Name: Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Poznaj metodę PLA do wykrywania kompleksów białkowych w komórkach zawiesinowych BV-173. Technika ta umożliwia wizualizację interakcji ATM-p53 w odpowiedzi na uszkodzenie DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Guikema są finansowane przez Innovational Research Incentives Scheme od The Netherlands Organization for Scientific Research (grant VIDI 016126355) oraz 'Stichting Kinderen Kankervrij' KiKA (projekt 252).

1. Leczenie komórek i indukcja uszkodzeń DNA
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich linii komórek limfoblastycznych B-komórkowych BCR-ABL+ BV173 lub SUP-B15 w IMDM uzupełnionych 20% FCS, 50 μM β-merkaptoetanolem, 2 mM L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Policz komórki i płytkę w 2 x 106 komórek/ml w płytkach 6-dołkowych, w 5 ml / dołku. 
	UWAGA: Opcjonalnie można stosować zawiesinowe linie komórkowe różnego pochodzenia.</li>
	<li>Aby zatrzymać komórki BCR-ABL+ B-ALL w fazie G1 cyklu komórkowego, dodaj 5 μM metanosulfonianu imatynibu (STI571) i inkubuj przez noc.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie pomiń ten krok podczas badania interakcji białko-białko w całym cyklu komórkowym lub w typach komórek BCR-ABL-ujemnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wywołać uszkodzenie DNA poprzez dodanie 50 ng/ml neokarzynostatyny (NCS) do kultury i inkubować przez 2 godziny.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, wywołać uszkodzenie DNA poprzez napromieniowanie komórek za pomocą źródła radioaktywnego [137Cs] w dawce 0,5 Gy/min, w dawce 5 Gy. Po napromieniowaniu pozostawić ogniwo na regenerację przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalnie, aby ocenić udział aktywności kinazy ATM w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, dodać 5 μM inhibitora kinazy ATM KU55933 przed dodaniem NCS lub napromienianiem.</li>
	<li>Przygotować 1x PBS + 10% BSA, nakładając 5 g frakcji V BSA na 50 ml 1x PBS w zlewce lub kolbie Erlenmeyera i pozostawić w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia BSA. Nie potrząsaj ani nie mieszaj, ponieważ spowoduje to obfite pienienie. Powoli przefiltruj przez filtr 0,22 μm i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Zbierz komórki i umyj dwukrotnie lodowatym 1x PBS. Policz komórki i ponownie zawieś w 2 x 106/ml w 1x PBS + 10% BSA. Utrzymuj komórki na lodzie.</li>
</ol>
2. Cytowirowanie, utrwalanie i przepuszczalność
<ol>
	<li>Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu w 1x PBS na świeżo. Dodać 2 g PFA do 50 ml 1x PBS i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, aż roztwór będzie klarowny. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia. 
	UWAGA: Opcjonalnie utrwalacz 4% PFA można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C. Po zamrożeniu rozmrozić tylko raz do użycia. W przeciwnym razie 4% roztwór PFA w PBS można zakupić bezpośrednio.</li>
	<li>Ostrożnie wypoleruj szkiełka mikroskopowe o wymiarach 76 mm x 26 mm niestrzępiącą się chusteczką i odtłuść je, umieszczając w 96% etanolu w słoiku Coplin na 5 minut. Pozostaw szkiełka mikroskopowe do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka mikroskopowe w lejkach cytospinowych/cytologicznych o powierzchni 6 mm. Wstępnie powlekaj szkiełka, pipetując 50 μL 1x PBS + 10% BSA do każdego lejka i wiruj przez 1 minutę przy 500 obr./min.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesiny komórek (co odpowiada 0,2 x 106 komórek) do każdego lejka i wirować przez 5 minut przy 500 obr./min. Dla każdej kombinacji przeciwciał wymagane są co najmniej 4 preparaty (eksperyment z dwoma przeciwciałami; dwie kontrole z pojedynczym przeciwciałem; brak kontroli z przeciwciałami).</li>
	<li>Ostrożnie zdemontuj lejki i upewnij się, że nie dotykasz miejsc. Natychmiast przystąp do utrwalania próbki.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 30 minut. Po wyschnięciu na powietrzu zawiń szkiełka pojedynczo w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Używając mrożonych preparatów, pamiętaj o rozmrożeniu szkiełek owiniętych w ręcznik papierowy, aby zapobiec jawnej kondensacji na szkiełkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narysuj okrąg (przybliżona średnica 15-20 mm) wokół tego miejsca za pomocą długopisu PAP blokującego płyn (końcówka 5 mm).</li>
