Name: Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Poznaj metody sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania mutacji w guzach litych i płynnych. Technika ta umożliwia identyfikację zmian genetycznych w genach FLT3, IDH2 i NPM1, wspierając precyzyjną diagnostykę onkologiczną i dobór terapii celowanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Danielowi Wildowi za przeczytanie manuskryptu i pomoc w jego przygotowaniu.

<ol><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Campbell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patterns+and+dynamics+of+genomic+instability+in+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).</li>
<li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+clinical+cancer+genomic+profiling+test+based+on+massively+parallel+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing.</a> Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC+%28the+Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer+%29%3A+a+resource+to+investigate+acquired+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).</li>
<li>Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mutations+in+epigenetic+regulators+in+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies.</a> Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).</li>
<li>Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+acute+myeloid+leukaemia+in+adults+-+biological+significance+and+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults - biological significance and clinical use.</a> Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).</li>
<li>Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics in acute myeloid leukemia.</a> Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).</li>
<li>Subramanian, J., Govindan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+in+%26%2334%3BNever-smokers%26%2334%3B%3A+a+unique+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+%28Williston+Park%29%22%5BJournal%5D)">Lung cancer in &#34;Never-smokers&#34;: a unique entity.</a> Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).</li>
<li>Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+pathology+of+non-small+cell+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma.</a> Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+clinicopathologic+associations%2C+and+molecular+spectrum+of+ERBB2+%28HER2%29+tyrosine+kinase+mutations+in+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).</li>
<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+neratinib+in+combination+with+temsirolimus+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-dependent+and+other+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors.</a> J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).</li>
<li>Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+FLT3+ITD+and+D835+mutations+in+AML+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+J%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients.</a> Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).</li>
<li>Mazières, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+that+harbors+an+HER2+mutation+epidemiologic+characteristics+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives.</a> J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 495-500 (2011).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+exploring+the+world%27s+knowledge+of+somatic+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).</li>
<li>Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+limitations+of+next+generation+sequencing+informatics%2C+an+approach+to+clinical+pipeline+validation+using+artificial+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets.</a> Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).</li>
<li>Haraksingh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Mapping+of+Copy+Number+Variation+in+Humans%3A+Comparative+Analysis+of+High+Resolution+Array+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27859(2011).</li>
<li>de Leeuw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+Array+Analysis+in+Constitutional+and+Cancer+Genome+Diagnostics+-+Copy+Number+Variants%2C+Genotyping+and+Quality+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control.</a> Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ dwa testy NGS opisane w tym manuskrypcie są oferowane klinicznie, najważniejszą kwestią praktyczną jest kontrola jakości. W szczególności należy zwrócić szczególną uwagę na jakość i ilość wyekstrahowanego DNA. Jest to szczególnie ważne w przypadku próbek FFPE, które często są silnie zdegradowane ze zmienną wydajnością DNA. Opracowano metodę wytrącania izopropanolu w celu maksymalizacji wydajności DNA z próbek FFPE, ponieważ stwierdzono, że metody oparte na kolumnach czasami prowadzą do ścinania DNA przy ograniczonych objętościach elucji. Dlatego w większości przypadków, gdy próbka ma zbyt niskie stężenie lub jest zbyt zdegradowana do testu, najprawdopodobniej jest to spowodowane rozmiarem, typem lub utrwaleniem tkanki, a nie procesem ekstrakcji. W przypadku próbek krwi/szpiku kostnego, jeśli nie dojdzie do ekstrakcji, jest to zwykle spowodowane hemodylucją próbki (tj. niewystarczającą liczbą białych krwinek lub komórek nowotworowych w tym pobraniu) lub ablacją chemioterapii.
Podczas walidacji należy ustalić wartości graniczne dla akceptowalności jakości i ilości DNA. W teście często stosuje się zalecane wejście 100 - 250 ng; jednak jeśli jakość DNA jest dobra, niższe ilości wejściowe mogą być skuteczne. Ponadto, jeśli jakość DNA jest słaba (tj. ilość amplifikowanego DNA jest mniejsza niż 100 - 250 ng), wówczas wyższe ilości wejściowe mogą poprawić jakość wyników sekwencjonowania (ponieważ ilość amplifikowanego DNA osiągnie zalecany wejście). Wskaźniki jakości i ilości DNA powinny być stosowane do każdej próbki przed przekazaniem DNA do przygotowania biblioteki. Próbki znajdujące się w "szarej strefie" (zob . rysunek 2) powinny być badane według uznania dyrektora laboratorium lub osoby przez niego wyznaczonej. Obecnie najlepszym sposobem przewidywania, czy DNA nie będzie działać dobrze podczas sekwencjonowania, jest wykonanie testu opartego na qPCR, który pozwala na kwantyfikację i ocenę jakości wejściowego DNA. Podejście to dotyczy biodostępności fragmentów o różnych rozmiarach w próbce poprzez amplifikację fragmentów o różnych rozmiarach (np. 100 pz, 150 pz, 200 pz i 300 pz) oraz wydajność porównawczą.
