Name: Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Poznaj protokół genetycznego badania przesiewowego wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe. Metoda pozwala identyfikować nowe interakcje genetyczne i supresory dla mutanta ell1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu badawczego Departamentu Biotechnologii Rządu Indii (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) do Nimishy Sharmy. Autorzy dziękują prof. Charlesowi Hoffmanowi (Boston College, USA) za dar biblioteki cDNA S. pombe oraz prof. Susan Forsburg za plazmidy drożdży.

1. Przekształcenie biblioteki cDNA w zmutowany szczep zapytania S. pombe w celu przesiewania pod kątem supresorów wielokopijnych
UWAGA: Standardowa metoda octanu litu27 została przeprowadzona w celu przekształcenia biblioteki cDNA S. pombe w szczep S. pombe ell1Δ z kilkoma modyfikacjami:
<ol>
	<li>Uprawiać szczep S. pombe ell1Δ w temperaturze 32 °C na podłożu YE (Tabela 1) na podłożu YE uzupełnionym po 225 μg/ml adeniny, leucyny i uracylu. Zaszczepić pętlę pełną inokulum szczepu ell1Δ z powyższej płytki w 15-20 ml pożywki YE uzupełnionej po 225 μg / ml adeniny, leucyny i uracylu. Inkubować przez noc w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem (200-250 obr./min).</li>
	<li>Następnego dnia rozcieńczyć nocną kulturę w 100 ml świeżej pożywki YE z pożądanymi dodatkami do OD600 nm (gęstość optyczna przy 600 nm) 0,3 i inkubować w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem przy 200-250 obr./min, aż OD600 nm osiągnie fazę mid-log.</li>
	<li>Podzielić 100 ml kultury na dwie probówki wirówkowe o pojemności 50 ml, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 4 000 × g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad komórek 1 ml sterylnej wody, tj. ponownie zawiesić komórki w 1 ml sterylnej wody i odwirować przy 4 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i przemyć każdą komórkę 1 ml 1x roztworu LiAc-TE (100 mM octanu litu, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), jak opisano w kroku 1.4.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę w 250 μl 1x LiAc-TE. Użyj tych kompetentnych komórek S. pombe (500 μl) do transformacji z interesującym nas DNA. Przenieś 125 μl właściwych komórek do czterech różnych sterylnych probówek mikrowirówkowych w celu przeprowadzenia kolejnych etapów transformacji.</li>
	<li>Gotuj DNA nosiciela z jąder łososia lub nasienia śledzia przez 1 minutę i natychmiast umieść na lodzie. Do każdej przemiany dodać 10 μl zdenaturowanego, jednoniciowego nośnika DNA o sile 10 mg/ml do probówki mikrowirówkowej zawierającej 125 μl właściwych komórek, a następnie delikatnie wymieszać za pomocą końcówki do mikropipet. Następnie dodać 50 μg biblioteki cDNA S. pombe do probówki mikrowirówkowej zawierającej mieszaninę DNA zawierającą komendał-nośnik DNA.</li>
	<li>Inkubować probówki do mikrowirówek w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie dodać 260 μl roztworu glikolu polietylenowego i octanu litu (40% [w/v] PEG 4,000, 100 mM octan litu, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) do probówek i delikatnie wymieszać za pomocą końcówki do mikropipet.</li>
	<li>Inkubować probówki do mikrowirówek zawierające mieszaninę transformacyjną w temperaturze 32 °C przez 2 godziny bez wytrząsania. Dodać 43 μl podgrzanego sulfotlenku dimetylu (DMSO) do probówki mikrowirówki i delikatnie wymieszać. Następnie należy wystawić probówki na szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Granulować komórki w ilości 4 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i usunąć resztki roztworu PEG-LiAc-TE za pomocą końcówki do mikropipet.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl sterylnej wody i ułożyć płytkę na jednej płytce EMM2 (Tabela 1) (150 mm) z wymaganymi dodatkami i 0,2 μg/ml 4-NQO.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 32 °C przez 5-6 dni, aby umożliwić pojawienie się kolonii na płytkach. Otrzymane kolonie rozprowadzić na tej samej pożywce w obecności 0,2 μg/ml 4-NQO i użyć do dalszych badań przesiewowych.</li>
	<li>W jednym eksperymencie transformacji biblioteki użyj 500 μl kompetentnych komórek (125 μl kompetentnych komórek x 4 probówki mikrowirówkowe) do transformacji, jak opisano w krokach 1.8 do 1.14 powyżej.</li>
	<li>Jako kontrolę, umieść 1/10tej mieszaniny transformacyjnej na jednej płytce EMM2 (150 mm) z wymaganymi dodatkami, ale bez 4-NQO, w celu obliczenia całkowitej liczby klonów bibliotecznych uzyskanych po transformacji biblioteki i ekranu do izolacji klonów supresorowych.</li>
</ol>
2. Przetestuj i zweryfikuj ratunek/tłumienie fenotypu związanego z zapytaniem zmutowanego szczepu przez domniemany tłumik
UWAGA: Testy punktowe stresu zostały przeprowadzone zgodnie z opisem poniżej, aby przetestować i potwierdzić ratowanie/tłumienie wrażliwości na stres 4-NQO związanej z delecją ell1 przez domniemany tłumik (tłumiki).