	<li>Dodać 50 μl 4% roztworu utrwalającego PFA do każdego miejsca i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy przez 5 minut z 1x PBS w słoiku Coplin w temperaturze RT z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Osusz szkiełka wokół miejsc niestrzępiącą się chusteczką i usuń jak najwięcej płynu z miejsca za pomocą pipety, nie dotykając miejsca lub przechylając szkiełko. Dodać 50 μL 0,25% Triton-X w 1x PBS do każdego miejsca i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania.</li>
	<li>Umyj szkiełka 3 razy przez 5 minut w ~50-60 ml 0,05% Tween-20 in TBS (TBS-T) w słoiku Coplin w temperaturze RT z delikatnym mieszaniem. W ten sposób można jednocześnie przetwarzać 10 szkiełek.</li>
</ol>
3. Blokowanie i inkubacja przeciwciał pierwotnych
<ol>
	<li>Sklep TBS-T i osusz szkiełka wokół miejsc niestrzępiącą się chusteczką. Usunąć jak najwięcej płynu z miejsca za pomocą pipety, nie dotykając miejsca lub przechylając szkiełko. Krótko wymieszaj roztwór blokujący i dodaj jedną kroplę (~ 40 μl) do każdego miejsca. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze.</li>
	<li>Przygotuj koktajl przeciwciał, mieszając kozio-anty-ATM w stosunku 1:1,000 i króliczo-anty-fosfo-Ser15-p53 w stosunku 1:100 w komercyjnym rozcieńczalniku przeciwciał, rozcieńczalniku przeciwciał wirowych przed użyciem. Do eksperymentów kontrolnych należy przygotować rozcieńczenia przeciwciał zawierające tylko kozio-anty-ATM i tylko królicze przeciwciało anty-fosfo-Ser15-p53 (kontrole z pojedynczym przeciwciałem).</li>
	<li>Stuknąć roztwór blokujący, ale należy uważać, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek przed dodaniem rozcieńczeń przeciwciał. Dodać 30 μl każdego rozcieńczenia koktajlu przeciwciał i inkubować w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować na miejscu bufor A do przemywania i bufor do przemywania B, rozpuszczając zawartość jednej saszetki buforu A i buforu B w końcowej objętości 1 000 ml wody każdy.
	<ol>
		<li>Alternatywnie należy przygotować bufor A do płukania, rozpuszczając 8,8 g NaCl, 1,2 g Tris-base i 0,5 ml Tween-20 w 800 ml wody. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl i dodaj do końcowej objętości 1,000 ml.</li>
		<li>Alternatywnie należy przygotować bufor płuczący B, rozpuszczając 5,84 g NaCl, 4,24 Tris-base i 26,0 g Tris-HCl w 500 ml wody. Dostosuj pH do 7,5 za pomocą HCl. Dodaj wodę do końcowej objętości 1,000 ml.</li>
		<li>Przefiltruj oba roztwory przez filtr 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj szkiełka 2 razy przez 5 minut z 1x buforem do mycia A in situ w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
</ol>
4. Sondy PLA, ligacja i amplifikacja
<ol>
	<li>Przygotuj sondy PLA, rozcieńczając anty-kozioł PLUS i anty-królik MINUS w stosunku 1:5 w komercyjnym rozcieńczalniku przeciwciał. Strząśnij 1x bufor A do płukania in situ ze szkiełek i dodaj 30 μl mieszaniny sondy PLA do każdego miejsca. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze. 
	UWAGA: Można zastosować dowolną kombinację przeciwciał drugorzędowych sond PLA PLUS i MINUS (anty-myszy, anty-królika, anty-kozy), o ile zastosowane przeciwciała pierwszorzędowe są hodowane u różnych gatunków, a kombinacja sond PLA powinna zawsze zawierać sondę PLUS i sondę MINUS.</li>
	<li>Myć szkiełka 2 razy przez 5 minut z ~50-60 ml 1x bufor do płukania A in situ w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Przygotować roztwór ligacji i ligazy na lodzie, dodając 1 μl ligazy do 39 μl roztworu ligacji i dodając 40 μl roztworu ligacji i ligazy do każdego miejsca. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze.</li>
	<li>Umyj szkiełka 2 razy przez 5 minut za pomocą ~50-60 ml 1x bufor do płukania A in situ w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę amplifikacji i polimerazy na lodzie, rozcieńczając roztwór podstawowy amplifikacji w stosunku 1:5 w wodzie. Następnie dodaj 0,5 μl polimerazy do 39,5 μl 1x roztworu do amplifikacji dla każdego miejsca. 
