Name: Wizualizacja replikacji DNA w Układzie Modelowym Kręgowców DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek w komórkach DT40. Technika włókien DNA umożliwia analizę dynamiki rozwidlenia replikacyjnego i parametrów syntezy DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr T. Helleday oraz dr E. Petermann za pomoc w zastosowaniu techniki światłowodowej, a także członkom laboratorium za pomocne dyskusje. WN jest wspierany przez Senior International Research Fellowship z Association for International Cancer Research oraz grant z Komitetu Badań Naukowych (N301 165935).

Metoda opisana w niniejszym materiale została wykorzystana w następującej publikacji: Schwab et al., EMBO J., 29(4):806-185.
1. Hodowla komórek DT40
Materiały: płodowa surowica bydlęca (FBS), surowica z kurczaka, penicylina/streptomycyna, 2-merkaptoetanol, RPMI
<ol>
<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej: do pożywki RPMI dodać 7% FBS, 3% surowicy z kurczaka, 1x penicylinę/streptomycynę oraz 10 μM 2-merkaptoetanolu.</li>
<li>Komórki DT40 hodować w sterylnych kolbach do hodowli komórkowej w temperaturze 38 °C i 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaczem. Przesiewać komórki codziennie do gęstości 5 x 105 komórek/ml6.</li>
</ol>
2. Markowanie in vivo
Materiały: IdU, CldU
<ol>
<li>Przygotować roztwory zapasowe analogów nukleotydów: rozpuścić IdU do stężenia 5 mM i CldU do 2,5 mM w pożywce. Krótko podgrzać oba roztwory do 60 °C i mieszać w wortexie aż do całkowitego rozpuszczenia analogów nukleotydów.</li>
<li>Dodać IdU do wykładniczo rosnących komórek DT40 do stężenia końcowego 25 μM i dobrze wymieszać zawiesinę komórkową. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 38 °C i 5% CO2.</li>
<li>Po inkubacji z pierwszym znacznikiem dodać CldU do stężenia końcowego 250 μM i postąpić z komórkami zgodnie z opisem w poprzednim kroku.</li>
<li>Przemyć komórki lodowatym PBS i resuspendować je w zimnym PBS do stężenia 7,5 x 105 komórek/ml. Przechowywać oznakowane komórki na lodzie.</li>
</ol>
Opisana procedura znakowania jest jedynie sugestią i może zostać zmodyfikowana w celu udzielenia odpowiedzi na konkretne pytania badawcze. Więcej informacji na temat planowania eksperymentu znajduje się w sekcji dyskusji.
3. Lizy komórek i rozprzestrzenianie DNA
Materiały: Przedmioty szkiełka, roztwór do lizy włókien
<ol>
<li>Przygotować roztwór do lizy włókien: 50 mM EDTA i 0,5% SDS w 200 mM Tris-HCl, pH 7,5</li>
<li>Nanieść 2 μl zawiesiny komórkowej na jeden koniec szkiełka przedmiotowego. Suszyć na powietrzu przez 5 minut lub do momentu znacznego zmniejszenia objętości kropli, tak aby nie wyschła całkowicie.</li>
<li>Nanieść pipetą 7 μl roztworu do lizy na zawiesinę komórkową i delikatnie wymieszać końcówką pipety. Inkubować przez 2 minuty w celu przeprowadzenia lizy komórek.</li>
<li>Przechylić szkiełka pod kątem 15°, aby umożliwić rozprzestrzenienie się włókien wzdłuż szkiełka.</li>
<li>Gdy roztwór z włóknami dotrze do dolnej krawędzi szkiełka, ułożyć je poziomo do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu wzdłuż szkiełka powinna być widoczna cienka, nieprzezroczysta linia. W tym momencie należy zaznaczyć ołówkiem początek rozciągniętych włókien, ponieważ po zabarwieniu linia ta nie będzie już widoczna. Zaznaczenie to pomoże później w zlokalizowaniu włókien pod mikroskopem.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
Materiały: Metanol, kwas octowy, HCl, 5% BSA w PBS, słoik do barwienia, przeciwciało anty-BrdU (mysie), przeciwciało anty-BrdU (szczurze), owcze przeciwciało anty-mysie Cy3, kozie przeciwciało anty-szczurze Alexa Fluor 488, medium montażowe Vectashield, szkiełka nakrywkowe, lakier do paznokci