<ol>
	<li>Dodaj 100-200 μl sterylnej wody do każdego z różnych dołków sterylnej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki do mikropipet o pojemności 20-200 μl pobrać niewielką ilość inokulum z każdej z różnych kolonii otrzymanych po transformacji biblioteki cDNA na płytkę zawierającą 4-NQO. Dodaj inokulum z każdej z różnych kolonii do oddzielnych niezależnych studzienek płytki do mikromiareczkowania, zawierających 100-200 μl sterylnej wody. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Umieścić 3 μl zawiesiny komórkowej z każdej studzienki na płytkach agarowych EMM2 zawierających adeninę (225 μg/ml) i uracyl (225 μg/ml), ale pozbawionych leucyny (wybieralnego markera auksotroficznego obecnego na wektorze plazmidowym używanym do budowy biblioteki używanej w tej pracy). W razie potrzeby dodać do płytek odpowiednie stężenia 4-NQO.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 32 °C przez 3-4 dni, aby komórki mogły rosnąć. Zidentyfikuj kolonie, które wykazują wzrost w obecności różnych stężeń 4-NQO jako przypuszczalnych supresorów.</li>
	<li>W celu dalszej walidacji supresorów, należy hodować wybrane supresory wraz z odpowiednimi szczepami kontrolnymi przez noc w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem (200-250 obr./min) w pożywce EMM2 zawierającej po 225 μg/ml adeniny i uracylu, ale bez leucyny.</li>
	<li>Następnego dnia rozcieńczyć komórki do średnicyzewnętrznej 600 nm 0,3 w świeżej pożywce EMM2 i hodować je w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem aż do połowy fazy logarytmicznej (okołoOD 600 nm 0,6-0,8).</li>
	<li>Wykryć odpowiednie seryjne rozcieńczenia (1:10 lub 1:5) kultur na płytkach EMM2 z wymaganymi dodatkami zawierającymi 0,4 μM 4-NQO lub 0,01% MMS. W celu kontroli należy umieścić szczepy na płytce EMM2 z wymaganymi suplementami, ale bez żadnego czynnika uszkadzającego DNA.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 32 °C przez 3-5 dni w celu monitorowania wzrostu. 
	UWAGA: Odpowiednie testy oparte na fenotypie związanym z zapytaniem, zmutowany szczep powinny być stosowane do testowania ratowania lub tłumienia fenotypu. Na przykład, jeśli konieczne jest zidentyfikowanie supresorów wrażliwego na zimno fenotypu zmutowanego szczepu zapytania, test do testowania i walidacji klonów supresorowych obejmowałby hodowlę transformantów w niskiej temperaturze.</li>
	<li>Wykryj zmutowane szczepy przekształcone za pomocą pełnowymiarowego genu będącego przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku Spell1) lub pustego wektora jako odpowiednio kontroli pozytywnej i negatywnej, wraz z transformantami bibliotecznymi.</li>
</ol>
3. Izolacja plazmidu od klonów supresorowych S. pombe 
UWAGA: Izolacja plazmidu z S. pombe została przeprowadzona zgodnie z protokołem opisanym w Fission yeast: a laboratory manual28 z kilkoma modyfikacjami.
<ol>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię drożdży w pożywce EMM2 zawierającej 225 μg/ml adeniny i uracylu i hodować komórki przez noc w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem przy 200-250 obr./min. Następnego dnia zbierz 5 komórek o średnicy zewnętrznej (tj. 10 ml kultury o średnicy zewnętrznej 0,5) przez wirowanie przez 2 minuty w temperaturze 4000 × g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 0,2 ml buforu do lizy (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) i 1 mM Na2EDTA).</li>
	<li>Do probówki mikrowirówki dodać 0,2 ml alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1) i 0,3 g szklanych kulek przemytych kwasem. Wirować probówkę mikrowirówki przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i inkubować na lodzie przez 1 minutę. Powtórz ten krok 6 razy.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 10 000 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść górną warstwę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki i dodać 200 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1).</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 × g przez 10 minut. Przenieść górną warstwę wodną do świeżej probówki i dodać do probówki dwie objętości 100% etanolu (~400 μl) i 1/10 objętości octanu sodu (3 M, pH 5,8) (~20 μL). Inkubować probówkę do mikrowirówki w temperaturze -70 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wytrącić DNA przez odwirowanie w temperaturze 10 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Umyj osad DNA 70% etanolem (~500 μL) i przechowuj go w temperaturze pokojowej do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić DNA w 20 μl sterylnej wody. Użyj 2-5 μl plazmidowego DNA do transformacji kompetentnych komórek E. coli. 
	UWAGA: Plazmid można również wyizolować z komórek drożdży za pomocą dowolnego z dostępnych na rynku zestawów do izolacji plazmidów drożdży.</li>
</ol>
4. Identyfikacja genu kodowanego przez klon supresorowy
<ol>
	<li>Przekształć izolowane plazmidy drożdży w szczep E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] przy użyciu standardowego protokołu29 i rozprowadź komórki na płytkach LB (Luria Broth) z wymaganymi antybiotykami.</li>
	<li>Wyizoluj plazmid (plazmidy) z transformantów E. coli przy użyciu standardowego protokołu lizy alkalicznej29 i postępuj zgodnie z odpowiednimi kombinacjami enzymów restrykcyjnych, aby sprawdzić uwolnienie fragmentu DNA insercji przez trawienie restrykcyjne. 
