Name: Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Poznaj standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej opartej na krążącym DNA wolnym. Metoda zmniejsza zmienność między laboratoriami i poprawia precyzję w badaniach onkologicznych oraz zastosowaniach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) za wsparcie i następujący grant na projekt: Platforma LB CIBERONC: platforma CIBERONC do standaryzacji i promocji płynnej biopsji. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Uprzednie zatwierdzenie etyczne zostało uzyskane od uczestniczących ośrodków przed pobraniem próbek krwi. Poniższe protokoły izolacji surowicy i osocza wykonano zgodnie z zasadami etycznymi badań biomedycznych.
UWAGA: Wcześniejsze rozważania przed rozpoczęciem protokołu są podane tutaj. W przypadku wykorzystywania próbek ludzkich w badaniach biomedycznych wymagana jest uprzednia zgoda etyczna, z odpowiednią świadomą zgodą. Do obsługi próbek krwi wymagana jest komora bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Przez cały czas trwania zabiegu należy nosić fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary, aby uniknąć zakażenia patogenami przenoszonymi przez krew. Do przetworzenia próbek surowicy potrzeba co najmniej 30 minut. Po ekstrakcji krwi w probówkach bez antykoagulantu należy utrzymywać w temperaturze pokojowej (RT) przez 30-45 minut, aby umożliwić tworzenie się skrzepów. Przygotowanie osocza wymaga co najmniej 40 minut, a próbki powinny być przetwarzane w ciągu 4 godzin od momentu ekstrakcji w przypadku stosowania probówek z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) lub w ciągu 24-48 godzin w przypadku stosowania probówek do pobierania stabilizujących komórki lub określonych probówek do pobierania DNA bez komórek. Jednak według niektórych producentów próbki są stabilne do 2 tygodni w tych specjalistycznych probówkach. Ważne jest, aby sprawdzić, czy nie ma hemolizy, która nada frakcji osocza lub surowicy czerwonawy wygląd. Zapoznaj się z sekcją dotyczącą rozwiązywania problemów, aby zapoznać się z próbkami hemolizy w dyskusji.
1. Przygotowanie surowicy do badań biopsji płynnej
UWAGA: Całkowity czas potrzebny do wykonania tego kroku to 30 minut (Rysunek 1).
<ol>
	<li>Ekstrahować 4-10 ml krwi w probówkach niezawierających antykoagulantu (czerwona lub czerwona/szaro-nasadka) i utrzymywać w temperaturze pokojowej przez 30-45 minut. Próbki te należy przetwarzać w ciągu 4 godzin od momentu ekstrakcji.</li>
	<li>Zapisz godzinę i datę pobrania próbki oraz identyfikację osoby (ID) w odpowiednio zaprojektowanej bazie danych próbek.</li>
	<li>Ubrany w fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary, odwirowywać probówkę zawierającą świeżą krew w temperaturze pokojowej (15 °C-25 °C) przez 10 minut w temperaturze 1 600 (± 150) x g, z zastosowaniem maksymalnej przerwy.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki; górna faza supernatantu surowicy będzie przezroczysta i żółtawa (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Sprawdź, czy próbka wykazuje oznaki hemolizy (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3) i w razie potrzeby zarejestruj obecność hemolizy.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przenieść surowicę do probówek zbiorczych o pojemności 250 μl podwielokrotności. 
	UWAGA: Objętość podwielokrotności musi być dostosowana do wymagań badania.</li>
	<li>Natychmiast zamrozić surowicę w pozycji pionowej w pojemniku do przechowywania w temperaturze -80 °C i zanotować czas przechowywania próbki.</li>
	<li>Sprawdzić, czy próbki zostały przetworzone w wymaganym czasie 4 godzin.</li>
</ol>
2. Przygotowanie osocza do badań nad biopsją płynną
UWAGA: Całkowity czas potrzebny do wykonania tego kroku to 40 minut (Rysunek 4).
<ol>
	<li>Ekstrahuj 4-10 ml krwi w probówkach zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Próbki należy przetworzyć w ciągu 4 godzin od momentu ekstrakcji.</li>
	<li>Zapisz datę i godzinę pobrania próbki oraz identyfikator podmiotu w odpowiednio zaprojektowanej bazie danych próbek.</li>
	<li>Ubrany w fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary, odwirować probówkę EDTA w temperaturze RT (15 °C-25 °C) przez 10 minut przy 1 600 (± 150) x g, z zastosowaniem maksymalnej przerwy. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z innych probówek zbiorczych należy zapoznać się z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Po odwirowaniu supernatant osocza będzie przezroczysty i żółtawy. Sprawdź, czy próbka wykazuje oznaki hemolizy (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3) i przenieś osocze (supernatant) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml bez naruszania warstwy komórkowej za pomocą jednorazowej pipety serologicznej (lub jednorazowej pipety z bańką lub pipet p1000 z końcówką filtrującą). Pozostaw niewielką resztkową objętość osocza nad warstwą komórek (około 5 mm).</li>
