Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia
16 września 2022
Płynna biopsja zrewolucjonizowała nasze podejście do badań translacyjnych w onkologii, a pobieranie, jakość i przechowywanie próbek są kluczowymi krokami dla jej udanego zastosowania klinicznego. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany i zwalidowany protokół dla dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia, który może być stosowany w większości laboratoriów badań translacyjnych.
Jest to standardowy protokół przetwarzania i przechowywania próbek krwi do dalszych zastosowań w płynnej biopsji opartej na krążącym wolnym DNA. Jest to pierwszy opublikowany standardowy protokół, chociaż technika ta jest stosowana od kilku lat. Jest łatwy do naśladowania dzięki standardowemu wyposażeniu dostępnemu w większości laboratoriów translacyjnych lub naukowych.
Protokół może być wykonany przez cały personel laboratorium. Protokół pomaga ustandaryzować sposób pobierania i przechowywania próbek, co ostatecznie wpłynie na sytuację kliniczną i zmniejszy zmienność między różnymi ośrodkami wykonującymi tę samą lub podobną analizę na dalszych etapach, gdzie precyzja ma ogromne znaczenie. Metoda ta jest szczególnie przydatna w badaniach onkologicznych, a także w zastosowaniach klinicznych.
Może być jednak również stosowany w innych chorobach nienowotworowych, w których stosuje się również płynną biopsję. Po odwirowaniu próbki krwi ustalenie, ile osocza lub surowicy należy usunąć, może być trudne, ale przestrzeganie tych konkretnych wskazówek pomoże w tym. Reszta protokołu jest bardzo łatwa do naśladowania przy ograniczonym doświadczeniu w laboratorium.
Procedurę zademonstruje Jorge, technik z naszego laboratorium. Na początek odwiruj probówkę zawierającą świeżą krew w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 1600 razy g, z zastosowaniem maksymalnej przerwy. Ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki.
Górna faza supernatantu surowicy będzie przezroczysta i żółtawa. Sprawdź, czy próbka wykazuje oznaki hemolizy i w razie potrzeby zarejestruj obecność hemolizy. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przenieść surowicę do probówek zbiorczych w postaci podwielokrotności o pojemności 250 mikrolitrów.
Podwielokrotności muszą być prawidłowo oznakowane. Natychmiast zamrozić surowicę w pozycji pionowej w pojemniku do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i zapisać czas przechowywania próbki. Sprawdzić, czy próbki zostały przetworzone w wymaganym czasie czterech godzin.
Odwirować probówkę EDTA w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 1600 razy g, z zastosowaniem maksymalnej przerwy. Po odwirowaniu supernatant osocza będzie przezroczysty i żółtawy. Sprawdź, czy próbka wykazuje oznaki hemolizy i przenieś osocze do 15-mililitrowej probówki wirówkowej bez naruszania warstwy komórkowej za pomocą jednorazowej pipety serologicznej.
Pozostaw niewielką resztkową objętość osocza nad warstwą komórek na wysokości około pięciu milimetrów. Jeśli zaobserwuje się hemolizę, wyrzuć próbkę do dalszej analizy. Odwirować osocze i 15-mililitrową probówkę wirówkową, aby usunąć wszelkie pozostałości nienaruszonych krwinek przeniesionych z pierwszego etapu wirowania.
Ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki, a nie osad komórkowy na dnie probówki, i przenieś od jednego do czterech mililitrów osocza do jednego do czterech mililitrów polipropylenowego biosu kriogenicznego lub Eppendorfów za pomocą jednorazowej pipety serologicznej. Pozostała objętość osocza musi pozostać na dnie probówki, aby uniknąć zanieczyszczenia osocza komórkami krwi. Natychmiast zamrozić osocze w pozycji pionowej w pojemniku do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i zapisać czas przechowywania próbki.
Sprawdź, czy próbki są prawidłowo oznakowane i czy zostały przetworzone w wymaganym czasie czterech godzin. Zbierz warstwę komórkową za pomocą P1000 i przefiltrowanej końcówki i przenieś ją do dwumililitrowej probówki. Natychmiast zamrozić i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Przykład wysokiej jakości ekstrakcji cfDNA, która może być wykorzystana do dalszych zastosowań, jest pokazany tutaj, podczas gdy ten obraz graficzny stanowi przykład nieodpowiedniej próbki o wysokim poziomie zanieczyszczenia genomu. Frakcja osocza lub surowicy musi mieć żółty kolor. Może się to różnić w zależności od konkretnej próbki.