	UWAGA: Plazmid supresorowy 84 był trawiony enzymem restrykcyjnym BamHI, a plazmid supresorowy 104 był trawiony enzymami restrykcyjnymi PstI/BamHI.</li>
	<li>Przekształć plazmidy wykazujące uwalnianie insercji po trawieniu restrykcyjnym w szczepie ell1Δ, aby sprawdzić ich zdolność do ratowania genotoksycznego, wrażliwego na stres fenotypu szczepu ell1Δ.</li>
	<li>Wybierz klony plazmidów wykazujące tłumienie wrażliwości na stres genotoksyczny i zsekwencjonuj fragment DNA insercji obecny w tych klonach plazmidów za pomocą specyficznych dla wektora starterów do przodu i do tyłu. 
	UWAGA: W tym badaniu użyto uniwersalnego startera do przodu specyficznego dla promotora adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') 30.</li>
	<li>Aby zidentyfikować gen odpowiedzialny za supresję, wyrównaj sekwencję uzyskaną za pomocą nukleotydu nukleotydowego NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) lub narzędzia do wyrównywania sekwencji Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Wybierz sekwencję wykazującą maksymalne wyrównanie i zidentyfikuj ją jako gen dla wielokopijnego plazmidu supresorowego.</li>
</ol>

<ol><li>Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+of+missing+heritability%3A+Genetic+interactions+create+phantom+heritability%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).</li>
<li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).</li>
<li>Bloom, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+contribute+less+than+additive+effects+to+quantitative+trait+variation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast.</a> Nature Communications. 6 (1), 8712(2015).</li>
<li>Tong, A. H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+genetic+interaction+network+maps+a+wiring+diagram+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function.</a> Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).</li>
<li>Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+three+novel+protein+complexes+in+the+absence+of+the+Sgs1+DNA+helicase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).</li>
<li>Kaplan, Y., Kupiec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+yeast+cell+cycle%2Fsplicing+factor+Cdc40+in+the+G1%2FS+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition.</a> Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).</li>
<li>Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+dosage+effects+in+yeast+support+broader+roles+for+the+LOG1%2C+HAM1+and+DUT1+genes+in+detoxification+of+nucleotide+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues.</a> PLOS One. 13 (5), 0196840(2018).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Duffy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+screens+identify+conserved+dosage+chromosome+instability+genes+in+yeast+and+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).</li>
<li>Appling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to the study of protein-protein interactions.</a> Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: yeast.</a> Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).</li>
<li>Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-fusion+PCR+for+one-step+mutagenesis+of+essential+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast.</a> Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).</li>
<li>Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+mechanisms%3A+themes+from+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Suppression mechanisms: themes from variations.</a> Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppressors+for+novel+antibacterial+compounds+reveal+targets+and+drug+efflux+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility.</a> Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).</li>
<li>Apfel, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+deformylase+as+an+antibacterial+drug+target%3A+Target+validation+and+resistance+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).</li>
<li>Tsukahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicinal+genetics+approach+towards+identifying+the+molecular+target+of+a+novel+inhibitor+of+fungal+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).</li>
<li>Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multidrug+efflux+transporter+gene+of+the+major+facilitator+superfamily+from+Candida+albicans+%28FLU1%29+conferring+resistance+to+fluconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole.</a> Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).</li>
<li>Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genes+mediating+resistance+to+inhibitors+of+nucleoside+and+ergosterol+metabolism+in+leishmania+by+overexpression%2Fselection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).</li>
<li>Nodake, Y., Yamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+a+macromolecular+conjugate+of+lysozyme+prepared+by+modification+with+a+monomethoxypolyethylene+glycol+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).</li>
<li>Sunnerhagen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+functional+genomics+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).</li>
<li>Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+yeast+for+young+geneticists%3A+A+primer+on+the+Schizosaccharomyces+pombe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system.</a> Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).</li>
<li>Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RNA+polymerase+II-mediated+transcriptional+elongation%3A+Implications+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease.</a> IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).</li>
<li>Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino-terminal+domain+of+ELL+transcription+elongation+factor+is+essential+for+ELL+function+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).</li>
<li>Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Schizosaccharomyces+pombe%3A+Lithium+acetate%2Fdimethyl+sulfoxide+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969(2016).</li>
