Szybkie oczyszczanie optyczne do półwysokoprzepustowej analizy sferoidów nowotworowych

Moje laboratorium specjalizuje się w trój- i czterowymiarowym modelowaniu nowotworów. Modele sferoidalne guzów są szeroko stosowane w biologii i odkrywaniu leków. Jednak istniejące protokoły zbierania danych z tych eksperymentów są drogie, trudne i ograniczone.

Protokół ten wymaga łatwo dostępnych chemikaliów i sprzętu i nie jest bardzo pracochłonny w porównaniu z obecnymi metodami, które zapewniają podobne wyniki. Protokół ten został opracowany tak, aby był stosunkowo łatwy do wdrożenia dla początkujących i odporny na drobne błędy, ponieważ wiele kroków jest odwracalnych. Zacznij od zważenia 0,5 grama niskotopliwej agarozy w szklanej butelce.

I dodaj 25 mililitrów PBS. Rozpuść agarozę, gotując roztwór w kuchence mikrofalowej przez 30 do 60 sekund z zamkniętą pokrywką i ciągłym wirowaniem. Zważ dziewięć gramów N, N, N'N'Tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiaminy, 22 gramy mocznika, 44 gramy sacharozy, 0,1 grama Triton X-100 i 24,9 grama wody dejonizowanej.

Podgrzej roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 56 stopni Celsjusza ze stałym mieszaniem. Po rozpuszczeniu kryształów odstaw roztwór w temperaturze pokojowej, aby pęcherzyki powstałe podczas mieszania mogły wypłynąć na powierzchnię. Generuj sferoidy za pomocą metody nakładki agarozowej opisanej w manuskrypcie tekstowym.

Odetnij końcówkę jednomililitrowej końcówki pipety za pomocą skalpela, aby powiększyć otwór. Za pomocą pipety odessać sferoidy z dołków i przenieść je do przezroczystej stożkowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Wiele sferoid z tych samych warunków można połączyć w tej samej rurze.

Umyj sferoidy dwukrotnie w jednym mililitrze PBS, a następnie dodaj neutralny 4% wstępnie podgrzany roztwór paraformaldehydu i inkubuj sferoidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 20 minutach usuń roztwór paraformaldehydu i przemyj sferoidy dwukrotnie jednym mililitrem PBS. Następnie w celu barwienia przenieś do 15 sferoid do probówki PCR o pojemności 200 mikrolitrów za pomocą pipety.

Przepuszczalność komórek za pomocą 200 mikrolitrów 0,5% Triton X-100 w PBS. Umieść probówki PCR w 50 mililitrowych, zakręć probówki i przykryj probówkę folią aluminiową i inkubuj sferoidy w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem. Po dwóch godzinach zastąp roztwór 200 mikrolitrami buforu do rozcieńczania przeciwciał i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia usuń bufor rozcieńczający przeciwciała przed dodaniem 75 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa i pół dnia. Po inkubacji usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć sferoidy 200 mikrolitrami PBS, zawierającymi 0,1% Tween i 0,1% Triton X-100 lub PBS-TT. Następnie inkubować z 200 mikrolitrami PBS-TT przez cztery godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń PBS-TT przed dodaniem 100 mikrolitrów przeciwciała wtórnego i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa i pół dnia. Po inkubacji usunąć supernatant i przemyć dwukrotnie PBS-TT, a następnie inkubować z 200 mikrolitrami PBS-TT przez cztery godziny. Do montażu użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, przenieś utrwalone i pobarwione sferoidy do probówek PCR o pojemności 500 mikrolitrów, po jednej probówce na stan.

Zastąp roztwór 200 mikrolitrami 2% płynnego żelu agarozowego i odwiruj na szybkim wirowaniu, ze stałą maksymalną prędkością, w temperaturze pokojowej, przez 30 sekund. Zassać sferoidy w 50 mikrolitrach płynnego żelu agarozowego i dozować do studzienki 24-dołkowej szklanej płytki dolnej. Zanim żel stwardnieje, oddziel sferoidy za pomocą końcówki pipety w otaczającym żelu i upewnij się, że sferoidy są pokryte żelem.

Następnie zanurz żel, dodając 500 mikrolitrów roztworu klarującego na studzienkę i inkubuj w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez 24 godziny przed obrazowaniem. Do obrazowania należy wybrać obiektyw o odległości roboczej wystarczająco dużej, aby objąć całą sferoidę, w tym wysokość montażu sferoidy w naczyniu. Aby zidentyfikować płaszczyznę równikową, dostosuj ostrość, aż zostanie osiągnięta największa powierzchnia w płaszczyźnie XY, a następnie zobrazuj z wymaganą wartością procentową mocy lasera, napięciem detektora, wzmocnieniem i ustawieniami przesunięcia.

W przypadku obrazów trójwymiarowych ustaw początek i koniec sferoid oraz wybierz odpowiednią intensywność sygnału na różnych głębokościach Z, korzystając z ustawień korekcji intensywności Z. Badanie to przedstawia porównanie oczyszczonych i nieoczyszczonych sferoid ludzkiego czerniaka FUCCI w porównaniu ze sferoidami zamontowanymi na PBS. Rozwiązanie czyszczące zapewnia obrazy o wysokiej wyrazistości przy minimalnych zniekształceniach rozmiaru.

Rozwiązanie oczyszczające pozwala ponadto na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości szczegółów na poziomie komórkowym w głębszych sferoidach bez konieczności przeprowadzania sekcji histologicznej. Dzięki trójwymiarowym obrazom konfokalnym można uzyskać szczegóły na poziomie komórkowym na głębokości 200 mikronów. Ponadto pokazano porównanie sferoidy z kriosekcją i oczyszczonym otworem, barwionej na obecność pimonidazolu i p27kip1.

Barwienie pimonidazolem pokazuje niedotleniony obszar sferoidy, a barwienie p27kip1 oznacza zatrzymanie cyklu komórkowego i barwienie jądra DAPI. Głębsza penetracja i mniejsze rozproszenie pozwalają na lepsze odwzorowanie trójwymiarowej struktury sferoidalnej przy minimalnych stratach światła. Pokazane jest trójwymiarowe odwzorowanie sferoid FUCCI, barwionych DRAQ7.

Roztwór czyszczący ma minimalny wpływ na rozmiar sferoidy. Średnica sferoidy została zdefiniowana na podstawie kuli o takim samym polu przekroju poprzecznego jak sferoida. Zaobserwowano, że sferoidy nieznacznie zwiększyły swój rozmiar w ciągu pierwszych sześciu godzin, na co wskazuje zmiana średnicy między 2% a 6%W przeciwieństwie do tego, po 24 do 72 godzinach, sferoidy powróciły do rozmiaru w przybliżeniu równego odpowiadającemu rozmiarowi w PBS po utrwaleniu paraformaldehydu.

Ważne jest, aby odczekać co najmniej 24 godziny przed obrazowaniem, aby roztwór klarujący zrównoważył się ze sferoidami i żelem. Protokół ten pozwala praktykom na szybkie zbieranie danych z dużej liczby sferoid, co pozwala na szczegółową ilościową analizę matematyczną i statystyczną, która zapewnia szczegółowy wgląd w biologię.