<ol>
<li>Zanurzyć preparaty w mieszaninie metanolu i kwasu octowego (3:1) w naczyniu do barwienia i inkubować przez 10 minut.</li>
<li>Przemyć preparaty w destylowanej H2O, a następnie zanurzyć w 2,5 M HCl na 80 minut.</li>
<li>Przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez 5 minut.</li>
<li>Wyjąć preparaty z naczynia do barwienia i zebrać nadmiar PBS za pomocą ręcznika papierowego. Położyć preparaty poziomo i nanieść pipetą 5% BSA na każdy z nich. Ostrożnie przykryć preparaty szkiełkiem nakrywkowym, aby równomiernie rozprowadzić BSA na całej powierzchni, i inkubować przez 20 minut.</li>
<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 5% BSA w następujących stężeniach: 1:25 przeciw-BrdU (mysie) oraz 1:40 przeciw-BrdU (szczurze).</li>
<li>Ostrożnie przesunąć szkiełko nakrywkowe wzdłuż płytki szklanej, aby je usunąć. Nie używać siły, jeśli szkiełko przywarło do preparatu. Preparat można nawodnić w PBS, aż szkiełko nakrywkowe poluzuje się i będzie można je z łatwością zdjąć. Zebrać nadmiar BSA ręcznikiem papierowym i położyć preparaty poziomo. Nanieść pipetą 50 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych na każdy preparat. Ponownie przykryć szkiełkiem nakrywkowym, aby równomiernie rozprowadzić roztwór przeciwciał na płytce, i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 2 godziny.</li>
<li>Po zdjęciu szkiełek nakrywkowych przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez 5 minut.</li>
<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 5% BSA w następujących stężeniach: 1:50 owcze przeciw-mysie Cy3 oraz 1:40 kozie przeciw-szczurze Alexa Fluor 48.</li>
<li>Nanieść 50 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych zgodnie z procedurą opisaną dla przeciwciał pierwszorzędowych. Chronić preparaty przed światłem i inkubować przez 1 godzinę.</li>
<li>Po zdjęciu szkiełek nakrywkowych przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez 5 minut.</li>
<li>Nanieść kroplę medium montażowego Vectashield na każdy preparat i przyłożyć szkiełko nakrywkowe. Delikatnie docisnąć szkiełka i usunąć nadmiar płynu z wokół nich za pomocą ręcznika papierowego. Uszczelnić szkiełka bezbarwnym lakierem do paznokci i pozostawić do wyschnięcia. Przechowywać preparaty w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazów
Materiały: mikroskop fluorescencyjny, kamera
Nanieś kroplę olejku imersyjnego na szkiełko w pobliżu znaku ołówkiem i zacznij lokalizować włókna. Zazwyczaj występuje główny pęczek włókien, jednak włókna te są zbyt splątane, co uniemożliwia ich późniejszą analizę. Przesuń się poza główny pęczek, aby znaleźć obszary, w których włókna są wyraźnie oddzielone od siebie (Ryc. 2). Wybieramy zdjęcia przy użyciu tylko jednego kanału kolorystycznego, aby uniknąć błędów systematycznych. Następnie wykonujemy około 10 zdjęć dla każdego punktu czasowego, stężenia lub linii komórkowej. Liczba zdjęć zależy jednak od tego, ile włókien można policzyć na każdym zdjęciu. Przesuwaj się wzdłuż szkiełka, aby wykonać różne zdjęcia, ponieważ jeden obszar szkiełka może nie zapewniać reprezentatywnych długości włókien lub struktur replikacyjnych.
6. Analiza danych
Materiały: Program do analizy obrazów, np. ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>) 
Zaimportuj zdjęcia do programu do analizy obrazu. Zmierz długości pęczków włókien i/lub policz różne struktury replikacyjne (Ryc. 3). Należy liczyć tylko włókna, które są wyraźnie widoczne i nie wychodzą poza krawędź zdjęcia. Zazwyczaj mierzymy długość około 10 włókien i liczymy 150-20 struktur replikacyjnych, a poszczególne eksperymenty powtarzamy co najmniej trzy razy.
7. Reprezentatywne wyniki:
