Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego
22 grudnia 2023
Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.
Reakcja na uszkodzenie DNA jest niezbędna do życia, ponieważ DNA jest stale narażone na różne czynniki uszkadzające. Brak naprawy prowadzi do niestabilności genomów i chorób. Opracowaliśmy metodę opartą na właściwościach biologicznych RPA2 do wizualizacji jednoniciowego odcinka DNA podczas naprawy DNA na różnych etapach cyklu komórkowego.
Tradycyjna metoda wykrywania jednoniciowego DNA wykorzystuje przeciwciała BrdU. Takie podejście można wykorzystać do aktywnej replikacji komórek. Dodatkowo przeciwciało to ma tendencję do reakcji krzyżowych z innymi analogami nukleotydów, co ogranicza ich stosowanie.
W przeciwieństwie do BrdU, nasze podejście ma wyższy stosunek sygnału do szumu, dzięki czemu można je stosować w każdej fazie cyklu. Kluczowe znaczenie ma zrozumienie działania różnych szlaków naprawy DNA w różnych fazach cyklu komórkowego i potencjalnie niereplikujących się komórkach. Nasz protokół zapewnia nowe podejście i narzędzie do wizualizacji jednoniciowych ognisk DNA, w przypadku których klasyczne podejścia wykorzystujące BrdU są ograniczone.
Kompleksowe zrozumienie procesów naprawy DNA może posłużyć jako cele terapeutyczne w leczeniu raka, starzenia się i chorób neurologicznych. Większość naszych komórek jest terminalnie różnicowana i dlatego nie replikuje się i nie dzieli. Bardzo ważne jest, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki te naprawiają różne uszkodzenia DNA.
W związku z tym nasze laboratorium będzie koncentrować się głównie na procesach poreplikacyjnej naprawy DNA i opracowywaniu nowych narzędzi do ich badania. Aby rozpocząć, wysterylizuj pęsetę 70% etanolem. Umieść pojedynczą szklaną pokrywę w dołku na płytce 24-dołkowej.
Dodać 500 mikrolitrów roztworu witronektyny do każdej studzienki zawierającej szkiełka nakrywkowe. Po inkubacji usunąć roztwór powlekający i zmyć szkiełka nakrywkowe jednym mililitrem PBS. Inkubuj komórki RPE1 w jednym mililitrze 0,05% trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Aby odłączyć wygłodzone komórki surowicy od płytki poddanej hodowli tkankowej, ponownie zawieś komórki RPE1 w sześciu mililitrach pożywki DMEM, aby dezaktywować trypsynę. Następnie odwirować komórki w temperaturze 150 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki hodowlanej.
Wysiać 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na powlekanym szkiełku nakrywkowym. Pulsuj komórki 10 mikromolami EdU przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń pożywkę zawierającą EdU i ścigaj komórki z 10 mikromolami tymidyny przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po usunięciu pożywki tymidynowej potraktuj komórki 250 mikromolami nadtlenku wodoru przez godzinę. Aby przeprowadzić ekstrakcję wstępną, należy inkubować umyte komórki w jednym mililitrze buforu ekstrakcyjnego CSK przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie utrwal komórki w 0,5 mililitra 3,6% roztworu paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie umyj komórki w jednym mililitrze PBS zawierającym 0,05% Triton X-100, aby usunąć paraformaldehyd. Po zakończeniu przepuszczalności usuń roztwór i przemyj komórki dwa razy jednym mililitrem buforu blokującego. Następnie dodaj jeden mililitr buforu blokującego i delikatnie kołysz płytką przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Dodać 500 mikrolitrów koktajlu reakcyjnego Click zawierającego Picolyl Azide-647 po usunięciu buforu blokującego. Następnie umyj komórki dwukrotnie PBS zawierającym 0,05% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Teraz inkubuj umyte komórki w jednym mililitrze buforu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie inkubować komórki w przeciwciałie pierwszorzędowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w 250 do 500 mikrolitrach buforu blokującego. Umyj komórki dwa razy za pomocą Triton X PBS. Następnie umyj komórki w buforze blokującym.
