Name: Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę wykrywania mutacji nowotworowych w krążącym DNA z płynów biologicznych pacjenta przy użyciu cyfrowego PCR. Ta technika umożliwia nieinwazyjne monitorowanie obciążenia mutacyjnego guza w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za hojność wszystkich pacjentów i ich rodzin. Praca ta była wspierana przez fundusze z Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), V Foundation (Atlanta, GA), The Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, Clinical and Translational Science Institute at Children's National (5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), The Lilabean Foundation for Pediatric Brain Cancer Research (Silver Spring, MD), Childhood Brain Tumor Foundation (Germantown, MD), Children's Brain Tumor Tissue Consortium (Filadelfia, PA) oraz Rally Foundation for Childhood Cancer Research (Atlanta, Georgia).

<ol><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+molecular+meta-analysis+of+1%2C000+pediatric+high-grade+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).</li>
<li>Hoffman, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+genomic+heterogeneity+in+diffuse+intrinsic+pontine+and+midline+high-grade+glioma%3A+implications+for+diagnostic+biopsy+and+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).</li>
<li>Puget, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+in+a+series+of+130+pediatric+diffuse+intrinsic+pontine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Child%27s+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas.</a> Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).</li>
<li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Year+one+in+the+molecular+era+of+pediatric+brain+tumor+diagnosis%3A+application+of+universal+clinical+targeted+sequencing+in+an+unselected+cohort+of+children%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children.</a> Neuro-Oncology. 19 (4), iv21(2017).</li>
<li>Mueller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIPG-40.+PNOC003%3A+Precision+medicine+trial+for+children+with+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Neuro-Oncology. 19 (4), iv14(2017).</li>
<li>Kilburn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIPG-76.+PNOC-003%3A+Precision+medicine+trial+for+children+with+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%3A+preliminary+experience+with+multi-agent+personalized+therapy+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations.</a> Neuro-Oncology. 20 (2), i64(2018).</li>
<li>Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+in+glioma+immunotherapy%3A+evidence%2C+pitfalls%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives.</a> Journal of Immunology Research. 2017, 5813951(2017).</li>
<li>Panditharatna, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+and+minimally+invasive+tumor+surveillance+of+pediatric+diffuse+midline+gliomas+using+patient-derived+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li>
<li>Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LNA+%28locked+nucleic+acids%29%3A+synthesis+and+high-affinity+nucleic+acid+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition.</a> Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).</li>
<li>Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+mismatch+discrimination+of+locked+nucleic+acid-DNA+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes.</a> Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).</li>
<li>Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LNA+probes+substantially+improve+the+detection+of+bacterial+endosymbionts+in+whole+mount+of+insects+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization.</a> BMC Microbiology. 12, 81(2012).</li>
<li>Qiagen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAamp+Circulating+Nucleic+Acid+Handbook%22">QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook</a>. , 1090257(2013).</li>
<li>Jackson, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+preamplification+of+serum+DNA+to+facilitate+reliable+detection+of+extremely+rare+cancer+mutations+in+circulating+DNA+by+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).</li>
<li>Rain Dance Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RainDrop+Assay+Guidelines%22">RainDrop Assay Guidelines</a>. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).</li>
<li>Rain Dance Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RainDrop+Analyst+II+Operator%27s+Manual%22">RainDrop Analyst II Operator's Manual</a>. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).</li>
<li>Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poisson+Plus+quantification+for+digital+PCR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Poisson Plus quantification for digital PCR system.</a> Scientific Reports. 7, 9617(2017).</li>
<li>Biorad. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Droplet+Digital+PCR+Applications+Guide%22">Droplet Digital PCR Applications Guide</a>. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).</li>
<li>Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+locked+nucleic+acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA).</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).</li>
<li>Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+genotyping+with+oligonucleotide+probes+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+tumors+of+the+brainstem+by+sequencing+of+CSF-derived+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li>
<li>Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+DNA+for+non-invasive+cancer+management%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management.</a> Cancer Genetics. , (2018).</li>
<li>Barault, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+methylated+circulating+DNA+biomarkers+for+comprehensive+non-invasive+monitoring+of+treatment+response+in+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer.</a> Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).</li>
</ol>

Metoda opisana w tym manuskrypcie jest zawarta w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym "Metody wykrywania biomarkerów raka" autorstwa Javad Nazarian i Eshini Panditharatna.