	UWAGA: Odczynniki do amplifikacji są wrażliwe na światło i należy je chronić przed bezpośrednim działaniem światła. Odczynnik wzmacniający występuje w czterech różnych kolorach (CZERWONY: wzbudzenie 594 nm, emisja 624 nm; FarRED: wzbudzenie 644 nm, emisja 669 nm; POMARAŃCZOWY: wzbudzenie 554 nm, emisja 576 nm; ZIELONY: wzbudzenie 501 nm, emisja 523 nm), upewnij się, że dostępny zestaw mikroskopowy ma odpowiednie właściwości wzbudzenia i filtry do obrazowania tych kolorów.</li>
	<li>Strząśnij 1x bufor do płukania in situ A i dodaj 40 μl mieszaniny amplifikacji i polimerazy na miejsce. Inkubować przez 100 minut w temperaturze 37 °C we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze.</li>
</ol>
5. Montaż i obrazowanie
<ol>
	<li>Przygotuj 0,01x in situ bufor do płukania B, dodając 1 ml 1x buforu do płukania B do 99 ml wody.</li>
	<li>Stuknąć z mieszaniny amplifikacji i polimerazy i umyć szkiełka 2 razy przez 10 minut 1x buforem B do płukania in situ w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Umyj szkiełka 1 minutę w 0,01x buforze do płukania B.</li>
	<li>Strząśnij nadmiar 0,01x buforu B i osusz szkiełka wokół miejsc niestrzępiącą się chusteczką. Usunąć jak najwięcej płynu z miejsca za pomocą pipety, nie dotykając miejsca lub przechylając szkiełko.</li>
	<li>Rozcieńczyć pożywkę montażową zawierającą DAPI w stosunku 1:5 w podłożu montażowym bez DAPI, aby uniknąć nadmiernego barwienia jąder.</li>
	<li>Dodać 25-30 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI w proporcji 1:5 do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 24 mm i podnieść szkiełko nakrywkowe za pomocą szkiełka, lekko docisnąć, aby upewnić się, że nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i odczekaj co najmniej 15 minut przed obrazowaniem.</li>
	<li>Przeanalizuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (konfokalnego).
	<ol>
		<li>Policz liczbę punktowych sygnałów PLA na komórkę w co najmniej 4 uzyskanych polach obrazu (obiektyw 20x, zliczając co najmniej 20 komórek na stan lub kombinację przeciwciał, w oparciu o obliczenia mocy przy użyciu przewidywanej średniej 7 ± 5 sygnałów w leczonych komórkach i 2 ± 2 sygnałów w komórkach nieleczonych, z prawdopodobieństwem błędu typu I wynoszącym 0,05, i potęga 80%, jak zgłoszono wcześniej15). 
		UWAGA: Najlepszą rozdzielczość uzyskuje się poprzez akwizycję stosu Z i dekonwolucję za pomocą pakietów oprogramowania (np. ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). Sygnały powinny być łatwo dostrzegalne w obrębie obwodu jądrowego, zgodnie z definicją barwienia DAPI.</li>
		<li>Nie licz sygnałów, które wyraźnie pojawiają się poza jądrami. Zazwyczaj leczenie NCS lub napromienianie γ powoduje około 5-10 sygnałów phosho-p53/ATM PLA na komórkę. Kontrole z pojedynczym przeciwciałem mogą dawać pewien sygnał tła, ale nie powinien on przekraczać 1-2 sygnałów PLA na 1 na każde 20 komórek.</li>
		<li>Do celów publikacji i prezentacji rób zdjęcia za pomocą obiektywu z olejkiem immersyjnym 40X lub 63X. Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C i należy je chronić przed działaniem światła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Maréchal, A., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+Sensing+by+the+ATM+and+ATR+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716(2013).</li>
<li>Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+checkpoint+and+repair+machineries+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites.</a> Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).</li>
<li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).</li>
<li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+and+ATR+substrate+analysis+reveals+extensive+protein+networks+responsive+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage.</a> Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).</li>
<li>Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+selectively+regulates+distinct+p53-dependent+cell-cycle+checkpoint+and+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways.</a> Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).</li>
<li>Tibbetts, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+ATR+in+the+DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53.</a> Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+Multicolor+Imaging+of+the+Nuclear+Periphery+with+3D+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).</li>
<li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sense+of+closeness%3A+protein+detection+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A sense of closeness: protein detection by proximity ligation.</a> Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Dong, Y., Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+immunosensing+using+antigen+and+antibody+monolayers+on+gold+surfaces+with+electrochemical+and+scanning+probe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection.</a> Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+of+DNA+repair+mechanisms+in+common+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies.</a> Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).</li>
<li>Rendleman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+DNA+repair+pathways+and+risk+of+non-Hodgkin%27s+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma.</a> PloS One. 9 (7), e101685(2014).</li>
<li>Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response+Regulates+RAG1%2F2+Expression+in+Pre-B+Cells+through+ATM-FOXO1+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling.</a> J Immunol. , (2016).</li>
<li>Banin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+phosphorylation+of+p53+by+ATM+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage.</a> Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym raporcie wykazano, że PLA może być używany do określania i wizualizacji specyficznej interakcji między białkami w zawiesinowych hodowlach komórkowych. Warto zauważyć, że opisany tutaj protokół nie ogranicza się do badania kompleksów naprawczych DNA, ale ma również zastosowanie do wizualizacji i ilościowego określania innych interakcji białko-białko w hodowlach komórek zawiesinowych. Wykazano, że kinaza ATM oddziałuje z fosforylowanym p53 w komórkach B-ALL BCR-ABL+ zatrzymanych przez G1 pod wpływem czynnika i...