<li>Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagan%2C+I+%22Fission+yeast%3A+a+laboratory+manual%22">Fission yeast: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli+using+calcium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932(2006).</li>
<li>Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+of+the+Schizosaccharomyces+pombefbp1+gene+include+two+redundant+Tup1p-like+corepressors+and+the+CCAAT+binding+factor+activation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex.</a> Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+plasmid+DNA+by+alkaline+lysis+with+SDS%3A+Maxipreparation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation.</a> CSH Protocols. 2006 (1), 4090(2006).</li>
<li>Choi, E., Lee, K., Song, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rax2p+in+the+polarized+growth+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast.</a> Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).</li>
<li>Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osh6+revisited%3A+Control+of+PS+transport+by+the+concerted+actions+of+PI4P+and+Sac1+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601(2021).</li>
<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeasts+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe%3A+models+for+cell+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gravitational+and+Space+Biology+Bulletin%3A+Publication+of+the+American+Society+for+Gravitational+and+Space+Biology%22%5BJournal%5D)">The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research.</a> Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicopy+suppressor+gene+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+G1+cell+cycle+mutant+gene+dbf4+encodes+a+protein+kinase+and+is+identified+as+CDC5%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).</li>
<li>Melnykov, A. V., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelnykov%2C+AV+%22MCH4+is+a+multicopy+suppressor+of+glycine+toxicity+in+Saccharomyces+cerevisiae%22">MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae</a>. , 653444(2019).</li>
<li>Kosodo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppressors+of+the+sly1+temperature-sensitive+mutation+in+the+ER-Golgi+vesicular+transport+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).</li>
<li>Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppression+of+oxidant-sensitive+eos1+mutation+by+IZH2+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+the+involvement+of+Eos1+in+zinc+homeostasis%3A+Eos1+involvement+in+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis.</a> FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).</li>
<li>Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppression+screening+of+Saccharomyces+cerevisiae+identifies+the+ubiquitination+machinery+as+a+main+target+for+improving+growth+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).</li>
<li>Sweta, K., Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+between+ELL+transcription+elongation+factor+and+Epe1+reveals+the+role+of+Epe1+in+the+regulation+of+transcription+outside+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin.</a> Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).</li>
<li>Kim, D. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).</li>
<li>Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genetic+interaction+screens+in+the+age+of+CRISPR%2FCas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas.</a> Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Drożdże są szeroko stosowane do badania podstawowych procesów biologicznych i szlaków, które są ewolucyjnie zachowane w organizmach eukariotycznych. Dostępność narzędzi genetycznych i genomicznych wraz z ich podatnością na różne procedury biochemiczne, genetyczne i molekularne sprawiają, że drożdże są doskonałym organizmem modelowym do badań genetycznych 34,35,36. Z biegiem lat naukowcy zajmujący się drożdżami zaprojektowali róż...

Sieci interakcji genetycznych dostarczają funkcjonalnych informacji o genach i wyznaczają szlaki i procesy biologiczne, w które te geny mogą być zaangażowane in vivo. Ponadto mogą również dostarczyć informacji na temat tego, jak różne geny oddziałują na siebie, co skutkuje określonym fenotypem1,2,3. Z biegiem lat naukowcy zaprojektowali różne genetyczne badania przesiewowe, aby odpowiedzieć na podstawowe pytania biologiczne i zbadać choroby ludzkie. Badania przesiewowe w celu identyfikacji interakcji genetycznych można przeprowadzać na wiele sposobów. Interakcje genetyczne zidentyfikowane w różnych badaniach genetycznych mogą reprezentować wyraźne relacje mechanistyczne między genami. Co więcej, badania wykazały, że wspólny zestaw interakcji genetycznych jest wspólny dla genów kodujących białka należące do tego samego szlaku lub kompleksu4,5. W ten sposób sieci interakcji genetycznych można wykorzystać do ustalenia funkcjonalnej organizacji w komórce, w której geny o najbardziej podobnych profilach należą do tego samego kompleksu lub szlaku, geny o nieco mniej podobnych profilach należą do tego samego procesu biologicznego, a geny wykazujące nakładające się, ale bardziej zróżnicowane profile odzwierciedlają członków należących do tego samego przedziału komórkowego6.
Genetyczne badania interakcji oparte na tłumieniu dawek ("tłumienie z dużą liczbą kopii lub wielu kopii") są jednym z powszechnie stosowanych podejść. Badania przesiewowe można przeprowadzić, przekształcając zmutowany szczep zapytania za pomocą biblioteki genomowej lub cDNA o wysokiej liczbie kopii, a następnie stosując odpowiednie testy/techniki selekcji w celu zidentyfikowania tłumienia lub wzmacniania interakcji genetycznych7,8,9. Aby zapewnić kompleksowe pokrycie całego genomu, badania przesiewowe przeprowadzono również poprzez nadekspresję określonego genu będącego przedmiotem zainteresowania w kolekcji mutantów tracących funkcję w całym genomie lub przez nadekspresję biblioteki genomowej lub cDNA zakodowanej plazmidem o wysokiej liczbie kopii w zapytaniu o utratę funkcji mutant9,10,11,12,13,14,15. Strategia multicopy może również działać przy użyciu podejścia dominującego/nadekspresji przy użyciu regulowanego promotora.