Obecnie przygotowanie biblioteki obejmuje dużą liczbę ręcznych kroków, w których błąd w jednym z kilku momentów może spowodować awarię biblioteki lub jej niską jakość. Analiza żelu mikroprzepływowego jest jedynym krokiem kontroli jakości, który pozwala sprawdzić problem z przygotowaniem biblioteki przed sekwencjonowaniem. W związku z tym istnieje kilka krytycznych kroków, w których dodatkowa uważność może zwiększyć prawdopodobieństwo udanej reakcji. Konieczne jest zagwarantowanie, że dla każdej próbki używana jest właściwa próbka i pula oligonukleotydów. Upewnienie się i prawidłowe zarejestrowanie, że każda próbka zawiera jedną z 96 unikalnych kombinacji podwójnie indeksowanych par starterów PCR, zmniejsza ryzyko pomieszania próbki. Ważne jest również, aby upewnić się, że płyta filtracyjna (FPU) prawidłowo opróżnia; Jeśli nie zostanie odpowiednio opróżniony, może to spowodować, że etap przedłużenia-ligacji przygotowania biblioteki będzie działał nieoptymalnie i doprowadzi do niskiej jakości danych sekwencjonowania. Po kontroli jakości biblioteki ważne jest, aby upewnić się, że kulki LNB1 są w pełni zawieszone i że roztwór LNB1 / LNA1 jest dobrze wymieszany przed dodaniem go do próbek, ponieważ stężenie tej mieszaniny służy do określenia molowości biblioteki. Wreszcie, jeśli etap elucji kulek prowadzi do nieoptymalnej ilości elucji biblioteki z koralików, zmniejszy to gęstość grupowania i prawdopodobnie spowoduje, że biblioteka nie uzyska odpowiedniego średniego pokrycia. I odwrotnie, nadmiar biblioteki doprowadzi do gorszej jakości odczytów. Dlatego ważne jest, aby zachować spójność na etapie normalizacji opartej na koralikach, aby zapewnić optymalne łączenie i grupowanie bibliotek w sekwencerze.
Oprócz przygotowania biblioteki, kluczowe znaczenie ma walidacja potoku bioinformatycznego, który będzie generował dokładne wywołania mutacji z surowych, zdemultipleksowanych plików fastq. Wybór niestandardowego rozwiązania może być czasochłonny, ponieważ istnieje wiele dostępnych nakładek typu open source i komercyjnie, wywoływania wariantów i pakietów oprogramowania NGS, które trzeba by przesiać. Konieczne będzie zaprojektowanie niestandardowych algorytmów, aby wyodrębnić podstawowe statystyki wydajności, zidentyfikować unikalne powtarzające się mutacje, które wymknęły się większości narzędzi open source, oraz określić status liczby kopii dla każdego z loci. Podczas procesu walidacji potoku bioinformatycznego ważne jest, aby określić możliwe do zgłoszenia wartości odcięcia dla wariantów, które spełniają lub przekraczają zarówno minimalną głębokość pokrycia po filtrowaniu jakości (np. co najmniej 250 odczytów), jak i minimalną częstość alleli (np. 4%). Ponieważ jest to multipleksowany test oparty na amplikonie, ważne jest, aby określić minimalną średnią głębokość pokrycia (np. 1,000x), którą biblioteka musi osiągnąć, aby móc uzyskać najniższy wydajność amplikonu do minimalnej głębokości odczytów. Ponadto multipleksowy charakter testu powoduje efekty niedocelowe, a te "artefakty" będą musiały zostać odkryte i w pełni zweryfikowane przed uruchomieniem. Innym ważnym ograniczeniem opisanego testu jest potrzeba, aby próbki zawierały więcej niż 10% guza, aby osiągnąć zwalidowaną minimalną częstość alleli.
Wykrycie insercji FLT3 o niskiej częstotliwości, 1%, jest dowodem na to, że ręczny przegląd jest nadal pożądany w tym procesie. Nawet przy odcięciu częstości alleli wynoszącym 5%, niektóre ważne mutacje mogą zostać pominięte, a zatem ręczny przegląd będzie niezbędny do ustalenia tych wariantów. W przypadku FLT3-ITD kontrola wzrokowa eksonu 14 jest wykonywana u wszystkich pacjentów z AML, aby upewnić się, że niski poziom lub duża insercja/duplikacja nie pozostanie niezauważona. Ponadto insercje eksonu HER2 20, które zwykle znajdują się obok sekwencji startera, wymagają ręcznej interwencji. Pomimo solidnego rurociągu bioinformatycznego, niektóre warianty mogą zostać przeoczone, co jest po prostu naturą twardego odcięcia dla większości wyżej wymienionych statystyk. Aby złagodzić ten problem, potrzebna byłaby lepsza bioinformatyka, a także lepsze przygotowanie bibliotek i/lub metodologie sekwencjonowania, ponieważ korzystniejsze jest posiadanie dobrej jakości danych przy jeszcze niższych wartościach granicznych, które zawierają mniej artefaktów i wyników fałszywie dodatnich.
Wykrywanie i interpretacja częstości alleli może być trudna ze względu na trudności w określeniu procentu guza i odchylenie amplifikacji niektórych regionów genomu. Ponadto można wykryć częstość alleli powyżej 50%, jak zaobserwowano w przypadku 2. Jest to interpretowane jako utrata heterozygotyczności (LOH), albo z powodu utraty normalnego allelu, co prowadzi do pozornego wzrostu odczytów mutantów, przyrostu zmutowanego allelu (np. 2 zmutowane i jedna normalna kopia), albo innych mechanizmów. Mechanizmy te można wyjaśnić, wykorzystując macierzową porównawczą hybrydyzację genomową (aCGH19) i/lub macierz genotypowania SNP. Lokal mieszkalny 20.
Obecne metodologie wzbogacania celu opierają się na całodniowych procedurach albo nieefektywnego wychwytywania hybrydowego, albo technik multipleksowanego PCR, które skutkują potrzebą większego pokrycia sekwencjonowania pojedynczej próbki i większej liczby odczytów sekwencjonowania poza celem. Dodatkowe zastosowania onkologii molekularnej NGS, które spodziewane są w najbliższej przyszłości, będą obejmowały łatwiejsze metody przygotowywania bibliotek, które mogą być w pełni zautomatyzowane i być w stanie przetwarzać próbki z bardzo małą ilością wejściowego DNA (tj. mniej niż 1 ng), a także próbki z wysoce zdegradowanym DNA. Aby sprostać tym wyzwaniom, większość metod będzie prawdopodobnie oparta na PCR, albo będzie to wieloetapowe podejście PCR, albo masowo równoległe podejście singleplex PCR. Ponadto wykazano, że molekularne kodowanie kreskowe poszczególnych amplikonów radykalnie zmniejsza szum sekwencjonowania tła i umożliwi testowanie próbek z niższymi proporcjami komórek nowotworowych w celu osiągnięcia niższych częstości alleli i przejścia do wychwytywania krążących komórek nowotworowych.
Wykrywanie mutacji związanych z chorobą w próbkach nowotworowych jest standardem opieki od dziesięcioleci. Historycznie rzecz biorąc, geny były często testowane sekwencyjnie, po jednym genie/eksonie na raz, z identyfikacją mutacji prowadzącą do końca sekwencji testowej. Pojawienie się NGS pozwoliło na mniej stronnicze podejście do sekwencjonowania wielu genów związanych z wieloma nowotworami równolegle, co doprowadziło do identyfikacji wielu mutacji związanych z nowotworami. Kliniczna przydatność NGS w wykrywaniu mutacji somatycznych w nowotworach jest coraz bardziej widoczna. Rzeczywiście, analiza próbek nowotworów oparta na NGS stanowi nowy paradygmat, który rzuca wyzwanie tradycyjnym testom pojedynczych genów, ale użyteczność kliniczna jest bardzo jasna. Laboratoria kliniczne mają dziś ekscytującą okazję do połączenia starannej walidacji metod i interpretacji testów z zastosowaniem tej potężnej technologii.

Sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) próbek onkologicznych stało się w ostatnich latach bardziej dostępne, ponieważ coraz obszerniejsza literatura naukowa wskazuje na znaczenie identyfikacji celowanych zmian genetycznych oraz predykcyjnych i prognostycznych markerów molekularnych. Analizy paneli wielogenowych oraz badania sekwencjonowania całego egzomu w przypadku nowotworów nabłonkowych1,2 i hematologicznych3 ugruntowały koncepcję heterogeniczności guza oraz ewolucji klonalnej w miarę postępu i nawrotów choroby. Ponadto, w przeciwieństwie do konkurencyjnych technologii, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) czy sekwencjonowanie metodą Sangera, NGS pozwala na wykrycie większości alteracji genomicznych we wszystkich istotnych klinicznie genach nowotworowych w ramach jednego badania4.
Centrum Diagnostyki Personalizowanej zostało początkowo uruchomione z dwoma klinicznymi panelami NGS: dedykowanym panelem hematologicznym (Heme-NGS Panel) oraz gotowym panelem nowotworowym dla próbek FFPE (Solid-NGS Panel) (patrz Rysunek 1). Panele te obejmują klinicznie istotne lub szczególnie interesujące regiony wybranych genów; nie wszystkie geny lub egzony są pokryte w całości. Amplikony są generowane poprzez hybrydyzację sond, a następnie elongację i ligację. Regiony docelowe są dalej amplifikowane za pomocą PCR z użyciem uniwersalnych starterów z podwójnym indeksem, co pozwala na łączenie do 96 próbek w jednej puli do sekwencjonowania.
<img alt="Rysunek 1" src="/files/ftp_upload/52758/52758fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Lista genów objętych panelami. Przygotowanie biblioteki przeprowadza się przy użyciu niestandardowego panelu hematologicznego (Heme-NGS Panel) obejmującego 33 geny lub gotowego panelu amplikonowego do nowotworów (Solid-NGS) obejmującego 47 genów. Nie wszystkie geny lub eksony są pokryte w całości, ponieważ niektóre amplikony mogą obejmować jedynie określone regiony hotspot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Zawartość panelu Heme-NGS została opracowana na podstawie wielu źródeł, jednak koncentruje się ona na 16 genach zmutowanych w ostrej białaczkach szpikowej (AML), które wcześniej opisano jako wykazujące wysoką użyteczność kliniczną5. Panel Solid-NGS jest produkowany komercyjnie, a obszary docelowe oparto na genach często mutujących w nowotworach, zgodnie z informacjami zawartymi w bazie danych Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC)6.
Cały proces pracy w przypadku klinicznego NGS charakteryzuje się kilkoma kluczowymi etapami. Po zleceniu testu przez lekarza klinicystę, patomorfolog ocenia odpowiedniość materiału, analizując procentową zawartość nowotworu oraz objętość próbki. W naszej instytucji wymagamy co najmniej 10% tkanki nowotworowej ze względu na poziom błędu sekwencjonowania w tle („szum”) danej technologii oraz wydajność podejścia celowanego. Jeśli tkanka jest odpowiednia do badań, ekstrahowane jest genomowe DNA. Następnie DNA to poddawane jest wielokrotnym etapom kontroli jakości (QC). Jeśli DNA przejdzie kontrolę jakości, generowana i sekwencjonowana jest biblioteka amplikonów. Uzyskane dane są analizowane za pomocą wewnętrznego potoku bioinformatycznego. Po analizie bioinformatycznej warianty są ręcznie przeglądane i interpretowane pod kątem patogenności przed włączeniem ich do raportu klinicznego. Poniżej opisujemy dwa przypadki, które przeszły przez ten rygorystyczny proces i w konsekwencji doprowadziły do zmian w postępowaniu klinicznym.
Przypadek 1 – Ostra białaczka szpikowa
Biopsja szpiku kostnego pacjentki A potwierdziła rozpoznanie AML bez dojrzewania. Badania cytogenetyczne przeprowadzone na materiale z szpiku kostnego wykazały prawidłowy kariotyp żeński. Stwierdzono obecność 95% krążących blastów, w związku z czym pobrano próbkę krwi obwodowej do spersonalizowanej diagnostyki z wykorzystaniem panelu Heme-NGS.
Ostra białaczka szpikowa (AML) jest nowotworem hematologicznym linii mieloidalnej białych krwinek. Wykrywanie mutacji genowych w AML stało się coraz ważniejsze dla rokowań i leczenia, a nawracające mutacje genowe uznaje się za istotne w patogenezie i prognozowaniu przebiegu choroby7. Mutacje w genach NPM1 i CEBPA wiążą się z korzystnym ryzykiem prognostycznym, podczas gdy wewnętrzne duplikacje tandemowe (ITD) w genie FLT3 wiążą się z mniej korzystnym wynikiem8. Rosnąca liczba dowodów potwierdza patogenny wpływ tych oraz innych mutacji w AML9.
Przypadek 2 – gruczolak płuca
Biopsja masy nadobojczykowej lewej u pacjenta B wykazała gruczolakoraka płuca. Materiał biopsyjny z utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie (FFPE) węzła chłonnego został wysłany do badań genomicznych (panel Solid-NGS) w formie zwitek/rolki z zawartością guza powyżej 50%, aby zidentyfikować obecność mutacji umożliwiającej celowaną interwencję terapeutyczną.
Rak płuca jest główną przyczyną śmiertelności z powodu nowotworów w Stanach Zjednoczonych i dzieli się na dwa główne typy: niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) oraz drobnokomórkowego raka płuca (SCLC). NSCLC można dalej zdefiniować jako gruczolak lub raka płaskonabłonkowego, w zależności od histologii zmiany. Gruczolak płuca jest najczęstszym podtypem raka płuca, występującym zarówno u palaczy, jak i osób niepalących, i stanowi najczęstszą postać raka płuca u osób niepalących10. Badania molekularne gruczolaków płuca zidentyfikowały mutacje w wielu onkogenach11. Najczęstszymi mutacjami sterującymi zidentyfikowanymi u palaczy są mutacje w KRAS i BRAF. Najczęstszymi mutacjami u osób niepalących są mutacje w EGFR oraz rearanżacje obejmujące geny ALK, RET i ROS1. Opisano guzy płuca z insercją wewnątrzramową w eksonie 20 genu ERBB2 (HER2/neu). Najczęstszą nieprawidłowością w HER2/neu jest amplifikacja tego locus w raku piersi, dla której dostępna jest terapia celowana (trastuzumab: upodobnione przeciwciało monoklonalne przeciwko HER2/neu). Insercja w eksonie 20 HER2/neu, obserwowana w 2 - 4% gruczolaków płuca12, wykazała częściową odpowiedź na terapię skojarzoną inhibitorami HER2/neu i mTOR (odpowiednio neratynibem i temsirolimusem)13.

