Name: Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Poznaj zintegrowany system sekwencjonowania NGS dla trudnych próbek nowotworowych, łączący reagenty laboratoryjne z narzędziami bioinformatycznymi. Metoda umożliwia dokładną analizę wariantów DNA z biopsji o niskiej jakości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Annette Schlageter za recenzję manuskryptu. Prace te były częściowo wspierane przez CP120017 grantowe z Instytutu Zapobiegania i Badań nad Rakiem w Teksasie (PI: GJL).

Uwaga: Ten protokół opisuje jednoczesne przetwarzanie próbek za pomocą systemu MiSeq NGS, ale może być dostosowany do instrumentu Personal Genome Machine (PGM). W przypadku zalecanego minimalnego wkładu DNA wynoszącego 400 amplifikowalnych kopii matryc, test jest w stanie wytworzyć co najmniej 3,000 razy medianę pokrycia dla każdej z 96 próbek na przebieg NGS i równoważną głębokość pokrycia dla 24 próbek przy użyciu PGM na chipie 318. Metoda wymaga również użycia przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym.
1. Kwantyfikacja funkcjonalna DNA i kontrola jakości (QC)
<ol>
	<li>Odczynniki do rozmrażania: 2x Master Mix, Primer Probe Mix, Inhibition Primer Probe Mix, 6-karboksy-X-rodamina (ROX), Rozcieńczalnik i cztery wzorce krzywej kalibracyjnej ludzkiego genomowego DNA (Standard DNA (50 ng / μl), Standard DNA (10 ng / μl), Standard DNA (2 ng / μl) i Standard DNA (0,4 ng / μl)) (Tabela 1). Wiruj wszystkie odczynniki przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość. Trzymaj 2x master mix na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla całkowitej liczby próbek do badania i dodaj o 10% większą objętość, aby uniknąć niedoborów spowodowanych pipetowaniem. Przygotować mieszankę wzorcową w probówce mikrowirówkowej, używając następujących objętości na próbkę: 5 μl 2x Master Mix, 0,5 μl Primer Probe Mix, 0,5 μl Inhibition Primer Probe Mix, 0,05 μl ROX i 2,95 μl Diluent. Wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.</li>
	<li>Dodać 9 μl mieszanki wzorcowej do studzienek na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Dodaj 1 μl wzorców DNA w dwóch egzemplarzach, aby wygenerować krzywą kalibracyjną. Wymieszać, pipetując pipetę w górę i w dół 5 razy.</li>
	<li>Upewnij się, że próbka kwasu nukleinowego jest dobrze wymieszana przed użyciem. Dodać 1 μl próbki do mieszanki wzorcowej i wymieszać, pipetując 5 razy w górę i w dół.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę, wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.</li>
	<li>Umieścić płytkę w systemie PCR. Przypisz zarówno detektory FAM (kwantyfikacja funkcjonalna), jak i VIC (inhibicja funkcjonalna) dla każdej próbki zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj cykle PCR trwające 10 minut w temperaturze 95 °C i 40 cykli (15 sekund w temperaturze 95 °C, 1 minuta w temperaturze 60 °C).</li>
	<li>Przeanalizuj dane qPCR, generując wykres regresji liniowej dla każdego ze zduplikowanych wzorców DNA przy użyciu protokołów programowych.</li>
	<li>Wykreślić log10 liczby kopii dla każdego wzorca DNA na osi x i odpowiadającą jej wartość FAM Cq na osi y.</li>
	<li>Potwierdzić, że wyniki z próbki kwasu nukleinowego mieszczą się w zakresie dynamicznym krzywej kalibracyjnej wzorców DNA, a następnie obliczyć stężenie nieznanego DNA w "funkcjonalnej" lub możliwej do amplifikacji liczbie kopii na μl od odpowiadającego mu położenia na wzorcowej krzywej odniesienia. Rysunek 1 przedstawia przykłady krzywych kalibracyjnych, które przeszły pomyślnie i nie.</li>
	<li>Określ, czy amplifikacja wystąpiła w każdej reakcji, sprawdzając obecność amplikonu docelowego innego niż ludzki w kanale VIC. 
	Uwaga: Jako kontrola pozytywna, Inhibition Primer Probe Mix zawiera startery specyficzne dla celu egzogennego innego niż ludzki i odpowiadającą im matrycę. Inhibition Primer Probe Mix jest składnikiem mieszanki wzorcowej, która jest dodawana do każdej reakcji, w tym do kontroli bez matrycy (NTC). W przypadku braku inhibitora, produkt PCR dla celu innego niż ludzki powinien być zawsze wykrywany w kanale VIC. "Niewykryte" Cq dla próbki w kanale VIC wskazuje na obecność inhibitorów PCR, które mogą odnieść korzyści z późniejszego oczyszczenia próbki przed dalszym przetwarzaniem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie biblioteki: PCR specyficzny dla genu (GS)
<ol>
	<li>Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla całkowitej liczby próbek do badania i dodaj o 10% większą objętość, aby uniknąć niedoborów spowodowanych pipetowaniem. Przygotować główną mieszankę GS PCR w probówce mikrowirówkowej, używając następujących objętości na próbkę: 5 μl 2x Amplification Master Mix (Tabela 1) i 1 μl Panel Pank Cancer Primer (Tabela 1). Mieszać pipetując w górę i w dół, wirować przez 10 sekund i wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.</li>
	<li>Podwielokrotnić 6 μl głównej mieszanki GS PCR do dołków na 96-dołkowej płytce. Dodać 4 μl każdej próbki kwasu nukleinowego do indywidualnych studzienek. Do innych studzienek dodać 4 μl kontroli FFPE (tabela 1), 4 μl kontroli wielowariantowej (tabela 1) i 4 μl wody wolnej od nukleaz w celu uzyskania proceduralnego NTC. Z każdym dodatkiem wymieszaj, pipetując pipetowanie w górę i w dół 5 razy.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę, wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.</li>
	<li>Umieścić płytkę w termocyklerze na następujące cykle PCR: 5 min w temperaturze 95 °C, 2 cykle (15 sekund w 95 °C, 4 minuty w 60 °C), 23 cykle (15 sekund w 95 °C, 4 minuty w 72 °C) i końcowe przedłużenie o 10 minut w temperaturze 72 °C. Utrzymać w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Po wykonaniu kroku 2.4 płytka będzie określana jako płytka GS PCR.</li>
</ol>
3. Przygotowanie biblioteki: Tag PCR
<ol>
	<li>Rozmrażanie odczynników: 2x Index Master Mix (Tabela 1) i Kody Indeksów (Tabela 1). Wirować przez 10 sekund i wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość. 
	Uwaga: Kody indeksowe są wstępnie wymieszane, aby zapewnić unikalny zestaw wskaźników parami (kodów kreskowych) dla każdej próbki.</li>
	<li>Do płytki 96-dołkowej dodać 7,5 μl 2x Index Master Mix i 5,5 μl Index Code do określonego dołka i wymieszać, pipetując 5 razy w górę iw dół.</li>
	<li>Ostrożnie otworzyć płytkę GS PCR i dodać 2 μl produktu GS PCR do nowej płytki z mieszanką wzorcową. Wymieszać, pipetując pipetę w górę i w dół 5 razy. Dla każdej próbki zapisz identyfikator próbki i odpowiadające im kody indeksu parami. Uszczelnij płytkę, wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.</li>
	<li>Umieścić płytkę w termocyklerze i PCR przez 5 minut w temperaturze 95 °C, 10 cykli (30 sekund w temperaturze 95 °C, 30 sekund w temperaturze 55 °C, 1 minutę w temperaturze 72 °C) i końcowe przedłużenie o 10 minut w temperaturze 72 °C. Utrzymać w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Po wykonaniu kroku 3.4 płytka będzie nazywana płytką Tag PCR.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie biblioteki i wybór rozmiaru
<ol>
	<li>Usunąć kulki magnetyczne Library Pure Prep (Tabela 1) i bufor elucyjny (Tabela 1) z 2-8 °C i pozostawić do zrównoważenia do RT przez 30 minut. Dodać 9,6 ml 100% etanolu do pojemnika buforu płuczącego (Tabela 1), zakręcić i wymieszać, kilkakrotnie odwracając butelkę.</li>
	<li>Wirować kulki magnetyczne przez 10 sekund i dodać 11 μl do oddzielnych studzienek 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Otwórz płytkę Tag PCR i dodaj 10 μl produktu Tag PCR do kulek i pipetuj 5 razy. Inkubować mieszaninę przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym (Tabela 1) na 4 minuty. Trzymając 96-dołkową płytkę nadal na stojaku, usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Wyjmij 96-dołkową płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 100 μl buforu płuczącego zawierającego etanol do każdej studzienki i wymieszaj, pipetując 5 razy w górę iw dół. Inkubować przez 2 minuty.</li>
	<li>Umieścić 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty, a następnie wyjąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 4.5, w sumie 2 płukania etanolem, usuwając jak najwięcej roztworu myjącego po drugim praniu.</li>