Tutaj przedstawiliśmy naszą metodę wykrywania i ilościowego określania allelicznej częstości mutacji nowotworowych w cfDNA z płynnej biopsji pacjenta. Kładziemy nacisk na kluczowe etapy sukcesu tej metody, w tym wstępne przetwarzanie próbek analitycznych, ekstrakcję cfDNA, projektowanie testu PCR i analizę danych. Aby ograniczyć objętość używanej próbki, cfDNA ekstrahuje się z 1 ml osocza, ale tylko 500 μl płynu mózgowo-rdzeniowego. Podczas ekstrakcji z płynu mózgowo-rdzeniowego stosuje się protokół ekstrakcji z 1 ml moczu (zgodnie z podręcznikiem zestawu do ekstrakcji cfDNA12), zgodnie z zaleceniami producenta. Różnica w wymaganej objętości próbki między osoczem a płynem mózgowo-rdzeniowym wynika z niższych poziomów specyficznego dla nowotworu cfDNA w osoczu w porównaniu z płynem mózgowo-rdzeniowym u pacjentów z guzami mózgu, co wymaga większych objętości próbek do wykrycia mutacji8. Jeśli próbka jest dostępna, można z niej wyekstrahować więcej niż 1 ml osocza, aby uzyskać wyższą wydajność DNA. Jednak w przypadku pacjentów pediatrycznych ważne jest, aby w miarę możliwości zminimalizować ilość używanej krwi, ponieważ nawet prosta procedura, taka jak pobranie krwi, jest męcząca dla pacjentów pediatrycznych z nowotworami poddawanych radioterapii. Ekstrakcja z 1 ml podwielokrotności osocza umożliwia również ekstrakcje powtórzone, dzięki czemu test można powtórzyć (np. w przypadku niepowodzenia ekstrakcji DNA lub zanieczyszczenia próbki).
W celu ograniczenia użycia próbek, które nie są absolutnie konieczne, cfDNA zazwyczaj nie jest oznaczane ilościowo. Znaleźliśmy jednak zakres stężeń cfDNA między 0,2-2 ng / μL i 0,6-13 ng / μl odpowiednio w osoczu i płynie mózgowo-rdzeniowym. Biorąc pod uwagę niską ilość cfDNA i fakt, że zmutowane allele specyficzne dla nowotworu są obecne z niską częstotliwością, etap wstępnej amplifikacji przy użyciu tego samego zestawu starterów, który jest używany do dPCR, jest konieczny, aby znacznie zwiększyć ilość docelowego DNA w próbce, pomagając w wykrywaniu mutacji8. Rozcieńczenie wstępnie amplifikowanego produktu w buforze zawiesiny DNA zapewnia wystarczającą objętość dla kontrprób technicznych, co pomaga w rozróżnieniu prawdziwie dodatnich. Ponieważ liczba zmutowanych kropelek może być niewielka (na przykład od 0 do 2 kropel zmutowanych w próbce osocza), włączenie kontrprób technicznych ma kluczowe znaczenie dla ustalenia statusu mutacji. Podczas gdy jedna studzienka PCR może dać 0 zmutowanych kropel, pozostałe dwie mogą dać 1-2 dla pojedynczej próbki osocza analizowanej w trzech egzemplarzach; W związku z tym włączenie kontrprób pozwala na większą dokładność przy określaniu statusu mutacji. MAF jest następnie obliczany jako średnia wartości powtórzeń.
Multipleksowana preamplifikacja (preamplifikacja alleli typu dzikiego i zmutowanego dwóch mutacji będących przedmiotem zainteresowania) zwiększa użyteczność pojedynczej próbki, ponieważ ten sam materiał wyjściowy może być użyty do zbadania dwóch mutacji. Co ważne, produkt preamplifikacji multipleksowej może być analizowany w singleplex podczas dPCR w celu większej prostoty, jak opisano tutaj. Jednak zarówno PCR przed amplifikacją, jak i dPCR mogą być multipleksowane. Podczas multipleksowania warunki muszą być zoptymalizowane zarówno dla zestawów starterów, jak i sond: temperatury wyżarzania startera muszą być podobne, aby przebiegały razem podczas amplifikacji PCR, a sondy powinny być zaprojektowane do generowania odrębnych klastrów (w oparciu o sygnał fluorescencyjny i intensywność). Podczas walidacji nowego zestawu starterów i sond należy uruchomić gradient temperatury wyżarzania, aby określić optymalną temperaturę wyżarzania w oparciu o zakres sugerowany przez producenta. Przed przetestowaniem sond na próbkach cfDNA pacjenta należy je zwalidować za pomocą syntetycznych konstruktów DNA i/lub gDNA tkanki nowotworowej o różnych danych wejściowych (tj. do 10 ng).