<table><tbody><tr><td>Taśma ScreenTape Genomic DNA</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5365</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do genomowego DNA</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5366</td><td></td></tr><tr><td>Taśma ekranowa D1000 o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki D1000 o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Technologia Agilent</td>Oprogramowanie do analizy <td>G2965A</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Technology</td><td>A.01.04 lub nowszy</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe stojaki do przechowywania probówek</td><td>dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak na probówki 15/50 ml Dowolny</td><td>dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak na płytki 96-dołkowe</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa, 0,5&ndash; 2,5 &mu; l</td><td>Pipeta dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, jednokanałowa, 1&ndash; 10 &mu; l</td><td>Pipeta dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, jednokanałowa, 2&ndash; 20 &mu; l</td><td>Pipeta dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, jednokanałowa, 10&ndash; 100 &mu; l</td><td>Pipeta dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, jednokanałowa, 20-calowa; 200 &mu; l</td><td>Pipeta dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, jednokanałowa, 100 &ndash; 1,000 &mu; l</td><td>Każdy sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetor serologiczny</td><td>Każdy sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Każdy sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka (do probówek i probówek paskowych)</td> <td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka, -20 & deg; C</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 & stopnie; C Lodówka</td><td>Dowolny Woda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lub Kąpiel z koralikami</td> Dowolny inkubator <td>dla sprzedawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(37 & Deg; c)</td> Pipety serologiczne <td>dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1&nbsp; ml</td> Pipety serologiczne <td>dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 5&nbsp; ml</td> Pipety serologiczne <td>dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 10&nbsp; ml</td> Pipety serologiczne <td>dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 25&nbsp; ml</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>Każdy sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żyletki/Szpulki</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuba stożkowa 15 ml</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuba stożkowa 50 ml</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-procentowy etanol</td><td>Każdy sprzedawca</td><td></td><td>Sklep w łatwopalnej szafce</td></tr><tr><td>2-Propanol (izopropanol)</td><td>Każdy sprzedawca</td><td></td><td>Sklep w łatwopalnej szafce</td></tr><tr><td>Zbiorniki 25 ml</td><td>Każdy sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta, 8-kanałowa, 1 &ndash; 10 &mu; l</td><td>Pipeta dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 8-kanałowa, 10 i ndash; 100 i mu; l</td><td>Pipeta dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 8-kanałowa, 20 i ndash; 300 i mu; l</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>butelka do spryskiwania wodą</td> dowolnego <td>sprzedawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelka do spryskiwania alkoholem</td><td>Dowolny papier do</td><td></td><td></td></tr><tr><td>czyszczenia soczewek</td> dostawcy <td>Dowolne talerze dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 96-dołkowy PCR, częściowo przyszywkowy</td><td>dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paski probówek, 8-dołkowe, 0,2&nbsp; ml</td><td>dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioShake IQ lub 3000-T wiąz</td><td>Bulldog Bio/Q.Instruments</td><td>1808-0506/ 1808-0517</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 S - Suwmiarka LabChipDS</td><td></td><td>128876</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 D - Suwmiarka LabChipDS</td><td></td><td>132848</td><td></td></tr><tr><td>Suwmiarka DropSense96</td><td>(Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DropQuant Software</td><td>Caliper (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta uszczelniająca</td><td>Denville</td><td>B1212-5S</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa folia uszczelniająca</td><td>Denville</td><td>B1212-6S</td><td></td></tr><tr><td>Wolny od nukleaz, czysty system wodny</td><td>Wirówka EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5424</td><td>Wirówka Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>5804R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>zarówno rotatory do probówek, jak i płytek o pojemności 15 ml, najlepiej wirówkę, która może osiągnąć do 2 500 x g.</td></tr><tr><td>Probówka Safe-Lock 1,5 ml, naturalna</td> probówka <td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>5 ml, probówka DNA LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5430R Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>022620645</td><td>Będzie działać każda wirówka rotatorowa</td></tr><tr><td>Hybex Inkubator mikropróbek Fisher</td><td>Scientific</td><td>1057-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hybex 0,2 ml Blok probówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-31-0</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Amplicon &ndash; Panel Raka</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1008</td><td>96 reakcji</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon</td><td>Illumina</td><td>PE-940-1011</td><td>96 reakcji</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td>96 indeksów, 384 próbki</td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v3, 500 cykli</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2, 300 cykli</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników MiSeq v2, 500 cykli</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Kierownik eksperymentów</td><td>Illumina</td><td>1.3 lub nowszy</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reporter</td><td>Illumina</td><td>2.0 lub nowszy</td><td></td></tr><tr><td>Przeglądarka analizy sekwencjonowania</td><td>Illumina</td><td>1.8 lub nowsza</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw opraw i kołnierzy TruSeq Index Plate</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1007</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq v2</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Niestandardowa płyta filtra Amplicon</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1006</td><td></td></tr><tr><td>Wymienne nasadki adaptera indeksu</td><td>Illumina</td><td>11294657</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0,5 ml</td><td>Probówki</td><td></td> Invitrogen Q32856 <td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Zestaw do testów szerokiego zakresu</td><td>Stojak magnetyczny Invitrogen</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>DynaMa6-96, listwy boczne</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700 (blok złoty/srebrny)</td><td>Life Technologies</td><td>N8050200</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Blood Kit</td><td>Qiagen</td><td>158489</td><td></td></tr><tr><td>roztwór deparufinizacyjny (16 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19093</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ATL (4 x 50ml)</td><td>Qiagen</td><td>939011</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do wytrącania białek (50 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hydratujący DNA (100 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>roztwór glikogenu (500&nbsp; &mu; l)</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz (10 x 50 ml)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>USA Scientific</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 10 &#181; l Podłużne końcówki pipet filtracyjnych w wysterylizowanych stojakach, 10 stojaków na 96 końcówek (960 końcówek).</td><td>Stany Zjednoczone Naukowe</td><td>1180-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 100 &#181; l naturalne, skośne końcówki do pipet filtracyjnych w sterylizowanych stojakach, 10 stojaków po 96 końcówek (960 końcówek)</td> <td>USA Scientific</td><td>1180-1840</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 &mu; l naturalne, skośne końcówki do pipet filtracyjnych w stojakach, stojaki sterylizowane, 10 stojaków po 96 końcówek (960 końcówek)</td> <td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 20 i mu; l naturalne, skośne końcówki do pipet filtracyjnych w stojakach, stojaki sterylizowane, 10 stojaków po 96 końcówek (960 końcówek)</td> <td>USA Scientific</td><td>1180-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1,000 &mu; l naturalne, wyskalowane końcówki do pipet z filtrem XL w</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

