Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Badania przesiewowe supresorów identyfikują interakcje genetyczne, które rzuciłyby światło na funkcje genu będącego przedmiotem zainteresowania, a także na szlaki i procesy biologiczne, w które mogą być zaangażowane in vivo. Technika ta może zidentyfikować pokrewieństwo genetyczne między dwoma produktami genowymi, które mogło nie zostać wykazane przy użyciu innych metod. Wyniki takich badań przesiewowych u drożdży można rozszerzyć na organizmy o wysokiej wartości eukariotycznej, ponieważ większość podstawowych szlaków i procesów biologicznych jest zachowana w całej ewolucji.

Powodzenie programu zależy od dostępności, wysokiej jakości i wysokiej skuteczności jego przekształcania w komórki drożdży. Tak więc, protokół transformacji z plazmidem przed wyhodowaniem szczepu delecji Schizosaccharomyces pombe ell1 w temperaturze 32 stopni Celsjusza na pożywce Y. Weź pętlę pełną zmutowanego szczepu ell1 z płytki, zaszczepij pięć mililitrów uzupełnionej pożywki YE, a następnie inkubuj fiolkę, wstrząsając w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc.

Po inkubacji rozcieńczyć nocną kulturę wzrostu w 100 mililitrach świeżej pożywki YE zawierającej pożądane suplementy, aby osiągnąć gęstość optyczną 0,3 przy 600 nanometrach. Inkubować podłoże w temperaturze 32 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością od 200 do 550 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie fazę środkowego logarytmu. Po podzieleniu 100 mililitrów kultury na dwie 50-mililitrowe probówki wirówkowe, osadzaj komórki w temperaturze 4 000 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po wyrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze sterylnej wody. Odwirować i ponownie wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad ogniwa w jednym mililitrze octanu litu TE. Osadzaj ogniwo przez odwirowanie i ponownie zawieś każdą osadę komórkową w 250 mikrolitrach octanu litu TE. Następnie przenieś 125 mikrolitrów właściwych komórek do czterech różnych sterylnych probówek mikrowirówek w celu przeprowadzenia kolejnych etapów transformacji. Gotować DNA nosiciela z jąder łososia lub nasienia śledzia przez jedną minutę i natychmiast umieścić probówkę na lodzie.

Do każdej przemiany dodać 10 mikrolitrów jednoniciowego nośnego DNA do probówki mikrowirówki zawierającej 125 mikrolitrów właściwych komórek i delikatnie wymieszać przez pipetowanie. Następnie dodać 50 mikrogramów biblioteki cDNA Schizosaccharomyces pombe do probówki zawierającej kompetentne komórki i mieszaninę nośnego DNA. Po inkubacji probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, dodać 260 mikrolitrów roztworu glikolu polietylenowego i octanu litu i wymieszać pipetując.

Inkubować probówkę zawierającą mieszaninę transformacyjną w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez dwie godziny bez wstrząsania. Dodaj 43 mikrolitry wstępnie podgrzanego sulfotlenku dimetylu do probówki i delikatnie wymieszaj. Teraz wystaw rurkę na szok termiczny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Osadzać komórki i wyrzucać supernatant, jak pokazano wcześniej, a następnie odpipetować resztki roztworu TE octanu litu z glikolu polietylenowego. Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach sterylnej wody i umieścić je na jednej płytce EMM2 zawierającej wymagane suplementy i 0,2 mikrograma na mililitr 4-NQO. Następnie pozwól koloniom pojawić się na płytkach, inkubując płytki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu dni.

W celu dalszych badań przesiewowych uzyskane kolonie należy rozprowadzić na tej samej pożywce w obecności 0,2 mikrograma na mililitr 4-NQO. W jednym eksperymencie transformacji biblioteki użyj 500 mikrolitrów kompetentnych komórek do transformacji i płytki 1 na 10 mieszaniny transformacyjnej na płytce EMM2 z wymaganymi suplementami pozbawionymi 4-NQO, aby obliczyć całkowitą liczbę klonów bibliotecznych uzyskanych po transformacji i przesiewie klonów supresorowych. Dodaj od 100 do 200 mikrolitrów sterylnej wody do każdej studzienki sterylnej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

Za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki mikropipety o pojemności od 20 do 200 mikrolitrów wybierz niewielką ilość inokulum z każdej kolonii uzyskanej po transformacji biblioteki cDNA na płytce zawierającej 4-NQO. Dodaj inokulum z każdej z różnych kolonii do każdej studzienki płytki zawierającej sterylną wodę i dokładnie wymieszaj. Umieścić trzy mikrolitry zawiesiny komórek z każdej studzienki na płytkach agarowych EMM2 i dodać odpowiednie stężenia 4-NQO do płytek.