Próbki poddane hemolizie należy wyrzucić. Należy uważać, aby nie usunąć żadnych osadów komórkowych podczas usuwania frakcji osocza. Protokół ten może być również stosowany do innych zastosowań opartych na kwasach nukleinowych i białkach, takich jak wykrywanie niekodujących RNA lub białek w próbkach surowicy i osocza przy użyciu technik wykrywania immunologicznego.
Jest to bardzo standardowa technika stosowana w wielu laboratoriach. Protokół ten pomaga naukowcom ustandaryzować sposób, w jaki przeprowadzamy naszą analizę, ponieważ jest to kluczowy aspekt, niezbędny dla przyszłych zastosowań klinicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia zstandardyzowany protokół przetwarzania i przechowywania próbek krwi do zastosowań w biopsji płynowej, skupiając się na swobodnie krążącej DNA. Protokół jest zaprojektowany tak, aby był łatwy do naśladowania i może być wdrożony w większości laboratoriów badań translacyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Badania translacyjne
Tło
- Biopsja płynowa zmieniła badania translacyjne w onkologii.
- Zbieranie próbek, ich jakość i przechowywanie są krytyczne dla zastosowań klinicznych.
- To pierwszy opublikowany standardowy protokół dla tej techniki.
- Metoda jest stosowana od kilku lat.
Cel badania
- Aby sstandardyzować zbieranie i przechowywanie próbek.
- Aby zmniejszyć zmienność między różnymi centrami przeprowadzającymi podobne analizy.
- Aby zwiększyć precyzję w zastosowaniach klinicznych.
Stosowane metody
- Przetwarzanie próbek krwi.
- Protokoły przechowywania dla swobodnie krążącej DNA.
- Wykorzystanie standardowego sprzętu laboratoryjnego.
- Protokół dostępny dla wszystkiego personelu laboratorium.
Główne wyniki
- Standardowy protokół poprawia przetwarzanie próbek.
- Zmniejsza zmienność w analizie sekwencyjnej.
- Favoryty lepsze wyniki kliniczne w badaniach onkologicznych.
Wnioski
- Protokół jest kluczowy dla zwiększenia wiarygodności zastosowań w biopsji płynowej.
- Standardyzacja pozytywnie wpłynie na praktyki kliniczne.
- Wspiera rosnące zapotrzebowanie na precyzję w badaniach onkologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized preanalytical protocols for liquid biopsy are critical for ensuring reproducible, high-quality circulating-free DNA (cfDNA) samples across translational and clinical research pipelines. This protocol directly addresses variability in sample handling, supporting predictive confidence and enabling robust downstream molecular analyses. Its adoption impacts early discovery, assay development, and translational continuity in oncology and other disease areas utilizing cfDNA.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent cfDNA sample quality for hypothesis-driven biomarker studies.
- Reduces preanalytical variability, supporting functional target validation.
- Facilitates reliable comparison of molecular signatures across cohorts.
Screening & Assay Development
- Provides standardized input material for assay optimization and validation.
- Supports reproducibility and quantitative output in cfDNA-based assays.
- Enables scalable sample processing for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sample handling with requirements for translational biomarker studies.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of cfDNA markers.
- Reduces risk of sample-related artifacts in disease-relevant model systems.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions preanalytical sample handling as a foundational step from early discovery through lead identification and translational research. Its standardization supports robust data generation and cross-study comparability.
- Discovery Biology: Ensures cfDNA integrity for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality samples for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, contamination-minimized inputs for downstream molecular analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation with consistent sample quality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cross-team protocol for cfDNA sample processing in diverse R&D settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cfDNA studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cfDNA-driven programs.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory expertise and adherence to biosafety protocols.
- Needs standard centrifugation and cold storage infrastructure.
- Demands rigorous sample labeling and time-tracking for cross-team standardization.
- Adaptable to various nucleic acid and protein applications in plasma and serum.
- Sample quality is limited by hemolysis and processing time constraints as specified.
