Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Ogólnym celem tego ukierunkowanego testu amplikonowego z wykorzystaniem sekwencjonowania następnej generacji jest wykrywanie mutacji patogennych w guzach pacjentów w celach terapeutycznych, w tym diagnostycznych, prognostycznych oraz w celu oceny odpowiedzi na terapię celowaną. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak to, czy pacjent posiada mutację w genie, która może przynieść korzyść z zastosowania terapii celowanej lub alternatywnej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykrycia za pomocą jednego testu mutacji o znaczeniu klinicznym, zarówno powszechnych, jak i rzadkich, w wielu genach w dowolnej tkance nowotworowej.

Ze względu na to, że techniki i technologia są niezwykle złożone, a poszczególne etapy trudne do opanowania, kluczowe jest przedstawienie tej metody w sposób wizualny. Jest to przełomowy moment w rozwoju onkologii medycznej. Dzięki wprowadzeniu sekwencjonowania nowej generacji do praktyki klinicznej, będziemy mogli zapewnić pacjentom więcej i lepszych metod leczenia nowotworów.

Nasi technolodzy CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy i Joe Grubb zaprezentują tę procedurę. Będę również pomagać w tym procesie, aby pokazać bardziej złożone części analizy. Po wyekstrahowaniu DNA genomowego zgodnie z protokołem tekstowym i instrukcją producenta, należy poddać dwie µL wyekstrahowanego DNA analizie na fluorometrze w celu uzyskania stężenia roboczego próbki.

Aby przygotować bibliotekę amplikonów, do pół-skirtowanej płytki 96-dołkowej, nazywanej płytką Hyb (Hyb Plate), należy dodać odpowiednią objętość buforu TE z niską zawartością EDTA oraz 5 µL z probówki z oligonukleotydami (Oligo Tube) danego panelu, a następnie do każdego odpowiedniego dołka dodać od 100 do 250 ng genomowego DNA. Jest to najważniejszy etap procesu, ponieważ jakakolwiek pomyłka na tym etapie będzie miała poważne konsekwencje. Po dodaniu odczynnika 1 do hybrydyzacji oligonukleotydów w celu sekwencjonowania (Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1) i wirowaniu zgodnie z protokołem tekstowym, należy inkubować płytkę Hyb w rozgrzanym inkubatorze do hybrydyzacji w temperaturze 95 °C przez jedną minutę.

Po powolnym schłodzeniu inkubatora do 40 °C, wyjmij płytkę z inkubatora i przenieś całą objętość każdej próbki z płytki hybrydyzacyjnej (Hyb Plate) do centrum wcześniej przygotowanej, przemytej, odpowiadającej jej jednostki płytki filtrującej, czyli FPU. Przykryj FPU i wiruj przy 2 250 ×g i 20 °C przez trzy minuty. Następnie dodaj 45 µL SW1 i ponownie wiruj.

Po drugim przemyciu roztworem SW1 i przemyciu roztworem UB1, dodaj 45 µL mieszaniny Extension Ligation Mix 3 do każdego dołka z próbką i wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół trzy razy. Użyj klejącej folii aluminiowej do uszczelnienia płytki, a następnie inkubuj cały zestaw FPU w rozgrzanym do 37 °C inkubatorze przez 45 minut. Aby zaindeksować amplifikację PCR, umieść startery w płytce do amplifikacji indeksów (Index Amplification Plate) lub w uchwycie IAP, a następnie rozdziel używane indeksy do odpowiednich dołków w płytce; dodaj 22 µL mieszaniny PCR Master Mix, 2E12, i wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół trzy razy.

Następnie, po odwirowaniu 45-minutowej reakcji ligacji wydłużającej zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 25 µL 50 mM wodorotlenku sodu do każdej studzienki próbki w FPU i pipetować ciecz w górę i w dół co najmniej sześć razy, upewniając się, że końcówka pipety styka się z membraną. Następnie, przy lekko nachylonej płytce i wielokanałowej pipecie ustawionej na 20 µL, należy pipetować wodorotlenek sodu w płytce FPU w górę i w dół co najmniej sześć razy. Przenieść eluat z FPU do odpowiadającej mu kolumny IAP.

Należy delikatnie pipetować ciecz w górę i w dół, aby dokładnie połączyć DNA z PCR Master Mix przed uruchomieniem programu PCR opisanego w protokole tekstowym. Po zweryfikowaniu wydajności biblioteki i inkubacji próbek z Magnetic Purification Beads zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 30 µL EBT do każdej studni z przemytymi kuleczkami. Pipetuj w górę i w dół kilka razy, aby upewnić się, że kuleczki oddzieliły się od ścianek probówki.

Po inkubacji płytki z wytrząsaniem, a następnie bez niego, należy umieścić płytkę na statywie magnetycznym i przenieść 20 µL supernatantu do całkowicie nowej płytki, nazywanej płytką do normalizacji biblioteki (LNP). Po przygotowaniu mieszaniny normalizującej, przy okresowym odwracaniu i wortexowaniu roztworu, należy dodać 45 µL do każdej próbki w LNP. Następnie płytkę należy uszczelnić przezroczystą folią przylepną i wytrząsać z prędkością 1 800 RPM przez 30 minut.

