Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Bakterie wewnątrzkomórkowe wydzielają białka efektorowe do gospodarza, które mogą manipulować szlakami biologicznymi, aby wspierać przetrwanie patogenu. Ujawnienie celów gospodarza efektorów jest niezbędne do zrozumienia patogenów wewnątrzkomórkowych, takich jak Chlamydia trachomatis. Badania przesiewowe toksyczności i supresorów drożdży mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat naturalnego celu biologicznego bakteryjnych białek efektorowych i mogą być szczególnie przydatne, gdy partner wiążący jest nieznany.

Wykazujemy tutaj testy toksyczności i supresorów drożdży do badań przesiewowych w kierunku białek efektorowych Chlamydia trachomatis, ale technika ta została również wykorzystana do scharakteryzowania efektorów Legionella pneumophila i Coxiella burnetii. Zacznij od zaszczepienia pięciu mililitrów bulionu z pojedynczą kolonią drożdży przekształconą białkiem efektorowym zawierającym plazmid. Użyj drożdży przekształconych z samym wektorem jako kontroli negatywnej i inkubuj inokulum przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając.

Następnego dnia dodaj 180 mikrolitrów sterylnej wody do studzienek od A2 do A6 na 96-dołkowej płytce. Zmieszaj kulturę przez noc i dodaj 180 mikrolitrów drożdży do studzienki A1. Następnie seryjnie rozcieńczyć drożdże w studzienkach wodą. Użyj pipety wielokanałowej, aby namierzyć pięć mikrolitrów każdego rozcieńczenia na pojedynczych płytkach z glukozą i pojedynczym agarem z galaktozą i inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Po inkubacji należy wizualnie ocenić toksyczność, porównując wzrost drożdży wykazujących ekspresję białka efektorowego wyhodowanego na pożywce zawierającej galaktozę ze wzrostem drożdży wykazujących ekspresję samego wektora. Zaszczepić 100 mililitrów bulionu z pojedynczej kropli jednym mililitrem wcześniej przygotowanego bulionu drożdżowego i inkubować go przez 16 do 24 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 150 obr./min. Następnego dnia dodaj całe 100 mililitrów nocnej kultury do 900 mililitrów wstępnie podgrzanego bulionu z pojedynczej kropli i inkubuj kolbę przez cztery do pięciu godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając.

Po inkubacji osadzać kulturę w granulkach 6 000 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 mililitrach sterylnej wody. Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant.

Następnie ponownie zawieś osad w 250 mililitrach jednego milimolowego octanu litu. Osadzaj kulturę przez wirowanie, usuń octan litu i ponownie zawieś osad w 9,6 mililitra 50% PEG 3350. Następnie dodaj odczynniki transformacyjne zgodnie z opisem w manuskrypcie i dostosuj objętość do 15 mililitrów sterylną wodą, delikatnie odwracając, aby wymieszać.

Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj 750 mikrolitrów DMSO i inkubuj w łaźni wodnej w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez kolejne 30 minut. Dodanie DMSO przed szokiem cieplnym ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej wydajności transformacji.

Po inkubacji osadzać drożdże przez odwirowanie 3 000 razy g przez pięć minut. Odrzuć supernatant i umyj osad 10 mililitrami sterylnej wody, a następnie powtórz wirowanie, aby osadzać drożdże. Zawiesić granulki w ośmiu mililitrach wody.

Określić wydajność przemiany, rozcieńczając próbkę od 1 do 10 i posiewając 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na agarze z podwójnym kroplą. Następnie rozłóż 200 mikrolitrów próbki na podwójnie wypadających płytkach z agarem galaktozowym i inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 do 96 godzin lub do momentu pojawienia się kolonii. Po pojawieniu się kolonii załataj je na agarze z podwójnym odpadnięciem i inkubuj przez kolejne 24 do 48 godzin.

Użyj części plastra, aby zaszczepić pięć mililitrów bulionu z podwójnym wypadnięciem i inkubować inokulum przez noc w temperaturze 26 stopni Celsjusza z potrząsaniem przy 150 obr./min. Następnego dnia dodaj 180 mikrolitrów sterylnej wody do pięciu studzienek z 96-dołkową płytką, zaczynając od studzienki A2. Zwiruj nocną mieszankę kultur. Dodaj 180 mikrolitrów drożdży do studzienki A1 i seryjnie rozcieńcz je wodą w studzienkach od A2 do A6. Zaznacz pięć mikrolitrów każdego rozcieńczenia na pojedynczych płytkach agarowych z glukozą i galaktozą z pojedynczą kroplą, upewniając się, że jako kontrola uwzględniono sam efektor toksyczny.

Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin, a następnie porównać wzrost drożdży z samym efektorem toksycznym ze wzrostem drożdży z potencjalnym supresorem. Aby potwierdzić supresory, które wykazały zmniejszoną toksyczność w porównaniu z samym efektorem toksycznym, należy wyizolować plazmid zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i ponownie przekształcić go w toksyczne drożdże. Zaszczepić bulion glukozowy z podwójnym dropoutem kolonią z płytki transformacyjnej.

Inkubuj go przez noc i umieść na agarze z podwójnym odpadaniem glukozy i galaktozy, aby potwierdzić tłumienie toksyczności. Przed wykonaniem badania przesiewowego supresora drożdży, interesujące nas białka efektorowe zostały przetestowane pod kątem toksyczności drożdży. Interesujące białko wyrażono w drożdżach pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą, a wzrost na galaktozie porównano ze wzrostem na glukozie.

Kiedy CT229 został przetestowany pod kątem toksyczności, zaobserwowano mniejsze kolonie i zahamowanie wzrostu. Idealnie byłoby, gdyby zaobserwowano spadek logarytmu o dwa do trzech logarytmów, aby kontynuować badania przesiewowe supresorów drożdży. Badanie przesiewowe supresora przeprowadzono poprzez przekształcenie toksycznego szczepu za pomocą biblioteki genomowej drożdży pYAP 13 i posiew transformantów na agarze galaktozowym.

Uzyskane klony supresorowe zostały wykryte na agarze galaktozowym z podwójnym spadkiem, aby potwierdzić supresję toksyczności. Supresory pSup1 i pSup2 hamowały toksyczność białka efektorowego, podczas gdy pSup3 nie. Procedury te wymagają starannej dbałości o szczegóły, a także krytycznych prac przygotowawczych, w tym przygotowania dużych ilości pożywek i płyt przed wykonaniem eksperymentu.

Po zidentyfikowaniu supresorów można przeprowadzić eksperymenty w celu zweryfikowania interakcji z efektorem będącym przedmiotem zainteresowania, w tym pull-down, kolokalizacji immunofluorescencyjnej, nokautu efektorowego lub knockdownu czynników gospodarza zidentyfikowanych na ekranach. Opracowanie tej techniki dla efektorów Chlamydia pozwoliło na przyspieszoną wstępną charakterystykę białek efektorowych i pomogło skoncentrować nasze wysiłki na wyjaśnieniu podstawowych mechanizmów molekularnych, które pośredniczą w interakcjach patogenów gospodarza.