Do wykrywania zmutowanych alleli o większej swoistości i zmniejszonych niedopasowaniach w hybrydyzacji sondy do docelowego DNA stosuje się sondy z zablokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA). LNA jest analogiem kwasu nukleinowego z mostkiem metylenowym łączącym 2'-tlen i 4'-węgiel pierścienia rybozy9. Mostek metylenowy blokuje kwas nukleinowy w sztywnej konformacji bicyklicznej, która ogranicza elastyczność, zwiększa stabilność termiczną dupleksu i poprawia specyficzność hybrydyzacji sondy w celu ukierunkowania DNA 10,18,19. Jeśli istnieje pojedyncze niedopasowanie zasad między sondą LNA a matrycą DNA, tworzenie dupleksu między sondą a celem ulegnie destabilizacji. W związku z tym sondy LNA poprawiają specyficzność wiązania sondy i skutkują wyższym stosunkiem sygnału do szumu11. Analiza osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego od pacjentów pediatrycznych niecierpiących na OUN ustaliła specyficzność naszego testu z sondami LNA ukierunkowanymi na H3F3A p.K27M, w celu ustalenia, że częstość alleli równa lub mniejsza niż 0,001% jest uważana za fałszywie dodatnią8. Aby uzyskać dodatkowe uwagi dotyczące optymalizacji konstrukcji sond i starterów, w tym zawartość GC, rozmiar amplikonu, barwniki reporterowe sondy i wygaszacze, zapoznaj się z wytycznymi producenta dPCR14,17. Chociaż nasza metoda jest zoptymalizowana do użytku z systemem RainDance, protokół może zostać dostosowany do użytku z innymi platformami dPCR.
Przedstawiona tutaj metoda czerpie siłę z wysokiej czułości i wzbogacenia celu osiągniętego przez dPCR, który pozostaje platformą z wyboru do wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych w cfDNA. Chociaż dPCR jest silny, ma ograniczoną liczbę mutacji, które można przetestować w jednym teście. Alternatywą dla dPCR jest sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), które może wykryć wiele mutacji w wielu genach, zwiększając użyteczność pojedynczej próbki. NGS może wykrywać mutacje w płynie mózgowo-rdzeniowym i osoczu pacjentów z glejakami pnia mózgu20, jednak obecnie jest mniej czuły niż dPCR w wykrywaniu mutacji nowotworowych w cfDNA, z granicami wykrywalności 0,1-10% MAF w porównaniu do 0,001% w podejściach opartych na PCR21. dPCR osiąga również szybszy czas realizacji niż NGS, umożliwiając szybkie wykrywanie mutacji będących przedmiotem zainteresowania. Podejście PCR ma zastosowanie we wszystkich typach nowotworów i może zostać rozszerzone w celu wykrywania mutacji hotspotów i metylowanego cfDNA22.
Płynna biopsja jest rzeczywiście w powijakach i będzie wymagała dalszego rozwoju w celu dostosowania do konkretnych chorób. Kolejnym wyzwaniem będzie monitorowanie nowotworów w kontekście ewolucji nowotworów, w przypadku których potrzebna będzie platforma zdolna do wykrywania pojawiających się mutacji z wysoką czułością. Ponadto platformy zdolne do wykrywania różnych biomolekuł (peptydów, cytokin, RNA) będą bardzo korzystne w ocenie odpowiedzi guza na leczenie, a także w rozwoju spersonalizowanych interwencji klinicznych.