Po przemyciu kulek należy zdjąć LNP ze statywu magnetycznego, a w celu elucji próbki dodać 30 µL świeżego 0,1 normalnego wodorotlenku sodu do każdej studzienki. Następnie LNP należy wstrząsać z prędkością 1 800 RPM przez pięć minut. Umieść LNP z powrotem na statywie magnetycznym i po oczyszczeniu się nadsączu przenieś 30 µL eluatu do wcześniej przygotowanego Library Normalization Storage Buffer 1 w płycie do przechowywania (Storage Plate).

Przechyl płytkę, a następnie dodaj pięć µL każdej próbki przeznaczonej do sekwencjonowania do oznakowanej probówki 1,5 ml na połączoną bibliotekę amplikonów (Pooled Amplicon Library, PAL). W zależności od stosowanej chemii sekwencjonowania, dodaj od czterech do 10 µL PAL do 590–596 µL Buforu HT1. Oczyść i załaduj komórkę przepływową (Flow Cell).

Wprowadź odczynniki. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby rozpocząć sekwencjonowanie. Po zakończeniu sekwencjonowania uruchom potok bioinformatyczny.

Przeanalizuj statystyki przebiegu, aby upewnić się, że zsekwencjonowana biblioteka spełnia określone przez laboratorium kryteria kontroli jakości. Na koniec, w przeglądarze danych genomicznych (Genomic Data Viewer), dokonaj manualnego przeglądu każdego wariantu poprzez analizę plików BAM. Jest to podsumowanie najważniejszych statystyk przebiegu, z wyłączeniem średniego pokrycia, wykorzystywane do ustalenia, czy próbka z przygotowanej biblioteki przeszła kontrolę jakości. Jak widać tutaj w przypadku Case One, analiza bioinformatyczna wykryła cztery raportowalne mutacje związane z AML.

Mutacja missense w genie FLT3, mutacja missense w genie IDH2 oraz mutacja przesunięcia ramki odczytu w genie NPM1. Mutacje w genie FLT3 obserwuje się u około 25% dorosłych pacjentów z AML. Znaczenie prognostyczne punktowych mutacji w domenie kinazy FLT3, zaobserwowanych u tego pacjenta z AML, ma niejasny wpływ na rokowanie.

Dehydrogenaza izocytrynianowa 2, czyli IDH2, koduje modyfikator epigenetyczny, który jest powszechnie mutowany w AML. Mutacje w genie nukleofosminy, czyli NPM1, należą do najczęściej występujących mutacji nabytych w AML. W poniższej tabeli wymieniono wszystkie warianty eksonowe dla Przypadku Drugiego.

Wykryto dwie mutacje związane z chorobą. Insertywną mutację w ramach odczytu w eksonie 20 genu ERBB2 oraz mutację missense w genie TP53. HER2/neu, czyli ERBB2, koduje receptor kinazy tyrozynowej.

Aktywujące insercje w eksonie 20 genu HER2/neu obserwuje się u 2 do 4% pacjentów z gruczolakorakiem płuca i stanowią one większość mutacji HER2/neu stwierdzanych w raku płuca. Zmiany w genie TP53 są również częste w nowotworach. Niezbędne jest zatem zwrócenie szczególnej uwagi na jakość i ilość wyizolowanego DNA.

Jest to szczególnie istotne w przypadku próbek FFPE. Często charakteryzują się one wysokim stopniem degradacji i zmienną wydajnością pozyskiwania DNA. W procesie walidacji testu klinicznego należy ustalić wskaźniki jakości i ilości DNA dla każdej próbki przed przekazaniem DNA do etapu przygotowania biblioteki.

Oprócz przygotowania biblioteki kluczowe jest zwalidowanie planu bioinformatycznego poprzez określenie wartości odcięcia dla procesu sekwencjonowania, statystyk kontroli jakości, statystyk przygotowania biblioteki, głębokości pokrycia amplikonu oraz minimalnej raportowalnej częstości alleli. Po opanowaniu procedury przygotowanie biblioteki można przeprowadzić w ciągu jednego dnia roboczego. Jednak cały przebieg analizy wymaga więcej czasu na ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie, przetwarzanie danych i analizę wariantów.

Niniejsza procedura została opracowana wyłącznie w celu analizy mutacji w genomowym DNA w wybranych kluczowych punktach zapalnych (hot spots). W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak różnicowa ekspresja genów, ocena ryzyka wystąpienia nowotworów oraz analizy reorganizacji strukturalnych, można przeprowadzić inne badania z wykorzystaniem RNA. Na horyzoncie znajdują się istotne postępy w tej dziedzinie.

Wprowadzenie automatyzacji oraz zastosowanie unikalnego kodowania molekularnego pozwolą laboratoriom na skrócenie czasu realizacji badań, zmniejszenie ilości wykorzystywanego materiału biologicznego oraz wykrywanie wariantów o bardzo niskiej częstotliwości alleli. Wykrywanie mutacji związanych z chorobą w próbkach nowotworowych stanowi standard opieki od dziesięcioleci. NGS jest mniej obciążone błędem podejście do równoległego sekwencjonowania wielu genów powiązanych z wieloma typami nowotworów, co prowadzi do identyfikacji wielu mutacji i lepszego doboru metod leczenia pacjentów.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.