	<li>Jeśli zaobserwuje się hemolizę, wyrzuć próbkę do dalszych analiz. (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Zapoznaj się z sekcją dotyczącą rozwiązywania problemów w dyskusji, aby ocenić hemolizę.</li>
	<li>Odwirować osocze w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej (15 °C-25 °C) przez 10-20 minut przy 3 000 (±150) x g. Wykonaj ten krok, aby usunąć wszelkie pozostałości nienaruszonych krwinek przeniesionych z pierwszego etapu wirowania.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie wyjąć probówkę z wirówki i przenieść 1-4 ml osocza do 1-4 ml polipropylenowych fiolek kriogenicznych za pomocą jednorazowej pipety serologicznej (lub jednorazowej pipety gruszkowej lub pipet p1000 z końcówką filtrującą). Pozostała objętość osocza (około 0,3 ml lub 7 mm wysokości) musi być pozostawiona na dnie probówki, aby uniknąć zanieczyszczenia osocza krwinkami (<silna klasa="xfig">Ryc. 5).</li>
	<li>Natychmiast zamrozić osocze w pozycji pionowej w pojemniku do przechowywania w temperaturze -80 °C i zapisać czas przechowywania próbki. Sprawdzić, czy próbki zostały przetworzone w wymaganym czasie 4 godzin.</li>
	<li>Zbierz warstwę komórkową (kożuchowiec) za pomocą P1000 i przefiltrowanej końcówki i przenieś ją do probówki o pojemności 2 ml. Natychmiast zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Alix-Panabières, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+exosomes+as+liquid+biopsy+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144(2020).</li>
<li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%3A+Genotyping+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA.</a> Nature Medicine. 4 (6), (2014).</li>
<li>Heitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+a+practical+implementation+of+circulating+tumor+DNA+mutation+testing+in+metastatic+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ESMO+Open%22%5BJournal%5D)">Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer.</a> ESMO Open. 7 (2), 100399(2022).</li>
<li>Gennari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESMO+Clinical+Practice+Guideline+for+the+diagnosis%2C+staging+and+treatment+of+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%3A+Official+Journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).</li>
<li>Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+monitor+hemolysis+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple method to monitor hemolysis in real time.</a> Scientific Reports. 10 (1), 5101(2020).</li>
<li>Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+enters+the+clinic+-+implementation+issues+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).</li>
<li>Sidstedt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+mechanisms+of+hemoglobin%2C+immunoglobulin+G%2C+and+whole+blood+in+digital+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).</li>
<li>Maass, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sampling+to+sequencing%3A+A+liquid+biopsy+pre-analytic+workflow+to+maximize+multi-layer+genomic+information+from+a+single+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube.</a> Cancers. 13 (12), 3002(2021).</li>
<li>Greytak, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonizing+cell-free+DNA+collection+and+processing+practices+through+evidence-based+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).</li>
<li>Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+influence+quality+and+yield+of+circulating-free+DNA%3A+A+systematic+review+of+the+methodology+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature.</a> Heliyon. 4 (7), 00699(2018).</li>
<li>Boissier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrifuge+brake+impacts+neither+routine+coagulation+assays+nor+platelet+count+in+platelet-poor+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).</li>
<li>Johansson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+and+quality+controls+when+analyzing+cell-free+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078(2019).</li>
<li>Casas-Arozamena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+uterine+aspirates+and+cfDNA+as+an+integrative+liquid+biopsy+strategy+in+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585(2020).</li>
<li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li>
<li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li>
<li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612(2021).</li>
<li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+%28pre%29analytical+work+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li>
<li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li>
<li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ESMO+Open%22%5BJournal%5D)">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060(2021).</li>
</ol>