	<li>Trzymając 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym, susz kulki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij płytkę ze stojaka.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kulki, dodając 20 μl buforu elucyjnego do każdej studzienki i pipetować w górę iw dół 5 razy.</li>
	<li>Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę z powrotem na stojaku magnetycznym na 4 minuty, a następnie ostrożnie wyjmij i przenieś 18 μl klarownego supernatantu do nowego dołka. 
	Uwaga: Na tym etapie procedurę można bezpiecznie zatrzymać, a próbki przechowywać w temperaturze od -15 do -30°C. Aby ponownie uruchomić, przed kontynuowaniem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja biblioteki
<ol>
	<li>Odczynniki Thaw Library Quant (LQ): 2x LQ Master Mix, LQ Primer / Probe Mix, LQ Standard, LQ Positive Control, LQ Dilurent i LQ ROX (Tabela 1). Wiruj przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.</li>
	<li>Korzystając z oczyszczonych produktów bibliotecznych, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie każdej pojedynczej próbki w rozcieńczalniku LQ.
	<ol>
		<li>Dodaj 2 μl (produkt oczyszczony z biblioteki) do 198 μl rozcieńczalnika LQ i mieszaj w górę iw dół za pomocą pipety 10 razy.</li>
		<li>Dodać 2 μl (rozcieńczenie 1:100) do 198 μl rozcieńczalnika LQ i mieszać w górę i w dół za pomocą pipety 10 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość głównej mieszanki LQ dla całkowitej liczby próbek do badania i dodać o 10% większą objętość, aby uniknąć niedoborów spowodowanych pipetowaniem. Przygotować LQ Master Mix w probówce mikrowirówkowej, używając następujących objętości na próbkę: 5 μl 2X LQ Master Mix, 2 μl LQ Primer/Probe Mix, 0,5 μl LQ Standard i 0,5 μl LQ ROX. Mieszać pipetując w górę i w dół, wirować przez 10 sekund i wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość.</li>
	<li>Dodać 8 μl głównej mieszanki LQ do dołka na 96-dołkowej płytki optycznej.</li>
	<li>W oddzielnych studzienkach dodać 2 μl rozcieńczonej biblioteki, 2 μl LQ kontroli pozytywnej i 2 μl rozcieńczalnika LQ (NTC) i wymieszać pipetując 5 razy w górę iw dół. Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną, wiruj przez 10 sekund i wiruj przy 400 x g przez 10 sekund w celu zebrania zawartości.</li>
	<li>Przypisz detektory FAM i VIC do każdej próbki. Przeprowadzić amplifikację PCR w warunkach cyklicznych trwających 5 minut w temperaturze 95 °C i 40 cykli (15 sekund w temperaturze 95 °C, 1 minuta w temperaturze 60 °C).</li>
	<li>Oznaczyć stężenie w każdej próbce (nM) przy użyciu metody porównawczej Cq. Oblicz różnicę między znanym wzorcem LQ (Cq VIC) a nieznaną biblioteką (Cq FAM). Stężenie rozcieńczonej próbki (pM) oblicza się za pomocą następującego równania: 
	[Conclib]nM = 12,5 x 2ΔCq 
	W przypadku stosowania współczynnika rozcieńczenia innego niż 10 000, obliczyć stosunek docelowego współczynnika rozcieńczenia do 10 000 i pomnożyć ten współczynnik przez wynik równania w ppkt 5.7.</li>
</ol>
6. Normalizacja bibliotek i łączenie próbek
<ol>
	<li>Określić medianę stężenia (nM) we wszystkich próbkach (z których każda zawiera unikalny indeks parami), które mają zostać połączone.</li>
	<li>Oznaczyć objętość pojedynczej próbki (μl) do pobrania, mnożąc medianę stężenia we wszystkich próbkach przez 5, a następnie dzieląc przez jej indywidualne stężenie (nM). Zaokrąglij wartość wynikową do najbliższej liczby całkowitej. Objętości okrągłe o wartościach od <2 μl do 2 μl i objętości od >15 μl do 15 μl.</li>
	<li>Dodaj znormalizowaną objętość (μl) dla każdej próbki do pojedynczej probówki mikrowirówkowej, aby utworzyć pulę próbek.</li>
	<li>Obliczyć nowe stężenie dla każdej próbki, używając zaokrąglonych wartości całkowitych, i zapisać wyniki.</li>
	<li>Aby określić stężenie w puli próbek, należy obliczyć sumę wszystkich poszczególnych stężeń i zapisać wynikową wartość (nM).</li>
	<li>Rozcieńczyć pulę próbek do 1,25 nM za pomocą rozcieńczalnika sekwencjonującego (Tabela 1). 
	Uwaga: Na tym etapie procedurę można bezpiecznie zatrzymać, a próbki przechowywać w temperaturze od -15 do -30 °C. Aby ponownie uruchomić, przed kontynuowaniem rozmrozić zamrożone próbki na lodzie.</li>
</ol>
7. Sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Denaturować pulę próbek w obecności PhiX Control v3 (tabela 1) poprzez dodanie następujących składników: 15 μl z puli próbek 1,25 nM, 3 μl z 0,5 nM PhiX i 2 μl z 1 N NaOH. Krótko wymieszać, a następnie krótko odwirować i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić pulę próbek zdenaturowanych na lodzie.</li>
	<li>Dodać 8 μl zdenaturowanej biblioteki do 992 μl wstępnie schłodzonego buforu HT1-Hyb do probówki mikrowirówkowej. Krótko zmieszać, a następnie krótko odwirować, aby zebrać zawartość. Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Dodać 600 μl denaturowanej i rozcieńczonej biblioteki do pozycji #17 wkładu z odczynnikiem.</li>
	<li>Rozmrażanie starterów sekwencjonowania odczytu 1 (tabela 1), starterów sekwencjonowania odczytu indeksu (tabela 1) i odczytu 2 starterów sekwencjonowania (tabela 1). W probówkach do mikrowirówek oddzielnie rozcieńczyć 4 μl starterów sekwencjonowania z 636 μl buforu HT1-Hyb. Uwaga: Bufor HT1-Hyb jest dostarczany z zestawem odczynników do sekwencjonowania (Tabela 1).</li>
	<li>Mieszaj przez wirowanie przez 10 sekund i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby zebrać zawartość. Dodaj 600 μl rozcieńczonych starterów do sekwencjonowania Read 1 do pozycji #18 wkładu z odczynnikiem do sekwencjonowania, 600 μl rozcieńczonych starterów do odczytu indeksu do pozycji #19 i 600 μl rozcieńczonych starterów do sekwencjonowania Read 2 do pozycji #20.</li>
	<li>Załaduj odczynniki na przyrząd NGS (Tabela 1) i ułóż je zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj sekwencjonowanie z sparowanym końcem 2 x 150 cykli.</li>
</ol>
8. Analiza danych
Uwaga: Oprogramowanie instrumentu NGS konwertuje obrazy klastrów na wywołania bazowe i wyniki jakości, a także demultipleksuje wskaźniki parami w celu wygenerowania indywidualnych plików FASTQ (*.fastq.gz) skompresowanych gzip dla każdej próbki. Przed przystąpieniem do analizy zdemultipleksowanych plików czytnik musi pobrać i zainstalować odpowiednie oprogramowanie bioinformatyczne (Tabela 1). Oprogramowanie można zainstalować na komputerze z systemem Windows klasy konsumenckiej i nie wymaga specjalistycznego sprzętu komputerowego ani połączenia z Internetem do przeprowadzenia analizy danych.
<ol>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania na pulpicie.</li>
	<li>Zaloguj się do systemu za pomocą nazwy użytkownika i hasła podanych w instrukcji oprogramowania.</li>
	<li>Otwórz pulpit nawigacyjny projektu i kliknij "Nowy projekt".
	<ol>
		<li>Nazwij projekt i podaj opcjonalny opis projektu. Wybierz docelowy typ panelu NGS i typ instrumentu NGS. Kliknij "Zapisz i kontynuuj".</li>
		<li>Prześlij skompresowane pliki FASTQ dla odczytów do przodu i do tyłu. Nie przesyłaj "nieprzypisanych" FASTQ, które zawierają odczyty, które nie mogły zostać zdemultipleksowane. Kliknij "Zapisz i kontynuuj".</li>
		<li>Wprowadź liczbę funkcjonalnych kopii wejściowych używanych do przygotowania każdej biblioteki, zgodnie z ustaleniami testu funkcjonalnej kwantyfikacji DNA (patrz krok 1 powyżej). Ręcznie dodaj wartości lub skopiuj i wklej wartości z arkusza kalkulacyjnego do tabeli adnotacji. Kliknij "Zapisz i kontynuuj".</li>
		<li>Przejrzyj biblioteki z adnotacjami przesłane do analizy i kliknij "Prześlij analizę", aby rozpocząć analizę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj postęp analizy wyświetlany za pośrednictwem pulpitu nawigacyjnego projektu. 
	Uwaga: Wskazanie stanu zakończenia analizy jest wyświetlane, gdy wyniki są gotowe do przeglądu.</li>
	<li>Przejrzyj przeanalizowane wyniki dla przykładowych wskaźników kontroli jakości, w tym całkowitego pokrycia na bibliotekę, procentu odczytów przechodzących przez filtry, głębokości pokrycia amplikonem i jednolitości. Przejrzyj wywołania wariantów dla każdej sekwencjonowanej biblioteki z dbSNP, COSMIC, 1,000 genomów i innymi źródłami adnotacji na poziomie funkcjonalnym i populacji.</li>
	<li>Eksportuj surowe wyniki jako tabele podsumowań arkuszy kalkulacyjnych, pliki *.bam i pliki *.vcf do długoterminowego przechowywania lub dalszej analizy za pomocą uzupełniających narzędzi informatycznych.</li>
</ol>

