Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie kompleksowego systemu sekwencjonowania trudnych próbek raka, który łączy w sobie mokre odczynniki laboratoryjne, znormalizowane kontrole i zestaw bioinformatyczny. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka, takie jak sekwencjonowanie biopsji guza o niskiej ilości i niskiej jakości, aby uzyskać dokładne analizy i interpretacje wariantów DNA. Główną zaletą tej metody jest to, że próbki, które są trudne do sekwencjonowania, to te, które po prostu mają dostępne ograniczone ilości DNA, mogą być szybko i niezawodnie analizowane przy użyciu odczynników i kontroli z jednego źródła oraz w pełni zintegrowanego oprogramowania bioinformatycznego.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności ze względu na złożoność docelowego NGS, którą ta metoda upraszcza. Jednak procedury kwantyfikacji biblioteki i łączenia próbek wymagają szczególnej uwagi, aby osiągnąć jednolite pokrycie we wszystkich bibliotekach próbek. Protokół ten integruje procesy na mokrym i suchym stanowisku do sekwencjonowania trudnych próbek nowotworowych.

Pierwszym krokiem jest kwantyfikacja i kwalifikacja DNA w celu określenia liczby kopii matryc DNA, które można amplifikować metodą PCR w czasie rzeczywistym. Procedurę oznaczania ilościowego próbki i kontroli jakości należy rozpocząć od przygotowania wystarczającej ilości mieszanki wzorcowej w probówce do mikrowirówki. Użyj następujących objętości na próbkę: 5 mikrolitrów 2x mieszanki wzorcowej, 0.5 mikrolitra mieszanki sondy startera, 0.5 mikrolitra mieszanki sondy startera inhibicji, 0.05 mikrolitra ROX i 2.95 mikrolitra rozcieńczalnika.

Dodać dziewięć mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka na płytce 96-dołkowej. Dodaj jeden mikrolitr wzorców DNA w dwóch egzemplarzach i wymieszaj, pipetując w górę i w dół pięć razy. Po upewnieniu się, że próbka kwasu nukleinowego jest dobrze wymieszana, dodaj jeden mikrolitr próbki do mieszanki głównej i wymieszaj, pipetując w górę iw dół pięć razy.

Umieścić zapieczętowaną płytkę w systemie PCR. Wykonaj cykle PCR trwające 10 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie 40 cykli po 15 sekund w temperaturze 95 stopni Celsjusza i jedną minutę w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Przeanalizuj dane qPCR, generując wykres regresji liniowej dla każdego ze zduplikowanych wzorców DNA.

Stężenie nieznanego DNA w funkcjonalnej lub możliwej do amplifikacji liczbie kopii na mikrolitr jest następnie obliczane zgodnie z opisem w tekście protokołu. Kolejnym krokiem po kwantyfikacji próbki i kontroli jakości jest wzbogacenie sekwencji gorących punktów raka za pomocą multipleksowego PCR z pojedynczą probówką. Specyficzny dla genu lub gsPCR, zostanie przeprowadzony w celu wzbogacenia 46 loci w 21 genach nowotworowych.

Przygotuj wystarczającą ilość głównej mieszanki gsPCR w probówce mikrowirówkowej, używając następujących objętości na próbkę, pięć mikrolitrów 2-krotnej amplifikacji głównej mieszanki i jeden mikrolitr panelu starterów pan-rakowych. Podwielokrotność sześciu mikrolitrów wzorca gsPCR wymieszać z każdym dołkiem na 96-dołkowej płytce. Dodaj cztery mikrolitry każdej próbki kwasu nukleinowego do indywidualnych studzienek.

Wymieszać, pipetując pięć razy w górę i w dół. Dołącz odpowiednie kontrolki. Umieść szczelnie zapieczętowaną płytkę w termocyklerze na kolejne cykle PCR.

Pięć minut w 95 stopniach Celsjusza, 15 sekund w 95 stopniach Celsjusza, a następnie cztery minuty w 60 stopniach Celsjusza przez dwa cykle. 15 sekund w 95 stopniach Celsjusza, a następnie cztery minuty w 72 stopniach Celsjusza przez 23 cykle.

