Użycie elektrody bipolarnej do stworzenia mysiego modelu padaczki skroniowej poprzez elektryczne rozppalenie ciała migdałowatego

W protokole tym zaproponowano model padaczki, w której pochodzeniu występuje ciało migdałowate. Otwiera to drogę do badania mezjalnych struktur płata skroniowego. Model ten może być interpretowany jako podstawa eksperymentu.

Ponieważ protokół ten jest tanią i wydajną metodą, można go szybko przeprowadzić w większości laboratoriów. Procedurę zademonstruje Yongchang Lu, doktorant w naszym laboratorium. Zacznij od zebrania wstępnie przygotowanych elementów, zaczynając od dwucentymetrowych kawałków drutu wolframowego pokrytego teflonem o średnicy niedźwiedzia 76,2 mikrometra.

Jeden kawałek srebrnego drutu o średnicy niedźwiedzia 127 mikrometrów o tej samej długości i jeden zestaw dwóch na dwa kołki linowe. Użyj zapalniczki, aby spalić jeden koniec każdego drutu wolframowego, aby usunąć pięć milimetrów powłoki izolacyjnej. Obierz odcinek bardzo cienkiego drutu wielożyłowego.

Rozwiń od dołu do górnego końca, gdzie zaczyna się, kontynuując do góry. Połącz ten bardzo cienki drut i drut wolframowy, ściskając jeden koniec i delikatnie skręcając drugi, umożliwiając łatwe splatanie ze sobą dwóch materiałów. Delikatnie pociągnij, aby upewnić się, że druty są szczelnie owinięte i odetnij nadmiar bardzo cienkiego drutu.

Staraj się, aby drut wolframowy był prosty przez cały proces. Przymocuj kołek linowy do zacisku na stole spawalniczym dłuższym bokiem kołków skierowanym na zewnątrz. Użyj igły strzykawki, aby nabrać trochę pasty lutowniczej i nałóż ją na kołki.

Podgrzej palnik spawalniczy do 320 stopni Celsjusza. Rozpuść i posmaruj trochę bezołowiowego drutu cynowego za pomocą końcówki palnika. Załóż górny koniec drutu wolframowego na jedną igłę kołków linowych i użyj lutu na palniku, aby przymocować drut wolframowy do kołka.

Przyspawaj kolejny drut wolframowy i kolejny srebrny drut do kołka linowego w ten sam sposób, tak aby każdy drut odpowiadał igły. Wytnij dwie rurki termokurczliwe nieco dłuższe niż górny koniec drutu wolframowego. Umieść je na złączu lutowanym dwóch drutów wolframowych, upewniając się, że część przewodząca jest całkowicie pokryta rurką, tak aby obwód dwóch drutów wolframowych nie był umieszczony szeregowo.

Wyjmij elektrodę ze stołu spawalniczego clamp i delikatnie przytrzymaj elektrodę dużymi szczypcami, ponieważ elektrody mogą łatwo stracić swój kształt podczas podgrzewania rurki termokurczliwej. Użyj zacisku o dobrej przewodności cieplnej z nieco większą siłą. Włącz kanał powietrzny i podgrzewaj, aż osiągniesz temperaturę 320 stopni Celsjusza.

Przedmuchuj rurkę termokurczliwą przez kilka sekund, aż zostanie dokręcona. Wzmocnij elektrodę klejem topliwym. Przytrzymaj dwa druty wolframowe i skręć je razem, trzymając ich końce osobno.

Przytnij skręcone druty wolframowe do około 10 milimetrów długości, tak aby odstęp na końcach nie przekraczał 0,5 milimetra. Sprawdź elektrody za pomocą multimetru, umieszczając jeden pręt multimetru po niespawanej stronie kołków liny i delikatnie dotykając końcem drutu wolframowego lub drutu srebrnego do drugiego pręta. Sprawdzanie, czy obwód jest płynny.

Upewnij się, że linie nie są umieszczone szeregowo. Oderwij pięć milimetrów powłoki izolacyjnej na każdym końcu, aby odsłonić metalowy drut w środku. Dodaj odcinek rurki termokurczliwej do każdego przewodu rozrusznika.

Zespawaj każdy przewód za pomocą wtyczki złącza urządzenia EEG. Rurkę termokurczliwą obkurczyć gorącym powietrzem. Dodaj odcinek rurki termokurczliwej do każdego drutu wirnika.

Skręć ze sobą przewodzące części czerwonego i pomarańczowego drutu i przyspawaj je do złącza i głowicy, aby pasowały do kołka liny. Przyspawaj pozostałe dwa druty na głowicy do każdego złącza. Zważ mysz.

Gdy mysz jest w pełni znieczulona, ogol włosy od oka do ucha maszynką do golenia. Umieść mysz na ramce stereotaktycznej. Włóż przednie górne zęby do siekacza i włóż oba paski do uszu na równą głębokość do uszu.