Główne zalety korzystania z ekranów opartych na supresorach polegają na tym, że tłumienie wcześniej istniejącego fenotypu w zmutowanym szczepie przez inny gen ustanawia genetyczne pokrewieństwo między tymi dwoma produktami genów, które mogło nie zostać wykazane przy użyciu innych metod. Po drugie, zaobserwowano, że obecność wcześniej istniejącej mutacji uwrażliwia na określony szlak, umożliwiając identyfikację dodatkowych składników tego szlaku poprzez izolację supresorów, które mogły nie zostać zidentyfikowane przez bardziej bezpośrednią selekcję genetyczną. Co więcej, ten ekran może być używany do identyfikowania tłumików, które mają różne mechanizmy tłumienia16. Interakcje supresorowe zwykle zachodzą między genami, które są funkcjonalnie powiązane i mogą być wykorzystane do wyjaśnienia hierarchii w szlakach. Dokładny mechanizm leżący u podstaw supresji może się różnić w zależności od kilku czynników, w tym rodzaju mutanta zapytania użytego w badaniu przesiewowym, warunków eksperymentalnych i poziomu ekspresji genów. Jednym z powszechnych mechanizmów tłumienia dawki są geny kodujące produkty, które funkcjonują razem w tym samym kompleksie lub równolegle w tym samym procesie komórkowym/biologicznym. Wyniki takich badań przesiewowych w prostszych organizmach modelowych, takich jak drożdże, można rozszerzyć na wyższe organizmy eukariotyczne, ponieważ większość podstawowych szlaków i procesów biologicznych jest zachowana w całej ewolucji.
Te genetyczne badania przesiewowe mogą być również modyfikowane na kilka sposobów, aby odpowiedzieć na różne pytania biologiczne. Na przykład można zidentyfikować ortologiczne geny z różnych organizmów, które mogą tłumić fenotyp zmutowanego szczepu zapytania. Został również wykorzystany do nakreślenia potencjalnych mechanizmów oporności i określenia celów białkowych nowych związków przeciwbakteryjnych17,18, antifungal19,20, antiparasitic21 i anticancer22. Badanie to zostało również wykorzystane do identyfikacji supresorów działania leków farmaceutycznych, których mechanizm działania nie jest znany. W ten sposób, w zasadzie, te wielokopijne ekrany tłumiące mogą być optymalizowane i wykorzystywane w różnych zastosowaniach w różnych organizmach. Chociaż większość genetycznych badań przesiewowych stosowanych przez badaczy drożdży została początkowo opracowana u S. cerevisiae, S. pombe pojawił się jako uzupełniający system modelowy do przeprowadzania różnych genetycznych badań przesiewowych i testów23. Co więcej, organizacja genomu i procesy biologiczne u S. pombe, takie jak występowanie intronów w większej liczbie genów, złożoność początków replikacji DNA, struktura centromerów, organizacja cyklu komórkowego i obecność maszynerii RNAi, wykazują większe podobieństwo między S. pombe a wyższymi eukariontami23,24, podkreślając znaczenie projektowania i stosowania narzędzi genetycznych w S. pombe.
Ten artykuł opisuje protokół identyfikacji genetycznych interakcji na podstawie 'tłumienia dawkowania' zmutowanego fenotypu utraty funkcji u S. pombe. Podstawą tego protokołu jest to, że jest to szybka i skuteczna metoda badania przesiewowego biblioteki cDNA z nadekspresją genów typu dzikiego na plazmidzie wielokopijnym i/lub z silnego promotora. Protokół ten składa się z czterech głównych etapów: przekształcenie biblioteki w zmutowany szczep zapytania, wybór klonów plazmidów, które tłumią pożądany fenotyp zmutowanego szczepu zapytania, odzyskanie plazmidu (estrogenów) z tych klonów supresorowych oraz identyfikacja genu odpowiedzialnego za supresję fenotypu. Podobnie jak w przypadku każdej metody opartej na selekcji i identyfikacji cDNA z biblioteki, sukces badania przesiewowego zależy od użycia biblioteki o wysokiej jakości i złożoności, ponieważ badanie przesiewowe może pobrać tylko te klony cDNA, które są obecne w bibliotece.
Korzystając z tego protokołu, udało nam się zidentyfikować dwa nowe supresory genotoksycznego, wrażliwego na stres fenotypu zapytania S. pombe ell1 null mutant. Rodzina czynników wydłużających transkrypcję ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) hamuje przejściowe wstrzymywanie polimerazy RNA II na matrycach DNA w testach biochemicznych in vitro i jest konserwatywna w różnych organizmach, od drożdży rozszczepialnych po ludzi25. Wcześniejsze prace dostarczyły dowodów na to, że mutant zerowy S. pombe ell1 wykazuje genotoksyczną wrażliwość na stres w obecności 1-tlenku 4-nitrochinoliny (4-NQO) i metanosulfonianu metylu (MMS)26. Dlatego przekształciliśmy wielokopijną bibliotekę cDNA kodowaną plazmidem S. pombe w zapytanie: S. pombe ell1 null mutant i zidentyfikowaliśmy dwa domniemane klony, które wykazywały zdolność do tłumienia wrażliwości na stres genotoksyczny mutanta zerowego S. pombe ell1 w obecności 4-NQO, związku, który indukuje zmiany w DNA. Późniejsze sekwencjonowanie insertu obecnego w klonach plazmidów wykazało, że geny kodujące rax2+ i osh6+ były odpowiedzialne za tłumienie wrażliwości na stres genotoksyczny mutanta ell1 null w przypadku nadekspresji w mutancie ell1 null.

