Name: Badanie mutacji kaspazy i modyfikacji potranslacyjnych za pomocą podejść do modelowania molekularnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Poznaj dynamikę molekularną kaspaz z użyciem symulacji Amber 20. Metoda pozwala analizować wpływ mutacji i modyfikacji potranslacyjnych na strukturę białka oraz aktywność enzymatyczną w kontekście apoptozy i terapii przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez grant Rosyjskiej Fundacji Naukowej (17-75-20102, opracowanie protokołu). Eksperymenty opisane w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych (analiza fosforylacji) były wspierane przez Sztokholmskie (181301) i Szwedzkie (190345) Towarzystwa Onkologiczne.

1. Przygotowanie systemu
UWAGA: Modele molekularne natywnych i zmutowanych form białkowych zbudowane są w oparciu o odpowiednią strukturę krystaliczną uzyskaną z Banku Danych o Białkach15,16.
<ol>
	<li>Aby pobrać wybraną strukturę PDB, skorzystaj z listy rozwijanej Pobierz pliki i kliknij Format PDB. Usuń uwagi i dane dotyczące połączeń, a następnie włóż kartę TER między oddzielnymi łańcuchami białkowymi w pliku PDB. Opcjonalnie ustaw stan protonacji reszt histydyny, zastępując nazwę reszty HIS nazwą HIE, HID lub HIP (plik uzupełniający 1). UWAGA: Rozsądne jest, aby nie usuwać krystalograficznie rozdzielonych cząsteczek wody (jeśli są obecne w pliku PDB).</li>
	<li>Aby przygotować model startowy, należy uruchomić program tleap (pakiet AmberTools), a następnie wprowadzić polecenia, które manipulują obiektami tleap.<ol>
		<li>Uruchom program: tleap. Załaduj pole siłowe ff14SB, aby opisać białko za pomocą mechaniki molekularnej: > źródło leaprc.protein.ff14SB.</li>
		<li>Pola siły obciążenia dla cząsteczek wody i jonów atomowych (Na+, Cl-): > źródło leaprc.water.tip3p.</li>
		<li>Załaduj plik PDB i zbuduj współrzędne wodorów, tworząc obiekt o nazwie mol: > mol = loadpdb protein.pdb.</li>
		<li>Sprawdź, czy nie ma wewnętrznych niespójności, które mogą powodować problemy: > sprawdź mol. UWAGA: Mostki dwusiarczkowe, jeśli występują, należy określić ręcznie. Zastąp nazwy kowalencyjnie związanych cystein CYS na CYX i wpisz następujące polecenie w tleap , aby utworzyć wiązanie między atomami SG: wiązanie mol.X.SG mol.Y.SG (X i Y to liczby reszt cysteiny).</li>
		<li>Utworzyć pudełko rozpuszczalnika wokół białka (woda TIP3P, odległość 12 A): > solwatbox mol TIP3PBOX 12,0.</li>
		<li>Sprawdź całkowity ładunek: > naładuj mol i dodaj przeciwjony (Na+ lub Cl-), aby zneutralizować system: 
		> dodatków mol Na+ 0.</li>
		<li>Utwórz plik prmtop topologii i plik inpcrd współrzędnych (dane wejściowe do uruchomienia symulacji): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Wyjdź z programu tleap : > wyjdź. UWAGA: Pliki współrzędnych w formacie bursztynowym można łatwo przekonwertować do formatu PDB za pomocą narzędzia ambpdb (patrz Podręcznik użytkownika, patrz Spis materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Minimalizacja energii
UWAGA: Minimalizacja energii jest konieczna, aby usunąć wszelkie złe styki i nakładanie się atomów w systemie rozruchowym, które prowadzą do niestabilności podczas pracy MD.
<ol>
	<li>Przeprowadź pierwszy etap minimalizacji energii (2,500 kroków algorytmu najbardziej stromego spadku + 2,500 kroków algorytmu gradientu sprzężonego), aby zoptymalizować pozycje dodanych atomów wodoru i cząsteczek wody, utrzymując współrzędne białka ustalone przez ograniczenia pozycyjne na ciężkich atomach.<ol>
		<li>Uruchom program pmemd w następujący sposób: 
		pmemd -O -i min1.in -p białko.prmtop -c białko.inpcrd -o protein_min1.out -r protein_min1.rst -ref białko.inpcrd.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z wymaganymi argumentami: -i PLIK dane kontrolne; -p PLIK topologia molekularna, parametry pola siłowego, nazwy atomów; -c PLIK współrzędne początkowe; -o PLIK wyjście dziennika czytelne dla użytkownika; -r PLIK współrzędne końcowe; -ref PLIK współrzędne odniesienia dla utwierdzeń pozycji.</li>