Końcowe przedłużenie o 10 minut w temperaturze 72 stopni Celsjusza, a następnie utrzymanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po PCR specyficznym dla genu wykonaj 10 cykli tag-PCR, aby włączyć adaptery specyficzne dla platformy w celu zapewnienia zgodności z sekwencjonowaniem nowej generacji. Dodać 7,5 mikrolitra 2-krotnej mieszanki głównej i 5,5 mikrolitra kodu indeksu do określonego dołka na 96-dołkowej płytce i wymieszać, pipetując pięć razy w górę iw dół.

Ostrożnie otwórz płytkę gsPCR i dodaj dwa mikrolitry produktu gsPCR do nowej płytki z mieszanką główną. Umieść zapieczętowaną płytkę w termocyklerze na kolejne cykle PCR: pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, 30 sekund w temperaturze 95 stopni Celsjusza, 30 sekund w temperaturze 55 stopni Celsjusza i jedną minutę w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez 10 cykli i końcowe przedłużenie o 10 minut w temperaturze 72 stopni Celsjusza. Następnie utrzymuje się w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po tag-PCR oczyszczanie biblioteki i wybór rozmiaru odbywa się za pomocą chemii kulek magnetycznych. Rozpocznij tę procedurę od dodania 11 mikrolitrów czystych kulek magnetycznych z biblioteki do oddzielnych studzienek 96-dołkowej płytki. Otwórz płytkę tag-PCR i dodaj 10 mikrolitrów produktu tag-PCR do kulek i wymieszaj, pipetując w górę iw dół pięć razy.

Inkubować mieszaninę przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Umieść 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym na cztery minuty. Trzymając 96-dołkową płytkę nadal na stojaku, usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.

Po dwukrotnym umyciu kulek buforem do płukania zawierającym etanol, zgodnie z opisem w tekście protokołu, należy wysuszyć kulki przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie zdjąć płytkę ze stojaka. Ponownie zawiesić kulki, dodając 20 mikrolitrów buforu elucyjnego do każdej studzienki i pipetując w górę iw dół pięć razy. Inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Umieść 96-dołkową płytkę z powrotem na stojaku magnetycznym na cztery minuty i ostrożnie wyjmij i przenieś 18 mikrolitrów klarownego supernatantu do studzienki w nowej 96-dołkowej płytce. Kolejnym krokiem w tym protokole jest kwantyfikacja każdej oczyszczonej biblioteki próbek za pomocą względnie konkurencyjnego PCR w czasie rzeczywistym. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wystarczającą ilość głównej mieszanki LQ w probówce mikrowirówkowej, używając następujących objętości na próbkę: pięć mikrolitrów 2x głównej mieszanki LQ, dwa mikrolitry mieszanki sondy startera LQ, 0,5 mikrolitra wzorca LQ i 0,5 mikrolitra LQ ROX.

Dodać 8 mikrolitrów głównej mieszanki LQ do dołka na optycznej płytce 96-dołkowej. W oddzielnych studzienkach dodać dwa mikrolitry seryjnego rozcieńczenia biblioteki, dwa mikrolitry kontroli pozytywnej LQ i dwa mikrolitry rozcieńczalnika LQ i wymieszać, pipetując w górę iw dół pięć razy. Umieść zapieczętowaną płytkę w systemie PCR i przypisz detektory FAM i VIC do każdej próbki.

Wykonaj amplifikację PCR w następujących warunkach cyklicznych: pięć minut w 95 stopniach Celsjusza i 15 sekund w 95 stopniach Celsjusza, a następnie jedna minuta w 60 stopniach Celsjusza przez 40 cykli. Stężenie każdej próbki jest następnie obliczane zgodnie z opisem w tekście protokołu. Po kwantyfikacji biblioteki każda biblioteka próbek jest normalizowana na podstawie zmierzonego stężenia i łączona w jednej probówce w celu sekwencjonowania.