<table><tbody><tr><td>4-NQO</td><td>Sigma</td><td>N8141</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowcowy</td><td>Sigma</td><td>1371301000</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan adeniny</td><td>Himedia</td><td>GRM033</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>GRM026</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50004L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Himedia</td><td>MB054</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Fermentas</td><td>ER0051</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Himedia</td><td>RM095</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Himedia</td><td>MB007</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform: alkohol izoamylowy 24:1</td><td>Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Himedia</td><td>RM1023</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy</td><td>bezwodny Himedia</td><td>GRM3960</td><td></td></tr><tr><td>jednoniciowe DNA z jąder łososia</td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodowy</td><td>Sigma</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza</td><td>Himedia</td><td>RM6353</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Amresco</td><td>188</td><td></td></tr><tr><td>Jonosytol</td><td>Himedia</td><td>GRM102</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Qualigen</td><td>Q26897</td><td></td></tr><tr><td>Leucyna</td><td>Himedia</td><td>GRM054</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu</td><td>Sigma</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Kwas molibdenowy</td><td>Himedia</td><td>RM690</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nikotynowy</td><td>Himedia</td><td>CMS177</td><td></td></tr><tr><td>PEG, MW 4000</td><td>Sigma</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pentotynowy</td><td>Himedia</td><td>TC159</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Himedia</td><td>MB082</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji plazmidu</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Wodoroftalan potasu</td><td>Merc</td><td>DDD7D670815</td><td></td></tr><tr><td>Jodek potasu</td><td>Himedia</td><td>RM1086</td><td></td></tr><tr><td>RNAzywa</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Himedia</td><td>GRM205</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Himedia</td><td>GRM1183</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan sodu</td><td>Himedia</td><td>RM1037</td><td></td></tr><tr><td>Tris free Base</td><td>Himedia</td><td>MB209</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Himedia</td><td>GRM264</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy w proszku</td><td>Himedia</td><td>RM668</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan siedmiowodny</td><td>Merc</td><td>DJ9D692580</td><td></td></tr></tbody></table>

genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u schizosaccharomyces pombe

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Identyfikacja interakcji genetycznych jest potężnym narzędziem do rozszyfrowywania funkcji genów poprzez dostarczanie wglądu w ich funkcjonalne relacje z innymi genami oraz organizację w biologiczne szlaki i procesy. Chociaż większość genetycznych badań przesiewowych została początkowo opracowana w przypadku Saccharomyces cerevisiae, uzupełniająca platforma do przeprowadzania tych genetycznych badań przesiewowych została dostarczona przez Schizosaccharomyces pombe. Jednym z powszechnych podejść stosowanych do identyfikacji interakcji genetycznych jest nadekspresja klonów z biblioteki plazmidów o wysokiej liczbie kopii w całym genomie u mutanta z utratą funkcji, a następnie selekcja klonów, które hamują zmutowany fenotyp.
Ten artykuł opisuje protokół przeprowadzania tego genetycznego badania przesiewowego opartego na 'tłumieniu wielu kopii' u S. pombe. To badanie przesiewowe pomogło zidentyfikować wielokopijne supresory genotoksycznego fenotypu wrażliwego na stres związanego z brakiem czynnika wydłużania transkrypcji Ell1 u S. pombe. Badanie przesiewowe zainicjowano poprzez transformację zmutowanego szczepu ell1 null z biblioteką plazmidów cDNA S. pombe o wysokiej liczbie kopii i wybranie supresorów na płytkach EMM2 zawierających 1-tlenek 4-nitrochinoliny (4-NQO), genotoksyczny związek wywołujący stres. Następnie plazmid wyizolowano z dwóch wyselekcjonowanych kolonii supresorowych i trawiono przez enzymy restrykcyjne w celu uwolnienia DNA insercji. Plazmidy uwalniające fragment insercji DNA zostały ponownie przekształcone w szczep delecji ell1, aby potwierdzić zdolność tych klonów plazmidów supresorowych do przywrócenia wzrostu mutanta delecji ell1 w obecności 4-NQO i innych związków genotoksycznych. Plazmidy wykazujące ratunek dla fenotypu delecji zostały zsekwencjonowane w celu zidentyfikowania genów odpowiedzialnych za supresję genotoksycznego fenotypu wrażliwego na stres związanego z delecją ell1.

Przesiewanie w celu znalezienia wielokrotnych kopii supresorów ell1 w kontekście wrażliwości na stres genotoksyczny związanej z delecją w S. pombe 
Przeprowadziliśmy przesiew genetyczny zgodnie z powyższym protokołem, aby zidentyfikować supresory wielokrotnych kopii dla fenotypu utraty funkcji w badanym szczepie mutantach z delecją ell1. Wrażliwość wzrostu szczepu z delecją ell1 zaobserwowana w obecności czynnika ...

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships ...