Ze względu na ograniczenia w dostępności tkanki nowotworowej do analiz molekularnych, istnieje potrzeba opracowania wysoce czułych metod zdolnych do wykrywania mutacji somatycznych guza w płynach biologicznych pacjenta, w tym w osoczu, surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Na przykład rozlane glejaki pośrodku linii środkowej (DMG) u dzieci stanowią wyzwanie ze względu na ich lokalizację neuroanatomiczną. W ciągu ostatniej dekady profilowanie molekularne próbek tkanek DMG ujawniło mutacje powodujące ten typ nowotworu1 i ujawniło przestrzenną i czasową heterogeniczność mutacji, co sprawia, że biopsja jest niezbędna do scharakteryzowania pacjenta w podgrupie choroby i promowania terapii ukierunkowanych molekularnie2. W związku z tym badania kliniczne opowiadają się za integracją biopsji chirurgicznych w celu profilowania molekularnego guza podczas wstępnej diagnozy3,4,5,6. Podczas leczenia monitorowanie odpowiedzi terapeutycznej w DMG jest ograniczone do MRI, który nie jest czuły na wykrycie małych zmian lub ewolucji genomu guza. MRI jest również podatny na wykrywanie pseudoprogresji, przejściowego stanu zapalnego w miejscu guza, który naśladuje prawdziwy postęp w obrazowaniu i może wprowadzać w błąd w interpretacji odpowiedzi guza7. W związku z tym DMG reprezentują typ nowotworu, w którym istnieje duże zapotrzebowanie na alternatywny, minimalnie inwazyjny sposób wykrywania mutacji nowotworowych i monitorowania odpowiedzi klinicznej. Aby zaspokoić te potrzeby, opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokół wykrywania i ilościowego określania częstości występowania alleli mutacji nowotworowych w cfDNA z osocza, surowicy i płynu mózgowo-rdzeniowego dzieci z glejakami linii środkowej8. Biorąc pod uwagę, że DMG w dzieciństwie często (>80%) mają somatyczną mutację lizyny do metioniny w pozycji 27 wariantu histonu H3.1 (H3.1K27M, 20% przypadków) lub H3.3 (H3.3K27M, 60% przypadków)1, te i inne mutacje charakterystyczne dla DMG (tj. ACVR1, PIK3R1) były celem kwantyfikacji zmutowanych alleli za pomocą cfDNA8. Test ten można dostosować do wykrywania mutacji hotspotów w innych typach nowotworów za pomocą starterów i sond specyficznych dla sekwencji. Wszechstronność tego podejścia sprawia, że można je zastosować do różnych nowotworów, które skorzystałyby na integracji narzędzi diagnostycznych opartych na cfDNA i monitorowaniu terapeutycznym.
Aby z czułością wykrywać mutacje o niskiej częstotliwości allelicznej w cfDNA, stosujemy metodę opartą na kropelkowym cyfrowym PCR (dPCR). W tej metodzie mieszanina reakcyjna PCR jest dzielona na teoretyczne maksimum 10 milionów kropel przy użyciu platformy dPCR (np. RainDance), z 7-9 milionami kropel na PCR, co zwykle obserwuje się eksperymentalnie. Ze względu na wysoki stopień partycjonowania próbki, w każdej kropli może znajdować się co najwyżej jedna do dwóch cząsteczek DNA. Amplifikacja PCR i specyficzna dla sekwencji hybrydyzacja sondy fluorescencyjnej mogą zachodzić w każdej kropli, tak że zachodzą miliony reakcji. Maksymalizuje to czułość i umożliwia wykrywanie rzadkich zmutowanych alleli, które w przeciwnym razie mogłyby pozostać niewykryte na tle DNA typu dzikiego. Wykorzystanie sond z zablokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA) zwiększa specyficzność testu, ograniczając hybrydyzację niedopasowania i wspierając dokładne wykrywanie mutacji9,10,11. W tym miejscu opisujemy nasze metody przetwarzania próbek, ekstrakcji cfDNA, wstępnej amplifikacji docelowych alleli, dPCR i analizy danych.