Po wyhodowaniu komórek w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni, zidentyfikuj kolonie, które wykazują wzrost w różnych stężeniach 4-NQO jako przypuszczalne supresory. Aby dalej walidować supresory, należy wyhodować wybrane supresory i odpowiednie szczepy kontrolne w pożywce EMM2 zawierającej 225 mikrogramów na mililitr adeniny i uracylu w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc z wytrząsaniem. Po zakończeniu inkubacji rozcieńczyć komórki do gęstości optycznej 0,3 w świeżej pożywce EMM2 i hodować je, wstrząsając w temperaturze 32 stopni Celsjusza aż do środkowej fazy logarytmicznej.

Wykryj odpowiednie seryjne rozcieńczenia kultur na płytkach EMM2 z wymaganymi suplementami zawierającymi 0,4 mikromolowego 4-NQO lub 0,01% MMS. W celu kontroli należy umieścić szczepy na płytce EMM2 z wymaganymi suplementami, ale bez żadnego czynnika uszkadzającego DNA. Inkubuj płytki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu dni, aby monitorować wzrost.

Wykryj zmutowane szczepy przekształcone za pomocą genu o pełnej długości lub pustego wektora jako kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio, wraz z transformantami bibliotecznymi. Zaszczepić pojedynczą kolonię drożdży w pożywce EMM2 zawierającej 225 mikrogramów na mililitr adeniny i uracylu i hodować komórki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc, wytrząsając przy 200 do 250 obr./min. Pod koniec inkubacji zebrać 10 mililitrów kultury o gęstości optycznej 0,5, wirując w temperaturze 4 000 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 0,2 mililitra buforu do lizy. Dodać 0,2 mililitra fenolu, chloroformu, alkoholu izoamylowego i 0,3 grama szklanych kulek przemytych kwasem do probówki mikrowirówkowej. Mieszać, wirując probówkę przez dwie minuty, a następnie inkubować na lodzie przez jedną minutę.

Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 razy G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną warstwę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki i dodaj 200 mikrolitrów fenolowo-chloroformowego alkoholu izoamylowego. Po ponownym odwirowaniu w temperaturze 10 000 razy G przez 10 minut, przenieść górną warstwę wodną do świeżej probówki.

Następnie dodaj dwie objętości 100% etanolu i 1 na 10 objętość octanu sodu do probówki i inkubuj w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza przez godzinę. Wytrącić DNA przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Umyj osad DNA 70% etanolem i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.

Ponownie zawiesić DNA w 20 mikrolitrach sterylnej wody i użyć trzech do pięciu mikrolitrów plazmidowego DNA do przekształcenia kompetentnych komórek Escherichia coli. Korzystając ze standardowego protokołu, przekształć izolowane plazmidy drożdży w szczep Escherichia coli TOP10 i rozprowadź komórki na płytkach LB z wymaganymi antybiotykami. Po wyizolowaniu plazmidu z transformantów Escherichia coli przy użyciu standardowego protokołu lizy alkalicznej, postępuj zgodnie z odpowiednimi kombinacjami enzymów restrykcyjnych, aby sprawdzić uwolnienie fragmentu DNA insercji przez trawienie restrykcyjne.

Następnie przetransformuj plazmidy wykazujące uwalnianie insercji po trawieniu restrykcyjnym w szczepie delecji ell1, aby sprawdzić ich zdolność do ratowania genotoksycznego, wrażliwego na stres fenotypu szczepu delecji ell1. Szczep Schizosaccharomyces pombe z delecją ell1 wykazywał wrażliwość na 4-NQO w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Na płytce uzyskuje się dużą liczbę kolonii pozbawionych 4-NQO.

Jednak na płytce 4-NQO uzyskano mniej transformantów, ponieważ działają one jako karzące tłumiki czułości 4-NQO mutanta zerowego ell1. Spośród 620 transformantów, 74 wykazały wzrost na 0,4-mikromolowym 4-NQO. Zaobserwowano, że tylko 16 z 74 wykazało wzrost w obecności 0,8-mikromolowego 4-NQO.

Szczep delecji ell1 przekształcony z pustym wektorem i wszystkimi 16 transformantami wykazywał wzrost na płytce bez 4-NQO. Mutant delecji ell1 zawierający tylko pusty wektor nie wykazywał wzrostu przy 0,8-mikromolowym 4-NQO, a sześć transformantów wykazywało wzrost przy 0,8-mikromolowym 4-NQO, co sugeruje, że obecne w nich klony biblioteczne mogą tłumić fenotyp stresu genotoksycznego mutanta zerowego ell1. Trawienie restrykcyjne plazmidu supresorowego 84 i 104 uwolniło wkładkę odpowiednio jednej kilozasady i 800 par zasad.

Ponowne wprowadzenie klonów plazmidu supresorowego do mutanta zerowego ell1 spowodowało zahamowanie wrażliwości wzrostu związanej z 4-NQO. Jednak w obecności MMS plazmidy supresorowe zawierające mutanta delecji ell1 wykazywały większy wzrost niż te z pustym wektorem. Te genetyczne badania przesiewowe mogą nakreślić potencjalne mechanizmy oporności i zidentyfikować cele białkowe nowych związków przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybiczych, przeciwpasożytniczych lub przeciwnowotworowych.

Mogą również zidentyfikować mechanizm działania leków farmaceutycznych.