszaniny polimerazy amplifikacyjnej na miejsce.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze przez 100 minut. Po zakończeniu 100-minutowej inkubacji stuknąć mieszaninę polimerazy amplifikacyjnej i umyć szkiełka 1X NC2 buforem do płukania B w słoiku Coplin. W temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem dwa razy po 10 minut.

Następnie umyj szkiełka w 0,01x buforze do płukania B przez jedną minutę. Strząśnij nadmiar buforu B do mycia i osusz szkiełka wokół miejsc niestrzępiącą się chusteczką. Usuń jak najwięcej płynu z miejsca.

Przygotować DAPI zawierające podłoże montażowe, które nie będzie nadmiernie barwić jąder, rozcieńczając DAPI zawierające podłoże montażowe 1:5 w podłożu montażowym bez DAPI. Dodać od 25 do 30 mikrolitrów rozcieńczonego DAPI zawierającego podłoże montażowe do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 milimetry na 24 milimetry. Podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą szkiełka i lekko dociśnij, aby upewnić się, że nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza.

Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i odczekaj co najmniej 15 minut przed obrazowaniem. Na koniec zobrazuj i przeanalizuj preparaty za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Test ligacji zbliżeniowej zastosowano do zbadania interakcji między ATM a fosfoseryną 15 p53 w ludzkich komórkach dodatnich BV 173 zdolnych do BCR zatrzymanych w fazie G1.

W przeciwieństwie do komórek, które nie były leczone NCS w celu wywołania uszkodzenia DNA, większość komórek leczonych NCS miała sygnały punktowe wyłącznie w jądrze ze średnio siedmioma sygnałami na komórkę. Wskazuje to, że indukcja uszkodzenia DNA powoduje interakcję między ATM a fosfoseryną 15 p53. Wstępne traktowanie komórek specyficznym inhibitorem kinazy ATM przed indukcją uszkodzenia DNA zmniejsza liczbę sygnałów do średnio dwóch sygnałów na komórkę, potwierdzając, że fosforylacja p53 przy reszcie seryny 15 była zależna od aktywności kinazy ATM.

Eksperymenty kontrolne z pojedynczym przeciwciałem, w których emitowano przeciwciało anty ATM lub przeciwciało antyfosfoseryny 15 p53, nie przyniosły żadnych sygnałów zgodnie z oczekiwaniami. Rysunek ten przedstawia kwantyfikację i analizę statystyczną wyników, które wykazują i potwierdzają swoistość techniki oznaczania ligacji zbliżeniowej na preparatach cytospinowych hodowli komórek zawiesinowych. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około pięciu godzin po całonocnej inkubacji z przeciwciałem pierwotnym, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym miareczkowaniu przeciwciała poprzez barwienie immunofluorescencyjne interesujących Cię komórek przed wykonaniem testu ligacji zbliżeniowej. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do badania przejściowych interakcji białek białkowych, które są trudne do oceny przy użyciu standardowych metod, takich jak immunoprecypitacje i obrazowanie oparte na FRET, które często prowadzą do powstania artefaktów technicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test ligacji zbliżeniowej na hodowlach komórek zawiesinowych, aby zwizualizować i określić ilościowo interakcję białek in situ.