Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1

Badania przesiewowe supresorów identyfikują interakcje genetyczne, które rzuciłyby światło na funkcje genu będącego przedmiotem zainteresowania, a także na szlaki i procesy biologiczne, w które mogą być zaangażowane in vivo. Technika ta może zidentyfikować pokrewieństwo genetyczne między dwoma produktami genowymi, które mogło nie zostać wykazane przy użyciu innych metod. Wyniki takich badań przesiewowych u drożdży można rozszerzyć na organizmy o wysokiej wartości eukariotycznej, ponieważ większość podstawowych szlaków i procesów biologicznych jest zachowana w całej ewolucji.

Powodzenie programu zależy od dostępności, wysokiej jakości i wysokiej skuteczności jego przekształcania w komórki drożdży. Tak więc, protokół transformacji z plazmidem przed wyhodowaniem szczepu delecji Schizosaccharomyces pombe ell1 w temperaturze 32 stopni Celsjusza na pożywce Y. Weź pętlę pełną zmutowanego szczepu ell1 z płytki, zaszczepij pięć mililitrów uzupełnionej pożywki YE, a następnie inkubuj fiolkę, wstrząsając w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc.

Po inkubacji rozcieńczyć nocną kulturę wzrostu w 100 mililitrach świeżej pożywki YE zawierającej pożądane suplementy, aby osiągnąć gęstość optyczną 0,3 przy 600 nanometrach. Inkubować podłoże w temperaturze 32 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością od 200 do 550 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie fazę środkowego logarytmu. Po podzieleniu 100 mililitrów kultury na dwie 50-mililitrowe probówki wirówkowe, osadzaj komórki w temperaturze 4 000 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po wyrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze sterylnej wody. Odwirować i ponownie wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad ogniwa w jednym mililitrze octanu litu TE. Osadzaj ogniwo przez odwirowanie i ponownie zawieś każdą osadę komórkową w 250 mikrolitrach octanu litu TE. Następnie przenieś 125 mikrolitrów właściwych komórek do czterech różnych sterylnych probówek mikrowirówek w celu przeprowadzenia kolejnych etapów transformacji. Gotować DNA nosiciela z jąder łososia lub nasienia śledzia przez jedną minutę i natychmiast umieścić probówkę na lodzie.

Do każdej przemiany dodać 10 mikrolitrów jednoniciowego nośnego DNA do probówki mikrowirówki zawierającej 125 mikrolitrów właściwych komórek i delikatnie wymieszać przez pipetowanie. Następnie dodać 50 mikrogramów biblioteki cDNA Schizosaccharomyces pombe do probówki zawierającej kompetentne komórki i mieszaninę nośnego DNA. Po inkubacji probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, dodać 260 mikrolitrów roztworu glikolu polietylenowego i octanu litu i wymieszać pipetując.

Inkubować probówkę zawierającą mieszaninę transformacyjną w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez dwie godziny bez wstrząsania. Dodaj 43 mikrolitry wstępnie podgrzanego sulfotlenku dimetylu do probówki i delikatnie wymieszaj. Teraz wystaw rurkę na szok termiczny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Osadzać komórki i wyrzucać supernatant, jak pokazano wcześniej, a następnie odpipetować resztki roztworu TE octanu litu z glikolu polietylenowego. Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach sterylnej wody i umieścić je na jednej płytce EMM2 zawierającej wymagane suplementy i 0,2 mikrograma na mililitr 4-NQO. Następnie pozwól koloniom pojawić się na płytkach, inkubując płytki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu dni.

W celu dalszych badań przesiewowych uzyskane kolonie należy rozprowadzić na tej samej pożywce w obecności 0,2 mikrograma na mililitr 4-NQO. W jednym eksperymencie transformacji biblioteki użyj 500 mikrolitrów kompetentnych komórek do transformacji i płytki 1 na 10 mieszaniny transformacyjnej na płytce EMM2 z wymaganymi suplementami pozbawionymi 4-NQO, aby obliczyć całkowitą liczbę klonów bibliotecznych uzyskanych po transformacji i przesiewie klonów supresorowych. Dodaj od 100 do 200 mikrolitrów sterylnej wody do każdej studzienki sterylnej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

Za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki mikropipety o pojemności od 20 do 200 mikrolitrów wybierz niewielką ilość inokulum z każdej kolonii uzyskanej po transformacji biblioteki cDNA na płytce zawierającej 4-NQO. Dodaj inokulum z każdej z różnych kolonii do każdej studzienki płytki zawierającej sterylną wodę i dokładnie wymieszaj. Umieścić trzy mikrolitry zawiesiny komórek z każdej studzienki na płytkach agarowych EMM2 i dodać odpowiednie stężenia 4-NQO do płytek.