Teraz nałóż przeciwciało wtórne w 250 do 500 mikrolitrach buforu blokującego w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, delikatnie kołysząc. Po zakończeniu inkubacji umyć komórki w PBS i buforze blokującym. Przeciwdziałaj barwieniu jąder umytych komórek w DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie myj komórki PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zanurz pokrywę w wodzie destylowanej, aby usunąć kryształki soli. Następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych w 10 mikrolitrach medium montażowego.
Przechowuj poplamione szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby uchwycić obrazy, użyj mikroskopu epifluorescencyjnego z rutynowymi zestawami filtrów dla kanałów DAPI, FITC i Cy5. Otwórz pliki obrazów w oprogramowaniu Fiji.
Aby wykonać maski nuklearne za pomocą barwienia DAPI, najpierw otwórz obraz DAPI. Wybierz Proces, a następnie Zwiększ kontrast i ustaw nasycony piksel na 0,35. Następnie ponownie naciśnij Przetwarzaj i wybierz Binarny, a następnie Konwertuj na maskę.
Kliknij ponownie Process i Binary. Następnie naciśnij przycisk Wypełnij otwory. Kliknij opcję Analizuj cząstki w obszarze Analizuj i ustaw rozmiar na 10-Nieskończoność.
Następnie kliknij Pokaż wszystko w Menedżerze ROI Aby znaleźć ogniska RPA2, najpierw otwórz obraz RPA2. Kliknij Procesowy i wybierz Znajdź maksimę. Następnie ustaw wypukłość na wartość, która podkreśla ogniska.
Kliknij przycisk Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Następnie podziel wartość w kolumnie RawIntDen przez 255, aby obliczyć całkowitą liczbę jądrowych ognisk jednoniciowego DNA. Dodanie pożywki zawierającej surowicę do wygłodzonych komórek przez sześć godzin powodowało ponowne wejście w cykl komórkowy.
Synchronizację komórek potwierdzono testem inkorporacji EdU i brakiem replikacji DNA w fazie G1. Leczenie nadtlenkiem wodoru i neokarzynostatyną powodowało wykrycie ognisk BrdU tylko w komórkach fazy S. Ani próbki nieleczone, ani poddane działaniu substancji nie wykazały kolokalizacji EdU i BrdU, co nie wykazało reaktywności krzyżowej przeciwciał w naszym podejściu.
Barwienie RPA2 wykazało powstawanie ognisk zależnych od neokarzynostatyny i nadtlenku wodoru, nie tylko w fazie S, ale także w innych fazach cyklu komórkowego. Przeciwciało RPA2 wykryło również naturalnie występujące tworzenie się jednoniciowego DNA podczas replikacji przy braku egzogennego stresu genotoksycznego. Znaczny wzrost ognisk RPA2 zaobserwowano w komórkach w fazie G1 po leczeniu nadtlenkiem wodoru.
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy detekcji ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego, podkreślając znaczenie mechanizmów naprawy DNA. Dzięki zastosowaniu synchronizacji cyklu komórkowego oraz barwienia immunofluorescencyjnego RPA2, metoda ta stanowi niezawodny sposób wizualizacji uszkodzeń DNA w różnych etapach cyklu komórkowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Odpowiedź na uszkodzenia DNA
- Synchronizacja cyklu komórkowego
- Barwienie immunofluorescencyjne
Wprowadzenie
- Znaczenie naprawy DNA w utrzymaniu stabilności genomu
- Ograniczenia tradycyjnych metod z użyciem przeciwciał przeciwko BrdU w detekcji jednoniciowego DNA
- Konieczność lepszego zrozumienia procesów naprawy DNA w komórkach niereplikujących się
Zastosowane metody
- Barwienie immunofluorescencyjne RPA2
- Komórki RPE1 jako model biologiczny
- Synchronizacja cyklu komórkowego z następującym po niej traktowaniem nadtlenkiem wodoru
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja ognisk RPA2 w różnych fazach cyklu komórkowego
- Wykazanie zwiększonej liczby ognisk w odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA
- Wyraźne odróżnienie od tradycyjnych metod z użyciem BrdU, bez zaobserwowanego krzyżowania reakcji przeciwciał
Wnioski
- Badanie przedstawia nowatorską metodę wizualizacji ognisk jednoniciowego DNA w trakcie całego cyklu komórkowego.