		<li>Określ opcje w pliku wejściowym min1.in: &cntrl powiedział: imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500, cięcie = 10,0, NTB = 1, ntc=1, ntf=1, NTPR=10, NTR=1, restraintmask=':1-517 & !@H=', restraint_wt=2,0 / UWAGA: Opcje wprowadzania: imin=1 wykonują minimalizację; maxcyc=5000 maksymalna liczba cykli minimalizacji; Metoda minimalizacji ncyc=2500 jest przełączana z najbardziej stromego spadku na gradient sprzężony po cyklach ncyc ; cut=10.0 niezwiązane odcięcie (A); NTB=1 narzucone są granice okresowe, stała objętość; NTC=1 nie stosuje się żadnych ograniczeń dotyczących długości wiązań (dla lepszej konwergencji energii); NTF=1 obliczane są wszystkie interakcje; NTPR=10 informacje o energii są wypisywane do pliku wyjściowego co krok NTPR ; ntr=1 flaga do ograniczania określonych atomów za pomocą potencjału harmonicznego; restraintmask=':1-517 & !@H=' określa ograniczone atomy; restraint_wt=2,0 masy (kcal/mol∙Å2) dla ograniczeń pozycyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź drugi etap minimalizacji energii (5 000 najbardziej stromych stopni zjazdu + 5 000 sprzężonych stopni gradientu) bez ograniczeń, aby zoptymalizować cały system.<ol>
		<li>Użyj min2.in i protein_min1.rst jako danych wejściowych: pmemd -O -i min2.in -p białko.prmtop -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.</li>
		<li>Określ opcje w pliku wejściowym min2.in: &cntrl powiedział: imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000, cięcie = 10,0, NTB = 1, ntc=1, ntf=1, NTPR=10 /</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ogrzewanie
UWAGA: Ten etap ma na celu podgrzanie układu od 0 K do 300 K. Prędkości początkowe są przypisywane atomom, ponieważ model wyjściowy oparty na pliku PDB nie zawiera informacji o prędkości.
<ol>
	<li>Przeprowadzić proces ogrzewania z ograniczeniami położenia na atomach białka (50 ps, stała objętość).<ol>
		<li>Użyj heat.in i protein_min2.rst jako danych wejściowych: pmemd -O -i heat.in -p białko.prmtop -c protein_min2.rst -o protein_heat.out -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst</li>
		<li>Postępuj zgodnie z wymaganymi argumentami: -x PLIK zestawy współrzędnych zapisane na trajektorii MD.</li>
		<li>Określ opcje w pliku wejściowym heat.in: &cntrl powiedział: imin=0, irest=0, ntx=1, nstlim=25000, dt=0,002, ntc=2, ntf=2, cięcie = 10,0, NTB = 1, ntpr=500, ntwx=500, ntt=3, gamma_ln=2,0, tempi=0,0, temp0=300,0, ntr=1, maska krępująca=':1-517', restraint_wt=1,0, nmropt=1 / &wt TYPE='TEMP0', istep1=0, istep2=25000, wartość1=0,1, wartość2=300,0 / &wt TYPE='KONIEC' / UWAGA: Opcje wprowadzania: imin=0 uruchom MD; irest=0 uruchamia nową symulację; ntx=1 z pierwszego pliku nie są odczytywane żadne prędkości początkowe; nstlim=25000 liczba kroków MD; dt=0,002 kroku czasowego (ps); ntc=2 wiązania zawierające wodór są ograniczone za pomocą algorytmu SHAKE; NTF=2 Siły dla wiązań ograniczonych nie są obliczane; ntwx=500 współrzędnych jest zapisywanych do pliku mdcrd co krok ntwx ; ntt=3 Regulacja temperatury Langevin; gamma_ln=2,0 częstotliwość kolizji dla dynamiki Langevina (ps−1); tempi=0,0 temperatura początkowa; temp0=300.0 temperatura odniesienia; Odczytywane są parametry nmropt=1 określone na liście nazw &wt ; TYPE='TEMP0' zmienia temperaturę docelową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Równowaga
UWAGA: Ten etap jest niezbędny do dostosowania gęstości wody i uzyskania stanu równowagi białka.
<ol>
	<li>Wykonać równoważenie w temperaturze 300 K bez żadnych ograniczeń (500 ps, stałe ciśnienie).<ol>
		<li>Użyj equil.in i protein_heat.rst jako danych wejściowych: pmemd -O -i equil.in -p białko.prmtop -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.</li>
		<li>Określ opcje w pliku wejściowym equil.in: &cntrl powiedział: imin=0, irest=1, ntx=5, nstlim=250000, dt=0,002, ntc=2, ntf=2, cięcie = 10,0, NTB = 2, NTP = 1, taup = 2,0, NTPR=1000, NTWX=1000, NTWR=50000, ntt=3, gamma_ln=2,0, temp0=300.0 / UWAGA: Opcje wprowadzania: irest=1 uruchom ponownie symulację; ntx=5 współrzędnych i prędkości są odczytywane z wcześniej wygenerowanego pliku rst ; NTB=2 narzucone są granice okresowe, stałe ciśnienie; NTP=1 Izotropowe skalowanie ciśnienia; taup=2,0 czas relaksacji ciśnienia (ps); ntwr=50000 Na każdym kroku NTWR zapisywany jest pierwszy plik, co zapewnia odzyskanie danych po awarii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Dynamika produkcji
<ol>
	<li>Po pomyślnym osiągnięciu równowagi należy przeprowadzić symulację produkcji MD (10 ns lub więcej) przy stałym ciśnieniu i wygenerować plik trajektorii do późniejszej analizy struktury białka.<ol>
		<li>Użyj prod.in i protein_equil.rst jako danych wejściowych: pmemd -O -i prod.in -p białko.prmtop -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.</li>