W miarę jak poprawia się nasze zrozumienie mutacji powodujących inicjację i progresję nowotworów, uzyskujemy kluczowe informacje na temat tego, jak określone profile molekularne guza mogą przewidywać reakcję na środki terapeutyczne lub dostarczać wiedzy na temat rokowania. W naszej placówce ustanowiono program genotypowania nowotworów w ramach rutynowej opieki klinicznej, badając zarówno guzy hematologiczne, jak i lite pod kątem szerokiego spektrum mutacji przy użyciu dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji (NGS): niestandardowego, 33-genowego panelu nowotworów hematologicznych do stosowania z krwią obwodową i szpikiem kostnym oraz komercyjnie produkowanego panelu guzów litych do stosowania z tkanką zatopioną w parafinie utrwalonej w formalinie, która jest ukierunkowana na 47 genów powszechnie zmutowanych w raku. Nasz przepływ pracy obejmuje przegląd biopsji przez patologa, aby upewnić się, że jest odpowiednia ilość guza do testu, a następnie przeprowadzana jest dostosowana ekstrakcja DNA na próbce. Kontrola jakości próbki obejmuje etapy dotyczące ilości, jakości i integralności, a dopiero po tym, jak wyekstrahowane DNA przejdzie te wskaźniki, generowana jest i sekwencjonowana biblioteka amplikonów. Uzyskane dane są analizowane za pomocą wewnętrznego systemu bioinformatycznego, a warianty są przeglądane i interpretowane pod kątem patogenności. W tym miejscu przedstawiamy migawkę użyteczności każdego panelu na przykładzie dwóch przypadków klinicznych, aby zapewnić wgląd w to, w jaki sposób dobrze zaprojektowany przepływ pracy NGS może przyczynić się do optymalizacji wyników klinicznych.