Beatriz Bellosillo (BB): BB otrzymała honoraria za rolę prelegenta, konsultanta lub doradcy od firm Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer i BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL otrzymała honoraria za rolę mówcy, konsultanta lub doradcy od Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline i Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT otrzymała honoraria za rolę mówcy, konsultanta lub doradcy od firm Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM i ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): otrzymał honoraria za rolę prelegenta, konsultanta lub doradcy od firm Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly i Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) informuje, że otrzymał granty badawcze związane z tym badaniem od Novartis oraz granty badawcze niezwiązane z tym badaniem od AstraZeneca i Beigene. Pozostali autorzy nie mają żadnych informacji na temat manuskryptu.

Płynna biopsja ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych momentach leczenia raka. Po pierwsze, przy diagnozie w celu zidentyfikowania markerów molekularnych guza, które sugerowałyby obecność potencjalnej zmiany nowotworowej, która może być dalej badana klinicznie. Po drugie, podczas leczenia w celu monitorowania choroby w czasie rzeczywistym, oceny odpowiedzi molekularnej na leczenie, ewolucji klonalnej i wczesnego wykrywania nawrotów choroby lub oporności na leczenie. Wreszcie, po leczeniu chirurgicznym, jako narzędzi...

Termin "płynna biopsja" został zdefiniowany w 20101 jako obecność cząsteczek (np. białka, kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), kwasu rybonukleinowego (RNA)), komórek lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (np. egzosomów) we krwi i innych płynach ustrojowych, które pochodzą z pierwotnego guza. Stosowanie próbek z płynnej biopsji zrewolucjonizowało badania nad onkologią translacyjną, ponieważ biopsje tkanek, ograniczone do określonego regionu w określonym momencie, mogą pomijać odpowiednie klony ze względu na niejednorodność guza. Ponadto płynna biopsja odgrywa istotną rolę w typach nowotworów, w których tkanka pierwotna jest rzadka lub niedostępna, ponieważ pozwala uniknąć inwazyjnej biopsji, zmniejszając koszty i ryzyko dla pacjentów. Co więcej, charakterystyka molekularna guza stale ewoluuje, głównie ze względu na ciśnienie terapii, a próbki z płynnej biopsji mogą uchwycić dynamikę klonalną guza, ponieważ można je pobierać wzdłużnie, w różnych okresach klinicznych i terapeutycznych choroby, takich jak wartość wyjściowa, leczenie, najlepsza odpowiedź i postęp choroby lub nawet przed. Koncepcja "płynnej biopsji w czasie rzeczywistym" oznacza, że dynamiczne zmiany w guzie mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym, co umożliwia medycynę precyzyjną w tej chorobie. Płynna biopsja ma wiele potencjalnych zastosowań w klinice, w tym badania przesiewowe i wczesne wykrywanie raka, monitorowanie choroby w czasie rzeczywistym, wykrywanie minimalnej choroby resztkowej, badanie mechanizmów oporności na leczenie oraz stratyfikacja pacjentów na poziomie terapeutycznym1. Wczesne wykrycie nawrotu i progresji choroby jest niezaspokojoną potrzebą kliniczną w wielu typach nowotworów i jest kluczowym czynnikiem zwiększającym przeżywalność i jakość życia pacjentów z rakiem. Rutynowe metody obrazowania i rozpuszczalne markery nowotworowe mogą nie mieć czułości i/lub swoistości wymaganych do tego zadania. W związku z tym w praktyce klinicznej pilnie potrzebne są nowe markery predykcyjne, takie jak te oparte na krążących wolnych kwasach nukleinowych.
