Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych
September 20th, 2016
Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.
Ogólnym celem tego ukierunkowanego testu amplikonowego sekwencjonowania nowej generacji jest wykrycie patogennych mutacji w nowotworach pacjentów do celów terapeutycznych, w tym diagnostycznych, prognostycznych, i odpowiedzi na terapię celowaną. Metoda ta odpowiada na kluczowe pytania, takie jak to, czy pacjent ma mutację w genie, który może odnieść korzyści z terapii celowanej lub alternatywnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że możliwe do działania mutacje, zarówno powszechne, jak i rzadkie, w wielu genach można wykryć w dowolnej tkance nowotworowej za pomocą jednego testu.
Ponieważ techniki i technologia są tak złożone, a kroki są tak trudne do nauczenia, bardzo ważne jest, aby zademonstrować tę metodę wizualnie. Jest to decydujący moment w rozwoju onkologii medycznej. Wraz z przyjęciem sekwencjonowania nowej generacji do kliniki, będziemy mieli więcej lepszych metod leczenia raka dla naszych pacjentów.
Nasi technolodzy CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy i Joe Grubb, zademonstrują tę procedurę. Pomogę również w tym procesie, aby pokazać bardziej złożone części testu. Po ekstrakcji genomowego DNA zgodnie z protokołem tekstowym, zgodnie z protokołem producenta, należy uruchomić dwa mikrolitry wyekstrahowanego DNA na fluorometrze, aby uzyskać stężenie robocze próbki.
Aby utworzyć bibliotekę amplikonów, w 96-dołkowej płytce z półspódniczką zwanej płytką Hyb, dodaj niezbędną objętość niskiego EDTA TE, pięć mikrolitrów rurki Oligo Tube panelu, dodaj od 100 do 250 nanogramów genomowego DNA do każdej odpowiedniej studzienki. Jest to najważniejszy krok, ponieważ każde zamieszanie w tym miejscu będzie miało poważne konsekwencje. Po dodaniu Oligonotywirusozytorii do sekwencjonowania odczynnika 1 i wirowaniu zgodnie z protokołem tekstowym, inkubuj płytkę Hyb w podgrzanym inkubatorze hybrydyzacyjnym w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez jedną minutę.
Po powolnym schłodzeniu inkubatora do 40 stopni Celsjusza wyjmij płytkę z inkubatora i przenieś całą objętość każdej próbki z płytki Hyb do środka wcześniej przygotowanej odpowiedniej, wstępnie umytej jednostki płytki filtracyjnej lub FPU. Przykryj FPU i odwiruj w temperaturze 2 250 razy G i 20 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj 45 mikrolitrów SW1 i ponownie odwiruj.
Po drugim przemyciu SW1 i przemyciu UB1, dodać 45 mikrolitrów Extension Ligation Mix 3 do każdej studzienki próbki i trzykrotnie przeciskać w górę i w dół, aby wymieszać. Użyj samoprzylepnej folii aluminiowej, aby uszczelnić płytkę i inkubuj cały zespół FPU w inkubatorze nagrzanym do 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Aby zindeksować amplifikację PCR, ułóż startery na płytce do amplifikacji indeksu lub oprawie IAP i podwielokrotn używane indeksy do odpowiednich dołków na płytce, a następnie dodaj 22 mikrolitry PCR Master Mix, 2E12 i trzykrotnie przetaczaj w górę iw dół.
Następnie, po odkręceniu 45-minutowej reakcji podwiązania przedłużającego zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 25 mikrolitrów 50-milimolowego wodorotlenku sodu do każdej studzienki próbki FPU i przeruruj ją w górę iw dół co najmniej sześć razy, upewniając się, że końcówka pipety styka się z membraną. Następnie, z lekko przechyloną płytką i pipetą wielokanałową ustawioną na 20 mikrolitrów, odpipetuj wodorotlenek sodu w płytce FPU w górę iw dół co najmniej sześć razy. Przenieść elucję z FPU do odpowiedniej kolumny IAP.
Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie połączyć DNA z PCR Master Mix przed uruchomieniem programu PCR opisanego w protokole tekstowym. Po zweryfikowaniu wydajności biblioteki i inkubacji próbek za pomocą magnetycznych kulek oczyszczających zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 30 mikrolitrów EBT do każdej studzienki umytych kulek. Odpipetuj kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że koraliki odchodzą od boku probówki.