Przypadek 1 – Panel Heme-NGS
DNA wyekstrahowany z leukemicznej krwi obwodowej charakteryzował się wystarczającą jakością i ilością (176 ng/µl) dla panelu Heme-NGS. Całkowita średnia głębokość pokrycia wyniosła 4 933x (powyżej minimalnej średniej głębokości pokrycia wynoszącej 1 000x). Dodatkowe statystyki z sekwencjonowania znajdują się w Tabeli 3. Z 8 regionów o pokryciu poniżej 250x, 3 wynikały z nieprawidłowego przycinania starterów (i.e. sekwencja startera nie została prawidłowo usunięta z powodu błędów sekwencjonowania), 1 był znanym artefaktem testu, a pozostałe 4 stanowiły częściowe regiony eksonów różnych genów bez raportowalnych wariantów. Chociaż nasz protokół kliniczny obejmuje raportowanie wyłącznie wariantów pokrytych co najmniej 250 odczytami, wszystkie dane z co najmniej 100 odczytami są importowane do bazy danych w celu weryfikacji.
Przetwarzanie danych z potoku bioinformatycznego wykazało trzy raportowalne mutacje związane z chorobą: mutację missense w genie FLT3, mutację missense w genie IDH2 oraz mutację przesunięcia ramki odczytu w genie NPM1. Warianty eksonowe wraz z ich częstościami allelicznymi opisano w Table 4. Powszechną mutacją w genie FLT3 jest wewnętrzna duplikacja tandemowa (ITD) FLT3, która nie jest automatycznie wykrywana przez nasz potok i wymaga wizualnej inspekcji eksonu 14. Wizualna inspekcja eksonu 14 genu FLT3 nie wykazała insercji ani duplikacji w przekazanej próbce. Mutacja FLT3 I836del występowała z częstością alleliczną 1% i nie została uwzględniona w końcowym raporcie, ponieważ znajdowała się poniżej zwalidowanej minimalnej częstości allelicznej wynoszącej 5%. Mutacja ta nie znajduje się na tej samej cząsteczce DNA co zmiana FLT3 D835Y (i.e., zaobserwowano ją w tym samym regionie amplikonu, ale nie w układzie „cis” w żadnym z odczytów sekwencyjnych) i została zauważona jedynie podczas ręcznego przeglądu plików .bam podczas weryfikacji zmiany p.D835Y. Niższe częstości alleliczne dwóch mutacji FLT3 sugerują, że mutacje te mogą reprezentować heterogeniczność i/lub ewolucję klonalną; jednak różnica ta może wynikać z wydajności analizy dla tego amplikonu lub z polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) w pobliżu lub nakładającego się na sekwencję startera, co wpłynęło na amplifikację tego allelu.
Wyniki panelu Heme-NGS dla przypadku 1 z AML wykazały mutacje w genach FLT3, IDH2 oraz NPM1, które są trzema powszechnie mutowanymi genami w AML. Mutacje w FLT3 obserwuje się u ~ 25% dorosłych pacjentów z AML (baza danych COSMIC17) i są to albo wewnętrzne duplikacje tandemowe (ITD), albo mutacje typu missense w domenie tyrozynowej kinazy. FLT3-ITD są częstszą mutacją i wiążą się ze słabą odpowiedzią na standardową chemioterapię, podczas gdy znaczenie prognostyczne punktowych mutacji domeny kinazy FLT3, zaobserwowanych u tego pacjenta z AML, ma niejasny wpływ na rokowania14. Dehydrogenaza izocytrynianowa 2 (NADP+), mitochondrialna (IDH2) to gen kodujący modyfikator epigenetyczny, który jest powszechnie mutowany w AML. Mutacje w modyfikatorach epigenetycznych są stosunkowo częste w AML, a mutacje w IDH1 i DNMT3A stanowią inne mutacje w tej klasie genów prowadzące do dysregulacji genów. Mutacje w genie nukleofozminy (NPM1) należą do najczęstszych nabytych mutacji w AML i są zazwyczaj uważane za dobry czynnik prognostyczny (w przypadku braku FLT3-ITD).
Współmutacje w NPM1 oraz IDH2 zostały opisane w literaturze jako korzystny wskaźnik prognostyczny5z 3-letnią całkowitą przeżywalnością na poziomie 89%. Stanowi to istotną korzyść w zakresie przeżywalności w porównaniu z całkowitą 3-letnią przeżywalnością typu dzikiego NPM1 i IDH2 wynoszącej 31%. Na przykład standardowa praktyka opieki obejmuje analizę mutacji w przypadku NPM1 i FLT3-ITD mutacje. W tym scenariuszu wykrycie jedynie jednego NPM1 mutacja nie pozwoliłaby na właściwą stratyfikację ryzyka pacjenta, ponieważ mutacje wtórne mogą być korzystne (np. IDH2) lub niekorzystne (np., TET2), co zmniejsza pewność co do możliwości złagodzenia przebiegu przeszczepu szpiku kostnego.
Przypadek 2 – Panel Solid-NGS
DNA wyekstrahowane z tkanki FFPE charakteryzowało się jakością i ilością wystarczającą dla panelu Solid-NGS, z koncentracją 252 ng/µl i zaledwie 4% DNA poniżej 1 000 par zasad (bp). Po analizie danych średnia głębokość pokrycia wyniosła 9 167 odczytów (znacznie powyżej naszej minimalnej granicy głębokości wynoszącej 1 000 odczytów), przy czym żadne regiony nie znajdowały się poniżej głębokości 250 odczytów. Dodatkowe parametry kontroli jakości przedstawiono w Tabeli 3.
Dane przetworzone za pomocą potoku bioinformatycznego wykazały dwie mutacje związane z chorobą: insercję w ramce odczytu w eksonie 20 genu ERBB2 (Her2/neu) oraz mutację typu missense w genie TP53. Wszystkie warianty eksonowe wraz z ich częstotliwością alleliczną przedstawiono w Tabeli 5. Insercja w ERBB2 w rzeczywistości reprezentuje tandemową duplikację sekwencji (Her2/neu), co odzwierciedla zastosowane nazewnictwo. Identyfikacja i potwierdzenie insercji w ramce odczytu wymagały manualnej analizy odczytów sekwencjonowania za pomocą oprogramowania IGV. Wykrycie częstotliwości mutacji przekraczającej 50%, zaobserwowane zarówno dla mutacji TP53, jak i Her2/neu, sugeruje wystąpienie utraty heterozygotyczności (LOH) (patrz sekcja dyskusja).
Wyniki panelu Solid-NGS dla przypadku 2 z gruczolakorakiem płuca wykazały obecność mutacji w genach ERBB2 (HER2/neu) oraz TP53, czyli dwóch genach rzadko badanych w ramach obecnego standardu opieki nad pacjentami z rakiem płuc. HER2/neu koduje receptor kinazy tyrozynowej podobny do innego często mutującego genu w raku płuc, EGFR. Aktywujące insercje w eksonie 20 HER2/neu obserwuje się u 2 - 4% przypadków gruczolakoraka płuca; stanowią one większość mutacji HER2/neu stwierdzanych w raku płuc i zazwyczaj występują w guzach bez mutacji w innych genach kierujących, takich jak EGFR i ALK 12. Istnieje kilka dowodów wskazujących na potencjał różnych opcji terapeutycznych dla pacjentów z aktywującymi insercjami HER2/neu, w tym na częściową odpowiedź na terapię skojarzoną inhibitorami HER2/neu oraz mTOR13, a także znaczną kontrolę choroby przy zastosowaniu przeciwciała monoklonalnego Trastuzumab w połączeniu z chemioterapią15. Wykrycie zmian w genie TP53 nie jest rzadkie w nowotworach, jednak obecnie nie istnieją dla nich terapie celowane.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Przypadek 1</td>
			<td>Przypadek 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita liczba odczytów początkowych</td>
			<td>2,215,926</td>
			<td>2,129,110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procent odczytów zmapowanych</td>
			<td>98.42%</td>
			<td>98.29%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procent odczytów w obszarze docelowym</td>
			<td>99.01%</td>
			<td>97.29%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procent odczytów w obszarze docelowym po filtrowaniu</td>
			<td>97.60%</td>
			<td>95.45%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procent odczytów użytecznych</td>
			<td>94.87%</td>
			<td>91.79%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procent zasad o pokryciu powyżej 250x</td>
			<td>98.40%</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Procent zasad z pokryciem powyżej 1000x</td>
			<td>95.90%</td>
			<td>99.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokrycie poniżej 250x – liczba amplikonów</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Metryki kontroli jakości (QC) cyklu sekwencjonowania. Jest to podsumowanie najważniejszych statystyk cyklu, z wyłączeniem średniego pokrycia, które są wykorzystywane podczas przeglądu danych w celu ustalenia, czy próbka z przygotowanej biblioteki przeszła kontrolę jakości. Cały proces uznaje się za udany, jeśli wszystkie wartości procentowe przekraczają 90%, jednak w przypadku przeniesienia SW1 lub UB1 podczas etapu płukania FPU lub wystąpienia interferencji starterów (primer cross-talk), wartość „Percent on Target” może być niższa i mieścić się w zakresie 80 – 90%. Zbyt niska wartość „Percent Mapped” wskazywałaby na zanieczyszczenie bakteriami lub innym DNA, ponieważ wszystkie próbki powinny mapować do genomu ludzkiego. Jeśli którakolwiek z tych specyfikacji spadnie poniżej 80%, próbka zostaje oznaczona do dalszej analizy, aby pomóc w ustaleniu dalszych kroków i udoskonaleniu procesu.
<img alt="Tabela 4" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl4.jpg" /> 
Tabela 4: Wyniki przypadku 1. Wymieniono wykryte patogenne, związane z chorobą, warianty o nieznanym znaczeniu (VUS) oraz prawdopodobnie łagodne warianty eksonowe przekraczające kryteria raportowania częstotliwości alleli na poziomie 5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
<img alt="Tabela 5" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl5.jpg" /> 
Tabela 5: Wyniki przypadku 2. Wymieniono wykryte warianty eksonowe o charakterze patogennym, związanym z chorobą, warianty o nieznanym znaczeniu (VUS) oraz prawdopodobnie łagodne, których częstość występowania alleli przekracza kryterium raportowania wynoszące 5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Przykład pliku SampleSheet.csv dla sekwencjonowania amplikonów. Arkusz ten przekazuje sekwenatorowi informacje o zastosowanej chemii (w tym przypadku Amplicon), przepływie pracy (np. GenerateFastq), zastosowanej aplikacji i badaniu (np. FastqOnly), liczbie zasad (lub odczytów) do sekwencjonowania (w tym przypadku 186 bp x 186 bp), a na koniec o tym, jakie próbki są powiązane z konkretnymi indeksami (w tym przypadku indeksowanie podwójne). Części zaznaczone na żółto mogą zostać zmienione zgodnie z potrzebami eksperymentatora, jednak w tym przypadku laboratorium stosuje te parametry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>