Uszkodzenie DNA uruchamia wysoce regulowaną serię zdarzeń obejmujących interakcje białko-białko i modyfikacje potranslacyjne, które zapewniają efektywną i szybką naprawę DNA, chroniąc w ten sposób integralność genomu1. Zazwyczaj naprawę DNA bada się w komórkach wystawionych na promieniowanie jonizujące poprzez monitorowanie powstawania tzw. ognisk wywołanych promieniowaniem jonizującym (IRIF) za pomocą (konfokalnej) mikroskopii fluorescencyjnej. Wiele białek naprawczych i wykrywających uszkodzenia DNA tworzy IRIF, które reprezentują kompleksy białkowe, które zarodkują w miejscach chromatyny, powodując uszkodzenie DNA2,3. Lokalizacja i rozdzielczość IRIF w czasie daje ważny wgląd w czasoprzestrzenną organizację naprawy DNA i może wskazywać na udział różnych szlaków naprawy DNA. Charakter uszkodzenia DNA i etap cyklu komórkowego, w którym dochodzi do uszkodzenia, określają, który szlak naprawy DNA jest aktywowany. Na przykład w komórkach aktywnie zaangażowanych w replikację DNA (faza S) rekombinacja homologiczna (HR) jest dominującym szlakiem naprawy DNA, podczas gdy w komórkach w fazie G1 lub G2/M cyklu komórkowego dominuje niehomologiczny szlak naprawy łączenia końców (NHEJ). Jednym z najwcześniejszych zdarzeń następujących po uszkodzeniu DNA jest aktywacja kinaz wykrywających uszkodzenia DNA: białka z mutacją ataksji teleangiektazji (ATM), które jest głównie aktywne w fazach G1 i G2/M cyklu komórkowego i reguluje NHEJ, oraz ataksji teleangiektazji i białka związanego z Rad3 (ATR), które działa w fazie S poprzez aktywację HR. Zarówno ATM, jak i ATR są bardzo plejotropowymi kinazami, które fosforylują wiele białek, które biorą udział w naprawie DNA, śmierci komórki i przeżyciu4. Wykazano, że obie kinazy fosforylują i aktywują białko supresorowe p53 po ekspozycji na stres genotoksyczny, co wskazuje, że kinazy te są mediatorami kluczowej osi sygnalizacji supresyjnej nowotworu5,6.
Powstawanie i skład IRIF jest zazwyczaj oceniane poprzez określenie kolokalizacji różnych białek za pomocą dwukolorowego barwienia immunofluorescencyjnego i mikroskopii, jednak nie wszystkie białka, które są częścią kompleksów białek naprawczych, tworzą IRIFs, co ogranicza możliwość zastosowania tego podejścia. Co więcej, mikroskopia immunofluorescencyjna (konfokalna) jest ograniczona przez właściwości dyfrakcyjne światła, co skutkuje raczej słabą rozdzielczością przestrzenną około 200-300 nm, przekraczającą rozmiar większości struktur subkomórkowych, co zasadniczo uniemożliwia bezpośrednie badanie interakcji białko-białko na poziomie molekularnym. W związku z tym kolokalizacja wzorców barwienia immunofluorescencyjnego wykrytych przez (konfokalną) mikroskopię fluorescencyjną niekoniecznie wskazuje na bezpośrednie interakcje białko-białko. Ostatnio opracowano nowe technologie superrozdzielczości, takie jak trójwymiarowa mikroskopia oświetlenia strukturalnego (3D-SIM)7, która została z powodzeniem wykorzystana do zbadania powstawania IRIF 53BP1 i BRCA1 w nanoskali, ujawniając charakterystykę rozkładu przestrzennego tych białek, której nie można było wykryć za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej8.