Nowo zreplikowany DNA można wizualizować jako linie analogów nukleotydowych znakowanych przeciwciałami. W naszych eksperymentach aktywny widelec replikacyjny jest reprezentowany przez sąsiadujące sygnały czerwone i zielone (Ryc. 3). Protokół podwójnego znakowania pozwala nam również zdefiniować cztery główne klasy struktur replikacyjnych: 1) nowe zdarzenia inicjacji można podzielić na miejsca inicjacji (origins), które zostały aktywowane podczas inkubacji komórek z pierwszym znacznikiem, oraz miejsca inicjacji aktywowane podczas inkubacji z drugim znacznikiem. Te pierwsze składają się z sąsiadujących sygnałów zielony-czerwony-zielony, a te drugie z linii wyłącznie zielonej. 2) zdarzenia terminacji manifestują się jako przylegające sygnały czerwony-zielony-czerwony. 3) rozproszone miejsca inicjacji (interspersed origins) to obszary w genomie z gęsto rozmieszczonymi punktami startu replikacji. Takie miejsca składają się z następujących po sobie sygnałów inicjacji i terminacji. 4) w zależności od projektu eksperymentalnego, zatrzymane lub zapadnięte widelce replikacyjne można zdefiniować albo jako sygnał wyłącznie czerwony7, albo jako linię czerwoną, po której następuje krótki odcinek zielony8,9.
Stosując warunki opisane w niniejszym opracowaniu, komórki DT40 typu dzikiego wykazują średnią prędkość widelca replikacyjnego wynoszącą 0,4 μm/min. Możemy wykryć około 63% aktywnych widelców, 10% miejsc inicjacji (originów), 16% zatrzymanych widelców (odcinki tylko czerwone), 8% terminacji oraz 3% przeplatających się włókien.
<img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig1.jpg" alt="Proces replikacji DNA; integracja IdU, CldU; schemat; układ eksperymentalny; technika znakowania DNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. (A) Lewa strona schematu przedstawia pierwszy etap procedury znakowania DNA: dodanie IdU do komórek DT40 w fazie wzrostu wykładniczego powoduje łatwe wbudowanie analogu nukleotydowego w nowo syntetyzowane nici wiodącą i opóźnioną. Można to zwizualizować przy użyciu specyficznego przeciwciała, co pod mikroskopem objawi się jako czerwona linia. Następnie tę samą procedurę powtarza się z użyciem CldU, co pokazano po prawej stronie rysunku. Po inkubacji z drugim analogiem nukleotydowym aktywny widelec replikacyjny będzie widoczny jako przyległy odcinek czerwono-zielony. Średnia długość włókna jest proporcjonalna do czasu inkubacji z analogami nukleotydowymi. (B) DNA z lizowanych komórek DT40 zostaje rozciągnięte pod wpływem grawitacji na preparacie mikroskopowym, a wbudowane analogi nukleotydowe są wizualizowane za pomocą specyficznych przeciwciał i mikroskopii fluorescencyjnej. 
<img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, oddziaływania filamentów białkowych, obraz mikroskopowy, badania w biologii komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny obraz fluorescencyjny przedstawia włókna z komórek DT40 typu dzikiego, które następnie znakowano IdU i CldU przez 20 minut każde. Większość włókien jest wyraźnie oddzielona od siebie, co pozwala na ich łatwą analizę. Biały pasek oznacza 10 μm. 
<img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Schemat widełek replikacyjnych DNA z etapami procesu: elongacja, początek replikacji, terminacja, widełki zatrzymane." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Technika podwójnego znakowania włókien pozwala na rozróżnienie różnych struktur replikacyjnych: 1 – aktywnie replikujące się widelce, 2 – nowe miejsca replikacji DNA (aktywacja nowych początków), 3 – terminacje widelców (dwa zbiegające się widelce), 4 – przeplatane włókna (miejsca blisko położonych początków) oraz 5 – zatrzymane widelce (sygnał wyłącznie czerwony).