		<li>Określ opcje w pliku wejściowym prod.in: &cntrl powiedział: imin=0, irest=1, ntx=5, nstlim=5000000, dt=0,002, ntc=2, ntf=2, cięcie = 10,0, NTB = 2, NTP = 1, taup = 2,0, NTPR=1000, NTWX=1000, NTWR=50000, ntt=3, gamma_ln=2,0, temp0=300.0, ig=-1 / UWAGA: Równoległa wersja pmemd (pmemd. MPI) lub wersja akcelerowana przez GPU (pmemd.cuda) może być używana w klastrach komputerowych i superkomputerach. Długa symulacja MD może być podzielona na kilka segmentów i wykonywana sekwencyjnie. Zdecydowanie zaleca się ustawienie ig=-1 (opcja losowego seeda) dla każdego ponownego uruchomienia symulacji. Programy ptraj lub cppptraj mogą być używane do analizy i przetwarzania trajektorii współrzędnych. Więcej informacji można znaleźć w Podręczniku użytkownika oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspases and cancer.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).</li>
<li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase%3A+Pharmacological+manipulation+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Caspase: Pharmacological manipulation of cell death.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).</li>
<li>Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+caspases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A decade of caspases.</a> Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).</li>
<li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspases%3A+Activation%2C+specificity%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human caspases: Activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li>
<li>Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification+of+caspases%3A+The+other+side+of+apoptosis+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation.</a> Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).</li>
<li>Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+the+evolution+of+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mechanism for the evolution of phosphorylation sites.</a> Cell. 147 (4), 934-946 (2011).</li>
<li>Zamaraev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Serine-384+in+Caspase-2+processing+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity.</a> Cell Death and Disease. 11 (10), 825(2020).</li>
<li>Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+mutations+in+caspase-6+negatively+impact+catalytic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency.</a> Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).</li>
<li>Ando, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+missense+mutations+of+caspase-8+activate+nuclear+factor-%CE%BAB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling.</a> Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).</li>
<li>Case, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCase%2C+DA+%22AMBER+2020%22">AMBER 2020</a>. , University of California, San Francisco. (2020).</li>
<li>Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+Amber+biomolecular+simulation+package%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Computational+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">An overview of the Amber biomolecular simulation package.</a> WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).</li>
<li>Roe, D. R., Cheatham, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTRAJ+and+CPPTRAJ%3A+Software+for+processing+and+analysis+of+molecular+dynamics+trajectory+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Theory+and+Computation%22%5BJournal%5D)">PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).</li>
<li>Maier, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ff14SB%3A+Improving+the+accuracy+of+protein+side+chain+and+backbone+parameters+from+ff99SB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Theory+and+Computation%22%5BJournal%5D)">ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).</li>
<li>Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+microsecond+molecular+dynamics+simulations+with+AMBER+on+GPUs.+2.+Explicit+solvent+particle+mesh+ewald%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Theory+and+Computation%22%5BJournal%5D)">Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald.</a> Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).</li>
<li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li>
<li>Burley, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCSB+Protein+Data+Bank%3A+Powerful+new+tools+for+exploring+3D+structures+of+biological+macromolecules+for+basic+and+applied+research+and+education+in+fundamental+biology%2C+biomedicine%2C+biotechnology%2C+bioengineering+and+energy+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences.</a> Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).</li>