<ol><li>Medicines in Development for Cancer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf ">http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf </a> 1-103 (2014).</li>
<li>Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+deamination+is+a+major+cause+of+baseline+noise+in+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing.</a> Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).</li>
<li>Choudhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+integrated+clinical+workflow+for+targeted+next-generation+sequencing+of+low-quality+tumor+DNA+using+a+51-gene+enrichment+panel%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel.</a> BMC Med Genomics. 7, 62(2014).</li>
<li>Sah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+DNA+quantification+guides+accurate+next-generation+sequencing+mutation+detection+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tumor+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies.</a> Genome Med. 5 (8), 77(2013).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+cancer+gene+mutations+in+clinical+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+colorectal+tumor+specimens+using+targeted+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing.</a> Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).</li>
<li>Latham, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tumor+biopsies%3A+navigating+the+perils+of+old+and+new+technology+to+advance+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).</li>
<li>Crawford, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+business+of+genomic+testing%3A+a+survey+of+early+adopters%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">The business of genomic testing: a survey of early adopters.</a> Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).</li>
<li>Smith, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+technology+platform+for+the+rapid+analysis+of+clinically+actionable+genetic+alterations+and+validation+for+BRAF+p.V600E+detection+in+1549+cytologic+and+histologic+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens.</a> Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).</li>
<li>Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tumor+sequencing+on+the+use+of+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).</li>
<li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+next-generation+sequencing+screen+for+mutational+hotspots+in+46+cancer-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes.</a> J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).</li>
<li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+highly+multiplexed+PCR+with+semiconductor-based+sequencing+for+rapid+cancer+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping.</a> J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).</li>
<li>McCall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+positives+in+multiplex+PCR-based+next-generation+sequencing+have+unique+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures.</a> J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).</li>
<li>Schleifman, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+MUT-MAP%2C+a+high-sensitivity+high-throughput+microfluidics+chip-based+mutation+analysis+panel%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel.</a> PLoS One. 9 (3), e90761(2014).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 7, 23(2014).</li>
<li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+measurement+of+hotspot+mutations+in+tumor+DNA+in+blood+using+error-suppressed+multiplexed+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing.</a> Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).</li>
<li>Hagemann, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+next-generation+sequencing+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer.</a> Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).</li>
<li>Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+somatic+genetic+alterations+in+tumor+specimens+by+exon+capture+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing.</a> J Vis Exp. (80), e50710(2013).</li>
<li>Simen, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+next-generation-sequencing+cancer+panel+for+use+in+the+clinical+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory.</a> Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).</li>
</ol>

JH, AH, RZ, BCH i GJL są pracownikami i posiadają udziały w Asuragen, Inc. RZ, BCH i GJL są współwynalazcami wniosku patentowego dotyczącego ulepszenia wywoływania wariantów przy użyciu amplifikowalnych informacji o numerze kopii określonych dla każdej próbki.

Technologie NGS na nowo zdefiniowały oczekiwania dotyczące badania profili molekularnych biopsji guza w warunkach klinicznych9. Szereg ukierunkowanych paneli NGS zostało opracowanych jako technologie badawcze, testy opracowane laboratoryjnie oraz dostępne na rynku produkty i niestandardowe panele do oceny wielu typów próbek klinicznych3,5,10-15. Doniesienia z wielu badań wykazały wartość NGS jako czułego i specyficznego narzędzia klinicznego do wykrywania zmian genomowych3,10-12,14. Jednak badania wykazały również ryzyko artefaktów, które mogą powodować fałszywie dodatnie wyniki z trudnych biopsji raka, takich jak próbki FFPE2-5,12,14. Ponadto ostatnie publikacje podkreśliły wysokie wskaźniki niepowodzeń w przypadku NGS przy użyciu próbek onkologicznych16 oraz fałszywie dodatnie połączenia z komercyjnymi ukierunkowanymi panelami NGS, które są pogarszane przez stosowanie DNA o niskim poziomie wejściowym12. W rezultacie, niektóre laboratoria zmodyfikowały lub dodały dodatkowe mechanizmy kontroli i równowagi do dostępnych na rynku technologii NGS w celu poprawy wydajności, często w celu zapewnienia dokładności lub potwierdzenia wyników analiz bioinformatycznych5,10,11.
Panel składający się z 21 genów (ryc. 2) został opracowany jako ukierunkowana zawartość dla kompleksowego systemu NGS do badania opartych na dowodach, możliwych do zastosowania mutacji w trudnych typach próbek, takich jak biopsje guzów FFPE i FNA. Przepływ pracy ma szereg zalet: 1) spójność dzięki zapewnieniu jednolitego pokrycia amplikonem (rysunki 3 i 4, tabela 3); 2) łatwość użycia dzięki dostarczaniu wstępnie sformułowanych, zoptymalizowanych zestawów odczynników i uproszczeniu wymagań bioinformatycznych; 3) wydajność poprzez usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie liczby etapów pipetowania w porównaniu z innymi komercyjnymi metodami NGS; oraz 4) dokładność poprzez włączenie testu kontroli jakości DNA do oceny liczby amplifikowalnych kopii DNA w celu zapewnienia akceptowalnej różnorodności matryc i uniknięcia stochastycznych wahań w wykrywaniu wariantów4. Integracja przedanalitycznych danych kontroli jakości z analizą bioinformatyczną pozwala na niskie wprowadzanie DNA FFPE. Udało się to osiągnąć poprzez wytrenowanie algorytmu drzewa decyzyjnego wykorzystującego różne funkcjonalne kopie danych wejściowych DNA z 400 próbek FFPE z niezależnymi pomiarami prawdy i włączenie tego algorytmu do oprogramowania bioinformatycznego. W rezultacie, zalecane wprowadzenie 400 amplifikowalnych kopii, zwykle równoważnych ~5-20 ng DNA FFPE, wypada korzystnie w porównaniu z innymi metodami10-12, w tym wzbogacaniem opartym na hybrydyzacji, gdzie zaleca się ~250 ng DNA FFPE17,18. Chociaż technika ta jest opisana do użytku na platformie MiSeq, można ją modyfikować za pomocą starterów Tag PCR z adapterami specyficznymi dla instrumentu, aby umożliwić analizę sekwencji na innych platformach NGS.
Aby zapewnić powodzenie procedury, należy wykonać kilka kroków. Przedanalityczny test kontroli jakości określa liczbę amplifikowalnych kopii DNA i informuje o funkcjonalnym hamowaniu. Jeśli jednak na etapie wzbogacania PCR zostanie użytych mniej niż 400 amplifikowalnych kopii DNA, istnieje zwiększone ryzyko fałszywie ujemnego wywołania z próbek z mutacjami o niskiej liczebności (Figura 6). Ponadto podczas czyszczenia biblioteki należy zachować ostrożność, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu kulek magnetycznych podczas etapów mycia lub elucji. Co więcej, udana kwantyfikacja biblioteki jest w dużym stopniu zależna od dokładnego rozcieńczenia DNA biblioteki. Aby uzyskać najlepszy wynik, różnica wyników qPCR dla biblioteki próbek (Cq FAM) w porównaniu ze standardem LQ (Cq VIC) powinna wynosić ≤3,3 Cq. Jeżeli różnica jest większa niż 3,3 Cq, zaleca się ponowne rozcieńczenie i zbadanie próbki. Chociaż zaobserwowano doskonałą korelację między tą konkurencyjną metodą qPCR a komercyjnymi zestawami, które oferują bezwzględną kwantyfikację przy użyciu krzywej standardowej, przesunięcie danych wejściowych biblioteki do etapu amplifikacji klonalnej w stosunku do innych metod może być konieczne do osiągnięcia optymalnej gęstości wysiewu.
Niektóre próbki nowotworów są szczególnie trudne do sekwencjonowania ze względu na inhibitory, które utrzymują się po izolacji DNA. Aby zidentyfikować te próbki przed przygotowaniem biblioteki, test QC qPCR wykrywa również hamowanie amplifikacji poprzez włączenie egzogennej matrycy, która służy zarówno jako kontrola wewnętrzna, jak i strażnik hamowania funkcjonalnego. Przykład przedstawiono na rysunku 3 , w którym próbka DNA czerniaka nie przeszła metryki hamowania QC przed sekwencjonowaniem, a następnie nie wygenerowała biblioteki, którą można by zsekwencjonować. Niepowodzenie było prawdopodobnie konsekwencją zanieczyszczenia melaniną, znanym inhibitorem PCR, przeniesionym z etapu izolacji DNA FFPE. Próbki, które zostały zidentyfikowane za pomocą testu kontroli jakości jako zagrożone niepowodzeniem amplifikacji, mogą zostać odzyskane poprzez dodatkowy etap oczyszczania w celu usunięcia potencjalnych inhibitorów.
Ukierunkowany panel 21-genowy koncentruje się na opartych na dowodach punktach zapalnych genów i zapewnia kompletny system ze zoptymalizowanymi odczynnikami i kontrolami dla DNA, QC, NGS i oprogramowania bioinformatycznego, który jest informowany o wstępnych analitycznych "funkcjonalnych" wynikach kwantyfikacji DNA. Metoda ta dokładnie wykrywa mutacje i indele substytucji zasad z niskowejściowego DNA i stanowi przykład systemu NGS z opcją rozszerzenia zawartości panelu, w celu wykrycia dodatkowych wariantów, takich jak CNV, i dostosowania do celowanego sekwencjonowania RNA.