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA DNA Bufor zawiesinowy (pH 8,0)</td><td>Teknova</td><td>T0227</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2-EDTA 7,2 mg Probówki do pobierania krwi (10 ml)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367525</td><td>Do pobierania osocza</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Plastikowa probówka do surowicy z czerwonym zamknięciem hemogardy BD (10 ml)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367895</td><td>Do zbierania surowicy</td></tr><tr><td></td><td>Wybielacz Ogólne Bufor dostawcy</td><td></td><td></td>laboratorium</tr><tr><td>ATL</td><td>Qiagen</td><td>19076</td><td></td></tr><tr><td>Bezkomórkowe probówki do pobierania krwi DNA</td><td>Probówki</td> do <td>pobierania krwi Streck 218961 cfDNA (opcjonalnie)</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator CentriVap</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Niestandardowy projekt</td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol klasy biologii molekularnej (200 dowodów)</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Sonda mutantów</td><td>Zintegrowane technologie DNA, Inc.</td><td></td><td>Niestandardowy projekt</td></tr><tr><td>PAXgene Probówki ccfDNA do krwi</td><td>PreAnalytiX</td><td>768115</td><td>probówki do pobierania krwi cfDNA (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Nasadki do probówek paskowych PCR 8 dołków</td><td>VWR</td><td>10011-786</td><td></td></tr><tr><td>Probówki paskowe 8-dołkowe do PCR</td><td>Pipeta Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td></td></tr><tr><td>(p20, p200, p1000)</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Końcówki filtrów do pipet (p20, p200, p1000)</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td>laboratoryjny</tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Krążący podręcznik kwasów nukleinowych&nbsp;</td><td>Podręcznik zestawu do ekstrakcji cfDNA Qiagen (wydanie 2013)</td><td></td>Zestaw krążących kwasów nukleinowych QIAamp Zestaw do ekstrakcji cfDNA Qiagen 55114 (Krok protokołu 4)&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td>Opcjonalny zestaw do ekstrakcji DNA z małych (< lub =200 &micro; L) objętości próbek</td></tr><tr><td>Qiavac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Do użytku z zestawem krążących kwasów nukleinowych QIAamp</td></tr><tr><td>Zestaw materiałów eksploatacyjnych Raindance</td><td>Bio-Rad</td><td>20-04411</td><td>Zawiera chipy do przyrządów do generowania kropel, chipy do przyrządów do oznaczania ilościowego, nasadki do pasków PCR, w tym nasadki szybkoobrotowe, oraz olej stabilizujący kropelki</td></tr><tr><td>Raindance Sense Instrument Instrument</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Quantification (stosowany w Krok 9 Raindance</td></tr> <tr><td>Source Instrument</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Przyrząd generujący krople (używany w Kroku 9 Protokołu)</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie RainDrop Analyst II</td><td>Oprogramowanie RainDance Technologies</td><td></td><td>Analyst używane do analizy danych (Krok 10 protokołu)</td></tr> <tr><td>Chłodzona pułapka parowa</td><td>Savant</td><td>RVT5105-115</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Indywidualny projekt</td></tr><tr><td>Smartblock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>05 412 506</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genotyping Master Mix</td><td>Thermofisher Scientific 4371353</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>14 285 562PM</td><td></td></tr><tr><td>WT</td><td>Probe Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Indywidualny projekt</td></tr></tbody></table>