- Postęp ten ma istotne znaczenie dla zrozumienia procesów naprawy DNA oraz ich związku z badaniami nad rakiem i starzeniem się organizmu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA (ssDNA) w komórkach w fazie G1 pozwala wypełnić istotną lukę w rozumieniu dynamiki naprawy DNA poza procesem replikacji. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dla szlaków odpowiedzi na uszkodzenia DNA, wspierając decyzje uwzględniające ryzyko w badaniach wczesnego etapu odkrywania oraz badaniach translacyjnych. Specyficzność tej metody oraz poprawiony stosunek sygnału do szumu umożliwiają rzetelną ocenę mechanizmów naprawczych w nie replikujących się i postmitotycznych populacjach komórek, istotnych dla onkologii oraz portfela chorób związanych z wiekiem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę aktywności szlaków naprawy DNA w komórkach w fazie G1.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez odróżnienie zdarzeń naprawczych niezależnych od replikacji DNA.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla białek zaangażowanych w stabilizację i naprawę ssDNA.
- Zwiększa pewność predykcyjną dla hipotez terapeutycznych specyficznych dla danego szlaku.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowany test immunofluorescencyjny do ilościowego oznaczania ognisk ssDNA w zsynchronizowanych populacjach komórek.
- Ogranicza reakcje krzyżowe i tło obserwowane w testach opartych na BrdU, co zwiększa powtarzalność.
- Umożliwia standaryzowany odczyt w badaniach przesiewowych związków ukierunkowanych na procesy naprawy DNA.
- Wspiera skalowalność testu i ponowne wykorzystanie platformy w różnych fazach cyklu komórkowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla chorób, umożliwiając analizę w komórkach niereplikujących się i terminalnie zróżnicowanych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację celów naprawy DNA.
- Ułatwia dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów modyfikujących odpowiedź na uszkodzenia DNA.
- Zapewnia wgląd mechanistyczny w angażowanie szlaków naprawczych w warunkach stresu genotoksycznego.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta metoda wizualizacji ssDNA oparta na immunofluorescencji integruje się z kontinuum od etapu odkryć po badania przedkliniczne, umożliwiając wczesne testowanie hipotez oraz rozwój dalszych analiz dla celów terapeutycznych związanych z naprawą DNA.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zaangażowania szlaków naprawy oraz tworzenia ssDNA w fazie G1.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe zliczanie ognisk do oceny związków.
- Analityka: Dostarcza solidnych pomiarów opartych na obrazowaniu w celu porównania różnych warunków i analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Umożliwia ocenę naprawy DNA w systemach komórkowych niepowielających się, istotnych dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę testową możliwą do ponownego wykorzystania w różnorodnych badaniach nad odpowiedzią na uszkodzenia DNA.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naprawy DNA.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów w zespołach badawczo-rozwojowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie aktywności ścieżek naprawy.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację modulatorów naprawy DNA i celów szlaków z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie synchronizacji komórek, immunofluorescencji oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do mikroskopii epifluorescencyjnej oraz kompatybilnego oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. Fiji).
- Wymaga standaryzacji protokołów barwienia, obrazowania i analizy pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych typów komórek, w tym modeli niereplikujących się i terminalnie zróżnicowanych.
- Skuteczność detekcji sygnału jest zależna od zastosowania zwalidowanych przeciwciał oraz zoptymalizowanych warunków barwienia.