Uproszczony moduł analizy jest używany w celu ułatwienia obliczeń na potrzeby normalizacji biblioteki i łączenia próbek. Aby znormalizować bibliotekę, najpierw określ medianę stężenia w nanomolach we wszystkich próbkach, z których każda zawiera unikalny indeks par, który ma zostać połączony. Następnie określ objętość pojedynczej próbki w mikrolitrach do połączenia, mnożąc medianę stężenia we wszystkich próbkach przez pięć, a następnie dzieląc przez jej indywidualne stężenie.

Dodaj znormalizowaną objętość każdej próbki do pojedynczej probówki mikrowirówkowej, aby utworzyć pulę próbek. Rozcieńczyć pulę próbek do 1,25 nanomola za pomocą rozcieńczalnika do sekwencjonowania. Przygotować pulę próbek do sekwencjonowania poprzez denaturację w obecności kontroli phix V3. Połącz następujące elementy: 15 mikrolitrów puli próbek o natężeniu 1,25 nanomola, trzy mikorylitry o stężeniu 0,5 nanomolowego phix i dwa mikrolitry 1N wodorotlenku sodu.

Po krótkim wirowaniu i odwirowaniu inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodać 8 mikrolitrów zdenaturowanej biblioteki do 992 mikrolitrów wstępnie schłodzonego wysokiego buforu HT1 w probówce do mikrowirówki. Dodać 600 mikrolitrów zdenaturowanej i rozcieńczonej biblioteki do pozycji numer 17 wkładu z odczynnikiem.

W probówkach do mikrowirówek oddzielnie rozcieńczyć cztery mikrolitry każdego startera sekwencjonowania 636 mikrolitrami wysokiego buforu HT1. Dodać 600 mikrolitrów rozcieńczonych starterów sekwencjonujących do odczytu 1 do pozycji numer 18 wkładu z odczynnikiem do sekwencjonowania. 600 mikrolitrów rozcieńczonych starterów do odczytu indeksu do pozycji numer 19 i 600 mikrolitrów rozcieńczonych starterów sekwencjonowania read-2 do pozycji numer 20.

Załaduj odczynniki do przyrządu do sekwencjonowania nowej generacji i wykonaj sparowany koniec, sekwencjonowanie dwa na 150 cykli zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec przeanalizuj dane sekwencjonowania za pomocą towarzyszącego oprogramowania bioinformatycznego. W sumie 90 próbek może być przetworzonych w jednym cyklu NGS przy użyciu sekwenatora laboratoryjnego.

W przypadku przedstawionego zestawu danych próbki obejmowały linię komórkową, resztkową kliniczną formalną i utrwaloną parafinę (FFPE) oraz syntetyczne matrycowe DNA, co skutkowało sekwencjonowaniem o dużej głębokości i jednolitym pokryciu. Wartości odstające składały się z kontroli bez matrycy, serii rozcieńczeń DNA jednej linii komórkowej z dużą amplifikacją liczby kopii oraz jednego DNA FFPE, które zostało oznaczone do hamowania PCR przez przedanalityczny test QC oparty na qPCR. Jednolitość pokrycia w 46 amplikonach została utrzymana przy użyciu trzech różnych operatorów i dla różnych próbek DNA FFPE o niskiej jakości.

W morfologii nowotworu FFPE mieszanina kontrolna DNA składająca się ze znanej 5% mutacji BRAF V600E została zgłoszona jako docelowa mutacja BRAF w średniej obfitości 5,2 plus minus 1,3 procent przez trzech operatorów przy użyciu danych wejściowych 400 amplifikowalnych kopii. Rozcieńczenia próbek DNA linii komórkowych i FFPE z wykazanymi amplifikacjami liczby kopii są zależne od amplifikacji EGFR i KRAS. Co ważne, dane wejściowe DNA FFPE można zredukować do zaledwie 50 amplifikowalnych kopii lub 1,2 nanograma DNA w masie.

Przy jednoczesnym zachowaniu wykrywania znanych mutacji bez żadnych fałszywych alarmów. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu 11 godzin przy około trzech i pół godzinie pracy ręcznej dla partii o wielkości 24 próbek na raz, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.