Medycyna precyzyjna opiera się na indywidualizacji opcji diagnostycznych i terapeutycznych dla pacjentów. Obietnica leczenia dostosowanego do potrzeb klienta jest bezpośrednią konsekwencją lepszego zrozumienia szlaków chorobowych, które mogą informować o powiązaniu diagnostyki molekularnej z terapiami celowanymi. Na przykład stosowanie terapii ukierunkowanych molekularnie wzrosło z 11% do 46% w latach 2003-20131, a leki przeciwnowotworowe, takie jak wemurafenib i kryzotynib, są zatwierdzone przez FDA za pomocą towarzyszących testów diagnostycznych. Dzięki zdolności do dokładnego odzyskiwania docelowych sekwencji o niskiej liczebności w wysoce multipleksowanych zestawach próbek, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) stało się metodą z wyboru do oceny aberracji genetycznych związanych z rakiem i identyfikacji celów molekularnych dla medycyny precyzyjnej.
Najczęstsze biopsje guzów litych do testów molekularnych obejmują próbki utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie (FFPE) i aspirowane cienkoigłowo (FNA). Próbki te są obarczone niską ilością i/lub niskiej jakości kwasami nukleinowymi, które stanowią wyzwanie dla dokładnych ocen NGS2-5. Obecne komercyjne metody NGS do analizy tych próbek opierają się na mozaice różnych odczynników, protokołów i narzędzi informatycznych, które stanowią ruchome cele ciągłych ulepszeń. Na przykład zmiany w chemii i/lub oprogramowaniu testowym następowały co 1-2 miesiące w przypadku najczęściej stosowanych docelowych zestawów NGS6. Ta niestabilność odzwierciedla brak spójności w konstruowaniu i weryfikowaniu ujednoliconego systemu NGS dla trudnych typów próbek, szczególnie do badań na raka, i nakłada nadmierne obciążenie na laboratoria w zakresie opracowywania spójnych protokołów, które są optymalizowane od próbki do wyników. Rzeczywiście, jedno z ostatnich badań przeprowadzonych wśród użytkowników NGS podkreśliło trudności związane z tymi "szybko zmieniającymi się" technologiami, wraz z wymaganiami dotyczącymi ustalonych, praktycznych treści medycznych, ugruntowaną wiedzą bioinformatyczną, ugruntowaną i zintegrowaną procedurą, którą można szybko wdrożyć, oraz usprawnionymi przepływami pracy i uproszczonymi protokołami, które ułatwiają szkolenie w miejscu pracy7. W tym artykule opisano kompleksowy system ukierunkowanego NGS, który wypełnia te luki.
Przedstawiona metodologia integruje wszystkie kroki proceduralne od przedanalitycznego do postanalitycznego, zarówno na mokrym, jak i suchym stanowisku, aby poprawić dokładność, czułość i niezawodność docelowej kwantyfikacji i wykrywania dla NGS klinicznie istotnych loci genów raka. Podejście to rozpoczyna się od kwantyfikacji "funkcjonalnego" DNA4 w celu oceny jakości DNA, kierowania danymi wejściowymi do etapu wzbogacania PCR i ochrony przed fałszywie dodatnimi połączeniami, które mogą powstać w wyniku przesłuchania bardzo niskich kopii matryc. Pojedynczy probówkowy multipleksowy PCR następnie wzbogaca o 46 loci w 21 genach nowotworowych przy użyciu zaledwie 400 amplifikowalnych kopii DNA, a następnie włącza sekwencje specyficzne dla platformy dla NGS przy użyciu popularnych stacjonarnych instrumentów sekwencjonowania. Biblioteki są oczyszczane za pomocą prostej procedury kulek magnetycznych i oznaczane ilościowo za pomocą nowatorskiego, niewymagającego kalibracji testu qPCR. Autonomiczny pakiet bioinformatyczny, oparty na wynikach kontroli jakości próbek DNA w celu poprawy wydajności połączeń, zapewnia analizę sekwencji po NGS. Przedstawiamy dane wykorzystujące to podejście systemowe dla ukierunkowanego NGS w celu ujawnienia mutacji substytucji zasad, insercji/delecji (indeli) i wariantów liczby kopii (CNV) w biopsjach guza o niskiej jakości i małej ilości, takich jak próbki FFPE i FNA, oraz przeprowadzamy kontrole.

<table><tbody><tr><td>2x Quantidex Master Mix</td><td>Asuragen</td><td>145345</td><td></td></tr><tr><td>Quant Primer Probe Mix</td><td>Asuragen</td><td>145336</td><td></td></tr><tr><td>Inhibition Primer Probe Mix</td><td>Asuragen</td><td>145344</td><td></td></tr><tr><td>ROX</td><td>Asuragen</td><td>145346</td><td></td></tr><tr><td>Diluent</td><td>Asuragen</td><td>145339</td><td></td></tr><tr><td>DNA Standard (50)</td><td>Asuragen</td><td>145340</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec DNA (10)</td><td>Asuragen</td><td>145341</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec DNA (2)</td><td>Asuragen</td><td>145342</td><td></td></tr><tr><td>Wzorzec DNA (0.4)</td><td>Asuragen</td><td>145343</td><td></td></tr><tr><td>2X Amplification Master Mix</td><td>Asuragen</td><td>145348</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cancer Primer Panel</td><td>Asuragen</td><td>145347</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cancer FFPE Control</td><td>Asuragen</td><td></td><td></td>145349</tr><tr><td>Pan Cancer Multi-Variant Control</td><td>Asuragen</td><td>145350</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka Pure Prep Beads</td><td>Asuragen</td><td>145351</td><td></td></tr><tr><td>Wash Buffer</td><td>Asuragen</td><td>145352</td> Bufor elucyjny Asuragen 145353 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2X LQ Master Mix</td><td>Asuragen</td><td>145358</td><td></td></tr><tr><td>LQ Diluent</td><td>Asuragen</td><td></td><td></td>145354</tr><tr><td>LQ Kontrola pozytywna</td><td>Asuragen</td><td>145355</td><td></td></tr><tr><td>LQ Standard</td><td>Asuragen</td><td>145356</td><td></td></tr><tr><td>LQ Mieszanka starterów/sond (ILMN)</td><td>Asuragen</td><td>145357</td><td></td></tr><tr><td>LQ ROX</td> Kody <td>indeksu 145359</td><td></td><td>Asuragen</td></tr><tr><td>(ILMN) - Zestaw A, AIL001 - AIL048 (48)</td>Kody indeksu <td>150004</td><td></td> <td>Asuragen</td></tr><tr><td>(ILMN) - Zestaw B, AIL049 - AIL096(48)</td><td>Asuragen</td><td>150005</td><td></td></tr><tr><td>2x Index Master Mix</td><td>Asuragen</td><td>145361</td><td></td></tr><tr><td>Read 1 Startery sekwencjonowania</td><td>Asuragen</td><td>150001</td><td></td></tr><tr><td>Index Odczyt Startery sekwencjonowania</td><td>Asuragen</td><td>150002</td><td></td></tr><tr><td>Read 2 Startery sekwencjonowania</td><td>Asuragen</td><td>150003</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie Diluent</td><td>Asuragen</td><td>145365</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v3 (600 cykli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300 cykli)</td><td>Illumina</td><td>MS-103-1001</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Podstawka magnetyczna-96 (lub równoważne urządzenie)</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Quantidex Reporter</td><td>Asuragen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