<li>Martinez, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+graphics%3A+Bridging+structural+biologists+and+computer+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists.</a> Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).</li>
<li>Lee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPU-accelerated+molecular+dynamics+and+free+energy+methods+in+Amber18%3A+Performance+enhancements+and+new+features%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).</li>
<li>Jäger, R., Zwacka, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+roles+of+caspases+in+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">The enigmatic roles of caspases in tumor development.</a> Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisane podejście MD pozwala na modelowanie zarówno dzikich, jak i zmutowanych form kaspazy przy użyciu pakietów symulacji biomolekularnych. Omówiono tu kilka istotnych zagadnień związanych z metodologią. Po pierwsze, reprezentatywna struktura krystaliczna kaspazy musi zostać wybrana z Banku Danych o Białkach. Co ważne, dopuszczalne są zarówno monomeryczne, jak i dimeryczne formy kaspazy. Dobrym pomysłem jest wybór struktur o wysokiej rozdzielczości z minimalną liczbą brakujących pozostałości. Stan protonacji niektórych reszt można ustawić ręcznie w wejściowym pliku PDB. Na przykład na rysunku 1 atom wodoru został przyłączony do atomu Nε2 (forma HIE) reszty katalitycznej His277. Po drugie, wokół białka należy utworzyć pudełko z rozpuszczalnikiem w celu przeprowadzenia dalszych symulacji rozpuszczalnika jawnego. Minimalizacja energii jest wymagana do optymalizacji współrzędnych dodawanych atomów wodoru i cząsteczek wody. Po trzecie, ogrzewanie i równoważenie muszą być przeprowadzone przed symulacją dynamiki produkcji. Na etapie ogrzewania należy upewnić się, że ubytki i kieszenie wiążące na powierzchni białka wypełnią się cząsteczkami wody (w razie potrzeby można zwiększyć liczbę kroków MD). Na etapie równowagi nabycie konformacji równowagowej białka musi zostać potwierdzone poprzez analizę odchylenia średniej kwadratowej jego atomów szkieletu od pozycji początkowych12. Po czwarte, konieczne jest monitorowanie zmian konformacyjnych struktury białka podczas symulacji dynamiki produkcji. W tym celu należy nałożyć ramy trajektorii na strukturę wyjściową poprzez dopasowanie atomów szkieletu, a następnie przeanalizować zmiany konformacyjne za pomocą narzędzia do wizualizacji molekularnej (VMD, PyMOL itp.).17. W razie potrzeby można zwiększyć liczbę kroków MD i/lub podzielić symulację na kilka segmentów wykonywanych sekwencyjnie. Po piąte, zaleca się korzystanie z akcelerowanej przez GPU wersji programu symulacyjnego MD (pmemd.cuda), której wydajność znacznie przewyższa osiągalną przez tradycyjną implementację procesora14,18.
Możliwym ograniczeniem opisanej metody jest dostępność określonych struktur kaspazy w Banku Danych o Białkach. Jednak ponad 900 wpisów PDB znajduje się w żądaniu "kaspazy", co wskazuje, że struktury kaspazy zostały szczegółowo zbadane. Pewne trudności mogą pojawić się, gdy struktura krystaliczna jest uzyskiwana w niskiej rozdzielczości (tj. na zgrubnym poziomie szczegółowości) lub brakuje w niej niektórych fragmentów ważnych dla funkcji kaspazy.
Podsumowując, podejścia do modelowania MD okazały się skuteczne w przewidywaniu zmian strukturalnych białek po mutacjach ich genów, modyfikacjach lub interakcjach międzycząsteczkowych. Zastosowanie symulacji MD w dziedzinie śmierci komórki otwiera ogromne możliwości badania molekularnych mechanizmów regulacji kaspazy poprzez modyfikacje potranslacyjne. W związku z tym długoterminowa symulacja MD może ocenić dynamiczne zachowanie regionów funkcjonalnych i potencjalny wpływ podstawiania aminokwasów w celu wyjaśnienia przyczyn molekularnych związanych ze zmutowaną lub zmodyfikowaną kaspazą-2, a także innymi kaspazami. Na przykład mutacje typu missense genów kaspazy inicjującej (kaspaza-2 / kaspaza-8 / kaspaza-9 / kaspaza-10) wykryto w nowotworach przewodu pokarmowego oraz w nowotworach ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego19. Modelowanie kaspaz metodą MD jest skutecznym podejściem in silico do zrozumienia mechanizmów regulujących zaprogramowaną śmierć komórki i związane z nią zaburzenia oraz do opracowania nowych skutecznych terapii.