Badania przesiewowe supresorów identyfikują interakcje genetyczne, które rzuciłyby światło na funkcje genu będącego przedmiotem zainteresowania, a także na szlaki i procesy biologiczne, w które mogą być zaangażowane in vivo. Technika ta może zidentyfikować pokrewieństwo genetyczne między dwoma produktami genowymi, które mogło nie zostać wykazane przy użyciu innych metod. Wyniki takich badań przesiewowych u drożdży można rozszerzyć na organizmy o wysokiej wartości eukariotycznej, ponieważ większość podstawowych szlaków i procesów biologicznych jest zachowana w całej ewolucji.Powodzenie programu zależy od dostępności, wysokiej jakości i wysokiej skuteczności jego przekształcania w komórki drożdży. Tak więc, protokół transformacji z plazmidem przed wyhodowaniem szczepu delecji Schizosaccharomyces pombe ell1 w temperaturze 32 stopni Celsjusza na pożywce Y. Weź pętlę pełną zmutowanego szczepu ell1 z płytki, zaszczepij pięć mililitrów uzupełnionej pożywki YE, a następnie inkubuj fiolkę, wstrząsając w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc.Po inkubacji rozcieńczyć nocną kulturę wzrostu w 100 mililitrach świeżej pożywki YE zawierającej pożądane suplementy, aby osiągnąć gęstość optyczną 0,3 przy 600 nanometrach. Inkubować podłoże w temperaturze 32 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością od 200 do 550 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie fazę środkowego logarytmu. Po podzieleniu 100 mililitrów kultury na dwie 50-mililitrowe probówki wirówkowe, osadzaj komórki w temperaturze 4 000 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Po wyrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze sterylnej wody. Odwirować i ponownie wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad ogniwa w jednym mililitrze octanu litu TE. Osadzaj ogniwo przez odwirowanie i ponownie zawieś każdą osadę komórkową w 250 mikrolitrach octanu litu TE. Następnie przenieś 125 mikrolitrów właściwych komórek do czterech różnych sterylnych probówek mikrowirówek w celu przeprowadzenia kolejnych etapów transformacji. Gotować DNA nosiciela z jąder łososia lub nasienia śledzia przez jedną minutę i natychmiast umieścić probówkę na lodzie.Do każdej przemiany dodać 10 mikrolitrów jednoniciowego nośnego DNA do probówki mikrowirówki zawierającej 125 mikrolitrów właściwych komórek i delikatnie wymieszać przez pipetowanie. Następnie dodać 50 mikrogramów biblioteki cDNA Schizosaccharomyces pombe do probówki zawierającej kompetentne komórki i mieszaninę nośnego DNA. Po inkubacji probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, dodać 260 mikrolitrów roztworu glikolu polietylenowego i octanu litu i wymieszać pipetując.Inkubować probówkę zawierającą mieszaninę transformacyjną w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez dwie godziny bez wstrząsania. Dodaj 43 mikrolitry wstępnie podgrzanego sulfotlenku dimetylu do probówki i delikatnie wymieszaj. Teraz wystaw rurkę na szok termiczny w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez pięć minut.Osadzać komórki i wyrzucać supernatant, jak pokazano wcześniej, a następnie odpipetować resztki roztworu TE octanu litu z glikolu polietylenowego. Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach sterylnej wody i umieścić je na jednej płytce EMM2 zawierającej wymagane suplementy i 0,2 mikrograma na mililitr 4-NQO. Następnie pozwól koloniom pojawić się na płytkach, inkubując płytki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu dni.W celu dalszych badań przesiewowych uzyskane kolonie należy rozprowadzić na tej samej pożywce w obecności 0,2 mikrograma na mililitr 4-NQO. W jednym eksperymencie transformacji biblioteki użyj 500 mikrolitrów kompetentnych komórek do transformacji i płytki 1 na 10 mieszaniny transformacyjnej na płytce EMM2 z wymaganymi suplementami pozbawionymi 4-NQO, aby obliczyć całkowitą liczbę klonów bibliotecznych uzyskanych po transformacji i przesiewie klonów supresorowych. Dodaj od 100 do 200 mikrolitrów sterylnej wody do każdej studzienki sterylnej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.Za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki mikropipety o pojemności od 20 do 200 mikrolitrów wybierz niewielką ilość inokulum z każdej kolonii uzyskanej po transformacji biblioteki cDNA na płytce zawierającej 4-NQO. Dodaj inokulum z każdej z różnych kolonii do każdej studzienki płytki zawierającej sterylną wodę i dokładnie wymieszaj. Umieścić trzy mikrolitry zawiesiny komórek z każdej studzienki na płytkach agarowych EMM2 i dodać odpowiednie stężenia 4-NQO do płytek.Po wyhodowaniu komórek w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni, zidentyfikuj kolonie, które wykazują wzrost w różnych stężeniach 4-NQO jako przypuszczalne supresory. Aby dalej walidować supresory, należy wyhodować wybrane supresory i odpowiednie szczepy kontrolne w pożywce EMM2 zawierającej 225 mikrogramów na mililitr adeniny i uracylu w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc z wytrząsaniem. Po zakończeniu inkubacji rozcieńczyć komórki do gęstości optycznej 0,3 w świeżej pożywce EMM2 i hodować je, wstrząsając w temperaturze 32 stopni Celsjusza aż do środkowej fazy logarytmicznej.Wykryj odpowiednie seryjne rozcieńczenia kultur na płytkach EMM2 z wymaganymi suplementami zawierającymi 0,4 mikromolowego 4-NQO lub 0,01% MMS. W celu kontroli należy