Ten manuskrypt opisuje protokoły kliniczne dla dwóch paneli sekwencjonowania nowej generacji. Jeden panel bada nowotwory hematologiczne, podczas gdy drugi panel koncentruje się na genach powszechnie zmutowanych w guzach litych. Klasyfikacja molekularna mutacji powodujących nowotwory złośliwe u ludzi dostarcza cennych informacji prognostykujących i predykcyjnych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Ogólnym celem tego ukierunkowanego testu amplikonowego z wykorzystaniem sekwencjonowania następnej generacji jest wykrywanie mutacji patogennych w guzach pacjentów w celach terapeutycznych, w tym diagnostycznych, prognostycznych oraz w celu oceny odpowiedzi na terapię celowaną. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak to, czy pacjent posiada mutację w genie, która może przynieść korzyść z zastosowania terapii celowanej lub alternatywnej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykrycia za pomocą jednego testu mutacji o znaczeniu klinicznym, zarówno powszechnych, jak i rzadkich, w wielu genach w dowolnej tkance nowotworowej.Ze względu na to, że techniki i technologia są niezwykle złożone, a poszczególne etapy trudne do opanowania, kluczowe jest przedstawienie tej metody w sposób wizualny. Jest to przełomowy moment w rozwoju onkologii medycznej. Dzięki wprowadzeniu sekwencjonowania nowej generacji do praktyki klinicznej, będziemy mogli zapewnić pacjentom więcej i lepszych metod leczenia nowotworów.Nasi technolodzy CPD, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy i Joe Grubb zaprezentują tę procedurę. Będę również pomagać w tym procesie, aby pokazać bardziej złożone części analizy. Po wyekstrahowaniu DNA genomowego zgodnie z protokołem tekstowym i instrukcją producenta, należy poddać dwie µL wyekstrahowanego DNA analizie na fluorometrze w celu uzyskania stężenia roboczego próbki.Aby przygotować bibliotekę amplikonów, do pół-skirtowanej płytki 96-dołkowej, nazywanej płytką Hyb (Hyb Plate), należy dodać odpowiednią objętość buforu TE z niską zawartością EDTA oraz 5 µL z probówki z oligonukleotydami (Oligo Tube) danego panelu, a następnie do każdego odpowiedniego dołka dodać od 100 do 250 ng genomowego DNA. Jest to najważniejszy etap procesu, ponieważ jakakolwiek pomyłka na tym etapie będzie miała poważne konsekwencje. Po dodaniu odczynnika 1 do hybrydyzacji oligonukleotydów w celu sekwencjonowania (Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1) i wirowaniu zgodnie z protokołem tekstowym, należy inkubować płytkę Hyb w rozgrzanym inkubatorze do hybrydyzacji w temperaturze 95 °C przez jedną minutę.Po powolnym schłodzeniu inkubatora do 40 °C, wyjmij płytkę z inkubatora i przenieś całą objętość każdej próbki z płytki hybrydyzacyjnej (Hyb Plate) do centrum wcześniej przygotowanej, przemytej, odpowiadającej jej jednostki płytki filtrującej, czyli FPU. Przykryj FPU i wiruj przy 2 250 ×g i 20 °C przez trzy minuty. Następnie dodaj 45 µL SW1 i ponownie wiruj.Po drugim przemyciu roztworem SW1 i przemyciu roztworem UB1, dodaj 45 µL mieszaniny Extension Ligation Mix 3 do każdego dołka z próbką i wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół trzy razy. Użyj klejącej folii aluminiowej do uszczelnienia płytki, a następnie inkubuj cały zestaw FPU w rozgrzanym do 37 °C inkubatorze przez 45 minut. Aby zaindeksować amplifikację PCR, umieść startery w płytce do amplifikacji indeksów (Index Amplification Plate) lub w uchwycie IAP, a następnie rozdziel używane indeksy do odpowiednich dołków w płytce; dodaj 22 µL mieszaniny PCR Master Mix, 2E12, i wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół trzy razy.Następnie, po odwirowaniu 45-minutowej reakcji ligacji wydłużającej zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 25 µL 50 mM wodorotlenku sodu do każdej studzienki próbki w FPU i pipetować ciecz w górę i w dół co najmniej sześć razy, upewniając się, że końcówka pipety styka się z membraną. Następnie, przy lekko nachylonej płytce i wielokanałowej pipecie ustawionej na 20 µL, należy pipetować wodorotlenek sodu w płytce FPU w górę i w dół co najmniej sześć razy. Przenieść eluat z FPU do odpowiadającej mu kolumny IAP.Należy delikatnie pipetować ciecz w górę i w dół, aby dokładnie połączyć DNA z PCR Master Mix przed uruchomieniem programu PCR opisanego w protokole tekstowym. Po zweryfikowaniu wydajności biblioteki i inkubacji próbek z Magnetic Purification Beads zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 30 µL EBT do każdej studni z przemytymi kuleczkami. Pipetuj w górę i w dół kilka razy, aby upewnić się, że kuleczki oddzieliły się od ścianek probówki.Po inkubacji płytki z wytrząsaniem, a następnie bez niego, należy umieścić płytkę na statywie magnetycznym i przenieść 20 µL supernatantu do całkowicie nowej płytki, nazywanej płytką do normalizacji biblioteki (LNP). Po przygotowaniu mieszaniny normalizującej, przy okresowym odwracaniu i wortexowaniu roztworu, należy dodać 45 µL do każdej próbki w LNP. Następnie płytkę należy uszczelnić przezroczystą folią przylepną i wytrząsać z prędkością 1 800 RPM przez 30 minut.Po przemyciu kulek należy zdjąć LNP ze statywu magnetycznego, a w celu elucji próbki dodać 30 µL świeżego 0,1 normalnego wodorotlenku sodu do każdej studzienki. Następnie LNP należy wstrząsać z prędkością 1 800 RPM przez pięć minut. Umieść LNP z powrotem na statywie magnetycznym i po oczyszczeniu się nadsączu przenieś 30 µL eluatu do wcześniej przygotowanego Library Normalization Storage Buffer 1 w płycie do przechowywania (Storage Plate).Przechyl płytkę, a następnie dodaj pięć µL każdej próbki przeznaczonej do sekwencjonowania do oznakowanej probówki 1,5 ml na połączoną bibliotekę amplikonów (Pooled Amplicon Library, PAL). W zależności od stosowanej chemii sekwencjonowania, dodaj od czterech do 10 µL PAL do 590–596 µL Buforu HT1. Oczyść i załaduj komórkę przepływową (Flow Cell).Wprowadź odczynniki. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby rozpocząć sekwencjonowanie. Po zakończeniu sekwencjonowania uruchom potok bioinformatyczny.Przeanalizuj statystyki przebiegu, aby upewnić się, że zsekwencjonowana biblioteka spełnia określone przez laboratorium kryteria kontroli jakości. Na koniec, w przeglądarze danych genomicznych (Genomic Data Viewer), dokonaj manualnego przeglądu każdego wariantu poprzez analizę plików BAM. Jest to podsumowanie najważniejszych statystyk przebiegu, z wyłączeniem średniego pokrycia, wykorzystywane do ustalenia, czy próbka z przygotowanej biblioteki przeszła kontrolę jakości. Jak widać tutaj w przypadku Case One, analiza bioinformatyczna wykryła cztery raportowalne mutacje związane z AML.Mutacja missense w genie FLT3, mutacja missense w genie IDH2 oraz mutacja przesunięcia ramki odczytu w genie NPM1. Mutacje w genie FLT3 obserwuje się u około 25% dorosłych pacjentów z AML. Znaczenie prognostyczne punktowych mutacji w domenie kinazy FLT3, zaobserwowanych u tego pacjenta z AML, ma niejasny wpływ na rokowanie.Dehydrogenaza izocytrynianowa 2, czyli IDH2, koduje modyfikator epigenetyczny, który jest powszechnie mutowany w AML. Mutacje w genie nukleofosminy, czyli NPM1, należą do najczęściej występujących mutacji nabytych w AML. W poniższej tabeli wymieniono wszystkie warianty eksonowe dla Przypadku Drugiego.Wykryto dwie mutacje związane z chorobą. Insertywną mutację w ramach odczytu w eksonie 20 genu ERBB2 oraz mutację missense w genie TP53. HER2/neu, czyli ERBB2, koduje receptor kinazy tyrozynowej.Aktywujące insercje w eksonie 20 genu HER2/neu obserwuje się u 2 do 4% pacjentów z gruczolakorakiem płuca i stanowią one większość mutacji HER2/neu stwierdzanych w raku płuca. Zmiany w genie TP53 są również częste w nowotworach. Niezbędne jest zatem zwrócenie szczególnej uwagi na jakość i ilość wyizolowanego DNA.Jest to szczególnie istotne w przypadku próbek FFPE. Często charakteryzują się one wysokim stopniem degradacji i zmienną wydajnością pozyskiwania DNA. W procesie walidacji testu klinicznego należy ustalić wskaźniki jakości i ilości DNA dla każdej próbki przed przekazaniem DNA do etapu przygotowania biblioteki.Oprócz przygotowania biblioteki kluczowe jest zwalidowanie planu bioinformatycznego poprzez określenie wartości odcięcia dla procesu sekwencjonowania, statystyk kontroli jakości, statystyk przygotowania biblioteki, głębokości pokrycia amplikonu oraz minimalnej raportowalnej częstości alleli. Po opanowaniu procedury przygotowanie biblioteki można przeprowadzić w ciągu jednego dnia roboczego. Jednak cały przebieg analizy wymaga więcej czasu na ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie, przetwarzanie danych i analizę wariantów.Niniejsza procedura została opracowana wyłącznie w celu analizy mutacji w genomowym DNA w wybranych kluczowych punktach zapalnych (hot spots). W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak różnicowa ekspresja genów, ocena ryzyka wystąpienia nowotworów oraz analizy reorganizacji strukturalnych, można przeprowadzić inne badania z wykorzystaniem RNA. Na horyzoncie znajdują się istotne postępy w tej dziedzinie.Wprowadzenie automatyzacji oraz zastosowanie unikalnego kodowania molekularnego pozwolą laboratoriom na skrócenie czasu realizacji badań, zmniejszenie ilości wykorzystywanego materiału biologicznego oraz wykrywanie wariantów o bardzo niskiej częstotliwości alleli. Wykrywanie mutacji związanych z chorobą w próbkach nowotworowych stanowi standard opieki od dziesięcioleci. NGS jest mniej obciążone błędem podejście do równoległego sekwencjonowania wielu genów powiązanych z wieloma typami nowotworów, co prowadzi do identyfikacji wielu mutacji i lepszego doboru metod leczenia pacjentów.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