Rodzaje próbek, które są używane do badań biopsji płynnej, obejmują między innymi próbki krwi, moczu, śliny i kału. Innymi próbkami specyficznymi dla nowotworu mogą być aspiraty komórkowe, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn opłucnowy, torbiele i wodobrzusze, plwocina i sok trzustkowy2. Te pierwsze płyny mogą zawierać różnego rodzaju materiały pochodzące z raka, krążące komórki nowotworowe (CTC) lub fragmenty, takie jak egzosomy i bezkomórkowe krążące DNA guza (ctDNA). Kwasy nukleinowe mogą być zamknięte w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV) lub uwalniane do płynów ustrojowych z powodu śmierci i uszkodzenia komórki. Krążące wolne DNA (cfDNA) jest głównie uwalniane do krwiobiegu z komórek apoptotycznych lub martwiczych i jest obecne u wszystkich osób, wykazując podwyższony poziom w chorobach zapalnych lub onkologicznych3. Egzosomy to małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (~30-150 nm) wydzielane przez komórki zawierające kwasy nukleinowe, białka i lipidy. Pęcherzyki te stanowią część międzykomórkowej sieci komunikacyjnej i są powszechnie spotykane w wielu rodzajach płynów ustrojowych2. Kwasy nukleinowe zamknięte w EV są chronione przed surowym środowiskiem w płynach ustrojowych, zapewniając w ten sposób bardziej niezawodny sposób badania tych cząsteczek w warunkach płynnej biopsji.
Ogólnie rzecz biorąc, poziomy krążących kwasów nukleinowych w próbkach płynnych biopsji są bardzo niskie, dlatego potrzebne są czułe metody do wykrywania, takie jak cyfrowy PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Postępowanie przedanalityczne nad próbką ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia lizie komórek krwi i uwolnieniu nienaruszonego DNA, powodując zanieczyszczenie cfDNA genomowym DNA. Ponadto należy zachować ostrożność podczas ekstrakcji próbek, aby uniknąć obecności inhibitorów metod analizy opartej na enzymach.
Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną metodę pobierania i przechowywania próbek osocza i surowicy, która jest kluczowym pierwszym krokiem dla dalszych zastosowań opartych na płynnej biopsji, w tym analiz krążących kwasów nukleinowych.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówki Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>Można użyć dowolnych standardowych probówek/urządzeń</td></tr><tr><td>10 ml jednorazowych pipet serologicznych</td><td>BIOFIL</td><td>GSP010010</td><td>Można użyć dowolnych standardowych probówek/urządzeń</td></tr><tr><td>10 ml Vacutainer K2 EDTA</td><td>Becton Dickinson</td><td>367525</td><td>Probówki te mogą być używane do pobierania osocza</td></tr><tr><td>15 ml polipropylenowe probówki wirówkowe</td><td>BIOFIL</td><td>CFT411150</td><td>Można użyć dowolnych standardowych probówek/urządzeń</td></tr><tr><td>3,5 ml BD Vacutainer bez antykoagulantu</td><td>Becton Dickinson</td><td>368965</td><td>Do pobierania surowicy można użyć probówek o pojemności 8,5 lub 3,5 ml</td></tr><tr><td>Fiolka kriogeniczna z polipropylenu, z okrągłym dnem, wolnostojąca</td><td>Corning</td><td>430662</td><td>Można użyć dowolnych standardowych probówek/urządzeń</td></tr> 4 <tr><td>ml Vacutainer K2 EDTA Becton</td><td>Dickinson</td><td>367864</td><td>Probówki te mogą być używane do pobierania osocza</td></tr><tr><td>4200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td>Dostępnych jest kilka metod oznaczania ilościowego z&nbsp; specyficznym zastosowaniem do</td></tr><tr><td>jednorazowych pipet serologicznych cfDNA 5 ml</td><td>BIOFIL</td><td>GSP010005</td><td>Można użyć dowolnych standardowych probówek/urządzeń</td></tr><tr><td>8,5 ml BD Vacutainer bez antykoagulantu</td><td>Becton Dickinson</td><td>366468</td><td>Do zbierania surowicy można użyć probówek o pojemności 8,5 lub 3,5 ml</td></tr><tr><td>, o wydajności ~3000 x g z obrotowym wirnikiem kubełkowym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST 16 &nbsp; 10688725</td><td>Można użyć dowolnych standardowych rur / sprzętu</td></tr><tr><td>Pudełka do przechowywania zamrażarki na 1&ndash; 4 mL fiolki kriogeniczne</td><td>Corning</td><td>431120</td><td>Te pudełka są potrzebne w przypadku używania fiolek 4 ml do przechowywania</td></tr><tr><td>końcówek do pipet p1000</td><td>CORNING</td><td>4809</td><td>Można użyć dowolnych standardowych probówek/urządzeń</td></tr><tr><td>Zestaw krążących kwasów nukleinowych QIAamp</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Każdy dostępny na rynku zestaw, który jest specyficzny do izolacji cfDNA, może być używany z tym protokołem oczyszczania krwi.</td></tr><tr><td>Streck&nbsp; Bezkomórkowe probówki DNA BCT CE 10 ml</td><td>Streck</td><td>218997</td><td>Probówki te mogą być używane do pobierania osocza</td></tr><tr><td>Zamrażarka temperatury (-80 &deg; C)</td> <td>ESCO</td><td>2180104</td><td>Można użyć dowolnych standardowych rur / urządzeń</td></tr></tbody></table>

standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań dna wolnych od krążenia

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

Termin płynna biopsja (LB) odnosi się do cząsteczek takich jak białka, DNA, RNA, komórki lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe we krwi i innych płynach ustrojowych, które pochodzą z guza pierwotnego i/lub przerzutowego. LB stała się podstawą badań translacyjnych i zaczęła stawać się częścią klinicznej praktyki onkologicznej, stanowiąc minimalnie inwazyjną alternatywę dla biopsji litej. LB umożliwia monitorowanie guza w czasie rzeczywistym poprzez minimalnie inwazyjną ekstrakcję próbki, takiej jak krew. Zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka, obserwację pacjenta w celu wykrycia progresji choroby, ocenę minimalnej choroby resztkowej oraz potencjalną identyfikację progresji molekularnej i mechanizmu oporności. W celu uzyskania wiarygodnej analizy tych próbek, które można zgłosić w klinice, procedury przedanalityczne powinny być dokładnie przemyślane i ściśle przestrzegane. Pobieranie, jakość i przechowywanie próbek to kluczowe kroki, które decydują o ich przydatności w dalszych zastosowaniach. W tym miejscu przedstawiamy ustandaryzowane protokoły z naszego modułu roboczego płynnej biopsji do pobierania, przetwarzania i przechowywania próbek osocza i surowicy do dalszej analizy płynnej biopsji w oparciu o krążące DNA. Przedstawione tutaj protokoły wymagają standardowego sprzętu i są wystarczająco elastyczne, aby można je było zastosować w większości laboratoriów zajmujących się procedurami biologicznymi.

Po odwirowaniu probówek z krwią bez antykoagulantu, górna faza przyjmuje bladożółty kolor i odpowiada frakcji surowicy (Rysunek 2). Frakcję tę ostrożnie pobiera się i rozdziela na alikwoty do późniejszej analizy.
Hemoliza może wystąpić w frakcji osocza lub surowicy, a faza górna będzie miała czerwonawy wygląd, co wskazuje na obecność i stopień hemolizy (Rysunek 3).
Po wirowaniu probówek z EDTA widocznych bę...

Płynna biopsja zrewolucjonizowała nasze podejście do badań translacyjnych w onkologii, a pobieranie, jakość i przechowywanie próbek są kluczowymi krokami dla jej udanego zastosowania klinicznego. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany i zwalidowany protokół dla dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia, który może być stosowany w większości laboratoriów badań translacyjnych.

Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Jest to standardowy protokół przetwarzania i przechowywania próbek krwi do dalszych zastosowań w płynnej biopsji opartej na krążącym wolnym DNA. Jest to pierwszy opublikowany standardowy protokół, chociaż technika ta jest stosowana od kilku lat. Jest łatwy do naśladowania dzięki standardowemu wyposażeniu dostępnemu w większości laboratoriów translacyjnych lub naukowych.Protokół może być wykonany przez cały personel laboratorium. Protokół pomaga ustandaryzować sposób pobierania i przechowywania próbek, co ostatecznie wpłynie na sytuację kliniczną i zmniejszy zmienność między różnymi ośrodkami wykonującymi tę samą lub podobną analizę na dalszych etapach, gdzie precyzja ma ogromne znaczenie. Metoda ta jest szczególnie przydatna w badaniach onkologicznych, a także w zastosowaniach klinicznych.Może być jednak również stosowany w innych chorobach nienowotworowych, w których stosuje się również płynną biopsję. Po odwirowaniu próbki krwi ustalenie, ile osocza lub surowicy należy usunąć, może być trudne, ale przestrzeganie tych konkretnych wskazówek pomoże w tym. Reszta protokołu jest bardzo łatwa do naśladowania przy ograniczonym doświadczeniu w laboratorium.Procedurę zademonstruje Jorge,

a-standardized-liquid-biopsy-preanalytical-protocol-for-downstream

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje procedurę membranową opartą na krzemionce, mającą na celu izolację krążącego wolnego od komórek DNA lub cfDNA z próbki ludzkiego osocza. cfDNA jest obiecującym biomarkerem do diagnozowania i oceny raka.

Izolacja krążącego DNA wolnego od komórek (cfDNA): procedura membranowa na bazie krzemionki w celu ekstrakcji cfDNA z osocza krwi pacjentów z rakiem

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przyjęty w badaniu przesiewowym BioMILD w celu przeprowadzenia testu klasyfikatora sygnatury krążącego mikroRNA do wczesnego wykrywania raka płuc.

Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół techniki nieinwazyjnej płynnej biopsji, w tym pobieranie krwi, separację osocza i kożucha, ekstrakcję cfDNA i DNA linii zarodkowej, kwantyfikację cfDNA lub DNA linii zarodkowej oraz analizę wzbogacania fragmentów cfDNA.

Wykrywanie bezkomórkowego DNA w próbkach osocza krwi pacjentów z rakiem

Ten artykuł opisuje zastosowanie zautomatyzowanego sprzętu do łatwego i efektywnego oddzielania i zbierania substancji, takich jak bezkomórkowe DNA i krążące komórki nowotworowe, z krwi pełnej.

Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

Poznaj standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej opartej na krążącym DNA wolnym. Metoda zmniejsza zmienność między laboratoriami i poprawia precyzję w badaniach onkologicznych oraz zastosowaniach klinicznych.

Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

Przeglądaj więcej filmów