Apoptoza jest jednym z najszerzej przebadanych procesów komórkowych, które regulują morfogenezę i homeostazę tkanek organizmów wielokomórkowych. Apoptoza może być zainicjowana przez szeroki zakres bodźców zewnętrznych lub wewnętrznych, takich jak aktywacja receptorów śmierci, zakłócenie sygnałów cyklu komórkowego, uszkodzenie DNA, stres retikulum endoplazmatycznego (ER) oraz różne infekcje bakteryjne i wirusowe1. Kaspazy - kluczowi gracze apoptozy - są konwencjonalnie klasyfikowane do dwóch grup: inicjatorów (kaspaza-2, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-10) i efektorów (kaspaza-3, kaspaza-6 i kaspaza-7), w zależności od ich struktury domenowej i miejsca w kaskadzie kaspazy 2,3. Po sygnale śmierci komórki kaspazy inicjujące oddziałują z cząsteczkami adaptorowymi, które ułatwiają dimeryzację indukowaną bliskością i autoprzetwarzanie w celu wytworzenia aktywnego enzymu. Kaspazy efektorowe są aktywowane poprzez rozszczepienie przez kaspazy inicjujące i wykonują dalsze etapy wykonawcze poprzez rozszczepienie wielu substratów komórkowych4.
Dojrzewanie i funkcja kaspaz inicjatora i efektora są regulowane przez dużą liczbę różnych mechanizmów wewnątrzkomórkowych, wśród których modyfikacja potranslacyjna odgrywa nieodzowną rolę w modulacji śmierci komórki5. Dodanie grup modyfikujących (fosforylacja, nitrozylacja, metylacja lub acetylacja) lub białek (ubikwitynacja lub SUMOylacja) zmienia aktywność enzymatyczną kaspaz lub konformację i stabilność białek, które regulują apoptozę. Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest szeroko stosowana do badania potencjalnych miejsc modyfikacji potranslacyjnej i rozpoznawania ich roli. Przypuszczalne miejsce modyfikacji jest zwykle zastępowane innym aminokwasem, którego nie można dalej modyfikować. W ten sposób potencjalnie ufosforylowana seryna i treonina są zmutowane do alaniny, a miejsca ubikwitynacji lizyny są zastępowane argininą. Inna strategia obejmuje zastąpienie aminokwasu, który szczególnie naśladuje modyfikację potranslacyjną (np. glutaminian i asparaginian zostały użyte do naśladowania fosforylowanej seryny lub treoniny)6. Jednak niektóre z tych substytucji zlokalizowanych w dużym sąsiedztwie miejsca aktywnego lub w krytycznych pozycjach mogą zmieniać strukturę kaspazy, zakłócać aktywność katalityczną i hamować apoptozę śmierci komórki7. Podobne efekty można zaobserwować w przypadkach związanych z nowotworem mutacji typu missense w genach kaspazy. Na przykład związana z nowotworem mutacja kaspazy-6 - R259H - spowodowała zmiany konformacyjne pętli w kieszeni wiążącej substrat, zmniejszając efektywny obrót katalityczny substratów8. Substytucja aminokwasów G325A w kaspazie-8 zidentyfikowana w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi może hamować aktywność kaspazy-8, co prowadziło do modulacji sygnalizacji czynnika jądrowego-kB (NF-kB) i sprzyjało powstawaniu nowotworzenia9.
Aby ocenić potencjalny wpływ podstawień aminokwasów na strukturę i funkcję kaspazy, można zastosować modelowanie molekularne. W niniejszej pracy opisano podejście oparte na dynamice molekularnej (MD) do modelowania kaspazy typu dzikiego i jej zmutowanych form przy użyciu pakietu symulacji biomolekularnej (Amber). Metoda MD daje wgląd w dynamiczną ewolucję struktury białka po wprowadzeniu mutacji. Pierwotnie opracowany przez grupę Petera Kollmana, pakiet Amber stał się jednym z najpopularniejszych narzędzi programowych do symulacji biomolekularnych 10,11,12,13. To oprogramowanie jest podzielone na dwie części: (1) AmberTools, zbiór programów rutynowo używanych do przygotowania systemu (przypisywanie typów atomów, dodawanie wodorów i cząsteczek wody itp.) oraz analizy trajektorii; oraz (2) Bursztynowy, który jest wyśrodkowany wokół programu symulacyjnego pmemd. AmberTools jest darmowym pakietem (i warunkiem wstępnym do zainstalowania samego Ambera), podczas gdy Amber jest dystrybuowany z oddzielną licencją i strukturą opłat. Równoległe symulacje na superkomputerze i/lub przy użyciu procesorów graficznych (GPU) mogą znacznie poprawić wydajność badań naukowych nad dynamiką struktury białek14. Najnowsze dostępne wersje oprogramowania to AmberTools21 i Amber20, ale opisane protokoły mogą być również używane z poprzednimi wersjami.