Do wykrywania interakcji białko-białko in vivo można użyć kilku innych metod, takich jak koimmunoprecypitacja, metody pull-down i metody badań przesiewowych drożdży. Techniki te są jednak dość kłopotliwe, wymagają dużej ilości komórek lub białek lub wiążą się z nadekspresją białek, co wprowadza artefakty eksperymentalne. Niedawno opracowano nowatorską technikę, która umożliwia wizualizację i kwantyfikację interakcji białko-białko in situ (tj. w komórkach i tkankach), która jest określana jako test ligacji zbliżeniowej (PLA)9,10. Przeciwciała pierwszorzędowe, które rozpoznają dwa interesujące białka, są wykrywane przez przeciwciała drugorzędowe, które są sprzężone z oligonukleotydami (tak zwane sondy PLA). Jeśli dwa różne przeciwciała drugorzędowe są wystarczająco blisko siebie ze względu na interakcje między białkami rozpoznawanymi przez przeciwciała pierwszorzędowe, sprzężone oligonukleotydy hybrydyzują i mogą być ligowane, tworząc zamknięty kolisty substrat DNA. Ten kołowy substrat jest następnie amplifikowany przez amplifikację tocznego koła i wizualizowany za pomocą komplementarnych oligonukleotydów sprzężonych z fluorochromem. Używając PLA, subkomórkowa lokalizacja interakcji białko-białko jest zachowana, ponieważ znakowany fluorescencyjnie produkt amplifikacji toczącego się koła pozostaje podłączony do sond PLA. Rozdzielczość tego testu wynosi <50 nm, w oparciu o ustalenie, że średnica przeciwciała wynosi około 7-10 nm11. Amplifikacja tocznego koła może mieć miejsce tylko w przypadku, gdy dwie pary przeciwciał (pierwszorzędowa + drugorzędowa) fizycznie oddziałują w obrębie obwodu określonego przez ich rozmiar (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Etap wzmacniania sygnału zwiększa czułość testu PLA i umożliwia wykrywanie oddziaływań białek o niskiej ekspresji. PLA generuje punktowe, podobne do ognisk wzorce sygnałów, które można określić ilościowo dla każdej komórki, za pomocą których można ocenić wewnątrz- i międzykomórkową zmienność interakcji białko-białko.
Tworzenie i skład kompleksów naprawczych DNA i IRIF-ów jest głównie badany w przylegających liniach komórkowych, takich jak ludzka linia komórek nabłonkowych kostniakomięsaka U2OS, ludzka embrionalna linia komórkowa nerki HEK293 i linia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki RPE-1, które są szybko rosnące i łatwe do transfekcji. Hodowle komórek zawiesinowych, takie jak linie komórek limfoidalnych i szpikowych, są stosowane rzadziej, ponieważ są one mniej podatne na transfekcję i na ogół nie przylegają do szkiełek nakrywkowych, co wymaga dodatkowych/alternatywnych etapów obrazowania. Ustąpienie uszkodzeń DNA jest jednak bardzo istotne w kontekście nowotworów złośliwych limfoidalnych i szpikowych, ponieważ na odpowiedź na uszkodzenie DNA często wpływają aberracje genomowe (napędzające) w tych nowotworach, odgrywając kluczową rolę w złośliwej transformacji prawidłowych komórek limfatycznych i szpikowych (progenitorowych)12,13,14.
Ten protokół opisuje, jak można wykorzystać PLA do oceny i ilościowego określenia interakcji białko-białko po indukcji uszkodzenia DNA w zawiesinowych hodowlach komórkowych. W tym przypadku PLA jest wykonywany w celu określenia i wizualizacji interakcji między ATM i p53 po uszkodzeniu DNA w ludzkich komórkach białaczki B-komórkowej, które są indukowane do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G1. Warto zauważyć, że przedstawiony tutaj protokół nie ogranicza się do badania interakcji ATM i p53 w komórkach białaczki zatrzymanych przez G1, ale może być również wykorzystany do wizualizacji innych interakcji białko-białko w różnych typach komórek i hodowlach komórek zawiesinowych.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa BV173</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ Linia komórkowa B-ALL</td></tr><tr><td>Linia komórkowa SUP-B15 Linia komórkowa</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>BCR-ABL+ Linia komórkowa B-ALL</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana przez Iscove'a Pożywka Dulbecco (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>lot #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco (życie Technologie)</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>metanosulfonian imatynibu</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>Rozpuścić w DMSO, przygotować 10 mM roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>neokarzinostatyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>Mutagenne/teratogenne, należy obchodzić się z</td></tr><tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>Rozpuścić w DMSO, przygotować 5 mM roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Starfrost Preparaty mikroskopowe</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>Długopis PAP bloker płynów</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Lejek cytospinowy</td><td>Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Czerwony zestaw startowy Koza/Królik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>Dostępne dla różnych gatunków/kombinacji, dostępne również w FarRED, Orange i Green</td></tr><tr><td>goat-anti-ATM</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td><td>PLA-grade; z powodzeniem użyliśmy lot#A300-136A-1 w naszych badaniach</td></tr><tr>królicza technologia <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>anty-fosfo-Ser15-p53</td><td>9284</td><td>Z powodzeniem wykorzystaliśmy partię #9284-4 w naszych badaniach</td></tr><tr><td>Przeciwblaknięcie przeciwblaknięcia medium montażowego Vectashield z DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antiblading podłoże montażowe</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd w PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Dostępne również u różnych innych dostawców</td></tr></tbody></table>

wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem dna w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Odpowiedź na uszkodzenie DNA koordynuje naprawę uszkodzeń DNA, które pojawiają się spontanicznie, są spowodowane stresem genotoksycznym lub pojawiają się w kontekście zaprogramowanych pęknięć DNA w limfocytach. Kinaza zmutowana ataksja-teleangiektazja (ATM), kinaza związana z ATM i Rad3 (ATR) oraz podjednostka katalityczna kinazy białkowej zależnej od DNA (DNA-PKcs) są jednymi z pierwszych, które są aktywowane po indukcji uszkodzenia DNA i są centralnymi regulatorami sieci kontrolującej naprawę DNA, apoptozę i przeżycie komórki. Jako część szlaku supresyjnego nowotworu, ATM i ATR aktywują p53 poprzez fosforylację, regulując w ten sposób aktywność transkrypcyjną p53. Uszkodzenie DNA powoduje również powstawanie tzw. ognisk wywołanych promieniowaniem jonizującym (IRIF), które reprezentują kompleksy białek czujnika uszkodzenia i naprawy DNA, które gromadzą się w miejscach uszkodzenia DNA, które są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Kolokalizacja białek w IRIF nie musi jednak oznaczać bezpośrednich interakcji białko-białko, ponieważ rozdzielczość mikroskopii fluorescencyjnej jest ograniczona. 