Wszystkie procedury sekwencjonowania nowej generacji (NGS) obejmują testy wykonywane na stanowisku laboratoryjnym ("mokre stanowisko") oraz analizy danych przeprowadzane przy użyciu rurociągów bioinformatycznych ("suche stanowisko"). Oba te elementy są niezbędne do uzyskania dokładnych i wiarygodnych wyników, które są szczególnie ważne dla laboratoriów klinicznych. Ukierunkowane technologie NGS coraz częściej znajdują uznanie w zastosowaniach onkologicznych, pomagając w realizacji celów medycyny precyzyjnej, jednak metody te często obejmują rozłączne i zmienne przepływy pracy na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym oraz nieskoordynowane zestawy odczynników. W niniejszym raporcie opisujemy metodę sekwencjonowania trudnych próbek nowotworów za pomocą panelu 21-genowego jako przykład kompleksowego ukierunkowanego systemu NGS. System integruje funkcjonalną kwantyfikację i kwalifikację DNA, wzbogacanie PCR z multipleksem w jednej probówce oraz oczyszczanie i normalizację biblioteki przy użyciu zweryfikowanych analitycznie odczynników z jednego źródła z samodzielnym pakietem bioinformatycznym. W rezultacie, można uzyskać dokładne wywołania wariantów z niskiej jakości i małej ilości biopsji guza utrwalonego w formalinie, zatopionego w parafinie (FFPE) i aspiracji cienkoigłowej (FNA). Metoda może rutynowo oceniać warianty związane z rakiem na podstawie danych wejściowych 400 amplifikowalnych kopii DNA i ma konstrukcję modułową, aby dostosować się do nowej zawartości genów. Dwa różne typy analitycznie zdefiniowanych kontroli zapewniają gwarancję jakości i pomagają zabezpieczyć dokładność połączeń z próbkami istotnymi klinicznie. Elastyczny etap PCR typu "tag" zawiera adaptery specyficzne dla platformy i kody indeksowe, aby umożliwić kodowanie kreskowe próbek i kompatybilność z popularnymi urządzeniami laboratoryjnymi NGS. Co ważne, protokół jest usprawniony i może wytworzyć 24 biblioteki gotowe do sekwencji w ciągu jednego dnia. Wreszcie, podejście to łączy procesy na mokrym i suchym stanowisku badawczym poprzez włączenie wyników kontroli jakości próbek przedanalitycznych bezpośrednio do algorytmów wywoływania wariantów w celu poprawy dokładności wykrywania mutacji i rozróżnienia wywołań fałszywie ujemnych i nieokreślonych. Ta ukierunkowana metoda NGS wykorzystuje postępy zarówno w oprogramowaniu mokrym, jak i oprogramowaniu, aby uzyskać bardzo szczegółowe, multipleksowane sekwencjonowanie i czułą analizę heterogenicznych próbek nowotworów do zastosowań diagnostycznych.

Łącznie 90 próbek (74 unikalnych), reprezentujących kontrole pozytywne i negatywne, wcześniej scharakteryzowane linie komórkowe oraz pozostałości klinicznych biopsji guzów utrwalonych w FFPE, zostało poddanych ocenie pod kątem zawartości DNA zdolnego do amplifikacji, wprowadzonych do multipleksowej amplifikacji PCR, oznaczonych adapterami sekwencyjnymi, zindeksowanych kodami kreskowymi i przeanalizowanych w jednym przebiegu na stacjonarnym sekwenatorze NGS (Rysunek 2), co dało 19,1 M odczytów przechodzących przez filtr. Równomolarne łączenie próbek zaowocowało wysoką głębokością sekwencjonowania (3 692x odczytów) i jednorodnym pokryciem (97,8% amplikonów pokrytych w zakresie 5-krotności mediany głębokości odczytów). Wartości odstające obejmowały kontrole bez matrycy, DNA jednej linii komórkowej z dużą amplifikacją liczby kopii oraz DNA z FFPE, które zostało oznaczone jako wykazujące inhibicję PCR w przedanalitycznym badaniu kontroli jakości (Rysunek 3). Jednorodność pokrycia w obrębie 46 amplikonów została utrzymana przy udziale trzech różnych operatorów (Rysunek 4A) oraz dla różnych próbek DNA z FFPE o niskiej jakości (Rysunek 4B). W przypadku kontroli DNA guza FFPE, sporządzonej z mieszaniny pozostałości próbek klinicznych w celu uzyskania 5% BRAF V600E (ilość określona metodą droplet digital PCR), trzej operatorzy zgłosili obecność docelowej mutacji BRAF z częstością 3,9%, 5,3% i 6,5% przy użyciu 400 kopii zdolnych do amplifikacji (a zatem zaledwie 20 kopii zmutowanych) (Rysunek 4B i „FFPE3” w tabeli wstawkowej). Ponadto mieszanina 12 syntetycznych matryc DNA, z których każda reprezentowała znaną mutację podstawienia „driver”, wykazała oczekiwane mutacje w zamierzonym zakresie od 9% do 17% średniej częstości alleli (Tabela 2). Rozcieńczanie próbek DNA z linii komórkowych i FFPE z amplifikacją liczby kopii wykazało zależność od dawki dla wariantów odpowiednio w EGFR i KRAS (Rysunek 5). Co istotne, ilość wprowadzanego DNA z FFPE mogła zostać zredukowana do zaledwie 50 kopii zdolnych do amplifikacji lub 1,2 ng całkowitego DNA, przy jednoczesnym zachowaniu wykrywalności znanych mutacji bez wyników fałszywie dodatnich (Rysunek 6). Ilości wprowadzanego DNA były akceptowalne w zakresie 100-krotnym, aż do co najmniej 50 000 kopii zdolnych do amplifikacji (Tabela 3). W tym oraz w powiązanych eksperymentach wykryte warianty w 22 próbkach FFPE i 20 próbkach FNA były zgodne z wynikami uzyskanymi niezależnymi metodami o wspólnym zakresie pokrycia mutacji (Tabela 4).
Czułość i wartość predykcyjna dodatnia testu zostały określone na podstawie analizy 97 próbek, w tym DNA z bloków FFPE, biopsji cienkoigłowej (FNA), tkanek świeżo zamrożonych oraz linii komórkowych, oraz łącznie 195 wyników sekwencjonowania. Wyniki wykazały 365 prawdziwie dodatnich oznaczeń wariantów, 4 wyniki fałszywie ujemne i 1 wynik fałszywie dodatni, co daje czułość na poziomie 98.9% (95% CI: 97.1-99.7%) oraz wartość predykcyjną dodatnią (PPV) wynoszącą 99.7% (95% CI: 98.2-99.99%). Analizy indeli przeprowadzono dla dwóch powszechnych wariantów EGFR (p.E746_A750delELREA i p.V769_D770insASV) w 33 przebiegach analizy próbek, wykazując czułość na poziomie 93.9% (95% CI: 78.4-98.9%) i PPV wynoszącą 100% (95% CI: 86.3-100%), przy wykrywaniu wariantów w zakresie 2.4-84.8%.