<table><tbody><tr><td>Bursztyn20</td><td>Uniwersytet Kalifornijski w San Francisco</td><td></td><td>Oprogramowanie do symulacji dynamiki molekularnej http://ambermd.org</td></tr><tr><td>Bursztynowe Narzędzia21</td><td>Uniwersytet Kalifornijski w San Francisco</td><td></td><td>Oprogramowanie do modelowania i analizy molekularnej http://ambermd.org</td></tr></tbody></table>

badanie mutacji kaspazy i modyfikacji potranslacyjnych za pomocą podejść do modelowania molekularnego

Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches

Apoptoza to rodzaj zaprogramowanej śmierci komórki, która eliminuje uszkodzone komórki i kontroluje rozwój i homeostazę tkanek organizmów wielokomórkowych. Kaspazy, rodzina proteaz cysteinowych, odgrywają kluczową rolę w inicjacji i wykonywaniu apoptozy. Dojrzewanie kaspaz i ich aktywność są dostrajane przez modyfikacje potranslacyjne w bardzo dynamiczny sposób. Aby ocenić wpływ zmian potranslacyjnych, potencjalne miejsca są rutynowo mutowane z pozostałościami trwałymi na wszelkie modyfikacje. Na przykład resztę seryny zastępuje się alaniną lub kwasem asparaginowym. Jednak takie substytucje mogą zmienić konformację miejsca aktywnego kaspazy, prowadząc do zaburzeń aktywności katalitycznej i funkcji komórkowych. Co więcej, mutacje innych reszt aminokwasowych znajdujących się w krytycznych pozycjach mogą również załamać strukturę i funkcje kaspaz oraz prowadzić do zaburzeń apoptozy. Aby uniknąć trudności związanych ze stosowaniem zmutowanych reszt, można łatwo zastosować podejścia modelowania molekularnego w celu oszacowania potencjalnego wpływu podstawień aminokwasów na strukturę kaspazy. Obecny protokół pozwala na modelowanie zarówno kaspazy typu dzikiego, jak i jej zmutowanych form za pomocą pakietu symulacji biomolekularnej (Amber) i urządzeń superkomputerowych w celu przetestowania wpływu mutacji na strukturę i funkcję białka.

Niniejszy protokół może być z łatwością zastosowany w badaniach nad potranslacyjną modyfikacją kaspaz lub mutacji patogennych. W tej sekcji zilustrowano przebieg modelowania MD (ryc. 1), który został z powodzeniem wykorzystany w badaniu kaspazy-27. Stosując mutagenezę in vitro ukierunkowaną na miejsce potencjalnych miejsc fosforylacji (Ser/Thr do Ala) i podejścia biochemiczne, wykazano, że mutacja Ser384Ala zapobiegała przetwarzaniu kaspazy-2 i blokowała aktywność enzymatyczną oraz indukcję apoptotycznej śmierci komórki (rysunek uzupełniający 1). Jednak ani analiza spektrometrii mas, ani technologia Phos-Tag nie potwierdziły, że Ser384 ulega fosforylacji7. Aby zrozumieć, w jaki sposób Ser384 reguluje aktywność kaspazy-2, przeprowadzono modelowanie MD trójwymiarowej struktury białka (ryc. 1).
Modele molekularne dzikich i zmutowanych form kaspazy-2 zostały skonstruowane przy użyciu struktury krystalicznej 1pyo (dostępne struktury kaspazy-2 są wymienione w tabeli uzupełniającej 1). Mutant Ser384Ala powstał w wyniku usunięcia atomu Oγ z reszty Ser384 (w PDB reszty Ser i Ala wyróżniają się posiadaniem atomu Oγ ). Współrzędne wodoru są zwykle nieobecne w strukturach krystalicznych. W związku z tym do struktury białka dodano atomy wodoru, a następnie poddano go solwatacji w warstwie wody TIP3P o grubości 12 A, aby umożliwić dalsze symulacje rozpuszczalnika. Jony sodu zostały dodane w celu zneutralizowania układu. Uzyskane modele wyjściowe kaspazy-2 poddano minimalizacji energii, zrównoważeniu, a następnie symulacji MD 10 ns zgodnie z protokołem modelowania MD, z wykorzystaniem plików danych kontrolnych min1.in, min2.in, heat.in, equil.in i prod.in .
W strukturze krystalicznej kaspazy-2 Ser384 wraz z Arg219 i Arg378 biorą udział w tworzeniu powierzchni ubytku w miejscu aktywnym. Arg219 i Arg378 tworzą wiązania wodorowe z grupą karboksylową substratu, podczas gdy Ser384 nie interweniuje w bezpośrednich oddziaływaniach z substratem. Symulacje MD potwierdziły, że substytucja Ser384Ala nie wpłynęła na reszty katalityczne Cys320 (nukleofil) i His277 (zasada ogólna), ale wywołała poważną zmianę konformacyjną w Arg378. Jego grupa guanidynowa zwróciła się w kierunku rozpuszczalnika objętościowego, tak że atom Nε nie mógł utworzyć niezbędnego wiązania wodorowego z grupą karboksylową substratu (ryc. 1). W enzymie natywnym zachodzi oddziaływanie elektrostatyczne między atomem Oγ Ser384 (częściowy ładunek ujemny) a grupą guanidynową Arg378 (ładunek dodatni). Jednak substytucja seryny najwyraźniej zakłóca tę interakcję. W ten sposób wykazano, że substytucja Ser384Ala wpłynęła na rozpoznawanie substratu przez reszty argininy w miejscu aktywnym kaspazy-2, upośledzając aktywność enzymatyczną i zdolność do wywoływania apoptotycznej śmierci komórki. Odkryty mechanizm wydaje się ewolucyjnie konserwatywny i wspólny dla innych członków rodziny kaspaz. Tym samym realizacja symulacji MD pozwoliła na potwierdzenie wyników biochemicznych i uzyskanie nowych informacji na temat struktury molekularnej aktywnego centrum kaspaz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64206/64206fig1v2.jpg"> 
Rysunek 1: Proces modelowania MD wykorzystany do badania struktury kaspazy. Kaspaza-2 typu dzikiego i jej mutant Ser384Ala zostały zbadane zgodnie z instrukcjami w sekcji protokołu. Wykazano, że substytucja Ser384Ala indukuje ważną zmianę konformacyjną w reszcie miejsca aktywnego Arg378. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64206/64206fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Funkcja kaspazy-2 w śmierci komórki. W odpowiedzi na bodźce zewnętrzne i wewnętrzne, kaspaza-2 typu dzikiego może być aktywowana przez mechanizm autoproteolityczny. Aktywna kaspaza-2 rozszczepia Bid, co z kolei sprzyja przenikaniu błony zewnętrznej mitochondriów i apoptotycznej śmierci komórki. Mutacja Ser384Ala zapobiega aktywacji kaspazy-2 i indukcji śmierci komórki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64206/Supplementary%20Figure%201%20fin.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Struktury kaspazy-2 dostępne w Banku Danych o Białkach. Struktury są sortowane według daty wydania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64206/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Różne kroki edytowania pliku PDB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64206/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Niniejszy protokół wykorzystuje pakiet symulacji biomolekularnej i opisuje podejście dynamiki molekularnej (MD) do modelowania kaspazy typu dzikiego i jej zmutowanych form. Metoda MD pozwala na ocenę dynamicznej ewolucji struktury kaspazy oraz potencjalnego wpływu mutacji lub modyfikacji potranslacyjnych.

