Wizualizacja replikacji DNA w kręgowym systemie modelowym DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Należy rozpocząć od wbudowania halogenowanych analogów nukleotydów do nowo syntetyzowanego DNA. W przypadku żywych komórek, komórki z oznakowanym DNA nanosi się na preparat mikroskopowy.

Następnie nanosi się komórki i rozciąga DNA na szkiełku przedmiotowym. Kolejne barwienie immunologiczne włókien DNA oraz analiza obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej pozwalają wyjaśnić globalną dynamikę widełek replikacyjnych, co umożliwia ilościową analizę parametrów wpływających na ogólny program replikacji. W ciągu ostatnich lat opracowano różne wersje technik znakowania włókien DNA w celu wizualizacji ruchu poszczególnych widełek replikacyjnych w żywych komórkach.

Ten eksperyment in vivo na komórkach DT 40, który za chwilę zostanie zaprezentowany, można przeprowadzić w ciągu jednego dnia; wymaga on jedynie podstawowego wyposażenia laboratoryjnego oraz mikroskopu fluorescencyjnego. Procedurę zademonstruje dr Rebecca Schwab, postdok w moim laboratorium. Aby znakować komórki DT 40 in vivo, należy rozpocząć od kultury w fazie wzrostu wykładniczego. Dodać znacznik IDU do stężenia końcowego 25 $\mu$M i wymieszać zawiesinę komórkową.

Komórki inkubujemy przez 20 minut w temperaturze 38°C i 5% carbon dioxide. Następnie dodajemy znacznik CLDU do stężenia końcowego 250 micromolar. Mieszamy i inkubujemy zawiesinę komórkową.

Następnie przemyj komórki DT 40 lodowatym roztworem PBS. Resuspender osady komórkowe w zimnym PBS i przechowywać oznakowane komórki w lodzie. Nanieś 2 µL zawiesiny komórkowej na jeden koniec szkiełka przedmiotowego i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, aż objętość kropli zostanie znacznie zredukowana, ale nie całkowicie wyschnie.

Teraz dodaj 7 µL roztworu do lizy włókien na powierzchnię zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj roztwory, mieszając końcówką pipety, a następnie inkubuj przez dwie minuty. Następnie przechyl preparaty pod kątem 15 stopni, aby umożliwić rozprzestrzenienie się włókien wzdłuż szkiełka. Gdy roztwór włókien dotrze do dolnej krawędzi szkiełka, połóż go poziomo i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

W tym momencie wzdłuż szkiełka powinna być widoczna cienka, nieprzezroczysta linia. Zaznacz ołówkiem początek rozciągniętych włókien. Następnie zanurz szkiełka w mieszaninie metanolu i kwasu octowego w stosunku trzech do jednego na 10 minut.

Przemyj preparaty wodą destylowaną, a następnie zanurz je w 2,5 M kwasie solnym na 80 minut. Przemyj preparaty trzykrotnie w PBS przez pięć minut. Nadmiar PBS usuń za pomocą ręcznika papierowego.

Następnie ułóż preparaty poziomo. Teraz nanieś pipetą 5% BSA w PBS na każdy preparat, nałóż szkiełko podstawowe i inkubuj przez 20 minut. Delikatnie przesuń szkiełko podstawowe w dół szkiełka przedmiotowego.

Nadmiar BSA należy usunąć za pomocą ręcznika papierowego. Następnie do każdego preparatu należy nanieść pipetą 50 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego anty-BRDU.

Przykryj preparat szkiełkiem nakrywką i inkubuj w wilgotnej komorze przez dwie godziny. Po zdjęciu szkiełek nakrywczych przemyj slajdy trzykrotnie w PBS przez pięć minut. Nanieś 50 µL roztworu przeciwciała wtórnego, nałóż szkiełka nakrywcze, a następnie zabezpiecz slajdy przed światłem.

Następnie inkubować przez jedną godzinę. Zdjąć szkiełka nakrywki i przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez pięć minut. Na koniec nanieść na każde szkiełko kroplę medium montującego Vector Shield.

Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkę i usuń nadmiar płynu wokół niej. Za pomocą ręcznika papierowego zabezpiecz krawędzie szkiełek nakrywek przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Przechowuj preparaty w temperaturze -20 °C.

Nanieś kroplę olejku immersyjnego na preparat w pobliżu zaznaczenia ołówkiem i rozpocznij lokalizację włókien. Przesuń się poza główny pęczek, aby znaleźć obszary, w których włókna są wyraźnie od siebie oddzielone. W typowym eksperymencie wybieraj zdjęcia przy użyciu tylko jednego kanału kolorystycznego, aby uniknąć błędu systematycznego.

Następnie należy wykonać około 10 zdjęć każdej próbki. Przesuwaj się wzdłuż szkiełka, aby wykonać różne zdjęcia, ponieważ jeden obszar preparatu może nie dostarczyć reprezentatywnych długości włókien lub struktur replikacyjnych. Zaimportuj zdjęcia do programu do analizy obrazu.

Zmierz długości 100 pęczków włókien lub policz od 150 do 200 różnych struktur replikacyjnych. Technika podwójnego znakowania włókien pozwala na rozróżnienie poszczególnych struktur replikacyjnych. Nowo zreplikowane DNA można wizualizować jako linie analogów nukleotydowych znakowanych przeciwciałami.

W tym przypadku trwająca elongacja widelca replikacyjnego jest reprezentowana jako sąsiadujące sygnały czerwone i zielone. Nowe zdarzenia inicjacji można podzielić na miejsca inicjacji, które uległy aktywacji podczas inkubacji komórek z pierwszym znacznikiem, oraz miejsca inicjacji, które aktywowały się podczas inkubacji z drugim znacznikiem. Te pierwsze składają się z sąsiadujących sygnałów zielonych oraz czerwono-zielonych, a te drugie wyłącznie z linii zielonej.

Zdarzenia terminacji objawiają się jako sąsiadujące ze sobą kolory czerwony i zielony. Sygnały czerwone występują przeplatająco. Obszary początkowe składają się z następujących po sobie sekwencji początkowych i sygnałów terminacji.

W zależności od projektu eksperymentalnego, zablokowane lub zapadnięte widelce mogą być definiowane albo jako sygnał wyłącznie czerwony, albo jako czerwona linia, po której następuje krótki zielony odcinek. W tym eksperymencie komórki DT 40 typu dzikiego mają średnią prędkość widelca wynoszącą 0,4 microns per minute. Odnotowano 63%ongoing forks, 10%origins, 16%stalled forks, 8%terminations oraz 3%interspersed fibers.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wizualizować i analizować dynamikę widełek replikacyjnych w komórkach DT 40. Dostarczy Ci to niezbędnego narzędzia do badania defektów replikacji DNA.