Po inkubacji płytki, a następnie bez wstrząsania, umieść płytkę na stojaku magnetycznym i przenieś 20 mikrolitrów supernatantu na zupełnie nową płytkę zwaną płytką normalizacyjną biblioteki lub LNP. Po przygotowaniu mieszaniny normalizacyjnej, z przerywaną inwersją i wirowaniem roztworu, dodać 45 mikrolitrów do każdej próbki LNP. Następnie użyj przezroczystej folii samoprzylepnej, aby uszczelnić płytkę i potrząsaj z prędkością 1 800 obr./min przez 30 minut.
Po umyciu kulek wyjmij LNP ze stojaka magnetycznego i aby wymyć próbkę, dodaj 30 mikrolitrów świeżego 0,1 normalnego wodorotlenku sodu do każdej studzienki. Następnie potrząsaj LNP przy 1 800 RMP przez pięć minut. Umieścić LNP z powrotem na stojaku magnetycznym, a po oczyszczeniu supernatantu przenieść 30 mikrolitrów elucji do wcześniej przygotowanego bufora normalizacyjnego biblioteki 1 na płytce pamięciowej.
Zegnij płytkę, a następnie dodaj pięć mikrolitrów każdej próbki, która ma być sekwencjonowana, do oznaczonej Pooled Amplicon Library lub PAL, 1,5-mililitrowej probówki. W zależności od tego, jaka chemia sekwencjonowania jest używana, dodaj od czterech do 10 mikrolitrów PAL do 590 do 596 mikrolitrów buforu HT1. Wyczyść i załaduj komórkę przepływową.
Załaduj odczynniki. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby rozpocząć sekwencjonowanie. Po zakończeniu sekwencjonowania wykonaj potok bioinfomatyczny.
Przeanalizuj statystyki uruchomienia, aby upewnić się, że sekwencjonowana biblioteka przeszła określone przez laboratorium metryki kontroli jakości. Na koniec w przeglądarce danych genomicznych ręcznie przejrzyj każdy wariant, wyświetlając pliki BAM. Jest to podsumowanie najważniejszych statystyk dotyczących przebiegu, bez uwzględnienia średniego zasięgu, służących do określenia, czy próbka przygotowana do przygotowania biblioteki przeszła QC.As widoczne tutaj dla przypadku pierwszego, Bioinformatyka wykryła cztery zgłaszalne mutacje związane z AML.
Mutacja missense w FLT3, mutacja missense w IDH2 i mutacja przesunięcia ramki w NPM1. Mutacje w FLT3 obserwuje się u około 25% dorosłych pacjentów z AML. Znaczenie prognostyczne mutacji punktowych kinazy FLT3, obserwowane u tego pacjenta z AML, ma niejasny wpływ na rokowanie.
Dehydrogenaza izocytrynianowa 2 lub IDH2 koduje modyfikator epigenetyczny, który jest często zmutowany w AML. Mutacje w genie nukleofosminy lub NPM1 są jedną z najczęściej nabytych mutacji w AML. Poniższa tabela zawiera listę wszystkich wariantów egzonicznych dla przypadku drugiego.
Wykryto dwie mutacje związane z chorobą. Insercja w klatce w eksonie 20 ERBB2 i mutacja missense w TP53. HER2/neu lub ERBB2 koduje receptor kinazy tyrozyny.
Aktywacja insercji HER2/neu Exon 20 obserwuje się w 2 do 4% gruczolakoraków płuc i odpowiada ona za większość mutacji HER2/neu obserwowanych w raku płuc. Zmiany TP53 są również powszechne w raku. Konieczne jest zwrócenie szczególnej uwagi na jakość i ilość wyekstrahowanego DNA.
Jest to szczególnie ważne w przypadku próbek FFPE. Próbujemy często mocno zdegradowanych za pomocą zmiennej, jaką daje DNA. Podczas procesu walidacji testu klinicznego należy ustalić wskaźniki jakości i ilości DNA dla każdej próbki przed przekazaniem DNA do przygotowania biblioteki.
Oprócz przygotowania biblioteki, kluczowe znaczenie ma walidacja Bioinfomatic Spy Plan, poprzez określenie wartości granicznych dla przebiegu sekwencjonowania, statystyk kontroli jakości, statystyk przygotowania biblioteki, głębokości odwagi Ampliconu i minimalnej częstotliwości alleli podlegającej zgłoszeniu. Po opanowaniu przygotowania biblioteki można je wykonać w ciągu jednego dnia roboczego. Jednak ogólny przebieg testu wymaga więcej czasu na ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie, przetwarzanie danych i przegląd wariantów.
Procedura ta ma na celu przyjrzenie się tylko mutacjom genomowego DNA w niektórych kluczowych gorących punktach. Inne masy, które wykorzystują RNA, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak różnicowa ekspresja genów, powiązanie ryzyka nowotworów i rearanżacje strukturalne. Na horyzoncie widać duże postępy.