wykrywanie i monitorowanie krążącego dna związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Powikłania związane z początkowym i powtórnym pobieraniem próbek tkanek chirurgicznych stwarzają potrzebę minimalnie inwazyjnych platform zdolnych do molekularnej podklasyfikacji i czasowego monitorowania odpowiedzi guza na terapię. W tym miejscu opisujemy naszą metodę opartą na dPCR do wykrywania mutacji somatycznych guza w DNA wolnym od komórek (cfDNA), łatwo dostępnych w płynach biologicznych pacjentów. Chociaż liczba mutacji, które można przetestować w każdym teście, metoda ta zapewnia wysoki poziom czułości i swoistości. Monitorowanie liczebności mutacji, obliczane za pomocą MAF, pozwala na ocenę odpowiedzi guza na terapię, zapewniając w ten sposób bardzo potrzebne uzupełnienie obrazowania radiograficznego.

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wyniki pomyślnego wykrycia mutacji H3F3A p.K27M w przedwzmocnionym cfDNA z osocza (panel górny lewy) i z CSF (panel górny prawy) u dwóch dzieci z DMG. Próbki cfDNA analizowano w powtórzeniach, lecz dla każdego rodzaju próbki przedstawiono tylko jeden reprezentatywny wykres. Wykresy dPCR wskazują na pomyślne generowanie kropli, z liczbą 7-9 milionów kropli na dołek PCR (z czego większość to krople negatywne, które nie zawierają docelowego DNA). Minimum 7 milionów kropli na dołek PCR świadczy o pomyślnym procesie dropletyzacji, natomiast liczba mniejsza niż 7 milionów wskazuje na niepowodzenie analizy, w takim przypadku użytkownik nie powinien przystępować do analizy danych. Rysunek 1 pokazuje wyraźne oddzielenie klastrów mutantów i typu dzikiego odpowiednio wzdłuż osi x i y. Wyraźne klastry typu dzikiego wskazują na pomyślną ekstrakcję cfDNA, ponieważ obecne jest DNA matrycy. Klastry mutantów wykazują MAF na poziomie odpowiednio 1,60% dla próbek z osocza i 39,92% dla próbek z CSF, co świadczy o pozytywnym wykryciu mutacji. W przypadku tych pacjentów wyniki dPCR są zgodne ze statusem mutacji guza, potwierdzonym w analizie genomicznej tkanki guza z biopsji8. Kontrola negatywna (panel dolny lewy) wykazuje 0 kropli mutantów i 0 kropli typu dzikiego, co wskazuje na brak kontaminacji mieszaniny reakcyjnej PCR. gDNA z tkanki guza w kontroli pozytywnej (panel dolny prawy) wykazuje wykrycie mutacji z częstotliwością alleliczną oczekiwaną dla wybranej próbki guza.
Na Rysunku 2 przedstawiono reprezentatywne wyniki dla nieudanej detekcji poszukiwanej mutacji, H3F3A p.K27M, w wolnokrążącym DNA (cfDNA) z osocza dziecka z DMG. Status mutacji został potwierdzony poprzez analizę genomiczną tkanki guza8. Przedstawiono reprezentatywne wyniki z dwóch powtórnych studni PCR (panele górne). Całkowita liczba kropel, w tym kropel negatywnych, wynosi od 7 do 9 milionów na studnię PCR, co świadczy o prawidłowej dropletyzacji. Klastry typu dzikiego, wykreślone wzdłuż osi y, wykazują około 7-8 0 kropel typu dzikiego na studnię PCR dla cfDNA z osocza, co wskazuje na udaną ekstrakcję cfDNA (ponieważ w próbce znajduje się docelowe DNA typu dzikiego). Jednak w próbce osocza nie wykryto żadnych kropel zmutowanych. Panel dolny lewy przedstawia kontrolę negatywną (MB H2O) bez kropel typu dzikiego ani zmutowanych, a panel dolny prawy pokazuje pozytywną kontrolę w postaci preamplifikowanego gDNA z tkanki guza (0,025 ng) z pozytywną detekcją mutacji. Jak pokazano na tym rysunku, brak detekcji mutacji w osoczu nie musi oznaczać, że pacjent ma genotyp typu dzikiego dla poszukiwanej mutacji, ponieważ zdarzają się wyniki fałszywie ujemne8. W niektórych przypadkach, gdy mutacja nie zostanie wykryta w osoczu pobranym podczas pierwszej biopsji, zostaje ona wykryta w osoczu pobranym od tego samego pacjenta w późniejszym terminie8.
<img alt="Wykresy kropkowe z analizy cytometrii przepływowej przedstawiające częstość występowania allelu zmutowanego (MAF) w próbkach po wstępnej amplifikacji oraz w kontrolach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Skuteczna detekcja H3F3A mutacja p.K27M w przedwzmacnianym cfDNA z osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego u dzieci z glejakami linii środkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej porównujące DNA plazmy i DNA guza po amplifikacji, przedstawiające częstość występowania allelu zmutowanego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2wyniki fałszywie ujemne uzyskane z analizy preamplifikowanej próbki cfDNA z osocza pacjenta, u którego stwierdzono obecność badanej mutacji, H3F3A p.K27M w guzie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Protokół ten umożliwia wykrywanie mutacji związanych z nowotworem i obecnie uzupełnia inwazyjne zabiegi chirurgiczne. Kolejną mocną stroną jest możliwość wykorzystania tego protokołu do monitorowania obciążenia mutacjami nowotworu w godzinach nadliczbowych. Technika ta umożliwia genotypowanie guza bez konieczności wykonywania chirurgicznej biopsji tkanki, co jest szczególnie pomocne w przypadku guzów w trudnych lokalizacjach, takich jak pień mózgu z ograniczonym dostępem do tkanek.W przypadku braku powtórnej biopsji, podłużne dane molekularne nie są dostępne, aby uzupełnić MRI. Cyfrowe monitorowanie PCR ułatwia molekularne uzupełnienie diagnozy, umożliwiając bardziej świadomy proces podejmowania