<ol><li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li>
<li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li>
<li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner%27s+syndrome+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li>
<li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li>
<li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li>
<li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint%3A+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Cycle%22%5BJournal%5D)">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li>
<li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Opisujemy metodę pozwalającą na ilościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S na poziomie pojedynczej cząsteczki. W ciągu ostatnich dziesięciu lat opracowano różne wersje techniki fluorografii włókien DNA w celu wizualizacji ruchu pojedynczych widełek replikacyjnych w żywych komórkach. Krytycznym parametrem we wszystkich tych technikach jest procedura stosowana w celu uzyskania jak najlepszego rozciągnięcia DNA na powierzchniach szklanych, co zapewnia dobrze odseparowane włókna DNA. Kluczowym krokiem do osiągnięcia tego celu jest czas inkubacji zawiesiny komórkowej na szkiełku mikroskopowym, a także czas lizy. Parametry te zależą od temperatury i przepływu powietrza w konkretnym laboratorium i powinny zostać określone empirycznie. Część praktyczna eksperymentu z włóknami DNA jest zazwyczaj realizowana w ciągu jednego dnia. Jednak późniejsza akwizycja obrazów i ich analiza są bardziej czasochłonne i wymagają praktyki.
Protokół znakowania można dostosować do rozwiązania różnych problemów naukowych: zastosowanie czynnika zakłócającego replikację podczas drugiego etapu znakowania (pulsacyjnego) pozwala monitorować elongację lub zatrzymanie widełek w odpowiedzi na stres replikacyjny. W tym scenariuszu pierwsza etykieta nie musi być wypłukiwana, ponieważ drugi nukleotyd jest dodawany w nadmiarze. Alternatywnie, leki hamujące replikację można stosować w połączeniu lub bezpośrednio po dodaniu pierwszej etykiety. Wymaga to usunięcia pierwszej etykiety oraz leku przed zastosowaniem drugiego analogu nukleotydu. Procedura ta pozwala określić znaczenie różnych czynników naprawy DNA dla stabilności i regeneracji widełek replikacyjnych w warunkach stresu replikacyjnego (tzn. zatrzymania i/lub zapadnięcia się widełek). Warto zaznaczyć, że bardziej szczegółową analizę detali programu replikacji DNA można przeprowadzić przy użyciu alternatywnych podejść łączących rozciąganie DNA (DNA combing) i fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH). Jest to jednak technicznie trudniejsze i wymaga kosztownego sprzętu.
Zdolność do jakościowej i ilościowej analizy szczegółów replikacji DNA stanowi niezbędne narzędzie do badania defektów samej replikacji DNA, a także szlaków hamujących niestabilność genomową związaną z widełkami replikacyjnymi. Bez wątpienia test ten pomoże w dalszym wyjaśnianiu mechanizmów naprawy DNA zapośredniczonej przez replikację, które pozwalają normalnym komórkom reagować i adaptować się do zmian środowiskowych, a także tego, w jaki sposób komórki nowotworowe wykorzystują te mechanizmy, aby oprzeć się toksyczności leków celujących w widełki replikacyjne.