umieścić szczepy na płytce EMM2 z wymaganymi suplementami, ale bez żadnego czynnika uszkadzającego DNA. Inkubuj płytki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu dni, aby monitorować wzrost.Wykryj zmutowane szczepy przekształcone za pomocą genu o pełnej długości lub pustego wektora jako kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio, wraz z transformantami bibliotecznymi. Zaszczepić pojedynczą kolonię drożdży w pożywce EMM2 zawierającej 225 mikrogramów na mililitr adeniny i uracylu i hodować komórki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc, wytrząsając przy 200 do 250 obr./min. Pod koniec inkubacji zebrać 10 mililitrów kultury o gęstości optycznej 0,5, wirując w temperaturze 4 000 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 0,2 mililitra buforu do lizy. Dodać 0,2 mililitra fenolu, chloroformu, alkoholu izoamylowego i 0,3 grama szklanych kulek przemytych kwasem do probówki mikrowirówkowej. Mieszać, wirując probówkę przez dwie minuty, a następnie inkubować na lodzie przez jedną minutę.Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 razy G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną warstwę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki i dodaj 200 mikrolitrów fenolowo-chloroformowego alkoholu izoamylowego. Po ponownym odwirowaniu w temperaturze 10 000 razy G przez 10 minut, przenieść górną warstwę wodną do świeżej probówki.Następnie dodaj dwie objętości 100% etanolu i 1 na 10 objętość octanu sodu do probówki i inkubuj w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza przez godzinę. Wytrącić DNA przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Umyj osad DNA 70% etanolem i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.Ponownie zawiesić DNA w 20 mikrolitrach sterylnej wody i użyć trzech do pięciu mikrolitrów plazmidowego DNA do przekształcenia kompetentnych komórek Escherichia coli. Korzystając ze standardowego protokołu, przekształć izolowane plazmidy drożdży w szczep Escherichia coli TOP10 i rozprowadź komórki na płytkach LB z wymaganymi antybiotykami. Po wyizolowaniu plazmidu z transformantów Escherichia coli przy użyciu standardowego protokołu lizy alkalicznej, postępuj zgodnie z odpowiednimi kombinacjami enzymów restrykcyjnych, aby sprawdzić uwolnienie fragmentu DNA insercji przez trawienie restrykcyjne.Następnie przetransformuj plazmidy wykazujące uwalnianie insercji po trawieniu restrykcyjnym w szczepie delecji ell1, aby sprawdzić ich zdolność do ratowania genotoksycznego, wrażliwego na stres fenotypu szczepu delecji ell1. Szczep Schizosaccharomyces pombe z delecją ell1 wykazywał wrażliwość na 4-NQO w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Na płytce uzyskuje się dużą liczbę kolonii pozbawionych 4-NQO.Jednak na płytce 4-NQO uzyskano mniej transformantów, ponieważ działają one jako karzące tłumiki czułości 4-NQO mutanta zerowego ell1. Spośród 620 transformantów, 74 wykazały wzrost na 0,4-mikromolowym 4-NQO. Zaobserwowano, że tylko 16 z 74 wykazało wzrost w obecności 0,8-mikromolowego 4-NQO.Szczep delecji ell1 przekształcony z pustym wektorem i wszystkimi 16 transformantami wykazywał wzrost na płytce bez 4-NQO. Mutant delecji ell1 zawierający tylko pusty wektor nie wykazywał wzrostu przy 0,8-mikromolowym 4-NQO, a sześć transformantów wykazywało wzrost przy 0,8-mikromolowym 4-NQO, co sugeruje, że obecne w nich klony biblioteczne mogą tłumić fenotyp stresu genotoksycznego mutanta zerowego ell1. Trawienie restrykcyjne plazmidu supresorowego 84 i 104 uwolniło wkładkę odpowiednio jednej kilozasady i 800 par zasad.Ponowne wprowadzenie klonów plazmidu supresorowego do mutanta zerowego ell1 spowodowało zahamowanie wrażliwości wzrostu związanej z 4-NQO. Jednak w obecności MMS plazmidy supresorowe zawierające mutanta delecji ell1 wykazywały większy wzrost niż te z pustym wektorem. Te genetyczne badania przesiewowe mogą nakreślić potencjalne mechanizmy oporności i zidentyfikować cele białkowe nowych związków przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybiczych, przeciwpasożytniczych lub przeciwnowotworowych.Mogą również zidentyfikować mechanizm działania leków farmaceutycznych.

genetic-screen-for-identification-multicopy-suppressors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Odporność na stres jest jedną z cech charakterystycznych długowieczności i jest znana z tego, że jest genetycznie uwarunkowana. W tym miejscu opracowaliśmy bezstronną, wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu mutacji, które nadają odporność na stres w komórkach ES, za pomocą której opracowaliśmy modele mysie do badań nad długowiecznością.

Zaawansowane podejście genetyczne do odkrycia genów odporności na stres u myszy — wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w komórkach ES

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Światło / ciemność testu transformacji jest jednym z najczęściej stosowanych testów do pomiaru lęku zachowań w myszy. Poniżej prezentujemy film, który pokazuje szczegółowe procedury, w jaki sposób przeprowadzenia testu.

Światło / ciemność test przejścia dla Myszy

Poznaj protokół genetycznego badania przesiewowego wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe. Metoda pozwala identyfikować nowe interakcje genetyczne i supresory dla mutanta ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Przeglądaj więcej filmów