Test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) to nowatorska technika, która pozwala na bezpośrednią wizualizację interakcji białko-białko w komórkach i tkankach z niespotykaną specyficznością i czułością. Technika ta opiera się na przestrzennej bliskości specyficznych przeciwciał wiążących się z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Gdy badane białka znajdują się w zakresie ~ 40 nm, reakcja amplifikacji jest wyzwalana przez oligonukleotydy, które są sprzężone z przeciwciałami, a produkt amplifikacji jest wizualizowany przez znakowanie fluorescencyjne, dając sygnał odpowiadający subkomórkowej lokalizacji oddziałujących białek. Na przykładzie ustalonej interakcji funkcjonalnej między ATM a p53 pokazano, w jaki sposób PLA można wykorzystać w hodowlach komórek zawiesinowych do badania bezpośrednich interakcji między białkami, które są integralną częścią odpowiedzi na uszkodzenie DNA.

Wykazano, że fosforylacja p53 w reszcie Ser15 jest zależna od aktywności kinazy ATM16. Aby zademonstrować i potwierdzić swoistość techniki PLA na preparatach cytospinowych kultur zawiesinowych komórek, wykazano, że indukcja uszkodzeń DNA poprzez 2-godzinną inkubację z NCS komórek BCR-ABL+ B-ALL zatrzymanych w fazie G1 cyklu komórkowego doprowadziła do swoistej interakcji między ATM a phospho-Ser15-p53, zgodnie z oczekiwaniami. Punktowe sygnały PLA zaobserwowano w j...

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu z zastosowaniem analizy ligacji bliskości (proximity ligation assay) jest wizualizacja i ilościowe określenie tworzenia się kompleksów białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA i białek naprawczych po indukcji uszkodzeń DNA w hodowlach komórkowych w zawiesinie. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące naprawy uszkodzeń DNA, takie jak organizacja i regulacja czasowo-przestrzenna oraz sposób, w jaki różne szlaki naprawcze reagują na różne rodzaje uszkodzeń DNA. Głównymi zaletami tej techniki są jej względna prostota, wymagana niewielka liczba komórek oraz brak konieczności rozległego przetwarzania próbek, które mogłoby zaburzyć lub zmienić oddziaływania białko-białko.Choć metoda ta umożliwia wgląd w naprawę DNA oraz tworzenie kompleksów białkowych w zawiesinie komórkowej, można ją również zastosować w hodowlach komórek adherentnych, tkankach mrożonych lub zatopionych w parafinie, a nawet w całych organizmach. W niniejszym badaniu wykorzystano ludzką linię komórkową ostrej białaczkowej białych krwinek BCR-ABL-dodatnią BV-173, hodowaną w pożywce IMDM z dodatkami w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Komórki wysiano w płytce 6-dołkowej w zagęszczeniu 2×10⁶/mL w objętości 5 mL na dołek.Aby zatrzymać komórki w fazie G1 cyklu komórkowego, dodaj 5 µM metanosulfonianu amonu do każdej studni i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia dodaj 5 µM inhibitora ATM do dwóch studni i odstaw płytkę do inkubatora na 30 minut. Następnie wywołaj uszkodzenie DNA, dodając 50 ng/mL NCS do jednej z studni poddanych wcześniejszemu działaniu inhibitora ATM oraz do drugiej studni, która nie była wstępnie traktowana inhibitorem.Inkubować przez dwie godziny. Przygotować 1XPBS z dodatkiem 10% BSA, nakładając pięć gramów BSA frakcji 5 na 50 mililitrów 1XPBS w zlewce i pozostawiając w temperaturze pokojowej bez wstrząsania lub mieszania aż do całkowitego rozpuszczenia BSA. Powoli przefiltrować roztwór PBS z 10% BSA przez filtr 0,22 mikrometra i przechowywać w lodzie.Zebierz komórki, przenosząc zawartość każdej studzienki do probówki o pojemności 15 ml. Przemyj komórki dwukrotnie lodowatym 1XBPS. Po policzeniu komórek zawieś je w stężeniu 2 × 10⁶ komórek/ml w 1XBPS z dodatkiem 10% BSA.Komórki należy przechowywać w lodzie. Przygotuj szkiełka do mikroskopii do tej procedury, polerując je ostrożnie bezpyłową chusteczką i odtłuszczając poprzez umieszczenie ich w koszyczku Coplin z 96% ethanol przez pięć minut. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.Umieść szkiełka mikroskopowe w lejkach do cytocentryfugi o objętości sześciu mililitrów. Przygotuj szkiełka, pipetując 50 µL 1XPBS z dodatkiem 10%BSA do każdego lejka, a następnie wiruj przez jedną minutę przy 500 RPM. Do każdego lejka dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej i wiruj przy 500 RPM przez pięć minut.Ostrożnie rozmontuj lejki, uważając, aby nie dotknąć plamek na szkiełkach. Za pomocą płynnego blokera Pap z końcówką pięciu milimetrów narysuj okrąg wokół każdej plamki. Następnie dodaj 50 µL 4% PFA roztworu utrwalającego do każdej plamki.Następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach przemyć komórki 1XPBS w naczyniu Coplina w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Powtórzyć to przemywanie trzykrotnie, za każdym razem przez pięć minut.Osusz brzegi szkiełek wokół plamek za pomocą beznitkowej chusteczki i usuń jak najwięcej płynu z plamek, przechylając szkiełko i osuszając je beznitkową chusteczką. Dodaj 50 µL 0,25% Triton X w 1X PBS do każdej plamki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Przemyj szkiełka w 50 do 60 mL TBS-T w naczyniu Coplina w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.Trzy razy po pięć minut za każdym razem. Przed blokowaniem odlej TBS-T i osusz obszary wokół plamek na szkiełkach za pomocą tkaniny beztłuszczowej i niepozostawiającej włókien. Usuń jak największą ilość cieczy z plamki.Krótko wymieszać roztwór blokujący w wirówce typu vortex, a następnie nanieść jedną kroplę o objętości około 40 µL na każdy punkt. Umieścić preparaty na szkiełkach w uprzednio ogrzanej, wilgotnej komorze i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Przygotować koktajle przeciwciał.Wymieszać na wirówce Vortex, a następnie pipetować komercyjny rozcieńczalnik przeciwciał do każdej probówki do mikrowirówki. Dodać przeciwciało kozie przeciwko ATM w rozcieńczeniu 1:1000 oraz przeciwciało królicze przeciwko fosfoserynie-15 p53 w rozcieńczeniu 1:100.W przypadku eksperymentów kontrolnych z pojedynczym przeciwciałem należy przygotować rozcieńczenia przeciwciał zawierające wyłącznie przeciwciało kozie anty-ATM oraz wyłącznie przeciwciało królicze anty-fosfoseryna-15 p53. Po zakończeniu jednej godziny inkubacji należy odlać roztwór blokujący, dbając o to, aby komórki nie wyschły. Należy dodać 30 µL każdego rozcieńczenia koktajlu przeciwciał i inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez noc.Następnego dnia przemyć preparaty 1X NC2 wash buffer A w naczyniu Coplina w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając dwukrotnie przez pięć minut za każdym razem. Po dwukrotnym przemyciu preparatów buforem wash buffer A, odlać bufor z produktów i nanieść 30 µL mieszaniny sond do testu proximity ligation assay na każdy punkt. Inkubować w temperaturze 37 °C w uprzednio ogrzanej, wilgotnej komorze przez jedną godzinę.Przemyć preparaty na szkiełkach 50–60 mililitrami buforu płuczącego A w naczyniu Coplina w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Następnie przygotować na lodzie roztwór ligazy do ligacji, dodając jeden mikrolitr ligazy do 39 mikrolitrów roztworu do ligacji na każdą plamkę. Nanieść 40 mikrolitrów roztworu ligazy do ligacji na każdą plamkę.Inkubować w temperaturze 37 °C w uprzednio ogrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut. Przemyć preparaty buforem do przemywania A w naczyniu Coplina w temperaturze pokojowej przy łagodnym wytrząsaniu. Przygotować na lodzie mieszaninę polimerazy do amplifikacji.Najpierw rozcieńczyć roztwór zapasowy do amplifikacji w wodzie w stosunku jeden do pięciu. Następnie dodać 0,5 µL polimerazy do 39,5 µL 1X roztworu do amplifikacji dla każdej plamki. Odpipować bufor piorący i dodać 40 µL mieszaniny polimerazy do amplifikacji na każdą plamkę.Inkubować w temperaturze 37°C w uprzednio ogrzanej komorze z nawilżeniem przez 100 minut. Po zakończeniu 100-minutowej inkubacji odlać mieszaninę polimerazy do amplifikacji i wypłukać preparaty buforem piorącym 1X NC2 wash buffer B w naczyniu Coplina. Przepłukiwać w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu dwukrotnie po 10 minut każdorazowo.Następnie przemyć preparaty w 0,01x buforze płuczącym B przez jedną minutę. Odlej nadmiar buforu płuczącego B i osusz preparaty wokół plamek za pomocą bezpyłowej chusteczki. Usuń jak największą ilość cieczy z plamki.Przygotuj medium montażowe z DAPI, które nie doprowadzi do nadmiernego barwienia jąder, rozcieńczając medium montażowe z DAPI w stosunku 1:5 w medium montażowym bez DAPI. Nanieś od 25 do 30 µL rozcieńczonego medium montażowego z DAPI na szkiełko nakrywką o wymiarach 24 mm na 24 mm. Podnieś szkiełko nakrywką wraz z preparatem i lekko dociśnij, aby upewnić się, że nie pozostały uwięzione pęcherzyki powietrza.Zapieczętuj szkiełko przykrywne lakierem do paznokci i odczekaj co najmniej 15 minut przed obrazowaniem. Na koniec wykonaj obrazowanie i przeanalizuj preparaty za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Test bliskości ligacji (proximity ligation assay) został wykorzystany do zbadania interakcji między ATM a fosfoseryną 15 p53 w ludzkich komórkach BCR-abl pozytywnych BV 173 zatrzymanych w fazie G1.W przeciwieństwie do komórek, których nie poddano działaniu NCS w celu wywołania uszkodzeń DNA, w większości komórek traktowanych NCS widoczne były sygnały punktowe wyłącznie w jądrze komórkowym, średnio siedem sygnałów na komórkę. Wskazuje to, że indukcja uszkodzeń DNA prowadzi do interakcji między ATM a fosfoseryną 15 p53. Wcześniejsze potraktowanie komórek specyficznym inhibitorem kinazy ATM przed indukcją uszkodzeń DNA zmniejszyło liczbę sygnałów do średnio dwóch sygnałów na komórkę, co potwierdza, że fosforylacja p53 w reszcie serynowej 15 była zależna od aktywności kinazy ATM.Eksperymenty kontrolne z pojedynczym przeciwciałem, w których zastosowano albo przeciwciało anty-ATM, albo przeciwciało anty-fosfoseryna 15 p53, nie dały żadnych sygnałów, co było oczekiwanym rezultatem. Rysunek ten przedstawia kwantyfikację i analizę statystyczną wyników, które demonstrują i potwierdzają specyficzność techniki analizy ligacji w bliskim sąsiedztwie (proximity ligation assay) na preparatach cytospinowych kultur komórek w zawiesinie. Po opanowaniu techniki, jej przeprowadzenie zajmuje około pięciu godzin po całonocnej inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, pod warunkiem prawidłowej realizacji procedury.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o dokładnym miareczkowaniu przeciwciała za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego komórek badanego obiektu przed przeprowadzeniem analizy ligacji bliskości. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom biologii komórki do badania przejściowych oddziaływań białko-białko, które są trudne do oceny przy użyciu standardowych metod, takich jak immunoprecypitacje i obrazowanie oparte na FRET, które często prowadzą do powstania artefaktów technicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić analizę ligacji bliskości w zawiesinowych kulturach komórkowych w celu wizualizacji i kwantyfikacji oddziaływań białko-białko in situ.

detection-visualization-dna-damage-induced-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy pokazujemy, jak wykorzystać test ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay, PLA) wraz z kombinacją przeciwciał do wizualizacji sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (Bone Morphogenetic Protein, BMP) w utrwalonych komórkach. Technika ta pozwoliła nam śledzić nuklearną akumulację endogennych kompleksów efektorowych aktywowanych przez BMP oraz ilościowo określić ich poziomy w czasie pod wpływem stymulacji BMP4.

Wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu ligacji w bliskości

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy...

Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj metodę PLA do wykrywania kompleksów białkowych w komórkach zawiesinowych BV-173. Technika ta umożliwia wizualizację interakcji ATM-p53 w odpowiedzi na uszkodzenie DNA.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Przeglądaj więcej filmów