<img alt="Wykres wydajności PCR i tabela danych porównująca kwantyfikację Cq; schemat przedstawia dwa układy A i B." src="/files/ftp_upload/53836/53836fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przykład krzywych kalibracyjnych kwantyfikacji DNA, które spełniają i nie spełniają kryteriów kontroli jakości (QC). (A) Prawidłowa krzywa wzorcowa. (B) Nieprawidłowa krzywa wzorcowa. W tym przypadku błąd był spowodowany podwójnym pipetowaniem najniższego stężenia standardu DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przepływu pracy panelu genów nowotworowych: qPCR, cykle PCR, kwantyfikacja biblioteki, analiza danych." src="/files/ftp_upload/53836/53836fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przegląd kompleksowego ukierunkowanego systemu NGS do zastosowań onkologicznych, integrującego przepływy pracy przedanalityczne, analityczne i poanalityczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza sekwencjonowania DNA, % amplikonów vs. mediana głębokości odczytu; wykres różnych typów próbek." src="/files/ftp_upload/53836/53836fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Pokrycie i jednorodność odczytów dla celowanego NGS genów nowotworowych w DNA FFPE niskiej jakości w porównaniu z nienaruszonym DNA linii komórkowych i kontrolami. Łącznie 90 próbek, obejmujących pozostałości kliniczne FFPE (zamknięte koła), linie komórkowe (otwarte koła) oraz syntetyczne DNA matrycowe (symbole plus), przetworzono przy użyciu jednopróbkowej, multipleksowej PCR wzbogacania 21 genów. Każda biblioteka amplikonów została oznaczona sekwencjami adapterów dla instrumentu NGS, zakodowana unikalnym kodem podwójnego indeksu, oczyszczona, zmierzona ilościowo i znormalizowana do stężenia 2.5 nM. Biblioteka DNA została zsekwencjonowana i przeanalizowana za pomocą towarzyszącego oprogramowania bioinformatycznego. Odchylenia próbek obejmowały serię rozcieńczeń DNA linii komórkowej MDA-MB-468 z dużą amplifikacją liczby kopii EGFR (góra, otwarte prostokąty wewnątrz przerywanego koła), co zniekształciło jednorodność pokrycia, oraz jedną próbkę FFPE czerniaka, która nie wygenerowała znaczącej liczby odczytów z powodu przeniesienia inhibitorów PCR z procesu ekstrakcji DNA. Niepowodzenie w przypadku próbki czerniaka (dół, przerywane koło) zostało przewidziane przez przedanalityczny test QC DNA metodą qPCR. NTC, kontrola bez matrycy (symbole x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe głębokości odczytu sekwencjonowania; porównania między loci z adnotacjami wyników." src="/files/ftp_upload/53836/53836fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Pokrycie odczytami, jednorodność i detekcja wariantów dla poszczególnych amplikonów w resztkowym klinicznym DNA guza z FFPE. (A) Pokrycie odczytami we wszystkich wzbogaconych loci w reprezentatywnej próbce DNA FFPE, zmierzone przez trzech różnych operatorów. Operator 1, Op1 (niebieskie słupki); Operator 2, Op2 (zielone słupki); Operator 3, Op3 (czarne słupki). (B) Jednorodność pokrycia i wywołania wariantów ocenione przy użyciu trzech próbek guza FFPE, w tym mieszaniny kontrolnej (FFPE3, szare słupki i tekst) zawierającej znaną mutację BRAF c.1799T&gt;A w stężeniu 5%. FFPE1 (niebieskie słupki i tekst), FFPE2 (pomarańczowe słupki i tekst). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy genomowej; zmiana liczby kopii względem locus; rak piersi, mutacje EGFR i KRAS." src="/files/ftp_upload/53836/53836fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Zależna od dawki detekcja wariantów liczby kopii w DNA linii komórkowych i z bloków FFPE.DNA linii komórkowej MDA-MB-468 z dobrze scharakteryzowaną amplifikacją liczby kopii EGFR poddano progresywnemu rozcieńczeniu w tle referencyjnego niezmutowanego DNA linii komórkowej, aby zilustrować spadek zmiany liczby kopii w funkcji rozcieńczenia. Procentowa zawartość DNA każdej próbki linii komórkowej jest przedstawiona oddzielną linią (0, 12,5, 25, 50 i 100%). Rozcieńczenie próbki guza jajnika FFPE ze znaną amplifikacją KRAS wykazało podobny profil przy użyciu tej samej serii miareczkowania, jednak w przypadku dwóch górnych linii zastosowano powtórzenia 100% DNA FFPE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Liczba kopii amplifikowalnego DNA w stosunku do procentowej zawartości wariantu; wykres granicy detekcji pokazujący próg dla KRAS G12D." src="/files/ftp_upload/53836/53836fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Precyzyjna detekcja i kwantyfikacja mutacji do 50 kopii amplifikowalnego DNA FFPE lub 1,2 ng całkowitego DNA. Liczba kopii amplifikowalnych DNA FFPE z raka jelita grubego została określona za pomocą testu QC opartego na qPCR, a następnie rozcieńczona od 400 do 25 kopii jako materiał wyjściowy do wzbogacania metodą multiplex PCR przed sekwencjonowaniem. Potok bioinformatyczny poprawnie zidentyfikował oba znane warianty aż do poziomu 50 kopii, co odpowiada około 10 matrycom zmutowanym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa materiału/Materiał</td>
			<td>Firma</td>
			<td>Numer katalogowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Quantidex Master Mix</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanina starterów i sond do qPCR</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145336</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanina starterów i sondy do badania inhibicji</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145344</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145346</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczalnik</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard DNA (50)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard DNA (10)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard DNA (2)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145342</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard DNA (0,4)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145343</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Master Mix do amplifikacji</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145348</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panel starterów Pan Cancer</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145347</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola Pan-Cancer FFPE</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145349</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola wielowariantowa dla wielu typów nowotworów</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kuleczki do oczyszczania bibliotek Library Pure Prep Beads</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145351</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor płuczący</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145352</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor elucyjny</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145353</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x LQ Master Mix</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145358</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczalnik LQ</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145354</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pozytywna kontrola LQ</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145355</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard LQ</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145356</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanina starterów i sond LQ (ILMN)</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145357</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LQ ROX</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145359</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kody indeksowe (ILMN) – Zestaw A</td>
			<td rowspan="2">Asuragen</td>
			<td rowspan="2">150004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIL001 - AIL048 (48)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kody indeksowe (ILMN) - Zestaw B</td>
			<td rowspan="2">Asuragen</td>
			<td rowspan="2">150005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIL049 - AIL096(48)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Index Master Mix</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145361</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Startery do sekwencjonowania Read 1</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>150001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Startery do sekwencjonowania odczytu indeksu</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>150002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczyt 2 starterów do sekwencjonowania</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>150003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczalnik do sekwencjonowania</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>145365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina MiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zestaw odczynników MiSeq Reagent Kit v3 (600 cykli)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zestaw odczynników MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300 cykli)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-103-1001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola PhiX v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statyw magnetyczny-96 (lub urządzenie równoważne)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM10027</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oprogramowanie raportujące Quantidex</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Odczynniki i zestawy. Po pierwszym użyciu ROX przechowywać fiolkę w temperaturze 2-8 °C. Nie zamrażać ponownie. Oprogramowanie można pobrać ze strony www.asuragen.com.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gen</td>
			<td>wariant COSMIC</td>
			<td>aminokwas COSMIC</td>
			<td>% Wariant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRAS</td>
			<td>c.182A&gt;G</td>
			<td>p.Q61R</td>
			<td>13.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRAS</td>
			<td>c.35G&gt;A</td>
			<td>p.G12D</td>
			<td>15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRAS</td>
			<td>c.182A&gt;G</td>
			<td>p.Q61R</td>
			<td>17.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRAS</td>
			<td>c.35G&gt;A</td>
			<td>p.G12D</td>
			<td>9.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRAS</td>
			<td>c.182A&gt;G</td>
			<td>p.Q61R</td>
			<td>13.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRAS</td>
			<td>c.35G&gt;A</td>
			<td>p.G12D</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIK3CA</td>
			<td>c.1633G&gt;A</td>
			<td>p.E545K</td>
			<td>9.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIK3CA</td>
			<td>c.3140A&gt;G</td>
			<td>p.H1047R</td>
			<td>9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zestaw</td>
			<td>c.2447A&gt;T</td>
			<td>p.D816V</td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR</td>
			<td>c.2369C&gt;T</td>
			<td>p.T790M</td>
			<td>11.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR</td>
			<td>c.2573T&gt;G</td>
			<td>p.L858R</td>
			<td>14.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAF</td>
			<td>c.1799T&gt;A</td>
			<td>p.V600E</td>
			<td>17.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Połączona kontrola syntetyczna składa się z 12 wariantów genów nowotworowych typu „driver”, których zawartość wynosi od 9% do 17%. Po sekwencjonowaniu oceniono mieszaninę 12 różnych dwuniciowych matryc syntetycznych zawierających 12 odrębnych mutacji. Wszystkie warianty zostały poprawnie zidentyfikowane, bez wyników fałszywie dodatnich.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Identyfikator próbki</td>
			<td nowrap>Funkcjonalny 
			cps</td>
			<td>Gen</td>
			<td>wariant COSMIC</td>
			<td>aminokwas COSMIC</td>
			<td>% Wariant</td>
			<td>Mediana głębokości odczytu</td>
			<td>% w zakresie 5x mediany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCPAP</td>
			<td>400</td>
			<td>BRAF </td>
			<td>c.1799T&gt;A</td>
			<td>p.V600E</td>
			<td>99.5</td>
			<td>3289</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCPAP</td>
			<td>10,000</td>
			<td>BRAF </td>
			<td>c.1799T&gt;A</td>
			<td>p.V600E</td>
			<td>99.7</td>
			<td>4040</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCPAP</td>
