Wizualizacja replikacji DNA w Układzie Modelowym Kręgowców DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja replikacji DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Zacznij od włączenia fluorowcowanych analogów nukleotydów do nowo zsyntetyzowanego DNA. W żywych komórkach należy umieścić komórki z oznakowanym DNA pod mikroskopem.

Następnie szkiełko układa komórki i rozciąga DNA na szkiełku mikroskopowym. Późniejsze barwienie immunologiczne włókien DNA i analiza obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej może rzucić światło na globalną dynamikę widełek replikacyjnych, aby umożliwić analizę ilościową parametrów, które wpływają na ogólny program replikacji. W ciągu ostatnich lat opracowano różne wersje technik fluorowych włókien DNA w celu wizualizacji ruchu poszczególnych widełek replikacyjnych w żywych komórkach.

Ten eksperyment in vivo na komórkach DT 40, którego właśnie jesteś świadkiem, może zostać przeprowadzony w ciągu jednego dnia i wymaga jedynie ogólnego sprzętu laboratoryjnego i mikroskopu fluorescencyjnego demonstrującego procedurę, którą będzie dr Rebecca Schwab, postdoc w moim laboratorium. Aby oznaczyć komórki DT 40 in vivo, należy zacząć od hodowli rosnącej wykładniczo. Dodaj etykietę dożylną do końcowego stężenia 25 mikromolów i wymieszaj zawiesinę komórkową.

Dobrze inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze 38 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie dodaj etykietę CLDU do końcowego stężenia 250 mikromolów. Wymieszać i inkubować zawiesinę komórkową.

Teraz umyj ogniwa DT 40 lodowatym PBS reus. Zawieś granulki komórek w zimnym PBS i trzymaj oznakowane komórki na lodzie. Umieść dwa mikrolitry zawiesiny komórek na jednym końcu szkiełka, wysusz powietrzem, aż objętość kropli zostanie znacznie zmniejszona, ale nie całkowicie sucha.

Teraz dodaj siedem mikrolitrów roztworu do lizy włókien na zawiesinę komórek i delikatnie wymieszaj roztwory, mieszając końcówką pipety, inkubuj przez dwie minuty. Następnie przechyl szkiełka do 15 stopni, aby umożliwić rozprowadzenie włókien wzdłuż zjeżdżalni. Gdy roztwór błonnika dotrze do dna szkiełka, umieść go poziomo do wyschnięcia na powietrzu.

W tym momencie wzdłuż szkiełka powinna być widoczna cienka, nieprzezroczysta linia. Zaznacz początek rozciągniętych włókien ołówkiem. Najpierw zanurz szkiełka w trzech do jednego metanolu z kwasem octowym na 10 minut.

Umyj szkiełka w wodzie destylowanej, a następnie zanurz w 2,5 molowym kwasie solnym na 80 minut. Umyj szkiełka trzy razy w PBS przez pięć minut dab. Zbierz nadmiar PBS na ręcznik papierowy.

Następnie ustaw slajdy poziomo. Teraz odpipetować pipetę 5% BSA w PBS na wierzchu każdego szkiełka i umieścić szkiełko nakrywkowe, inkubować przez 20 minut. Delikatnie przesuń szkiełko nakrywkowe w dół szklanego szkiełka.

Usuń nadmiar BSA ręcznikiem papierowym. Następnie odpipetować 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego anty BRDU. Na każdym slajdzie.

Przykryj grę szkiełkiem nakrywkowym i inkubuj w wilgotnej komorze przez dwie godziny. Po zdjęciu szkiełek nakrywkowych umyj je trzykrotnie w PBS przez pięć minut. Nałożyć 50 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na szkiełka nakrywkowe, a także chronić szkiełka przed światłem.

Następnie inkubuj przez godzinę. Usuń szkiełka nakrywkowe i umyj je trzy razy w PBS przez pięć minut. Na koniec dodaj kroplę nośnika montażowego Vector Shield na każdy slajd.

Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe i usuń nadmiar płynu wokół niego. Ręcznikiem papierowym uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i wysusz na powietrzu. Przechowuj szkiełka w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Umieść kroplę olejku immersyjnego na szkiełku w pobliżu znaku ołówka i zacznij lokalizować włókna. Odsuń się od głównej wiązki, aby znaleźć obszary, w których włókna są wyraźnie oddzielone od siebie. W typowym eksperymencie należy wybierać zdjęcia przy użyciu tylko jednego kanału kolorów, aby uniknąć stronniczości.

Następnie zrób około 10 zdjęć każdej próbki. Poruszaj się wzdłuż szkiełka, aby zrobić różne zdjęcia, ponieważ jeden obszar szkiełka może nie zapewniać reprezentatywnych długości włókien lub struktur replikacji. Importowanie obrazów do programu do analizy obrazów.

Zmierz długość 100 odcinków włókien i / lub policz od 150 do 200 różnych struktur replikacyjnych. Technika podwójnego znakowania włókien pozwala na rozróżnienie różnych struktur replikacji. Nowo zreplikowane DNA można wizualizować jako linie analogów nukleotydów znakowanych przeciwciałami.

Tutaj trwające wydłużenie widelca jest reprezentowane jako sąsiednie czerwone i zielone sygnały. Nowe zdarzenia inicjacji można podzielić na początki, które zostały uruchomione, gdy komórki były inkubowane z pierwszym znacznikiem, oraz początki, które zostały uruchomione podczas inkubacji z drugim znacznikiem. Pierwsza z nich składa się z sąsiadujących ze sobą sygnałów zielonych, czerwonych zielonych, a druga z zielonej linii. Tylko.

Zdarzenia zakończenia są wyświetlane jako sąsiadujące z kolorem czerwonym i zielonym. Czerwone sygnały przeplatały się. Początki składają się z kolejnych początków i sygnałów zakończenia.

W zależności od projektu eksperymentalnego, zablokowane lub zapadnięte widły mogą być zdefiniowane jako sygnał tylko czerwony lub czerwona linia, po której następuje krótki zielony trakt. W tym eksperymencie ogniwa DT 40 typu dzikiego mają średnią prędkość wideł 0,4 mikrona na minutę. Z 63% bieżącymi widelcami, 10% początkami, 16% zablokowanymi widełkami, 8% zakończeniami i 3% przeplatanymi włóknami.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować i analizować dynamikę widełek replikacji w komórkach DT 40. Zapewni Ci to niezbędne narzędzie do badania defektów w replikacji DNA.