Badanie mutacji kaspazy i modyfikacji potranslacyjnych za pomocą podejść do modelowania molekularnego

Apoptosis is a type of programmed cell death that eliminates damaged cells and controls the development and tissue homeostasis of multicellular organisms. ...

odgrywają kluczową rolę w inicjowaniu i realizacji za pomocą modelowania molekularnego. Badamy wpływ modyfikacji i mutacji potranslacyjnych na strukturę i funkcję kaspazy. Opisujemy podejście oparte na dynamice molekularnej, które daje wgląd w ewolucję białka po wprowadzeniu modyfikacji strukturalnych na poziomie atomowym.Takie podejście ma szczególne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów regulujących programową śmierć komórkową i związane z nią zaburzenia oraz opracowania nowych skutecznych terapii. Demonstrujemy możliwości modelowania molekularnego za pomocą jednego z najpopularniejszych narzędzi, jakim jest Amber 20. Ale prezentowany protokół może być również używany z formalnymi wersjami tego oprogramowania.Poniższy film opisuje krok po kroku instrukcje dotyczące przygotowania struktury kaspazy do symulacji i przeprowadzenia badania ascilica tego białka typu dzikiego i zmodyfikowanych form. Aby pobrać wybrany bank danych o białkach lub strukturę P, D B, skorzystaj z listy rozwijanej pobierania plików i kliknij format P, D B, format. Usuń uwagi i dane dotyczące połączeń, a następnie włóż kartę T E R między oddzielnymi łańcuchami białkowymi w pliku P, DB.Aby przygotować model startowy, uruchom program T-LEAP z pakietu Amber Tools. Następnie załaduj pole siłowe F, F, 14, S, B, aby opisać białko za pomocą mechaniki molekularnej oraz parametrów dla cząsteczek wody i jonów atomowych, takich jak sód i chlorek, wprowadzając wskazane polecenia w wierszu poleceń. Następnie załaduj plik P D B i zbuduj współrzędne wodoru, tworząc obiekt o nazwie mol.Sprawdź, czy nie ma wewnętrznych niespójności, które mogą powodować problemy za pomocą polecenia check mol. Stwórz pudełko z rozpuszczalnikiem wokół białka. Następnie sprawdź całkowity ładunek, wprowadzając mol ładunku i dodaj jony przeciwstawne, aby zneutralizować system.Utwórz górny plik topologii P R M oraz plik współrzędnych I N P C R D , wprowadzając wskazane polecenie. Po zakończeniu wyjdź z programu T-lEAP. Przeprowadź pierwszy etap minimalizacji energii, aby zoptymalizować położenie dodanych atomów wodoru i cząsteczek wody, utrzymując współrzędne białka na stałym poziomie za pomocą ograniczeń pozycyjnych na ciężkich atomach.Uruchom program P M E M D , wprowadzając wskazane polecenie. Postępuj zgodnie z wymaganymi argumentami, gdy kontroluję dane. P topologia molekularna, parametry pola siłowego i nazwy atomów.Współrzędne początkowe C. O czytelne dla użytkownika wyjście dziennika Współrzędne końcowe R. REF, współrzędne odniesienia dla utwierdzeń położenia.Następnie należy przeprowadzić drugi etap minimalizacji energii bez ograniczeń, aby zoptymalizować cały system za pomocą wejść wskazanego polecenia. Ten etap ma na celu podgrzanie systemu od zera do 300 kelwinów. Przeprowadź proces ogrzewania z ograniczeniami położenia na atomach białka z 50 pikosekundami przy stałej objętości, używając podanego polecenia jako danych wejściowych.Postępuj zgodnie z wymaganym argumentem jako zestawami współrzędnych X zapisanymi na trajektorii dynamiki molekularnej. Kolejny etap jest niezbędny do dostosowania gęstości wody i uzyskania stanu równowagi białka. Wykonaj równoważenie przy 300 kelwinach przez 500 pikosekund przy stałym ciśnieniu bez żadnych ograniczeń, używając wskazanego polecenia po pomyślnym osiągnięciu równowagi.Przeprowadź symulację dynamiki molekularnej produkcji przez 10 nanosekund lub dłużej przy stałym ciśnieniu i wygeneruj plik trajektorii do późniejszej analizy struktury białka za pomocą wskazanego polecenia. Równoległa wersja programu, P M E M D M P I lub G P U przyspieszona wersja P M E M D cuda może być używana w klastrach komputerowych i superkomputerach. Długa symulacja dynamiki molekularnej może być podzielona na kilka segmentów i wykonywana sekwencyjnie.W tej analizie badano kaspazę dwa typu dzikiego i jej mutanta alaniny seryny-384 zgodnie z procesem modelowania dynamiki molekularnej. Substytucja alaniny seryny-384 indukowała istotną zmianę konformacyjną w reszcie miejsca aktywnego argininy-378. Ponadto wykazano, że substytucja alaniny seryny-384 wpłynęła na rozpoznawanie substratu przez reszty argininy w miejscu aktywnym, upośledzając aktywność zasady odlewu.Mutageneza ukierunkowana na miejsce i testy biochemiczne wykazały, że mutacja alaniny seryny-384 blokowała aktywność enzymatyczną w przetwarzaniu kaspazy drugiej i hamowała apoptozę komórek rakowych. Opisane podejście może być wykorzystane do oceny wpływu mutacji aminokwasów i modyfikacji potranslacyjnych w kaspazie drugiej, a także w innych kaspazach biorących udział w różnych chorobach nowotworowych.