Zastosowanie automatyzacji i włączenie unikalnego molekularnego kodu kreskowego pozwoli laboratoriom skrócić czas realizacji, zużywać mniej próbek wejściowych i wykrywać warianty przy bardzo niskiej częstotliwości alleli. Wykrywanie mutacji związanych z chorobą w próbkach nowotworowych jest standardem opieki od dziesięcioleci. NGS jest mniej stronniczym podejściem do sekwencjonowania wielu genów związanych z wieloma nowotworami równolegle, co prowadzi do identyfikacji wielu mutacji i lepszych metod leczenia pacjentów.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla paneli sekwencjonowania nowej generacji ukierunkowanych na nowotwory krwi i guzy stałe. Klasyfikacja molekularna mutacji predysponujących zapewnia cenne informacje prognostyczne i predykcyjne dla leczenia raka.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Genomika
- Medycyna precyzyjna
Tło
- Sekwencjonowanie nowej generacji umożliwia wykrywanie patogennych mutacji w guzach.
- Rozumienie mutacji może przewodzić decyzjom terapeutycznym.
- Złożone techniki wymagają wizualnych demonstracji dla efektywnego uczenia się.
- Postępy w technologii sekwencjonowania są kluczowe dla poprawy terapii raka.
Cel badania
- Rozwój protokołów wykrywania działalnych mutacji u pacjentów z rakiem.
- Poprawa zdolności diagnostycznych i prognostycznych w onkologii.
- Ułatwienie stosowania terapii ukierunkowanej na podstawie informacji genetycznych.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja DNA genomowego z próbek guzowych.
- Przygotowanie bibliotek Amplicon za pomocą specyficznych reagentów.
- Wdrożenie protokołów amplifikacji PCR i sekwencjonowania.
- Analiza bioinformatyczna do oceny wyników sekwencjonowania i wykrywania wariantów.
Główne wyniki
- Wykrycie mutacji raportowanych związanych z ostrą białaczką szpikową (AML).
- Identyfikacja mutacji w genach FLT3, IDH2 i NPM1.
- Wgląd w znaczenie prognostyczne tych mutacji.
- Demonstracja efektywności metody w warunkach klinicznych.
Wnioski
- Sekwencjonowanie nowej generacji jest potężnym narzędziem do analizy mutacji rakowych.
- Działalne mutacje mogą znacząco wpływać na strategie leczenia.
- Wizualizacje ułatwiają zrozumienie złożonych metodologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Next-generation sequencing (NGS) panels for solid and liquid tumors enable comprehensive detection of actionable mutations, directly informing therapeutic strategies and prognostic assessment in oncology pipelines. Integrating robust NGS workflows with stringent quality control and bioinformatics review enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions. These capabilities are critical for advancing precision medicine and optimizing translational continuity from discovery through clinical implementation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of driver mutations for functional target validation in cancer models.
- Supports biological de-risking by clarifying mutational landscapes relevant to disease progression.
- Facilitates prioritization of therapeutic hypotheses based on mutation prevalence and pathogenicity.
Screening & Assay Development
- Provides validated mutation panels for standardized screening across diverse tumor types.
- Ensures reproducibility and quantitative output through rigorous DNA quality and integrity controls.
- Enables scalable, multiplexed detection of rare and common variants in a single workflow.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant biomarkers for translational research continuity.
- Supports preclinical model selection and mechanistic de-risking based on actionable mutation status.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by integrating genomic data with clinical endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
NGS-based mutation detection bridges early discovery, lead identification, and translational research by providing high-confidence genomic data for decision-making.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through comprehensive mutation profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative variant detection for assay readiness and downstream evaluation.
- Analytics: Provides robust variant calling, allele frequency quantification, and QC metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease models and biomarker strategies when supported by mutation data.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable NGS workflow adaptable to evolving oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes mutation detection with reproducible, scalable protocols and bioinformatics pipelines.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires specialized expertise in molecular biology, sequencing, and bioinformatics analysis.
- Demands high-quality instrumentation for DNA extraction, library preparation, and sequencing.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of QC metrics and variant interpretation thresholds.
- Must adapt protocols for variable sample types, especially FFPE and low-yield specimens.
- Relies on validated bioinformatics pipelines and established cutoff values for reliable reporting.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Genomic DNA Quality Control and Amplicon Library Preparation
3:23
Indexing and PCR Amplification
4:37
PCR Purification and Bead-based Normalization
6:33
Sequencing and Data Analysis
7:19
Results: Mutations Detected in Solid and Liquid Tumors Using Next Generation Sequencing
9:06
Conclusion
