Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Protokół ten umożliwia wykrywanie mutacji związanych z nowotworem i obecnie uzupełnia inwazyjne zabiegi chirurgiczne. Kolejną mocną stroną jest możliwość wykorzystania tego protokołu do monitorowania obciążenia mutacjami nowotworu w godzinach nadliczbowych. Technika ta umożliwia genotypowanie guza bez konieczności wykonywania chirurgicznej biopsji tkanki, co jest szczególnie pomocne w przypadku guzów w trudnych lokalizacjach, takich jak pień mózgu z ograniczonym dostępem do tkanek.

W przypadku braku powtórnej biopsji, podłużne dane molekularne nie są dostępne, aby uzupełnić MRI. Cyfrowe monitorowanie PCR ułatwia molekularne uzupełnienie diagnozy, umożliwiając bardziej świadomy proces podejmowania decyzji dotyczących leczenia. Podobne metody mogą być stosowane do wykrywania ekspresji genów w określonym systemie, za pomocą konwencjonalnych sond Fluo-4 i połączonych z wygaszaczem, ale z większą czułością niż w przypadku ilościowego PCR.

Przed rozpoczęciem procedury kropelkowego cyfrowego PCR wyczyść przestrzeń stołu i sprzęt 10% wybielaczem i 70% etanolem, a następnie delikatnie odwiruj i krótko odwiruj wszystkie odczynniki, z wyjątkiem oleju stabilizującego kropelki. Upewnij się, że butla ze sprężonym azotem jest podłączona do przyrządu do wytwarzania kropel i że zbiornik butli jest ustawiony na 90 funtów na cal kwadratowy. I 38 mikrolitrów cyfrowej mieszaniny reakcyjnej PCR bezpośrednio na dno każdej studzienki ośmiodołkowego paska probówki do PCR, usuwając wszelkie pęcherzyki czystą końcówką pipety.

Dodać 12 mikrolitrów wstępnie amplifikowanej próbki DNA w trzech egzemplarzach do odpowiednich dołków paska probówki. Delikatnie odpipetować pełną objętość 10 razy, aby wymieszać mieszaninę reakcyjną z próbką DNA i odpipetować pełną objętość z każdej studzienki do odpowiednich kanałów od A do H chipa przyrządu wytwarzającego kropelki. Włóż nowy pasek probówki do PCR do urządzenia generującego kropelki i zeskanuj identyfikator chipa przyrządu generującego kropelki do oprogramowania na komputerze instrumentu.

Następnie kliknij przycisk Uruchom uruchamianie, aby rozpocząć dropletyzację próbek. Po zakończeniu kropelowania usuń pasek probówki do PCR i nałóż nakrętki z probówką. Przenieś pasek rurki do termocyklera i zrównoważ rurkę z innym paskiem probówki zawierającym 80 mikrolitrów wody na studzienkę.

Następnie uruchom termocykler w odpowiednich warunkach cykli termicznych. Zamień nasadki pasków na nasadki o dużej prędkości. Po zakończeniu cykli termicznych przenieś pasek rurki do przyrządu do pomiaru ilościowego, kliknij przycisk Set Up a Run w oprogramowaniu urządzenia i umieść pasek rurki w przyrządzie do oznaczania ilościowego.

Umieść metalową osłonę na nowym chipie przyrządu do oznaczania ilościowego, zeskanuj identyfikator chipa do instrumentu i włóż chip do maszyny. Zamknij pokrywę instrumentu. W oprogramowaniu komputerowym wprowadź nazwę przebiegu cyfrowego PCR i dla każdego z ośmiu kanałów, a następnie wybierz tryb szybki i kliknij Start, aby rozpocząć kwantyfikację.

Aby przeanalizować surowe dane spektralne, uruchom oprogramowanie analityczne i otwórz pliki fcs. W obszarze Widok analizy wybierz opcję nienaruszony. W widoku próbki kliknij pola obok każdego z ośmiu przykładów.

Oprogramowanie wykreśli sygnały dla alleli typu zmutowanego i dzikiego odpowiednio wzdłuż osi x i y. Użyj obliczonej funkcji macierzy, aby zastosować kompensację spektralną na nienaruszonych kroplach, zgodnie z instruktorami producenta i dostosuj ustawienia osi w opcjach osi. Ustaw oś x na minimum zero i maksimum 30 000, a oś y na minimum minus 5 000 i maksimum 10 000.

Po zidentyfikowaniu klastrów kropel dostosuj oś, aby zmniejszyć puste miejsce na wykresie. Wybierz próbkę odpowiadającą genomowemu DNA tkanki nowotworowej kontroli pozytywnej, aby ustawić ujemne bramki zmutowane i dzikie, zapewniając, że klastry są odrębne i łatwe do zidentyfikowania. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Zastosuj wszystkie ustawienia do wybranych próbek, aby zastosować ustawienia bramki dla kontroli pozytywnej do wszystkich próbek.

W widoku graficznym kliknij wiele próbek, aby wyświetlić wykresy dla wszystkich wybranych próbek i wyeksportować obraz jako plik tif. Następnie w obszarze Obszar roboczy wybierz opcję Eksportuj analizę i zapisz przeanalizowany plik danych jako plik csv. W tym artykule przedstawiono reprezentatywne wyniki skutecznego wykrywania mutacji we wstępnie amplifikowanym DNA wolnym od komórek osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego od dwójki dzieci z rozlanymi glejakami linii środkowej.

W tym eksperymencie można zaobserwować wyraźną separację między klastrami typu zmutowanego i dzikiego odpowiednio wzdłuż osi x i y. Solidne klastry typu dzikiego wskazują, że ekstrakcja DNA bez komórek zakończyła się sukcesem, ponieważ obecne jest DNA matrycowe. U tych pacjentów zmutowane klastry wykazują częstość alleli mutacji wynoszącą 1,6 i 39,32 procent odpowiednio dla próbek osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego, zgodnie ze statusem mutacji nowotworu, potwierdzonym analizą genomiczną tkanki nowotworowej poddanej biopsji.

Z drugiej strony kontrola negatywna wykazuje zero kropelek zmutowanych i zero kropelek typu dzikiego, co wskazuje, że nie doszło do zanieczyszczenia mieszaniny reakcyjnej PCR. Genomowe DNA tkanki nowotworowej kontroli pozytywnej pokazuje, że mutacja jest wykrywana z oczekiwaną częstością alleli dla konkretnej wybranej próbki guza. Brak wykrycia mutacji w osoczu może nie musi oznaczać, że pacjent jest typem dzikim dla mutacji będącej przedmiotem zainteresowania, ponieważ występują wyniki fałszywie ujemne.

Na przykład u tego pacjenta, mimo że nie wykryto interesującej go mutacji, status mutacji został potwierdzony przez analizę genomiczną tkanki nowotworowej. PCR jest bardzo czułą techniką, która wymaga częstej dekontaminacji obszaru roboczego i sprzętu, aby uniknąć uzyskania fałszywie dodatnich danych.