			<td>25,000</td>
			<td>BRAF </td>
			<td>c.1799T&gt;A</td>
			<td>p.V600E</td>
			<td>99.4</td>
			<td>3687</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCPAP</td>
			<td>50,000</td>
			<td>BRAF </td>
			<td>c.1799T&gt;A</td>
			<td>p.V600E</td>
			<td>99.7</td>
			<td>4611</td>
			<td>93%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Pokrycie i wywoływanie wariantów zostają zachowane w ramach &gt;100-krotny zakres ilości wejściowej DNA. DNA zdolny do amplifikacji z linii komórkowej BCPAP wprowadzono do multiplexowej reakcji PCR w zakresie od 400 do 50 000 kopii, a następnie poddano sekwencjonowaniu. Głębokość odczytu, jednorodność pokrycia, wykrywalność mutacji oraz dokładność identyfikacji mutacji zostały zachowane w całym zakresie ilości wejściowych.
<img alt="Wykres analizy mutacji genów nowotworowych; porównanie wariantów COSMIC; tabela danych z częstotliwością mutacji." src="/files/ftp_upload/53836/53836table4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 4"> 
Tabela 4: Wykryte warianty w 22 biopsjach guzów FFPE i 20 biopsjach FNA są zgodne z wynikami niezależnych testów mutacyjnych. Zestaw 22 próbek DNA z guzów FFPE, których status mutacyjny został wcześniej określony za pomocą ortogonalnych celowanych testów NGS, wprowadzono w ilości od 400 do 2 928 kopii amplifikowalnych do etapu wzbogacania PCR i zsekwencjonowano przy użyciu 21-genowego panelu Pan Cancer. Dodatkowo kohorta 20 próbek DNA z FNA, wcześniej scharakteryzowanych przy użyciu testu mutacyjnego liquid bead array8, została poddana amplifikacji PCR przy użyciu od 156 do 36 080 wprowadzonych kopii amplifikowalnych i zsekwencjonowana. Wszystkie wspólne wyniki uzyskane za pomocą panelu Pan Cancer NGS oraz metod referencyjnych były zgodne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53836/53836table4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opis kompleksowego systemu sekwencjonowania trudnych próbek nowotworowych, który łączy odczynniki laboratoryjne, zestandaryzowane kontrole oraz samodzielny pakiet bioinformatyczny. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii, takie jak sposób sekwencjonowania biopsji guzów o niskiej ilości i niskiej jakości materiału w celu uzyskania dokładnych analiz i interpretacji wariantów DNA. Główną zaletą tej metody jest to, że próbki trudne do sekwencjonowania – a konkretnie te, w których dostępna ilość DNA jest ograniczona – mogą być szybko i niezawodnie analizowane przy użyciu odczynników i kontroli z jednego źródła oraz w pełni zintegrowanego oprogramowania bioinformatycznego.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na złożoność ukierunkowanego NGS, którą niniejsza metoda upraszcza. Niemniej jednak, procedury ilościowego oznaczania bibliotek oraz łączenia próbek wymagają szczególnej uwagi, aby uzyskać jednorodne pokrycie we wszystkich bibliotekach próbek. Niniejszy protokół integruje procesy laboratoryjne i bioinformatyczne w celu sekwencjonowania trudnych próbek nowotworowych.Pierwszym krokiem jest kwantyfikacja i ocena jakości DNA w celu określenia liczby kopii matrycy DNA, które można powielić za pomocą techniki real-time PCR. Rozpocznij procedurę kwantyfikacji próbek i kontroli jakości od przygotowania odpowiedniej ilości master mixu w probówce do mikrowirówki. Na każdą próbkę zastosuj następujące objętości: 5 µL 2x master mix, 0,5 µL mieszaniny starterów i sond, 0,5 µL inhibicyjnej mieszaniny starterów i sond, 0,05 µL ROX oraz 2,95 µL rozcieńczalnika.Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodaj 9 µL mieszaniny master mix. Dodaj 1 µL standardów DNA w dwóch powtórzeniach i wymieszaj, pipetując w górę i w dół pięć razy. Po upewnieniu się, że próbka kwasu nukleinowego została dobrze wymieszana, dodaj 1 µL próbki do mieszaniny master mix i wymieszaj, pipetując w górę i w dół pięć razy.Umieść zamkniętą płytkę w systemie PCR. Przeprowadź cykle PCR: 10 minut w temperaturze 95 °C, a następnie 40 cykli obejmujących 15 sekund w 95 °C oraz jedną minutę w 60 °C. Przeanalizuj dane qPCR, generując wykres regresji liniowej dla każdego z dubletów standardów DNA.Następnie oblicza się stężenie nieznanego DNA w postaci funkcjonalnej lub amplifikowalnej liczby kopii na mikrolitr, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Kolejnym krokiem po ilościowym oznaczeniu próbek i kontroli jakości jest wzbogacenie sekwencji punktów zapalnych (hot spot) nowotworowych za pomocą seryjnej reakcji PCR w jednej probówce (multiplex PCR). Przeprowadzona zostanie specyficzna dla genów reakcja gsPCR w celu wzbogacenia 46 loci w 21 genach nowotworowych.Przygotuj odpowiednią ilość mieszaniny gsPCR w probówce do mikrocentryfugi, używając następujących objętości na próbkę: 5 µL 2x amplification master mix oraz 1 µL pan-cancer primer panel. Nanieś 6 µL mieszaniny gsPCR do każdej studni płytki 96-dołkowej. Dodaj 4 µL każdej próbki kwasów nukleinowych do poszczególnych studni.Wymieszaj, pipetując w górę i w dół pięć razy. Uwzględnij odpowiednie kontrole. Umieść zamkniętą płytkę w termocyklerze w celu przeprowadzenia następujących cykli PCR.Pięć minut w temperaturze 95 °C. 15 sekund w temperaturze 95 °C, a następnie cztery minuty w temperaturze 60 °C przez dwa cykle. 15 sekund w temperaturze 95 °C, a następnie cztery minuty w temperaturze 72 °C przez 23 cykle.Końcowy etap elongacji trwa 10 minut w temperaturze 72°C, po czym próbki przechowywano w temperaturze 4°C. Po genowo specyficznej reakcji PCR należy przeprowadzić 10 cykli tag-PCR w celu wprowadzenia adapterów specyficznych dla platformy, aby zapewnić kompatybilność z sekwencjonowaniem nowej generacji. Do określonej studzienki płytki 96-dołkowej należy dodać 7,5 µL 2x index master mix oraz 5,5 µL kodu indeksowego, a następnie wymieszać poprzez pięciokrotne pipetowanie w górę i w dół.Ostrożnie otwórz płytkę gsPCR i dodaj 2 µL produktu gsPCR do nowej płytki z master miksem. Umieść zamkniętą płytkę w termocyklerze w celu przeprowadzenia następujących cykli PCR: 5 minut w 95 °C, a następnie 10 cykli składających się z 30 s w 95 °C, 30 s w 55 °C oraz 1 min w 72 °C, zakończonych finalną elongacją przez 10 min w 72 °C. Następnie przechowuj próbki w temperaturze 4 °C.Po przeprowadzeniu tag-PCR oczyszczanie biblioteki i selekcję wielkości przeprowadza się z wykorzystaniem kulek magnetycznych. Procedurę rozpoczyna się od dodania 11 µL magnetycznych kulek do oczyszczania biblioteki (library pure prep magnetic beads) do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej. Należy otworzyć płytkę z produktem tag-PCR, dodać 10 µL produktu tag-PCR do kulek i wymieszać, pipetując pięciokrotnie w górę i w dół.Inkubuj mieszaninę przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę 96-dołkową na stojaku magnetycznym na cztery minuty. Gdy płytka 96-dołkowa wciąż znajduje się na stojaku, usuń i wylej supernatant za pomocą pipety.Po dwukrotnym przemyciu kulek etanolem zawierającym bufor płuczący, zgodnie z opisem w tekście protokołu, suszyć kulki przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wyjąć płytkę ze statywu. Resuspendować kulki, dodając 20 µL buforu elucyjnego do każdej studni i pipetując pięć razy w górę i w dół. Inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Umieść płytkę 96-dołkową z powrotem na statywie magnetycznym na cztery minuty, a następnie ostrożnie pobierz i przenieś 18 µL przezroczystego supernatantu do dołka w nowej płytce 96-dołkowej. Kolejnym krokiem w tym protokole jest kwantyfikacja każdej oczyszczonej biblioteki próbek za pomocą relatywnej konkurencyjnej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj w probówce do mikrocentryfugi odpowiednią ilość mieszaniny LQ master mix, stosując następujące objętości na próbkę: pięć µL 2x LQ master mix, dwa µL mieszaniny LQ primer probe mix, 0,5 µL LQ standard oraz 0,5 µL LQ ROX.Dodaj 8 µl mieszaniny LQ master mix do dołka optycznej płytki 96-dołkowej. W osobnych dołkach dodaj 2 µl rozcieńczeń seryjnych biblioteki, 2 µl kontroli pozytywnej LQ oraz 2 µl rozcieńczalnika LQ, a następnie wymieszaj poprzez pięciokrotne pipetowanie w górę i w dół. Umieść zamkniętą płytkę w systemie PCR i przypisz detektory FAM oraz VIC dla każdej próbki.Przeprowadzić amplifikację PCR zgodnie z następującymi warunkami cyklicznymi: pięć minut w 95°C, a następnie 15 sekund w 95°C oraz jedna minuta w 60°C przez 40 cykli. Następnie obliczono stężenie każdej próbki zgodnie z opisem w tekście protokołu. Po kwantyfikacji bibliotek każda biblioteka próbek została znormalizowana na podstawie zmierzonego stężenia i połączona w jednej probówce do sekwencjonowania.Do ułatwienia obliczeń związanych z normalizacją biblioteki i łączeniem próbek wykorzystuje się uproszczony moduł analizy. Aby znormalizować bibliotekę, należy w pierwszej kolejności wyznaczyć medianę stężenia w nanomolach dla wszystkich próbek zawierających unikalny indeks parowy przeznaczony do połączenia. Następnie należy obliczyć objętość pojedynczej próbki do połączenia w mikrolitrach, mnożąc medianę stężenia wszystkich próbek przez pięć, a następnie dzieląc wynik przez stężenie danej próbki.Dodaj znormalizowaną objętość każdej próbki do jednej probówki do mikrocentryfugi, aby utworzyć pulę próbek. Rozcieńcz pulę próbek do stężenia 1,25 nanomolar przy użyciu rozcieńczalnika do sekwencjonowania. Przygotuj pulę próbek do sekwencjonowania poprzez denaturację w obecności kontroli phix V3. Połącz następujące składniki: 15 µL puli próbek o stężeniu 1,25 nanomolar, 3 µL phix o stężeniu 0,5 nanomolar oraz 2 µL 1N wodorotlenku sodu.Po krótkim wymieszaniu w wirówce typu vortex i odwirowaniu, inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodać 8 µL zdenaturowanej biblioteki do 992 µL schłodzonego buforu HT1 high w probówce do mikrowirowania. Dodać 600 µL zdenaturowanej i rozcieńczonej biblioteki do pozycji numer 17 kartridża z odczynnikami.W probówkach do mikrocentryfugi osobno rozcieńcz cztery mikrolitry każdego startera sekwencjonującego w 636 mikrolitrach buforu HT1 high buffer. Dodaj 600 mikrolitrów rozcieńczonych starterów sekwencjonujących read-1 do pozycji numer 18 w kartridżu z odczynnikami do sekwencjonowania. Dodaj 600 mikrolitrów rozcieńczonych starterów indeksujących (index read) do pozycji numer 19 oraz 600 mikrolitrów rozcieńczonych starterów sekwencjonujących read-2 do pozycji numer 20.Należy załadować odczynniki do sekwenatora nowej generacji i przeprowadzić sekwencjonowanie par końcowych (paired-end) w cyklu 2 × 150 zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec dane z sekwencjonowania należy przeanalizować przy użyciu towarzyszącego oprogramowania bioinformatycznego. W jednym przebiegu NGS przy użyciu sekwenatora nablatowego można było przetworzyć łącznie 90 próbek.W przypadku przedstawionego zestawu danych próbki obejmowały linię komórkową, pozostałości materiału klinicznego utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie (FFPE) oraz syntetyczny matrycowy DNA, co pozwoliło uzyskać sekwencjonowanie o wysokiej głębokości i jednolitym pokryciu. Wartości odstające obejmowały kontrole bez matrycy, serię rozcieńczeń DNA jednej linii komórkowej z dużą amplifikacją liczby kopii oraz jedną próbkę DNA FFPE, która została oznaczona jako wykazująca inhibicję PCR w preanalitycznym teście kontroli jakości opartym na qPCR. Jednolitość pokrycia dla 46 amplikonów została zachowana przy udziale trzech różnych operatorów oraz dla różnych próbek DNA FFPE o niskiej jakości.W mieszaninie kontrolnej DNA z guza FFPE zawierającej znaną mutację BRAF V600E na poziomie 5% zgłoszono, że średnia zawartość docelowej mutacji BRAF wynosiła 5,2 ± 1,3 procent, co zostało wykazane przez trzech operatorów przy użyciu 400 kopii amplifikowalnych. Rozcieńczenia próbek DNA z linii komórkowych i FFPE z amplifikacjami liczby kopii wykazały zależność w przypadku amplifikacji EGFR oraz KRAS. Co istotne, ilość wejściowego DNA FFPE mogła zostać zredukowana do poziomu zaledwie 50 kopii amplifikowalnych lub 1,2 nanogramów całkowitego DNA.Zachowując jednocześnie wykrywalność znanych mutacji bez generowania wyników fałszywie dodatnich. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, cały proces zajmuje 11 godzin, z czego około trzy i pół godziny to czas pracy bezpośredniej dla serii 24 próbek jednocześnie.