decyzji dotyczących leczenia. Podobne metody mogą być stosowane do wykrywania ekspresji genów w określonym systemie, za pomocą konwencjonalnych sond Fluo-4 i połączonych z wygaszaczem, ale z większą czułością niż w przypadku ilościowego PCR.Przed rozpoczęciem procedury kropelkowego cyfrowego PCR wyczyść przestrzeń stołu i sprzęt 10% wybielaczem i 70% etanolem, a następnie delikatnie odwiruj i krótko odwiruj wszystkie odczynniki, z wyjątkiem oleju stabilizującego kropelki. Upewnij się, że butla ze sprężonym azotem jest podłączona do przyrządu do wytwarzania kropel i że zbiornik butli jest ustawiony na 90 funtów na cal kwadratowy. I 38 mikrolitrów cyfrowej mieszaniny reakcyjnej PCR bezpośrednio na dno każdej studzienki ośmiodołkowego paska probówki do PCR, usuwając wszelkie pęcherzyki czystą końcówką pipety.Dodać 12 mikrolitrów wstępnie amplifikowanej próbki DNA w trzech egzemplarzach do odpowiednich dołków paska probówki. Delikatnie odpipetować pełną objętość 10 razy, aby wymieszać mieszaninę reakcyjną z próbką DNA i odpipetować pełną objętość z każdej studzienki do odpowiednich kanałów od A do H chipa przyrządu wytwarzającego kropelki. Włóż nowy pasek probówki do PCR do urządzenia generującego kropelki i zeskanuj identyfikator chipa przyrządu generującego kropelki do oprogramowania na komputerze instrumentu.Następnie kliknij przycisk Uruchom uruchamianie, aby rozpocząć dropletyzację próbek. Po zakończeniu kropelowania usuń pasek probówki do PCR i nałóż nakrętki z probówką. Przenieś pasek rurki do termocyklera i zrównoważ rurkę z innym paskiem probówki zawierającym 80 mikrolitrów wody na studzienkę.Następnie uruchom termocykler w odpowiednich warunkach cykli termicznych. Zamień nasadki pasków na nasadki o dużej prędkości. Po zakończeniu cykli termicznych przenieś pasek rurki do przyrządu do pomiaru ilościowego, kliknij przycisk Set Up a Run w oprogramowaniu urządzenia i umieść pasek rurki w przyrządzie do oznaczania ilościowego.Umieść metalową osłonę na nowym chipie przyrządu do oznaczania ilościowego, zeskanuj identyfikator chipa do instrumentu i włóż chip do maszyny. Zamknij pokrywę instrumentu. W oprogramowaniu komputerowym wprowadź nazwę przebiegu cyfrowego PCR i dla każdego z ośmiu kanałów, a następnie wybierz tryb szybki i kliknij Start, aby rozpocząć kwantyfikację.Aby przeanalizować surowe dane spektralne, uruchom oprogramowanie analityczne i otwórz pliki fcs. W obszarze Widok analizy wybierz opcję nienaruszony. W widoku próbki kliknij pola obok każdego z ośmiu przykładów.Oprogramowanie wykreśli sygnały dla alleli typu zmutowanego i dzikiego odpowiednio wzdłuż osi x i y. Użyj obliczonej funkcji macierzy, aby zastosować kompensację spektralną na nienaruszonych kroplach, zgodnie z instruktorami producenta i dostosuj ustawienia osi w opcjach osi. Ustaw oś x na minimum zero i maksimum 30 000, a oś y na minimum minus 5 000 i maksimum 10 000.Po zidentyfikowaniu klastrów kropel dostosuj oś, aby zmniejszyć puste miejsce na wykresie. Wybierz próbkę odpowiadającą genomowemu DNA tkanki nowotworowej kontroli pozytywnej, aby ustawić ujemne bramki zmutowane i dzikie, zapewniając, że klastry są odrębne i łatwe do zidentyfikowania. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Zastosuj wszystkie ustawienia do wybranych próbek, aby zastosować ustawienia bramki dla kontroli pozytywnej do wszystkich próbek.W widoku graficznym kliknij wiele próbek, aby wyświetlić wykresy dla wszystkich wybranych próbek i wyeksportować obraz jako plik tif. Następnie w obszarze Obszar roboczy wybierz opcję Eksportuj analizę i zapisz przeanalizowany plik danych jako plik csv. W tym artykule przedstawiono reprezentatywne wyniki skutecznego wykrywania mutacji we wstępnie amplifikowanym DNA wolnym od komórek osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego od dwójki dzieci z rozlanymi glejakami linii środkowej.W tym eksperymencie można zaobserwować wyraźną separację między klastrami typu zmutowanego i dzikiego odpowiednio wzdłuż osi x i y. Solidne klastry typu dzikiego wskazują, że ekstrakcja DNA bez komórek zakończyła się sukcesem, ponieważ obecne jest DNA matrycowe. U tych pacjentów zmutowane klastry wykazują częstość alleli mutacji wynoszącą 1,6 i 39,32 procent odpowiednio dla próbek osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego, zgodnie ze statusem mutacji nowotworu, potwierdzonym analizą genomiczną tkanki nowotworowej poddanej biopsji.Z drugiej strony kontrola negatywna wykazuje zero kropelek zmutowanych i zero kropelek typu dzikiego, co wskazuje, że nie doszło do zanieczyszczenia mieszaniny reakcyjnej PCR. Genomowe DNA tkanki nowotworowej kontroli pozytywnej pokazuje, że mutacja jest wykrywana z oczekiwaną częstością alleli dla konkretnej wybranej próbki guza. Brak wykrycia mutacji w osoczu może nie musi oznaczać, że pacjent jest typem dzikim dla mutacji będącej przedmiotem zainteresowania, ponieważ występują wyniki fałszywie ujemne.Na przykład u tego pacjenta, mimo że nie wykryto interesującej go mutacji, status mutacji został potwierdzony przez analizę genomiczną tkanki nowotworowej. PCR jest bardzo czułą techniką, która wymaga częstej dekontaminacji obszaru roboczego i sprzętu, aby uniknąć uzyskania fałszywie dodatnich danych.