Po wyhodowaniu komórek w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni, zidentyfikuj kolonie, które wykazują wzrost w różnych stężeniach 4-NQO jako przypuszczalne supresory. Aby dalej walidować supresory, należy wyhodować wybrane supresory i odpowiednie szczepy kontrolne w pożywce EMM2 zawierającej 225 mikrogramów na mililitr adeniny i uracylu w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc z wytrząsaniem. Po zakończeniu inkubacji rozcieńczyć komórki do gęstości optycznej 0,3 w świeżej pożywce EMM2 i hodować je, wstrząsając w temperaturze 32 stopni Celsjusza aż do środkowej fazy logarytmicznej.

Wykryj odpowiednie seryjne rozcieńczenia kultur na płytkach EMM2 z wymaganymi suplementami zawierającymi 0,4 mikromolowego 4-NQO lub 0,01% MMS. W celu kontroli należy umieścić szczepy na płytce EMM2 z wymaganymi suplementami, ale bez żadnego czynnika uszkadzającego DNA. Inkubuj płytki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu dni, aby monitorować wzrost.

Wykryj zmutowane szczepy przekształcone za pomocą genu o pełnej długości lub pustego wektora jako kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio, wraz z transformantami bibliotecznymi. Zaszczepić pojedynczą kolonię drożdży w pożywce EMM2 zawierającej 225 mikrogramów na mililitr adeniny i uracylu i hodować komórki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc, wytrząsając przy 200 do 250 obr./min. Pod koniec inkubacji zebrać 10 mililitrów kultury o gęstości optycznej 0,5, wirując w temperaturze 4 000 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 0,2 mililitra buforu do lizy. Dodać 0,2 mililitra fenolu, chloroformu, alkoholu izoamylowego i 0,3 grama szklanych kulek przemytych kwasem do probówki mikrowirówkowej. Mieszać, wirując probówkę przez dwie minuty, a następnie inkubować na lodzie przez jedną minutę.

Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 razy G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną warstwę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki i dodaj 200 mikrolitrów fenolowo-chloroformowego alkoholu izoamylowego. Po ponownym odwirowaniu w temperaturze 10 000 razy G przez 10 minut, przenieść górną warstwę wodną do świeżej probówki.

Następnie dodaj dwie objętości 100% etanolu i 1 na 10 objętość octanu sodu do probówki i inkubuj w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza przez godzinę. Wytrącić DNA przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Umyj osad DNA 70% etanolem i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.

Ponownie zawiesić DNA w 20 mikrolitrach sterylnej wody i użyć trzech do pięciu mikrolitrów plazmidowego DNA do przekształcenia kompetentnych komórek Escherichia coli. Korzystając ze standardowego protokołu, przekształć izolowane plazmidy drożdży w szczep Escherichia coli TOP10 i rozprowadź komórki na płytkach LB z wymaganymi antybiotykami. Po wyizolowaniu plazmidu z transformantów Escherichia coli przy użyciu standardowego protokołu lizy alkalicznej, postępuj zgodnie z odpowiednimi kombinacjami enzymów restrykcyjnych, aby sprawdzić uwolnienie fragmentu DNA insercji przez trawienie restrykcyjne.

Następnie przetransformuj plazmidy wykazujące uwalnianie insercji po trawieniu restrykcyjnym w szczepie delecji ell1, aby sprawdzić ich zdolność do ratowania genotoksycznego, wrażliwego na stres fenotypu szczepu delecji ell1. Szczep Schizosaccharomyces pombe z delecją ell1 wykazywał wrażliwość na 4-NQO w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Na płytce uzyskuje się dużą liczbę kolonii pozbawionych 4-NQO.

Jednak na płytce 4-NQO uzyskano mniej transformantów, ponieważ działają one jako karzące tłumiki czułości 4-NQO mutanta zerowego ell1. Spośród 620 transformantów, 74 wykazały wzrost na 0,4-mikromolowym 4-NQO. Zaobserwowano, że tylko 16 z 74 wykazało wzrost w obecności 0,8-mikromolowego 4-NQO.

Szczep delecji ell1 przekształcony z pustym wektorem i wszystkimi 16 transformantami wykazywał wzrost na płytce bez 4-NQO. Mutant delecji ell1 zawierający tylko pusty wektor nie wykazywał wzrostu przy 0,8-mikromolowym 4-NQO, a sześć transformantów wykazywało wzrost przy 0,8-mikromolowym 4-NQO, co sugeruje, że obecne w nich klony biblioteczne mogą tłumić fenotyp stresu genotoksycznego mutanta zerowego ell1. Trawienie restrykcyjne plazmidu supresorowego 84 i 104 uwolniło wkładkę odpowiednio jednej kilozasady i 800 par zasad.

Ponowne wprowadzenie klonów plazmidu supresorowego do mutanta zerowego ell1 spowodowało zahamowanie wrażliwości wzrostu związanej z 4-NQO. Jednak w obecności MMS plazmidy supresorowe zawierające mutanta delecji ell1 wykazywały większy wzrost niż te z pustym wektorem. Te genetyczne badania przesiewowe mogą nakreślić potencjalne mechanizmy oporności i zidentyfikować cele białkowe nowych związków przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybiczych, przeciwpasożytniczych lub przeciwnowotworowych.

Mogą również zidentyfikować mechanizm działania leków farmaceutycznych.