exploring-caspase-mutations-post-translational-modification-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zawał mięśnia sercowego (MI) nie tylko powoduje upośledzenie funkcji serca, ale także apoptozę w ciele migdałowatym, regionie mózgu zaangażowanym w behawioralne konsekwencje zawału mięśnia sercowego. Protokół ten opisuje, w jaki sposób indukować zawał mięśnia sercowego, pobierać tkankę ciała migdałowatego i mierzyć w niej aktywność kaspazy-3, markera apoptozy.

Aktywność kaspazy-3 w ciele migdałowatym szczura mierzona spektrofluorometrią po zawale mięśnia sercowego

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Zakażenie wirusem grypy A (IAV) aktywuje kaspazy, które rozszczepiają białka gospodarza i wirusa, które z kolei pełnią funkcje pro- i przeciwwirusowe. Stosując inhibitory, interferencję RNA, mutagenezę ukierunkowaną na miejsce oraz techniki western blotting i RT-qPCR, zidentyfikowano kaspazy w zakażonych komórkach ssaków, które rozszczepiają kortaktynę gospodarza i deacetylazy histonowe.

Identyfikacja kaspaz i ich motywów, które rozszczepiają białka podczas infekcji wirusem grypy A

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół immunohistochemiczny do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach.

Kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania i oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila Dronc i Drice oraz ich zastosowanie w testach rozszczepienia in vitro.

In vitro Testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz Drosophila do badań przesiewowych substratów

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy protokół optymalizacji i parametryzacji reszt aminokwasowych modyfikowanych reaktywnymi gatunkami karbonylowymi, które można dostosować do systemów białkowych. Etapy protokołu obejmują projektowanie i optymalizację struktury, przypisywanie ładunków, konstrukcję parametrów i przygotowanie układów białkowych.

Synteza aminokwasów modyfikowanych reaktywnymi karbonylkami in silico w celu oceny efektów strukturalnych przy użyciu symulacji dynamiki molekularnej

Poznaj dynamikę molekularną kaspaz z użyciem symulacji Amber 20. Metoda pozwala analizować wpływ mutacji i modyfikacji potranslacyjnych na strukturę białka oraz aktywność enzymatyczną w kontekście apoptozy i terapii przeciwnowotworowych.

Badanie mutacji kaspazy i modyfikacji potranslacyjnych za pomocą podejść do modelowania molekularnego

Przeglądaj więcej filmów