Badanie mutacji kaspazy i modyfikacji potranslacyjnych za pomocą podejść do modelowania molekularnego

Niniejszy protokół wykorzystuje pakiet symulacji biomolekularnej i opisuje podejście dynamiki molekularnej (MD) do modelowania kaspazy typu dzikiego i jej zmutowanych form. Metoda MD pozwala na ocenę dynamicznej ewolucji struktury kaspazy oraz potencjalnego wpływu mutacji lub modyfikacji potranslacyjnych.

odgrywają kluczową rolę w inicjowaniu i realizacji za pomocą modelowania molekularnego. Badamy wpływ modyfikacji i mutacji potranslacyjnych na strukturę i funkcję kaspazy. Opisujemy podejście oparte na dynamice molekularnej, które daje wgląd w ewolucję białka po wprowadzeniu modyfikacji strukturalnych na poziomie atomowym.

Takie podejście ma szczególne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów regulujących programową śmierć komórkową i związane z nią zaburzenia oraz opracowania nowych skutecznych terapii. Demonstrujemy możliwości modelowania molekularnego za pomocą jednego z najpopularniejszych narzędzi, jakim jest Amber 20. Ale prezentowany protokół może być również używany z formalnymi wersjami tego oprogramowania.

Poniższy film opisuje krok po kroku instrukcje dotyczące przygotowania struktury kaspazy do symulacji i przeprowadzenia badania ascilica tego białka typu dzikiego i zmodyfikowanych form. Aby pobrać wybrany bank danych o białkach lub strukturę P, D B, skorzystaj z listy rozwijanej pobierania plików i kliknij format P, D B, format. Usuń uwagi i dane dotyczące połączeń, a następnie włóż kartę T E R między oddzielnymi łańcuchami białkowymi w pliku P, DB.

Aby przygotować model startowy, uruchom program T-LEAP z pakietu Amber Tools. Następnie załaduj pole siłowe F, F, 14, S, B, aby opisać białko za pomocą mechaniki molekularnej oraz parametrów dla cząsteczek wody i jonów atomowych, takich jak sód i chlorek, wprowadzając wskazane polecenia w wierszu poleceń. Następnie załaduj plik P D B i zbuduj współrzędne wodoru, tworząc obiekt o nazwie mol.

Sprawdź, czy nie ma wewnętrznych niespójności, które mogą powodować problemy za pomocą polecenia check mol. Stwórz pudełko z rozpuszczalnikiem wokół białka. Następnie sprawdź całkowity ładunek, wprowadzając mol ładunku i dodaj jony przeciwstawne, aby zneutralizować system.

Utwórz górny plik topologii P R M oraz plik współrzędnych I N P C R D , wprowadzając wskazane polecenie. Po zakończeniu wyjdź z programu T-lEAP. Przeprowadź pierwszy etap minimalizacji energii, aby zoptymalizować położenie dodanych atomów wodoru i cząsteczek wody, utrzymując współrzędne białka na stałym poziomie za pomocą ograniczeń pozycyjnych na ciężkich atomach.

Uruchom program P M E M D , wprowadzając wskazane polecenie. Postępuj zgodnie z wymaganymi argumentami, gdy kontroluję dane. P topologia molekularna, parametry pola siłowego i nazwy atomów.

Współrzędne początkowe C. O czytelne dla użytkownika wyjście dziennika Współrzędne końcowe R. REF, współrzędne odniesienia dla utwierdzeń położenia.

Następnie należy przeprowadzić drugi etap minimalizacji energii bez ograniczeń, aby zoptymalizować cały system za pomocą wejść wskazanego polecenia. Ten etap ma na celu podgrzanie systemu od zera do 300 kelwinów. Przeprowadź proces ogrzewania z ograniczeniami położenia na atomach białka z 50 pikosekundami przy stałej objętości, używając podanego polecenia jako danych wejściowych.

Postępuj zgodnie z wymaganym argumentem jako zestawami współrzędnych X zapisanymi na trajektorii dynamiki molekularnej. Kolejny etap jest niezbędny do dostosowania gęstości wody i uzyskania stanu równowagi białka. Wykonaj równoważenie przy 300 kelwinach przez 500 pikosekund przy stałym ciśnieniu bez żadnych ograniczeń, używając wskazanego polecenia po pomyślnym osiągnięciu równowagi.

Przeprowadź symulację dynamiki molekularnej produkcji przez 10 nanosekund lub dłużej przy stałym ciśnieniu i wygeneruj plik trajektorii do późniejszej analizy struktury białka za pomocą wskazanego polecenia. Równoległa wersja programu, P M E M D M P I lub G P U przyspieszona wersja P M E M D cuda może być używana w klastrach komputerowych i superkomputerach. Długa symulacja dynamiki molekularnej może być podzielona na kilka segmentów i wykonywana sekwencyjnie.

W tej analizie badano kaspazę dwa typu dzikiego i jej mutanta alaniny seryny-384 zgodnie z procesem modelowania dynamiki molekularnej. Substytucja alaniny seryny-384 indukowała istotną zmianę konformacyjną w reszcie miejsca aktywnego argininy-378. Ponadto wykazano, że substytucja alaniny seryny-384 wpłynęła na rozpoznawanie substratu przez reszty argininy w miejscu aktywnym, upośledzając aktywność zasady odlewu.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce i testy biochemiczne wykazały, że mutacja alaniny seryny-384 blokowała aktywność enzymatyczną w przetwarzaniu kaspazy drugiej i hamowała apoptozę komórek rakowych. Opisane podejście może być wykorzystane do oceny wpływu mutacji aminokwasów i modyfikacji potranslacyjnych w kaspazie drugiej, a także w innych kaspazach biorących udział w różnych chorobach nowotworowych.