Nałóż maść do oczu z erytromycyną na oczy, aby zapobiec suchości i ślepocie spowodowanej jasnym światłem podczas zabiegu. Zdezynfekuj obszar operacyjny co najmniej trzy razy naprzemiennie wacikami z jodoforem i 75% alkoholem. Wykonaj nacięcie podłużne, aby całkowicie odsłonić obszar operacyjny lub wykonaj trójkątne nacięcie, o ile odsłania przednie i tylne ciemiączka oraz miejsca implantacji elektrod.

Zwiń mały kawałek bawełny w kulkę i zwilż go 3% nadtlenkiem wodoru. Usuń tkankę miękką przyczepioną do czaszki, delikatnie pocierając odsłonięty obszar małym wacikiem, aż zobaczysz przednie i tylne ciemiączko. Dostosuj wysokość przednią i tylną tak, aby ciemiączko przednie i tylne było poziome.

Rozważ położenie przedniego ciemiączka jako początek osi. Przymocuj ze stali nierdzewnej do lewej czaszki móżdżku. Ustaw współrzędne rozpałki ciała migdałowatego z bregmy i dostosuj urządzenie stereotaktyczne, aby zlokalizować to miejsce i oznaczyć je.

Wywierć otwór w miejscu marszu wiertłem do czaszki o średnicy 0,5 milimetra. Przymocuj elektrody do pręta ustalającego urządzenia stereotaktycznego. Umieść elektrodę pionowo nad otworem i powoli obniż pozycję do minus 4.9 milimetra.

Owiń srebrny drut wokół trzykrotnie. Uważaj, aby nie potrząsnąć korpusem elektrody podczas pracy. Wymieszaj cement dentystyczny i delikatnie nałóż go na elektrodę i powierzchnię czaszki.

Gdy cement dentystyczny stwardnieje, zmodyfikuj zewnętrzną stronę, aż cement otaczający stałą elektrodę zamieni się w stożek. Następnie zwolnij elektrodę z urządzenia stereotaktycznego. Wyjmij mysz i umieść ją z powrotem w klatce.

Trzymanie go oddzielnie od innych myszy. Umieść mysz w specjalnie zaprojektowanym pudełku z ślizgowymi łączącymi elektrodę na głowie myszy z urządzeniem EEG. Przeprowadź przez otwór w pokrywie pudełka i dostosuj długość pozostawioną w pudełku, aby umożliwić swobodne poruszanie się myszy.

Włącz urządzenie EEG i upewnij się, że działa poprawnie. Ustaw parametry stymulatora tak, aby dostarczały jednomilisekundowe monofazowe impulsy fali prostokątnej o częstotliwości 60 Hz przez jedną sekundę przez 10 cykli stymulacji. Zacznij od natężenia prądu 50 mikroamperów dla pierwszej stymulacji.

Monitoruj EEG po wyładowaniu charakteryzującym się skokami o wysokiej częstotliwości. Jeśli nie zaobserwuje się wyładowania po wyładowaniu, dodaj 25 mikroamperów do następnego bodźca i kontynuuj ten proces co 10 minut, aż do zaobserwowania wyładowania po wyładowaniu i będzie trwało pięć sekund. Stymuluj mysz określonym natężeniem prądu co 15 minut, nie częściej niż 20 razy dziennie.

Monitoruj reakcje behawioralne na bodziec. Operację wszczepienia elektrody przeprowadzono na sześciu zdrowych dorosłych samcach C57 czarnych 6 myszach, a stymulację elektryczną wykonano dwa tygodnie po operacji. Poziom napadów behawioralnych stopniowo wzrastał wraz ze wzrostem liczby bodźców i rejestrowano liczbę bodźców wymaganych do całkowitego rozpalenia.

EEG po wyładowaniach trwało od pięciu do 15 sekund. Następnie nasiliły się samoistne wyładowania wewnątrzczaszkowe i zaczęły się objawy behawioralne. Czas trwania napadu był zwykle krótszy niż jedna minuta, co zmniejsza ryzyko zgonu z powodu ciężkich drgawek prowadzących do bezdechu.

Ekspresję c-Fos w tkance mózgowej wykryto za pomocą immunohistochemii dwie godziny po całkowitym rozpałszczeniu. Wyniki pokazują, że ekspresja c-Fos w ipsilateralnym ciele migdałowatym znacznie wzrosła, weryfikując wykonalność tego modelu. Odstęp między końcami drutu wolframowego nie powinien przekraczać pół milimetra, w przeciwnym razie nie przedostanie się przez otwór mózgowy.

Długość elektrody nie powinna być zbyt długa, w przeciwnym razie wpłynie to na aktywność myszy.