detection-monitoring-tumor-associated-circulating-dna-patient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiono protokół wykorzystania mikrofiltra pokrytego poli(N-izopropylolakrylamidem) (PIPAAm) do skutecznego wychwytywania i termoresponsywnego uwalniania żywotnych krążących komórek nowotworowych (CTC). Metoda ta umożliwia wychwycenie CTC z krwi pacjenta, a następnie uwolnienie żywego CTC do dalszej hodowli poza chipem, analiz i charakterystyki.

Wychwytywanie i uwalnianie żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Prezentujemy nowe podejście do charakterystyki komórek nowotworowych. Połączyliśmy immunofluorescencję z fluorescencyjną hybrydyzacją DNA in situ, aby ocenić komórki wychwycone przez funkcjonalizowany przewód medyczny zdolny do wzbogacania in vivo CTC bezpośrednio z krwi pacjenta.

Charakterystyka komórek nowotworowych za pomocą przewodu medycznego do wychwytywania krążących komórek nowotworowych: podejście 3D oparte na immunofluorescencji i DNA FISH

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół techniki nieinwazyjnej płynnej biopsji, w tym pobieranie krwi, separację osocza i kożucha, ekstrakcję cfDNA i DNA linii zarodkowej, kwantyfikację cfDNA lub DNA linii zarodkowej oraz analizę wzbogacania fragmentów cfDNA.

Wykrywanie bezkomórkowego DNA w próbkach osocza krwi pacjentów z rakiem

Płynna biopsja zrewolucjonizowała nasze podejście do badań translacyjnych w onkologii, a pobieranie, jakość i przechowywanie próbek są kluczowymi krokami dla jej udanego zastosowania klinicznego. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany i zwalidowany protokół dla dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia, który może być stosowany w większości laboratoriów badań translacyjnych.

Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

Ten artykuł opisuje zastosowanie zautomatyzowanego sprzętu do łatwego i efektywnego oddzielania i zbierania substancji, takich jak bezkomórkowe DNA i krążące komórki nowotworowe, z krwi pełnej.

Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Poznaj metodę wykrywania mutacji nowotworowych w krążącym DNA z płynów biologicznych pacjenta przy użyciu cyfrowego PCR. Ta technika umożliwia nieinwazyjne monitorowanie obciążenia mutacyjnego guza w czasie.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Przeglądaj więcej filmów