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica bydlęca gold (FBS)</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kurza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>PAA Laboratories</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>5-jodo-2&amp;rsquo;-deoksyurydyna (IdU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td></td></tr><tr><td>5-chloro-2&amp;rsquo;-deoksyurydyna (CldU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td></td></tr><tr><td>Lamelki do mikroskopu SuperFrost</td><td>VWR international</td><td>631-0910</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki nr 1</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3234</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield</td><td>H-1000 Vector lab</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-BrdU (mysie)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-BrdU (szczurze)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td></td></tr><tr><td>owcze anty-mysie Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td></td></tr><tr><td>kozie anty-szczurze przeciwciało Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A110060</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja replikacji dna w kręgowym systemie modelowym dt40 z wykorzystaniem techniki włókien dna

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Utrzymanie stabilności widełek replikacyjnych ma kluczowe znaczenie dla komórek dzielących się w celu zachowania żywotności i zapobiegania chorobom. Procesy te nie tylko zapewniają wierną duplikację genomu w obliczu endogennych i egzogennych uszkodzeń DNA, ale także zapobiegają niestabilności genomicznej, która jest uznanym czynnikiem sprawczym rozwoju nowotworów.
W niniejszej pracy opisujemy prostą i kosztowo efektywną metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji replikacji DNA w ptasiej linii komórkowej limfocytów B DT40. Linia ta stanowi potężne narzędzie do badania funkcji białek in vivo za pomocą genetyki odwrotnej w komórkach kręgowców1. Fluorografia włókien DNA w komórkach DT40 pozbawionych konkretnego genu pozwala na wyjaśnienie funkcji produktu tego genu w replikacji DNA i stabilności genomu. Tradycyjne metody analizy dynamiki widełek replikacyjnych w komórkach kręgowców opierają się na pomiarze ogólnego tempa syntezy DNA w populacji komórek poddanych znakowaniu impulsowemu. Jest to podejście ilościowe, które nie pozwala na jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA. W przeciwieństwie do tego, tempo przemieszczania się aktywnych widełek można śledzić bezpośrednio, stosując technikę włókien DNA2-4. W tym podejściu nowo syntetyzowane DNA jest znakowane in vivo poprzez wbudowanie nukleotydów halogenowanych (Rys 1A). Następnie pojedyncze włókna są rozciągane na szkiełku przedmiotowym, a znakowane odcinki replikacji DNA są barwione swoistymi przeciwciałami i wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rys 1B). Inicjację replikacji, jak i kierunkowość widełek, określa się poprzez sekwencyjne zastosowanie dwóch różnie zmodyfikowanych analogów. Ponadto podejście z podwójnym znakowaniem umożliwia ilościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S, tj. struktur replikacyjnych, takich jak widełki aktywne i zahamowane, gęstość miejsc inicjacji replikacji, a także terminacje widełek. Ostatecznie, procedurę eksperymentalną można przeprowadzić w ciągu jednego dnia, a wymaga ona jedynie ogólnego wyposażenia laboratoryjnego oraz mikroskopu fluorescencyjnego.

DT40, modelowy system genetyczny kręgowców, stanowi potężne narzędzie do analizy funkcji białek. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S w komórkach DT40 na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Wizualizacja replikacji DNA w kręgowym systemie modelowym DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

