Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Reakcja na uszkodzenie DNA jest niezbędna do życia, ponieważ DNA jest stale narażone na różne czynniki uszkadzające. Brak naprawy prowadzi do niestabilności genomów i chorób. Opracowaliśmy metodę opartą na właściwościach biologicznych RPA2 do wizualizacji jednoniciowego odcinka DNA podczas naprawy DNA na różnych etapach cyklu komórkowego.

Tradycyjna metoda wykrywania jednoniciowego DNA wykorzystuje przeciwciała BrdU. Takie podejście można wykorzystać do aktywnej replikacji komórek. Dodatkowo przeciwciało to ma tendencję do reakcji krzyżowych z innymi analogami nukleotydów, co ogranicza ich stosowanie.

W przeciwieństwie do BrdU, nasze podejście ma wyższy stosunek sygnału do szumu, dzięki czemu można je stosować w każdej fazie cyklu. Kluczowe znaczenie ma zrozumienie działania różnych szlaków naprawy DNA w różnych fazach cyklu komórkowego i potencjalnie niereplikujących się komórkach. Nasz protokół zapewnia nowe podejście i narzędzie do wizualizacji jednoniciowych ognisk DNA, w przypadku których klasyczne podejścia wykorzystujące BrdU są ograniczone.

Kompleksowe zrozumienie procesów naprawy DNA może posłużyć jako cele terapeutyczne w leczeniu raka, starzenia się i chorób neurologicznych. Większość naszych komórek jest terminalnie różnicowana i dlatego nie replikuje się i nie dzieli. Bardzo ważne jest, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki te naprawiają różne uszkodzenia DNA.

W związku z tym nasze laboratorium będzie koncentrować się głównie na procesach poreplikacyjnej naprawy DNA i opracowywaniu nowych narzędzi do ich badania. Aby rozpocząć, wysterylizuj pęsetę 70% etanolem. Umieść pojedynczą szklaną pokrywę w dołku na płytce 24-dołkowej.

Dodać 500 mikrolitrów roztworu witronektyny do każdej studzienki zawierającej szkiełka nakrywkowe. Po inkubacji usunąć roztwór powlekający i zmyć szkiełka nakrywkowe jednym mililitrem PBS. Inkubuj komórki RPE1 w jednym mililitrze 0,05% trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby odłączyć wygłodzone komórki surowicy od płytki poddanej hodowli tkankowej, ponownie zawieś komórki RPE1 w sześciu mililitrach pożywki DMEM, aby dezaktywować trypsynę. Następnie odwirować komórki w temperaturze 150 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki hodowlanej.

Wysiać 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na powlekanym szkiełku nakrywkowym. Pulsuj komórki 10 mikromolami EdU przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń pożywkę zawierającą EdU i ścigaj komórki z 10 mikromolami tymidyny przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po usunięciu pożywki tymidynowej potraktuj komórki 250 mikromolami nadtlenku wodoru przez godzinę. Aby przeprowadzić ekstrakcję wstępną, należy inkubować umyte komórki w jednym mililitrze buforu ekstrakcyjnego CSK przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie utrwal komórki w 0,5 mililitra 3,6% roztworu paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj komórki w jednym mililitrze PBS zawierającym 0,05% Triton X-100, aby usunąć paraformaldehyd. Po zakończeniu przepuszczalności usuń roztwór i przemyj komórki dwa razy jednym mililitrem buforu blokującego. Następnie dodaj jeden mililitr buforu blokującego i delikatnie kołysz płytką przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Dodać 500 mikrolitrów koktajlu reakcyjnego Click zawierającego Picolyl Azide-647 po usunięciu buforu blokującego. Następnie umyj komórki dwukrotnie PBS zawierającym 0,05% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Teraz inkubuj umyte komórki w jednym mililitrze buforu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubować komórki w przeciwciałie pierwszorzędowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w 250 do 500 mikrolitrach buforu blokującego. Umyj komórki dwa razy za pomocą Triton X PBS. Następnie umyj komórki w buforze blokującym.

Teraz nałóż przeciwciało wtórne w 250 do 500 mikrolitrach buforu blokującego w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, delikatnie kołysząc. Po zakończeniu inkubacji umyć komórki w PBS i buforze blokującym. Przeciwdziałaj barwieniu jąder umytych komórek w DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie myj komórki PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zanurz pokrywę w wodzie destylowanej, aby usunąć kryształki soli. Następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych w 10 mikrolitrach medium montażowego.

Przechowuj poplamione szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby uchwycić obrazy, użyj mikroskopu epifluorescencyjnego z rutynowymi zestawami filtrów dla kanałów DAPI, FITC i Cy5. Otwórz pliki obrazów w oprogramowaniu Fiji.

Aby wykonać maski nuklearne za pomocą barwienia DAPI, najpierw otwórz obraz DAPI. Wybierz Proces, a następnie Zwiększ kontrast i ustaw nasycony piksel na 0,35. Następnie ponownie naciśnij Przetwarzaj i wybierz Binarny, a następnie Konwertuj na maskę.

Kliknij ponownie Process i Binary. Następnie naciśnij przycisk Wypełnij otwory. Kliknij opcję Analizuj cząstki w obszarze Analizuj i ustaw rozmiar na 10-Nieskończoność.

Następnie kliknij Pokaż wszystko w Menedżerze ROI Aby znaleźć ogniska RPA2, najpierw otwórz obraz RPA2. Kliknij Procesowy i wybierz Znajdź maksimę. Następnie ustaw wypukłość na wartość, która podkreśla ogniska.

Kliknij przycisk Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Następnie podziel wartość w kolumnie RawIntDen przez 255, aby obliczyć całkowitą liczbę jądrowych ognisk jednoniciowego DNA. Dodanie pożywki zawierającej surowicę do wygłodzonych komórek przez sześć godzin powodowało ponowne wejście w cykl komórkowy.

Synchronizację komórek potwierdzono testem inkorporacji EdU i brakiem replikacji DNA w fazie G1. Leczenie nadtlenkiem wodoru i neokarzynostatyną powodowało wykrycie ognisk BrdU tylko w komórkach fazy S. Ani próbki nieleczone, ani poddane działaniu substancji nie wykazały kolokalizacji EdU i BrdU, co nie wykazało reaktywności krzyżowej przeciwciał w naszym podejściu.

Barwienie RPA2 wykazało powstawanie ognisk zależnych od neokarzynostatyny i nadtlenku wodoru, nie tylko w fazie S, ale także w innych fazach cyklu komórkowego. Przeciwciało RPA2 wykryło również naturalnie występujące tworzenie się jednoniciowego DNA podczas replikacji przy braku egzogennego stresu genotoksycznego. Znaczny wzrost ognisk RPA2 zaobserwowano w komórkach w fazie G1 po leczeniu nadtlenkiem wodoru.