next-generation-sequencing-for-detection-actionable-mutations-solid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Sekwencjonowanie nowej generacji w wykrywaniu aktywnych mutacji w tkankach stałych i nowotworach płynnych

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Ten artykuł szczegółowo opisuje użycie zestawu do przygotowania biblioteki opartej na reakcji łańcuchowej polimerazy zakotwiczonej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji, do oceny fuzji genów onkogennych w klinicznych próbkach guzów litych. Opisano zarówno etapy mokrej ławki, jak i analizy danych.

Wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół techniki nieinwazyjnej płynnej biopsji, w tym pobieranie krwi, separację osocza i kożucha, ekstrakcję cfDNA i DNA linii zarodkowej, kwantyfikację cfDNA lub DNA linii zarodkowej oraz analizę wzbogacania fragmentów cfDNA.

Wykrywanie bezkomórkowego DNA w próbkach osocza krwi pacjentów z rakiem

Wzrost liczby biomarkerów molekularnych do testowania w leczeniu leczenia niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NS-NSCLC) skłonił do opracowania szybkich i niezawodnych metod wykrywania molekularnego. Opisujemy przebieg pracy do oceny zmian genomowych u pacjentów z NS-NSCLC przy użyciu podejścia ultraszybkiego sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Ultraszybkie sekwencjonowanie nowej generacji oparte na amplikonie w niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym raku płuca

Protokół ten opisuje zautomatyzowany, akredytowany przez ISO15189 proces sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania celowanych zmian genomowych w tkankach formalinowych osadzonych w parafinie tkankach raka płuc niedrobnokomórkowych (NSCLC).

Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj metody sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania mutacji w guzach litych i płynnych. Technika ta umożliwia identyfikację zmian genetycznych w genach FLT3, IDH2 i NPM1, wspierając precyzyjną diagnostykę onkologiczną i dobór terapii celowanych.

Sekwencjonowanie nowej generacji do wykrywania mutacji, które można podjąć w celu działania, w guzach litych i płynnych

Przeglądaj więcej filmów