Utrzymanie stabilności widełek replikacyjnych jest niezwykle istotne dla komórek dzielących się w celu zachowania żywotności i zapobiegania chorobom. Procesy w to zaangażowane nie...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Należy rozpocząć od wbudowania halogenowanych analogów nukleotydów do nowo syntetyzowanego DNA. W przypadku żywych komórek, komórki z oznakowanym DNA nanosi się na preparat mikroskopowy.Następnie nanosi się komórki i rozciąga DNA na szkiełku przedmiotowym. Kolejne barwienie immunologiczne włókien DNA oraz analiza obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej pozwalają wyjaśnić globalną dynamikę widełek replikacyjnych, co umożliwia ilościową analizę parametrów wpływających na ogólny program replikacji. W ciągu ostatnich lat opracowano różne wersje technik znakowania włókien DNA w celu wizualizacji ruchu poszczególnych widełek replikacyjnych w żywych komórkach.Ten eksperyment in vivo na komórkach DT 40, który za chwilę zostanie zaprezentowany, można przeprowadzić w ciągu jednego dnia; wymaga on jedynie podstawowego wyposażenia laboratoryjnego oraz mikroskopu fluorescencyjnego. Procedurę zademonstruje dr Rebecca Schwab, postdok w moim laboratorium. Aby znakować komórki DT 40 in vivo, należy rozpocząć od kultury w fazie wzrostu wykładniczego. Dodać znacznik IDU do stężenia końcowego 25 $\mu$M i wymieszać zawiesinę komórkową.Komórki inkubujemy przez 20 minut w temperaturze 38°C i 5% carbon dioxide. Następnie dodajemy znacznik CLDU do stężenia końcowego 250 micromolar. Mieszamy i inkubujemy zawiesinę komórkową.Następnie przemyj komórki DT 40 lodowatym roztworem PBS. Resuspender osady komórkowe w zimnym PBS i przechowywać oznakowane komórki w lodzie. Nanieś 2 µL zawiesiny komórkowej na jeden koniec szkiełka przedmiotowego i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, aż objętość kropli zostanie znacznie zredukowana, ale nie całkowicie wyschnie.Teraz dodaj 7 µL roztworu do lizy włókien na powierzchnię zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj roztwory, mieszając końcówką pipety, a następnie inkubuj przez dwie minuty. Następnie przechyl preparaty pod kątem 15 stopni, aby umożliwić rozprzestrzenienie się włókien wzdłuż szkiełka. Gdy roztwór włókien dotrze do dolnej krawędzi szkiełka, połóż go poziomo i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.W tym momencie wzdłuż szkiełka powinna być widoczna cienka, nieprzezroczysta linia. Zaznacz ołówkiem początek rozciągniętych włókien. Następnie zanurz szkiełka w mieszaninie metanolu i kwasu octowego w stosunku trzech do jednego na 10 minut.Przemyj preparaty wodą destylowaną, a następnie zanurz je w 2,5 M kwasie solnym na 80 minut. Przemyj preparaty trzykrotnie w PBS przez pięć minut. Nadmiar PBS usuń za pomocą ręcznika papierowego.Następnie ułóż preparaty poziomo. Teraz nanieś pipetą 5% BSA w PBS na każdy preparat, nałóż szkiełko podstawowe i inkubuj przez 20 minut. Delikatnie przesuń szkiełko podstawowe w dół szkiełka przedmiotowego.Nadmiar BSA należy usunąć za pomocą ręcznika papierowego. Następnie do każdego preparatu należy nanieść pipetą 50 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego anty-BRDU.Przykryj preparat szkiełkiem nakrywką i inkubuj w wilgotnej komorze przez dwie godziny. Po zdjęciu szkiełek nakrywczych przemyj slajdy trzykrotnie w PBS przez pięć minut. Nanieś 50 µL roztworu przeciwciała wtórnego, nałóż szkiełka nakrywcze, a następnie zabezpiecz slajdy przed światłem.Następnie inkubować przez jedną godzinę. Zdjąć szkiełka nakrywki i przemyć preparaty trzykrotnie w PBS przez pięć minut. Na koniec nanieść na każde szkiełko kroplę medium montującego Vector Shield.Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkę i usuń nadmiar płynu wokół niej. Za pomocą ręcznika papierowego zabezpiecz krawędzie szkiełek nakrywek przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Przechowuj preparaty w temperaturze -20 °C.Nanieś kroplę olejku immersyjnego na preparat w pobliżu zaznaczenia ołówkiem i rozpocznij lokalizację włókien. Przesuń się poza główny pęczek, aby znaleźć obszary, w których włókna są wyraźnie od siebie oddzielone. W typowym eksperymencie wybieraj zdjęcia przy użyciu tylko jednego kanału kolorystycznego, aby uniknąć błędu systematycznego.Następnie należy wykonać około 10 zdjęć każdej próbki. Przesuwaj się wzdłuż szkiełka, aby wykonać różne zdjęcia, ponieważ jeden obszar preparatu może nie dostarczyć reprezentatywnych długości włókien lub struktur replikacyjnych. Zaimportuj zdjęcia do programu do analizy obrazu.Zmierz długości 100 pęczków włókien lub policz od 150 do 200 różnych struktur replikacyjnych. Technika podwójnego znakowania włókien pozwala na rozróżnienie poszczególnych struktur replikacyjnych. Nowo zreplikowane DNA można wizualizować jako linie analogów nukleotydowych znakowanych przeciwciałami.W tym przypadku trwająca elongacja widelca replikacyjnego jest reprezentowana jako sąsiadujące sygnały czerwone i zielone. Nowe zdarzenia inicjacji można podzielić na miejsca inicjacji, które uległy aktywacji podczas inkubacji komórek z pierwszym znacznikiem, oraz miejsca inicjacji, które aktywowały się podczas inkubacji z drugim znacznikiem. Te pierwsze składają się z sąsiadujących sygnałów zielonych oraz czerwono-zielonych, a te drugie wyłącznie z linii zielonej.Zdarzenia terminacji objawiają się jako sąsiadujące ze sobą kolory czerwony i zielony. Sygnały czerwone występują przeplatająco. Obszary początkowe składają się z następujących po sobie sekwencji początkowych i sygnałów terminacji.W zależności od projektu eksperymentalnego, zablokowane lub zapadnięte widelce mogą być definiowane albo jako sygnał wyłącznie czerwony, albo jako czerwona linia, po której następuje krótki zielony odcinek. W tym eksperymencie komórki DT 40 typu dzikiego mają średnią prędkość widelca wynoszącą 0,4 microns per minute. Odnotowano 63%ongoing forks, 10%origins, 16%stalled forks, 8%terminations oraz 3%interspersed fibers.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wizualizować i analizować dynamikę widełek replikacyjnych w komórkach DT 40. Dostarczy Ci to niezbędnego narzędzia do badania defektów replikacji DNA.