integration-wet-dry-bench-processes-optimizes-targeted-next

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Cyfrowa adnotacja z automatyczną sekcją tkanek zapewnia innowacyjne podejście do wzbogacania guza w przypadkach o niskiej zawartości guza i jest dostosowana zarówno do parafiny, jak i mrożonych typów tkanek. Opisany przepływ pracy poprawia dokładność, odtwarzalność i przepustowość i może być stosowany zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych.

Zautomatyzowany protokół preparacji w celu wzbogacenia guza w tkankach o niskiej zawartości guza

Wzrost liczby biomarkerów molekularnych do testowania w leczeniu leczenia niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NS-NSCLC) skłonił do opracowania szybkich i niezawodnych metod wykrywania molekularnego. Opisujemy przebieg pracy do oceny zmian genomowych u pacjentów z NS-NSCLC przy użyciu podejścia ultraszybkiego sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Ultraszybkie sekwencjonowanie nowej generacji oparte na amplikonie w niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym raku płuca

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół pobierania próbek raka piersi, zaprojektowany tak, aby zoptymalizować ich zastosowanie w biobankowaniu, medycynie spersonalizowanej i innych zastosowaniach badawczych. Szczegółowo opisano proces pobierania próbek, w tym biopsję piersi i mastektomii, koncentrując się na minimalizacji uszkodzeń tkanek i maksymalizacji jakości próbki.

Optymalizacja procedur biopsji piersi i pobierania próbek po mastektomii dla biobankowania, medycyny spersonalizowanej i zastosowań badawczych

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Protokół ten opisuje zautomatyzowany, akredytowany przez ISO15189 proces sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania celowanych zmian genomowych w tkankach formalinowych osadzonych w parafinie tkankach raka płuc niedrobnokomórkowych (NSCLC).

Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj zintegrowany system sekwencjonowania NGS dla trudnych próbek nowotworowych, łączący reagenty laboratoryjne z narzędziami bioinformatycznymi. Metoda umożliwia dokładną analizę wariantów DNA z biopsji o niskiej jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości (Wideo) | JoVE Journal

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Przeglądaj więcej filmów