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja replikacji DNA w modelowym układzie kręgowców DT40 za pomocą techniki włókien DNA

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Przedstawiamy procedurę, w której dwuwymiarowa analiza w żelu agarozowym może zostać wykorzystana do identyfikacji struktury produktów pośrednich replikacji powstających po napromieniowaniu UV.

Wizualizacja indukowanych promieniami UV produktów pośrednich replikacji w E. coli przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Opisujemy tutaj system wykorzystujący specyficzny dla miejsca, odwracalny blok białkowy in vivo do zatrzymywania i zwijania widełek replikacyjnych u Escherichia coli. Ustanowienie bloku replikacji ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a do wizualizacji produktów pośrednich replikacji stosuje się neutralno-neutralną 2-wymiarową elektroforezę w żelu agarozowym.

Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Metodologia pomaga w analizie zmienności dynamiki replikacji DNA w obecności nanocząstek. Można przyjąć różne metodologie w zależności od poziomu cytotoksyczności materiału będącego przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo zamieszczono opis analizy obrazu, który ma pomóc w analizie włókien DNA.

Demonstracja testu włókien DNA do badania uszkodzeń DNA i dynamiki naprawy indukowanych przez nanocząstki

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Tutaj przedstawiamy procedurę analizy przebiegu replikacji poprzez patogenne, podatne na struktury powtórzenia za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej.

Analiza elektroforetyczna replikacji przez podatne na strukturę powtórzenia DNA w ludzkim episomie opartym na SV40

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Poznaj metodę wizualizacji replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek w komórkach DT40. Technika włókien DNA umożliwia analizę dynamiki rozwidlenia replikacyjnego i parametrów syntezy DNA.

Wizualizacja replikacji DNA w kręgowym systemie modelowym DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

Przeglądaj więcej filmów